具有抗炎活性的大环内酯的制作方法

专利名称：具有抗炎活性的大环内酯的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有抗炎活性的大环内酯，更确切地涉及具有抗炎活性的脱二甲氨基大环内酯衍生物、它们的药学上可接受的盐和含有它们作为活性成分的药物组合物。
已知很多抗生素、特别是从红霉素衍生的具有14个原子的大环内酯类除了抗菌活性以外，还赋有抗炎性质(《临床免疫疗法》(1996)，6，454-464)。
红霉素是一种天然的大环内酯(《默克索引》XII版，n°3720，p.625)，临床上已经广泛用于治疗由革兰氏阳性菌、有些革兰氏阴性菌或支原体属所导致的感染。
最近，科学界已经把研究的焦点集中于红霉素和衍生物的抗炎与免疫调制组分(《抗微生物化学疗法杂志》(1998)，41，增刊B，37-46)。
关于该活性的临床研究和体内与体外实验都有详细的文献记载。
例如，大环内酯已经证明对炎性疾病的治疗有效，例如泛细支气管炎(《Thorax》(1997)，52，915-918)、支气管哮喘(《Chest》(1991)，99，670-673)和囊性纤维变性(《柳叶刀》(1998)，351，420)，或者对炎症的动物模型有效，例如酵母多糖诱导的小鼠腹膜炎(《抗微生物化学疗法杂志》(1992)，30，339-348)和内毒素诱导的大鼠气管嗜中性白细胞募集(《抗微生物剂和化学疗法》(1994)，38，1641-1643)，或者对免疫系统细胞的体外研究有效，例如嗜中性白细胞(《免疫学杂志》(1997)，159，3395-4005)和T-淋巴细胞(《生命科学》(1992)，51，PL 231-236)，或者对细胞因子的调制有效，例如白介素8(IL-8)(《Am.J.Respir.Crit.Care Med.》(1997)，156，266-271)或白介素5(IL-5)(EP 0775489和EP0771564，Taisho Pharmaceutical Co.，Ltd.)。
大环内酯对常规抗炎药、例如皮质甾类已经证明无效的疾病(《Thorax》(1997)，52，915-918，已被引用)的特有治疗功效证实了对这类新颖、潜在的抗炎剂的浓厚兴趣。
然而，常规大环内酯的强抗菌活性不允许扩大在慢性炎性病变治疗中的用途，原因不在于病原体，而是耐药菌株的迅速产生。
因此，需要具有大环内酯结构的新物质，在显示抗炎活性的同时，缺乏抗生性质。
为了清楚起见，我们展示红霉素的结构式，其中标示出本专利申请中所采用的编号。 文献中描述了有些类赋有高抗炎活性的红霉素衍生物。
例如，以Taisho名义的已被引用的欧洲专利申请中要求保护在3、9、11和12位被修饰的红霉素衍生物作为IL-5合成的强抑制剂。
具有下式结构、不含克拉定糖和脱氧糖胺的阿齐霉素的N-烷基衍生物在EP0283055(Sour Pliva)中被描述为抗炎剂
其中R1是氢、低级烷基或低级烷酰基；R2、R3和R4相同或不同地是氢或低级烷酰基。
以Smith-Kline Beecham公司名义的WO92/16226要求保护红霉素作为抗炎剂的用途，它通过抑制哺乳动物mdr-P糖蛋白来减少白介素I的释放而发挥作用。
在文献所述的大环内酯衍生物中，少数是3-脱二甲氨基-9-羟亚氨基(oxyimino)衍生物。对这类化合物的兴趣有限的事实依据是已知二甲氨基对大环内酯特有的核糖体结合活性具有关联性(《四面体快报》(1994)，35，3837-3840)。
US3928387(Hoffmann-La Roche Inc.)中描述了3’-脱二甲氨基-3’，4’-脱氢红霉素A肟是可用于制备抗生素1745A/X的中间体。
EP 0254534(Robinson，William S.)要求保护一大类具有抗病毒活性的大环内酯。其中描述了下式化合物 其正确的化学名称是3’-脱二甲氨基-3’，4’-脱氢红霉素A 9-O-甲基肟，不过在EP254534的文本中被错误地报道为脱二甲氨基红霉素9-O-甲基肟(第10页第46行)。
现在我们已经发现，从9-羟亚氨基大环内酯的脱氧糖胺的3’位除去二甲氨基，得到赋有抗炎活性且本质上缺乏抗生性质的化合物。
因此，本发明的目的是下式化合物 其中R是氢或甲基；R1和R2都是氢，或者它们一起构成一条键；R3是氢、直链或支链C1-C5烷基、苄基，可选地被一个或多个取代基取代，取代基选自硝基、羟基、羧基、氨基、直链或支链C1-C5烷基、C1-C4烷氧基羰基、氨基羰基或氰基，或者是下式的链 其中A是氢或苯基，可选地被一个或两个取代基取代，取代基选自硝基、羟基、羧基、氨基、直链或支链C1-C5烷基、C1-C4烷氧基羰基、氨基羰基或氰基，或者是饱和或不饱和的5或6元杂环，它含有1至3个选自氮、氧和硫的杂原子，可选地被一个或两个取代基取代，取代基选自C1-C5烷基、苯基、羟基、氧代(＝O)、硝基、C1-C4烷氧基羰基、氨基羰基、单或二C1-C4烷基氨基羰基、C1-C4烷基羰基；X和Y相同或不同地是O、S、SO、SO2或NR4，其中R4是氢、直链或支链C1-C5烷基、C1-C5烷氧基羰基、苄氧基羰基；r是1至6的整数；m是1至8的整数；n是0至2的整数；
