一种饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法
【专利摘要】一种饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法，包括缓冲液的配制、干肽粉制备、小肽溶液的配制、铜溶液的配制、纳米小肽螯合铜溶液的制备、并经分离、干燥即得纳米小肽螯合铜。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：（1）生产成本低；（2）产品纯度高，晶型结构好；（3）生物学效价高，提高机体免疫力。
【专利说明】
一种饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及化学合成领域，具体涉及一种饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 铜是动物和人体必须的微量元素，对造血、中枢神经系统的发育、骨及结缔组织的 形成具有重要作用。缺铜，将导致一系列的病变而影响生物体的健康。但不同铜源的生物利 用效率不同，铜元素的总利用率较低但促幼小动物生长作用明显，导致饲料中铜元素超量 添加的情况比较普遍，从而带来铜排泄量高，形成对环境的污染和资源浪费等问题（邓科 敏，李前勇，等.高铜对畜禽养殖及其产品安全的影响[J].四川畜牧兽医，2008,2:30-32.)。因此，近年来，寻求具有高吸收利用率的铜源成为饲料研究的热点之一。
[0003] 有研究表明：不同C-端的四肽螯合铜对DNA的作用中发现游离态的铜离子不易到 达靶组织的结合位点，四肽螯合铜的铜离子借助四肽比较容易到达DNA的结合位点，有利于 动物对铜的吸收利用（Ryoichi Nagane , Toshiaki Koshigoe , Makoto Chikira.Interaction of Cu(II)-Arg-Gly-His-Xaa metallopeptides with DNA: effectof C-terminal residues, Leu and Glu Journal of Inorganic Biochemistry 93 (2003) 204-212)。国外对小肽微量元素螯合物的研究主要是Ca、Fe、Zn和Mn，小肽螯合 铜报道的还比较少。多数停留在对小肽螯合铜晶型的研究，但还未见纳米级小肽螯合铜的 相关报道。因此，纳米级小肽螯合铜作为新一代高效绿色营养添加剂，适口性好，营养功能 强，生物学效价高(陈宝江.小肽的营养与应用[J].中国饲料，2004，5:34-36 .)，提高免疫力 (乔伟，周安国，等.小肽促进微量元素吸收的研究进展[J].饲料工业，2006,17(27) :12-14.)，降低环境污染等特点，必将拥有潜在的市场前景。
[0004] 但由于小肽螯合物(特别是单项小肽螯合盐)价格比较高，这在一定程度上限制了 其应用。本专利利用豆柏酶解小肽，采用有机金属化合反应及晶型调控，并经喷雾干燥制备 了螯合度高的纳米小肽螯合铜，并为其它纳米小肽微量元素螯合物研究推广提供新的研究 思路。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法。
[0006] 基于上述目的，本发明采取如下技术方案： 一种饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法，包括如下步骤： (1) 缓冲液的配制：用〇. 2M磷酸氢二钠溶液和0.1M梓檬酸溶液配制pH为2.2~8.0的 缓冲液； (2) 干肽粉制备:将豆柏粉溶于步骤(1)的缓冲液中，使豆柏粉浓度为155~165g/L，在35 ~45°C搅拌10~15 min;再在89~92°C下热处理15~20min;加入碱性蛋白酶与风味蛋白酶 【Alcalase碱性蛋白酶(液体)2.4 L，Flavorzyme风味蛋白酶500 MG，均由诺维信投资有限 公司提供】，在50~60°C、pH=6.5~7.5、振荡酶解4~6小时，酶解结束后在沸水浴灭酶活，调pH 值至4~5，离心、过滤，得酶解液，干燥，得干肽粉； (3 )小肽溶液的配制:将干肽粉溶解在水中制成饱和溶液即为小肽溶液； (4) 铜溶液的配制:将五水硫酸铜溶于水配制成质量分数为15~25%的硫酸铜溶液； (5) 纳米小肽螯合铜溶液的制备:将小肽溶液倒入反应容器中，调整pH为7.5~8.5，温度 为50~60°C，搅拌下加入硫酸铜溶液，使干肽粉的质量与五水硫酸铜的质量比为(3~5): 1，加 完后再反应3~8 min; (6) 分离、干燥即得纳米小肽螯合铜。