和它们的药学上可接受的盐；化合物3’-脱二甲氨基-3’，4’-脱氢红霉素A肟(R1和R2＝键；R＝H；R3＝H)和3’-脱二甲氨基-3’，4’-脱氢红霉素A 9-O-甲基肟(R1和R2＝键；R＝H；R3＝CH3)除外。
本发明的进一步目的是化合物3’-脱二甲氨基-3’，4’-脱氢红霉素A肟和3’-脱二甲氨基-3’，4’-脱氢红霉素A 9-O-甲基肟作为抗炎剂的用途。
式I化合物是缺乏抗生活性的抗炎大环内酯，因此它们可用于炎性疾病的治疗。
术语直链或支链C1-C5烷基指选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和异戊基的基团。
术语饱和或不饱和的5或6元杂环，并含有1至3个选自氮、氧和硫的杂原子，指这样的杂环，例如吡咯、噻吩、呋喃、咪唑、吡唑、噻唑、异噻唑、异噁唑、噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、噻唑、噻二唑和它们的部分或全部饱和的形式。
优选的式I化合物是这样的化合物，其中R、R1和R2是氢。
这类中特别优选这样的化合物，其中R3是下式的链 其中X、Y、A、r、m和n具有已经报道过的含义。进而更优选的化合物是这样的化合物，其中R3是下式的链 其中r是2，m是2或6，n是1，Y是NR4，X是O或NR4，R4是氢，A是苯基或噻唑基。
式(I)化合物的药学上可接受的盐的实例是与有机或无机酸所形成的盐，酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磷酸、乙酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、琥珀酸和戊二酸。
本发明的式I化合物按照这样的合成流程加以制备，该流程包括(a)3’位二甲氨基的除去，和(b)可选的肟的官能化。
二甲氨基的除去按照已知方法通过氧化、热解和可选的还原加以进行。对本领域技术人员来说显而易见的是，为了避免与R3取代基上可选存在的官能团的干扰，二甲氨基的除去优选地将从下式中间体开始进行 其中R具有已经报道过的含义，R3’是氢或直链或支链C1-C5烷基。通过氧化作用得到相应的下式N-氧化物 其中R和R3’具有已经报道过的含义；通过热解、可选地接着还原，分别得到本发明的下式(I-R3＝氢或C1-C5烷基)化合物 和 按照普通的工艺，其中R3不同于氢的式I化合物可以从其中R3’是氢的式I-A和I-B化合物通过肟的官能化加以制备。
一般，官能化作用通过与下式化合物的反应加以进行R3”-W(IV)其中R3”具有除了氢以外的R3的全部含义，W是离去基团，优选为氯或溴原子或甲磺酰基。
特别适合于制备其中R3是下式的链的化合物的可供选择的合成途径 其中X、Y、A、r、m和n具有已经报道过的含义；包括其中R3是氢的式I化合物与下式中间体的反应 其中W、X、Y、m和n具有已经报道过的含义，Z代表保护基团；得到下式中间体 其中R、R1、R2、X、Y、Z、r和m具有已经报道过的含义；在Z保护基团的除去之后，与下式衍生物反应 其中A、W和n具有已经报道过的含义；得到式I化合物。其中Y是NR4的式I化合物可以按照上述所报道的合成途径加以制备，并且使用下式的醛代替式VII中间体A-CHO(VIII)其中A具有已经报道过的含义；从式VI中间体除去Z保护基团。
而且，其中R1＝R2＝H的式I化合物可以通过其中R1和R2构成一条键的相应式I化合物的还原作用加以制备。
本发明的式I化合物赋有抗炎活性，且缺乏抗生活性。
式I化合物的药理学活性已经通过对比已知大环内酯的体外和体内试验进行了评价，这些大环内酯例如红霉素、克拉霉素和罗红霉素，它们赋有抗炎活性和抗生活性。
抗炎活性被评价为对IL-8释放和超氧阴离子释放的体外抑制作用(实施例11)，以及对反复给药后LPS诱导嗜中性白细胞增多的体内抑制作用(实施例12)。
在全部实验中，本发明的化合物作为抗炎剂具有非常强的活性，其抗炎活性等于或大于参照化合物之一。
关于治疗应用，式I化合物可以适合于口服或肠胃外给药的药物剂型使用。
因此，本发明的目的是药物组合物，其中含有治疗学上有效量的式I化合物或其盐，并与药学上可接受的载体混合。
为了更好地阐述本发明，现在给出下列实施例。
实施例1[6-(2-羟基-乙氨基)-己基]-氨基甲酸苄基酯的制备向用冰冷却至约10℃的、如WO96/18633所述制备的(6-羟基-己基)-氨基甲酸苄基酯(25g，99.47mmol)的CH2Cl2(350ml)溶液中先加入KBr(1.18g，9.94mmol)的水(20ml)溶液和TEMPO(0.155g，0.994mmol)，然后在约15-20分钟内、保持温度在10-12℃下，滴加NaHCO3(7.5g，89.28mmol)与NaClO(4.5％水溶液；197ml，125mmol)制成的溶液。
滴加结束后15分钟，分离各相，含水相用CH2Cl2(100ml)萃取一次。收集有机萃取液，用盐水(20％NaCl)洗涤两次，在硫酸钠上干燥。
向所得溶液(约800ml)中加入3分子筛(30g)，然后在冰水冷却下，快速滴加2-氨基乙醇(35.9ml，0.597mol)的乙醇(600ml)溶液。
滴加结束后，混合物在室温下搅拌2小时，然后过滤。
将NaBH4(4.54g，120mmol)分批加入到在氮气氛中搅拌的、用冰水冷却的所得溶液中。
加入结束后，反应混合物在室温下搅拌2小时，然后蒸发溶剂。
用水和乙酸乙酯收集残余物，分离各相，含水相再用乙酸乙酯萃取两次。
收集有机萃取液，用盐水(20％NaCl)洗涤，在硫酸钠上干燥，浓缩，得到油性残余物，有固化的趋势。
该残余物用己烷研制，过滤，用己烷与乙醚的混合物洗涤，得到[6-(2-羟基-乙氨基)-己基]-氨基甲酸苄基酯(26.22g，收率89％)，为白色固体。1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.33-7.25(m，5H，Ar)；5.05(s，2H，COOCH2)；4.96(宽-t，1H，NH)；3.63-3.58(m，2H，*CH2-OH)；3.19-3.09(m，2H，CH2NCO)；2.72-2.67(m，N-*CH2-CH2O)；2.59-2.52(m，4H，OH和CH3)；1.53-1.23(m，8H，4CH2).
实施例26-(苄氧基羰基氨基-己基)-(2-羟基-乙基)-氨基甲酸苄基酯的制备将苄基氯甲酸苄基酯(50％甲苯溶液；42.5ml，0.128mol)的乙酸乙酯(85.5ml)溶液和1N NaOH(128ml，0.128mol)同时滴加到在0-5℃下冷却的、如实施例1所述制备的[6-(2-羟基-乙氨基)-己基]-氨基甲酸苄基酯(31.5g，0.107mol)在水(87ml)、1N NaOH(17ml)与乙酸乙酯(180ml)的混合物中的溶液中，并控制温度和pH(约8)。
滴加结束后，反应混合物在0-5℃下搅拌30分钟，然后撤去冷却，进一步加入1N NaOH(15ml)，使pH再次为8，然后在室温下搅拌过夜。
分离各相，含水相再次用乙酸乙酯萃取。收集有机萃取液，用盐水洗涤，在硫酸钠上干燥，在真空下浓缩，得到油性残余物。
经过色谱纯化(洗脱剂乙酸乙酯∶矿脂60∶40至70∶30)，得到6-(苄氧基羰基氨基-己基)-(2-羟基-乙基)-氨基甲酸苄基酯(42.5g，收率92％)，为一种油。1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.39-7.25(m，10H，Ar)；5.10和5.07(2s，4H，2COOCH2)；3.71(宽信号，2H，*CH2-OH)；3.43-3.01(m，4H，2CH2NCO)；1.57-1.19(m，8H，4CH2).
按类似方式操作，得到下列化合物(2-苄氧基羰基氨基-乙基)-(2-羟基-乙基)-氨基甲酸苄基酯从2-(2-氨基乙氨基)-乙醇开始(收率32％)1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.33-7.28(m，10H，2Ph)；5.06和5.04(2s，4H，2CH2-Ph)；3.73-3.34(宽-m，8H，4CH2).-(2-羟基-乙基)-氨基甲酸苄基酯从如WO96/18633所述制备的2-[2-(苄氨基)-乙氨基]-乙醇开始(收率50％)1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)(很宽的信号)7.42-7.13(m，15H，3Ar)；5.12和5.09(2s，4H，COOCH2*)；4.55(s，2H，N-*CH2-Ph).-氨基甲酸苄基酯从2-(2-氨基乙氧基)-乙醇开始(收率85％)1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.36-7.28(m,5H，Ar)；5.18(宽信号，1H，NH)；5.08(s，2H，Ph-*CHO)；3.74-3.34(m，8H，*CH2-*CH2-O-*CH2-*CH2-OH)；2.13(宽-t，1H，OH).