[0007] 进一步地，步骤(2)中碱性蛋白酶与风味蛋白酶质量比为1:1，且两种酶占豆柏粉 质量的（10~11)%。
[0008] 步骤(5)中调整pH为7.5~8.5时，用0.1M氢氧化钠溶液调的pH。
[0009] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果： (1) 生产成本低； (2) 广品纯度尚，晶型结构好； (3) 生物学效价高，提高机体免疫力。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1 一种饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法，包括如下步骤： (1) 缓冲液的配制:配制〇. 2M磷酸氢二钠溶液和0.1M柠檬酸溶液，备用； (2) 干肽粉制备:取1.6 kg豆柏粉(粒度彡0.6 mm)溶于10 1^!1=4.3、0.21磷酸氢二钠 溶液和0.1M柠檬酸溶液组成的缓冲液中，在40 °C下搅拌12 min;再在90 °C下热处理17.5 min;然后加入碱性蛋白酶与风味蛋白酶【Alcalase碱性蛋白酶(液体)2.4 L，Flavorzyme风 味蛋白酶500 MG，均由诺维信投资有限公司提供，两种酶的质量比为1:1】，在55°C、pH为 7.0(用0.2M磷酸氢二钠溶液调pH)，酶浓度为10.5%(即两种酶占豆柏粉质量的10.5%)的条 件下置于恒温振荡器上振荡酶解5小时，再在沸水浴灭酶活10 min，用0.1M柠檬酸溶液调pH 值至4.5，然后于3000 r/min离心10 min，过滤得酶解液，经喷雾干燥(热进风温度80°085 。(：，热排风温度65~75°C，物料收集器内温度45~60°C，风量3.4 m3/min，风速60 HZ，干燥时 间6~8 s，最终含水量3.5~4.0%)，得干肽粉。
[0011 ] (3)小肽溶液的配制:将干肽粉溶解在自来水中制成饱和溶液即为小肽溶液。
[0012] (4)铜溶液的配制:准确称取250 g的五水硫酸铜粉末，用少量自来水溶解，用自来 水定容至1 L，摇勾。
[0013] (5)纳米小肽螯合铜溶液的制备:将小肽溶液匀速倒入带有搅拌装置的反应容器 中，0.1M NaOH调整pH为8.50，在55 °C、搅拌速度120 r/min下，加入硫酸铜溶液，使干肽粉与 五水硫酸铜质量比为4:1，将硫酸铜溶液先以100 mL/min的速度匀速加入小肽溶液中，待铜 溶液加入总体积的1/20后即30 s后，再以1000 mL/min的速度匀速添加，待物料添加完毕后 再反应5 min; (6)分离、干燥（同步骤(2)中的喷雾干燥条件）即得纳米小肽螯合铜，产出率为99.88%， 测得平均粒度为219nm，有效铜含量多15%〇
[0014] 纳米小肽螯合铜的添加量可参照中华人民共和国农业部公告第1224号中微量元 素铜在猪、家禽、牛、羊、鱼类的添加量。
[0015] 试验例1 1、根据目前的中国饲养标准(NY/T 65-2004)选择原料，根据国家标准GB14924.3《实 验动物小鼠大鼠配合饲料》，基础饲粮组成及各项营养指标见表1。
[0016] 表1小白鼠基础日粮组成
注：1)复合矿物盐其组成为（每千克饲粮）：CaHP〇4 22.21g，MgS〇4.7H2〇 4.11g， FeS04 · H20 125mg, MnS04 · H20 140mg, ZnS04 · 7H20 133mg,KI 0.33mg,Na2Se03 · 5 H20 lOmg, K2S04 3.92g, NaCl 11.Og. 2)营养指标均为实测值。
[0017] 2、选择130只18日龄健康昆明种小白鼠预饲5天后，挑选120只发育良好、体重差 异不显著的小鼠随机分为I、π、m、IV、v和VI等六个处理组，每个处理组设四个重复，每个 重复5只小白鼠。各重复间的雌雄数相等，雌雄分笼饲养，试验小白鼠分组情况见表2。
[0018] 表2试验小白鼠分组情况
3、根据国家标准GB14924.3《实验动物小鼠大鼠配合饲料》制订各处理组铜的添加量， 详见表3。
[0019] 表3各处理组铜的添加量
4、试验中，从第6天开始每周称1次体重、2次食物摄入量，计算食物利用率及总利用率。 于第12(1、19(1、26(1和33(1分别从各组中收集粪便参照68八5009.13-2003测得饲料和粪便 中铜含量，其结果见表4和表5。