实施例3甲磺酸2-[苄氧基羰基-(6-苄氧基羰基氨基-己基)-氨基]-乙基酯的制备将三乙胺(8.95ml，64.31mmol)加入到如实施例2所述制备的6-(苄氧基羰基氨基-己基)-(2-羟基-乙基)-氨基甲酸苄基酯(13.78g，32.15mmol)的CH2Cl2(140ml)溶液中。混合物冷却至0-5℃，然后滴加到甲磺酰氯(3.36ml，43.41mmol)的CH2Cl2(20ml)溶液中。
加入结束后，混合物在室温下搅拌60分钟，然后用5％柠檬酸水溶液、盐水(20％NaCl)、5％NaHCO3水溶液、最后再用盐水洗涤。在硫酸钠上干燥并在真空下蒸发后，得到甲磺酸2-[苄氧基羰基-(6-苄氧基羰基氨基-己基)-氨基]-乙基酯(16.37g，收率100％)，为棕色的油。1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.35-7.27(m，10H，Ar)；5.11和5.07(2s，4H，2COOCH2)；4.36-4.19(m，2H，CH2OSO2)；3.57-3.51(m，2H，SO-CH2-*CH2N)；3.32-3.07(m，4H，2CH2N)；2.91和2.85(2s-构象异构体，3H，CH3)；1.50-1.20(m，8H，4CH2).
按类似方式操作，得到下列化合物甲磺酸2-[2-(苄氧基羰基-氨基)-乙氧基]-乙基酯从如实施例2所述制备的[2-(2-羟基-乙氧基)-乙基]-氨基甲酸苄基酯开始(收率98％)1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.36-7.28(m，5H，Ar)；5.16(宽信号，1H，NH)；5.08(s，2H，COOCH2)；4.34-4.30(m，2H，SO3CH2)；3.72-3.67(m，2H，SO3-CH2-*CH2)；3.60-3.34(m，4H，N-*CH2-*CH2)；2.98(s，3H，SO3CH3).
甲磺酸2-[[2-(苄基-苄氧基羰基-氨基)-乙基]-苄氧基羰基-氨基]-乙基酯从如实施例2所述制备的[2-(苄基-苄氧基羰基-氨基)-乙基]-(2-羟基-乙基)-氨基甲酸苄基酯开始(收率72％)1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.40-7.00(m，15H，3Ar)；5.13-5.01(宽信号，4H，2COOCH2)；4.51-3.30(宽-m，10H，4CH2N和CH2SO3)；2.92-2.76(宽信号，3H，CH3).
甲磺酸2-[苄氧基羰基-(2-苄氧基羰基氨基-乙基)-氨基]-乙基酯从如实施例2所述制备的(2-苄氧基羰基氨基-乙基)-(2-羟基-乙基)-氨基甲酸苄基酯开始
(收率100％)1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.35-7.27(m，10H，2Ar)；5.10和5.04(2s，4H，2COOCH2)；4.41-4.15(m，2H，*CH2-MeSO2)；3.63-3.23(m，6H，N-*CH2-*CH2-N-*CH2)；2.90(s-宽，3H，MeSO2).
实施例4红霉素A肟N-氧化物的制备在机械搅拌下、保持温度在20-25℃下，在1小时内将H2O2(72.00g，滴定度34％w/v，0.72mol)的水(780ml)溶液滴加到红霉素A肟(35.00g，0.0467mol)的甲醇(1400ml)溶液中。加入结束后，反应混合物在室温下搅拌24小时。加入更多的H2O2(8ml)后，混合物进一步搅拌6小时。
在约40℃真空下蒸发甲醇，并保持水的体积恒定(约700ml)。
过滤、用水洗涤、干燥后，得到红霉素A肟N-氧化物(36.3g，收率99％)，为白色结晶固体。1H-NMR(200MHz，DMSO-d6)δ(ppm)10.71-10.19(宽信号，2H，移动的H)；5.14-5.08(m，1H，H-13)；4.72(d，1H，JHH＝4.4Hz，H-1″)；4.45(d，1H，JHH＝7.0Hz，H-1′).
实施例53’-脱(二甲氨基)-3’.4’-脱氢-红霉素A肟(化合物1)的制备将如实施例4所述制备的红霉素A肟N-氧化物(30.00g，38.3mmol)的二甲基甲酰胺(235ml)溶液在预温热的油浴(175-180℃)中温热至150℃，在该温度下机械搅拌15-20分钟。
冷却并蒸发二甲基甲酰胺后，用软化水(500ml)收集油性残余物，温热，冷却。将过滤后的固体研制，在40-45℃真空下干燥，得到粗产物(25.5g)。
粗产物首先从乙腈(110ml)中结晶，过滤，用水洗涤，在50℃真空下干燥，得到结晶产物(20g)，再次从甲醇/水＝65/35(400ml)中结晶，过滤，在40-50℃真空下干燥。
如此得到化合物1，为结晶产物(10.3g，收率38.2％)。
然后从结晶母液中回收更多的产物(3.7g)，总收率为51.8％。1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)5.67-5.55(m，2H，*CH＝*CH)；4.44(d，1H，JHH＝7.0Hz，H-1′)；4.33-4.22(m，1H，H-5′)；4.13-4.04(m，1H，H-2′)；3.84-3.73(m，1H，H-8)；3.69(s，1H，H-11).13C-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)171.11(s，C-9)；132.2和126.1(2s，C-3′和C4′).