[0020] 表4不同处理组对断奶小鼠铜排泄量的影响(n=4)M± SEM单位:mgCu/kg排泄物
注:表中数据进行横向和纵向比较，同列或同行比较时，相同的小写字母表示差异不显 著(P>0.05)，不同的小写字母表示差异显著(P〈0.05)，下同。 表5不同处理组对断奶小鼠体重的影响(g)(n=5)M±SEM单位:g
5、如表4所示，在饲养的各个阶段，断奶小鼠对不同铜源的生物学效价差异显著（K 0.05)，小鼠排泄铜差异明显，纳米小肽螯合铜组显著低于其它各组(包括对照组）；如表5所 示，适量添加不同铜源均能有效提高小鼠体重，与硫酸铜、碱式氯化铜、蛋氨酸铜及纳米铜 相比较，纳米小肽螯合铜更能有效促进机体增重。
[0021] 试验例2 1、根据目前的中国饲养标准(NY/T 65-2004)选择原料，根据国家标准GB14924.3《实 验动物小鼠大鼠配合饲料》，基础饲粮组成及各项营养指标见表6。
[0022] 表6小白鼠基础日粮组成
注：1)复合矿物盐其组成为（每千克饲粮）：CaHP〇4 22.21g，MgS〇4.7H2〇 4.11g， FeS04*H20 125mg, MnS04 · H20 140mg,ZnS04 · 7H20 133mg, KI 0.33mg, Na2Se03 · 5 H20 10mg,K2S〇4 3.92g,NaCl 11.Og. 2)营养指标均为实测值。
[0023] 2、选择200只18日龄健康昆明种小白鼠预饲5天后，挑选180只发育良好、体重差 异不显著的小鼠随机分为Ι、Π 、ΙΠ 、IV、V和VI等六个处理组，每个处理组设五个重复，每个 重复6只小白鼠。各重复间的雌雄数相等，雌雄分笼饲养，试验小白鼠分组情况见表7。
[0024] 表7试验小白鼠分组情况
3、根据国家标准GB14924.3《实验动物小鼠大鼠配合饲料》制订各处理组铜的添加量， 见表8。
[0025] 表8各处理组铜的添加量
4、在动物试验期的第12d、19d、26d和33d，摘除眼球采血，制备血清，测定血清免疫蛋白 IgG、IgM、IgA见表9、表10 和表11。 表9不同处理组对小鼠 IgG的影响(n=5)M±SEM mg/mL
表10不同铜源对小鼠 IgM的影响(n=3)M±SEM单位:mg/mL
表11不同铜源对小鼠 IgA的影响(n=3)M±SEM单位:ug/mL
【主权项】
1. 一种饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 缓冲液的配制：用0.2M磷酸氢二钠溶液和0.1M梓檬酸溶液配制pH为2.2~8.0的 缓冲液； (2) 干肽粉制备:将豆柏粉溶于步骤(1)的缓冲液中，使豆柏粉浓度为155~165g/L，在35 ~45°C搅拌10~15 min;再在89~92°C下热处理15~20min;加入碱性蛋白酶与风味蛋白酶，在 50~60°C、pH=6.5~7.5、振荡酶解4~6小时，酶解结束后在沸水浴灭酶活，调pH值至4~5，离心、 过滤，得酶解液，干燥，得干肽粉； (3 )小肽溶液的配制:将干肽粉溶解在水中制成饱和溶液即为小肽溶液； (4) 铜溶液的配制:将五水硫酸铜溶于水配制成质量分数为15~25%的硫酸铜溶液； (5) 纳米小肽螯合铜溶液的制备:将小肽溶液倒入反应容器中，调整pH为7.5~8.5，温度 为50~60°C，搅拌下加入硫酸铜溶液，使干肽粉的质量与五水硫酸铜的质量比为(3~5): 1，加 完后再反应3~8 min; (6) 分离、干燥即得纳米小肽螯合铜。2. 根据权利要求1所述的饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法，其特征在于，步骤 (2)中碱性蛋白酶与风味蛋白酶质量比为1:1，且两种酶占豆柏粉质量的（10~11)%。3. 根据权利要求1所述的饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法，其特征在于，步骤 (5)中调整pH为7.5~8.5时，用0.1M氢氧化钠溶液调的pH。
【文档编号】A23J3/16GK106035983SQ201610466064
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】张天勇, 王卫国, 高天增, 郭小云, 李国平, 王全亮, 高鹏飞, 廖晖, 丁冉冉, 汪伟
【申请人】河南广安生物科技股份有限公司