实施例63’-脱(二甲氨基)-红霉素A肟(化合物2)的制备在室温下，将氧化铂(0.615g)加入到如实施例5所述制备的化合物1(20.00g，28.4mmol)的乙醇(850ml)溶液中(轻微加热后实现完全溶解)。
混合物在Parr设备(1.36atm)中氢化，即时发生吸收。
过滤催化剂并在真空下蒸发溶剂后，白色结晶残余物用矿脂研制，过滤，在50℃真空下干燥，得到化合物2(19.8g，收率99％)。1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)5.05-4.98(m，1H，H-13)；4.94(d，1H，JHH＝4.4Hz，H-1″)；4.23(d，1H，JHH＝7.4Hz，H-1′)；3.44-3.30(m，1H，H-2′)；2.07-1.21(m，2H，H-3′)；1.65-1.45(m，2H，H-4′).13C-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)171.2(s，C-9)；104.7(s，C-1′)；31.8(s，C-3′)；29.5(s，C-4′).
实施例73’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-[苄氧基-羰基-(6-苄氧基-羰基氨基-己基)-氨基]-乙基]-肟](化合物3)的制备在搅拌下、在氮气氛中，将如实施例6所述制备的化合物2(12.51g，17.73mmol)加入到95％叔丁基钾(2.45g，19.48mmol)的无水THF(120ml)溶液中，同时保持温度在约25℃。
反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后加入18-冠-6醚(4.69g，17.73mmol)和如实施例3所述制备的甲磺酸2-[苄氧基羰基-(6-苄氧基羰基氨基-己基)-氨基]-乙基酯(8.98g，17.73mmo1)的无水THF(60m1)溶液，在室温下搅拌过夜。
在真空下蒸发溶剂后，将残余物溶于乙酸乙酯与盐水(20％NaCl)的混合物，分离各相。含水相再次用乙酸乙酯萃取。将收集并干燥后的有机萃取液在真空下浓缩，得到粗产物(23.4g)。
经过色谱纯化(洗脱剂CH2Cl2∶CH3OH＝97∶3)，得到仍然略微不纯的化合物3(15.42g)，在使用时无需进一步纯化。1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.35-7.28(m，10H，Ar)；5.14-5.06(m，1H，H-13)；5.11和5.07(2s，4H，2COOCH2)；4.84(d，1H，JHH＝4.4Hz，H-1″)；4.28(d，1H，JHH＝7.4Hz，H-1′).
按类似方式进行操作，得到下列化合物3’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-[2-(苄氧基羰基氨基)-乙氧基]-乙基]-肟](化合物4)从甲磺酸2-[2-(苄氧基羰基-氨基)-乙氧基]-乙基酯开始(收率62％)1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.34-7.27(m，5H，Ar)；6.09(宽信号|，1H，NH)；5.13-5.05(m，1H，H-13)；5.06(s，2H，COOCH2)；4.79(d，1H，JHH＝4.4Hz，H-1″)；4.26 (d，1H，JHH＝7.4Hz，H-1′).
3’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-甲氧基-乙氧基]-甲基]-肟](化合物5)从甲氧基-乙氧基-甲基氯开始(收率32.5％)1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)5.21-5.12(m，2H，O-CH2-O)；5.12-5.05(m，1H，H-13)；4.85(d，1H，JHH＝5.4Hz，H-1″)；4.39(d，1H，JHH＝7.5Hz，H-1′)；3.40(s，3H，CH2-O-*CH3)；3.27(s，3H，H-3″).13C-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)172.5(s，C-9)；97.44(s，NO-C-O)；32.12(s，C-3′)；29.84(s，C-4′).
3’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-[[2-(苄基-苄氧基羰基-氨基)-乙基]-苄氧基羰基-氨基]-乙基]-肟](化合物12)从甲磺酸2-[[2-(苄基-苄氧基羰基-氨基)-乙基]-苄氧基羰基-氨基]-乙基酯开始1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.40-7.16(宽m|，15H，3Ph)；5.17-5.00(m，5H，2*CH2-Ph和H-13).
3’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-[[2-(苄氧基羰基-氨基)-乙基]-苄氧基羰基-氨基]-乙基]-肟](化合物13)从甲磺酸2-[苄氧基羰基-(2-苄氧基羰基氨基-乙基)-氨基]-乙基酯开始(收率42％)1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.38-7.25(m，10H，2Ph)；5.11和5.05(2s，4H，2COOCH2)；5.14-5.00(m，1H，H-13)；4.89-4.79(宽-m，1H，H1″)；2.26(d，1H，JHH＝7.4Hz，H1′).
实施例83’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-[(6-氨基-己基)-氨基]-乙基]-肟](化合物6)的制备将10％Pd/C(1.6g)加入到如实施例7所述得到的化合物3(15.42g，13.8mmol)的乙醇(160ml)溶液中。
混合物在Parr设备(1.02atm)中氢化。2小时后，过滤催化剂，蒸发溶剂。
残余物经过快速色谱纯化(洗脱剂CH2Cl2∶CH3OH∶NH3＝85∶15∶1.5然后80∶20∶2)，得到化合物6(8.48g)，为无定形白色固体。1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)5.07-5.00(m，1H，H-13)；4.79(d，1H，JHH＝4.4Hz，H-1″)；4.21(d，1H，JHH＝7.4Hz，H-1′).13C-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)171.8(s，C-9)；71.6(s，＝N-O-C)；49.43和49.0(2s，＝N-O-C-*C-N-*C)；41.1(s，C-NH2).
按类似方式进行操作，得到下列化合物3’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙基]-肟](化合物7)从化合物4开始(收率85％)1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)5.12-5.05(m，1H，H-13)；4.83(d，1H，JHH＝4.4Hz，H-1″)；4.26(d，1H，JHH＝7.5Hz，H-1′).
3’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-[(2-苄氨基-乙基)-氨基]-乙基]-肟](化合物14)
从化合物12开始(收率48％)1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.32-7.17(m，5H，Ph)；5.08-5.00(m，1H，H-13)；4.74(d，1H，JHH＝4.6Hz，H-1″)；4.22(d，1H，JHH＝7.4Hz，H-1′)；AB系统Va＝3.80，Vb＝3.76，Jab＝13.7Hz，*CH2Ph.13C-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)171.3(s，C-9)；105.0(s，C-1′)；32.2(s，C-3′)；29.8(s，C-4′).
3’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-[(2-氨基-乙基)-氨基]-乙基]-肟](化合物15)从化合物13开始(收率70％)1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)5.08-5.00(m，1H，H-13)；4.76(d，1H，JHH＝4.6Hz，H-1″)；4.23(d，1H，JHH＝7.4Hz，H-1′).
实施例93’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-[6-[(噻唑-2-基甲基)-氨基]-己基-氨基]-乙基]-肟](化合物8)的制备将如实施例8所述制备的化合物6(3g，3.53mmol)、97％2-噻唑甲醛(0.412g，3.53mmol)与分子筛(3，6.75g)的乙醇(60ml)悬液搅拌3小时。
在硅藻土上过滤分子筛后，加入10％Pd/C(0.3g)，混合物在Parr氢化器(1.02atm)中氢化。20小时后过滤催化剂，蒸发溶剂。
残余物经过色谱纯化(洗脱剂CHCl3∶矿脂∶三乙胺＝90∶10∶10)，得到化合物8(1.66g，收率49.8％)，为无定形固体。1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.66(d，1H，JHH＝3.2Hz，CHN)；7.22(d，1H，CHS)；5.08-5.02(m，1H，H-13)；4.78(d，1H，JHH＝4.4Hz，H-1″)；4.21(d，1H，JHH＝7.4Hz，H-1′)；4.07(s，2H，*CH2-thiaz.).13C-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)172.0(s，S-C＝N)；171.7(s，C-8)；142.4(s，CHN)；118.7(s，CHS)；104.9(s，C-1′)；96.3(s，C-1″)；71.7(s，N-O-C).
按类似方式进行操作，得到下列化合物
3’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-[6-(苄氨基)-己氨基]-乙基]-肟](化合物9)从化合物6和苯甲醛开始1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.27-7.17(m，5H，Ar)；5.07-5.01(m，1H，H-13)；4.75(d，1H，JHH＝4.4Hz，H-1″)；4.19(d，1H，JHH＝7.4Hz，H-1′)；3.73(s，2H，*CH2-Ph).13C-NMR(200MHz，CDC13)δ(ppm)171.8(s，C-9)；104.9(s，C-1′)；96.3(s，C-1″)；71.8(s，＝N-O-C)；53.8(s，N-*C-Ph)；49.7，49.2和49.1(3s，3N-C).
3’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-[2-[(噻唑-2-基甲基)-氨基]-乙氧基]-乙基]-肟](化合物10)从化合物7和2-噻唑甲醛开始1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.64(d，1H，JHH＝3.2Hz，CHN)；7.19(d，1H，CHS)；5.10-5.02(m，1H，H-13)；4.78(d，1H，JHH＝4.4Hz，H-1″)；4.21(d，1H，JHH＝7.4Hz，H-1′)；4.13(s，2H，*CH2-thiaz.).13C-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)172.7(s，SC＝N)；171.5(s，C-9)；142.4(s，CHN′)；118.6(s，CHS)；104.7(s，C-1′)；96.4(s，C-1″)；50.7(s，N-*C-thiaz.).
3’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-[2-(苄氨基)-乙氧基]-乙基]-肟](化合物11)从化合物7和苯甲醛开始1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.33-7.10(m，5H，Ar)；5.12-5.04(m，1H，H-13)；4.78(d，1H，JHH＝4.4Hz，H-1″)；4.72(d，1H，JHH＝7.4Hz，H-1′)；3.80(s，2H，NCH2).13C-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)171.5(s，C-9)；104.8(s，C-1′)；96.5(s，C-1″)；69.4，70.8和72.4(3s，3OCH2)；53.6(s，*C-Ph)；48.2(s，O-C-*C-N).
3’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-[2-[(噻唑-2-基甲基)-氨基]-乙基-氨基]-乙基]-肟](化合物16)从化合物15和2-噻唑甲醛开始1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.62(d，1H，JHH＝3.0Hz，N-*CH＝CH)；7.18(d，1H，S-*CH＝CH)；4.18(d，1H，JHH＝7.4Hz，H1′).13C-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)172.6(s，SC＝N)；171.3(s，C-9)；142.4(s，CHN)；118.6(s，CHS)；104.9(s，C-1′)；96.4(s，C-1″)；32.17(s，C-3′)；29.8(s，C-4′).
3’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-[6-[(2-苯基-1H-咪唑-4-基甲基)-氨基]-己基-氨基]-乙基]-肟](化合物17)从化合物6和2-苯基-1H-咪唑-4-甲醛开始1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.86-7.21(m，5H，Ar)；6.91(s，1H，CH-Imid.)；5.11-5.02(m，1H，H13)；4.76(d，1H，JHH＝4.2Hz，H1″)；4.21(d，1H，JHH＝7.4Hz，H1′)；3.76(s，2H，*CH2-Imid.)；3.23(s，3H，OMe).13C-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)171.7(s，C-9)；104.8(s，C-1′)；96.3(s，C-1″)；32.1(s，C-3′)；29.9(s，C-4′).
3’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-[6-[(1-甲基-2-苯基-1H-咪唑-4-基甲基)-氨基]-己基-氨基]-乙基]-肟](化合物18)从化合物6和1-甲基-2-苯基-1H-咪唑-4-甲醛开始1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.57-7.31(m，5H，Ar)；6.87(s，1H，CH-Imid.)；5.09-5.00(m，1H，H13)；4.76(d，1H，JHH＝4.2Hz，H1″)；4.20(d，1H，JHH＝7.4Hz，H1′)；3.71(s，2H，*CH2-Imid.)；3.62(s，3H，NMe)；3.21(s，3H，OMe).13C-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)171.8(s，C-9)；104.9(s，C-1′)；96.3(s，C-1″)；32.1(s，C-3′)；29.7(s，C-4′).
实施例103’-脱(二甲氨基)-红霉素A(E)-9-[O-[2-[2-[(噻唑-2-基甲_基)-(甲基)-氨基]-乙氧基]-乙基]-肟](化合物19)的制备将化合物10(0.23g，0.258mmol)、甲醛(37％w/v；42μl，0.516mmol)、10％钯/碳(25mg)和乙醇与水的4∶1混合物(10ml)装入1.02atm Parr设备中。2小时和3小时后进一步加入甲醛(42μl+21μl)。反应结束时(共6小时)，滤出催化剂，蒸发溶剂。所得残余物经过快速色谱纯化(洗脱剂CH2Cl2∶CH3OH＝95∶5)，得到化合物19，为无定形固体。1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)7.64(d，1H，JHH＝3.6Hz，N-*CH＝CH)；7.21(d，1H，S-*CH＝CH)；5.10-5.00(m，1H，H13)；4.80(d，1H，JHH＝4.6Ha，H1″)；4.23(d，1H，JHH＝7.4Hz，H1′)；3.94(s，2H，*CH2-Thiaz.).13C-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)172.0(s，SC＝N)；171.8(s，C-9)；142.2(s，CHN)；119.3(s，CHS)；104.9(s，C-1′)；96.4(s，C-1″)；32.2(s，C-3′)；29.9(s，C-4′).
实施例11体外药理学活性A)白介素8(IL-8)的释放从ATTC(Rockville，Md)得到人内皮无限增殖化细胞系(ECV304)，在37℃下、在含有5％CO2的湿润气氛中，使其生长在培养基199，mod.Earle’s盐(GIBCO，Life Technologies，Grand Island，N.Y.)中，其中补充有20％胎牛血清(GIBCO)、100U/ml青霉素和100□g/ml链霉素(SIGMA，St.Louis，MO)。
在96孔平板上培养细胞，直到获得铺满的单层。
将所要评价的化合物溶于DMSO，浓度为10-2M，用培养基稀释。
试验前，将化合物与细胞预培养1小时。
加入0.66□g/ml脂多糖B(大肠埃希氏菌055B5，Difco，Detroit，Mi)，最终体积为200□1，以诱导IL-8的释放。
一夜后，收集上清液，用于IL-8试验。
用ELISA试剂盒(Amersham，UK)测量关于培养物上清液中IL-8的特异性免疫反应性。
结果以最高可获得的抑制作用(功效)表示，可能的话，以获得50％该作用时的浓度(IC50)表示。
B)超氧阴离子的释放从健康志愿者静脉血中通过Ficoll-Hypaque离心分离嗜中性白细胞，继之以6％葡聚糖的沉积作用和红细胞的渗透溶胞作用。然后洗涤嗜中性白细胞，将其再次悬浮在由RPMI-1640制成的培养基中，其中补充有5％胎牛血清和1.34mmol/l EDTA二钠二水合物。将细胞在4℃下保持24小时，试验前，将悬液离心，再次悬浮在HBSS(Hanks平衡盐溶液)中。用台盼蓝和土耳其蓝染色，以验证嗜中性白细胞制剂的活力和纯度。
利用Lucigenin(双-N-甲基吖啶鎓硝酸酯)-加强的化学发光法测量超氧阴离子。
在37℃下，将嗜中性白细胞(2×106细胞/ml)在900□l含有和不含供试化合物的HBSS(读数系统)中预培养30分钟。
在向读数系统中加入浓度为1×10-5M的Lucigenin(2mmol/l)与N-甲酰基-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸(FLMP)的100□lHBSS溶液作为刺激剂之后，用Lumac/3M生物计数器测量超氧阴离子的产生。
将FLMP溶于DMSO(1×10-2M)，进而稀释在HBSS中。将供试化合物溶于DMSO，浓度为10-2M。从该溶液制备更低浓度的DMSO溶液，进行试验。读数系统内所存在的DMSO的量低于1％。
将关于每种供试浓度的化合物在峰处所得发光度值转化为相对参照的抑制百分率。
从所得“剂量-反应”曲线计算能够抑制50％超氧阴离子产生的浓度(IC50)。
下表报告了代表全部种类的一些式I化合物与红霉素、克拉霉素和罗红霉素相比所得到的结果。
表1IL-8释放的体外抑制作用，以效能(IC50)和功效(％)表示，和超氧阴离子释放的体外抑制作用(IC50)
实施例12体内药理学活性●动物使用体重在200与300g之间的雄性Sprague-Dawley大鼠。
用在实验中的大鼠没有明显感染。在标准条件下供养动物7天，然后处死。
●内毒素给药将LPS(大肠埃希氏菌脂多糖)(内毒素；055B5血清型；SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)溶于无菌盐水溶液，通过腹膜内注射(i.p.)进行给药，剂量为6mg/kg(1ml/kg)。类似地，将盐水溶液和/或载体(盐水溶液+0.5％吐温20)注射给对照动物。
●化合物给药(预防性处理)将每种化合物通过i.p.注射进行给药，一天两次，长达6天，第7天是LPS给药前1小时和LPS给药后5小时。化合物是用0.5％吐温20悬浮在盐水溶液中的。
●支气管肺泡灌洗LPS注射24小时后，将大鼠用过量的戊巴比妥(100mg/kg i.p.)处死。向气管插入套管，37℃下滴注两次5ml PBS(磷酸盐缓冲盐水)试样洗涤肺部，立即除去流体。再次注射流体，关于每份试样总共重复三次该操作。
●细胞计数和分类将200μl BALF(支气管肺泡灌洗流体)稀释在1ml冷水和19mlIsoton中。利用Contraves自溶仪800计数两次细胞总数。当总数低于2000时，将BALF以800rpm离心10分钟，目的是分离细胞与上清液。弃去上清液，将细胞再次悬浮在少量PBS中。关于细胞学评价，利用Shandon Cytospinl离心机将50μl含有再悬浮细胞的溶液以1300rpm离心1分钟。将玻片固定在丙酮中，用DiffQuick染色。通过随机计数200个细胞，在每只玻片上进行细胞的分类计数；按照形态学标准，将细胞类型分为嗜中性白细胞、嗜曙红细胞和单核细胞。下表报告了作为全部种类代表的一些式I化合物所得结果。
表2LPS反复给药后诱导嗜中性白细胞增多的体内抑制作用
权利要求
1.下式化合物 其中R是氢或甲基；R1和R2都是氢，或者它们一起构成一条键；R3是氢、直链或支链C1-C5烷基、苄基，可选地被一个或多个取代基取代，取代基选自硝基、羟基、羧基、氨基、直链或支链C1-C5烷基、C1-C4烷氧基羰基、氨基羰基或氰基，或者是下式的链 其中A是氢或苯基，可选地被一个或两个取代基取代，取代基选自硝基、羟基、羧基、氨基、直链或支链C1-C5烷基、C1-C4烷氧基羰基、氨基羰基或氰基，或者是饱和或不饱和的5或6元杂环，它含有1至3个选自氮、氧和硫的杂原子，可选地被一个或两个取代基取代，取代基选自C1-C5烷基、苯基、羟基、氧代(＝O)、硝基、C1-C4烷氧基羰基、氨基羰基、单或二C1-C4烷基氨基羰基、C1-C4烷基羰基；X和Y相同或不同地是O、S、SO、SO2或NR4，其中R4是氢、直链或支链C1-C5烷基、C1-C5烷氧基羰基、苄氧基羰基；r是1至6的整数；m是1至8的整数；n是0至2的整数；和它们的药学上可接受的盐；化合物3’-脱二甲氨基-3’，4’-脱氢红霉素A肟和3’-脱二甲氨基-3’，4’-脱氢红霉素A 9-O-甲基肟除外。
2.根据权利要求1的化合物，其中R、R1和R2是氢。
3.根据权利要求2的化合物，其中R3是下式的链 其中X、Y、A、r、m和n具有权利要求1所述含义。
4.根据权利要求2的化合物，其中R3是下式的链 其中r是2，m是2或6，n是1，Y是NR4，X是O或NR4，R4是氢，A是苯基或噻唑基。
5.化合物3’-脱二甲氨基-3’，4’-脱氢红霉素A肟和3’-脱二甲氨基-3’，4’-脱氢红霉素A 9-O-甲基肟，用作抗炎剂。
6.药物组合物，含有药学上有效量的根据权利要求1的化合物，并与药学上可接受的载体混合。
全文摘要
描述了赋有抗炎活性的式(I)的3’－脱二甲氨基－9－羟亚氨基大环内酯和它们的药物用途。
文档编号A61P29/00GK1336932SQ00802767
公开日2002年2月20日 申请日期2000年1月12日 优先权日1999年1月15日
发明者F·派拉希尼, D·伯塔, S·罗马格纳诺, E·莫里吉, L·普拉戴拉 申请人:萨宝集团公司