用于生成分化祖细胞和谱系缺陷型胚胎干细胞的方法

专利名称：用于生成分化祖细胞和谱系缺陷型胚胎干细胞的方法
背景技术：
发明领域本发明涉及使桑椹胚细胞或胚泡内细胞分化的方法。这些细胞可用于细胞疗法和用于生成等基因、同种异体、和/或异种移植用的细胞和器官。本发明还涉及生成谱系缺陷型胚胎干细胞，它们不会分化成特定分化谱系，诸如中胚层、内胚层、或外胚层。
相关技术的描述用于在体外由早期前植入小鼠胚胎衍生胚胎干(ES)细胞系的方法是众所周知的(参阅例如Evans等人，Nature，29154-156，1981；Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，787634-7638，1981)。若存在成纤维细胞饲养层(Evans等人，同上)或分化抑制源(Smith等人，Dev.Biol.，1211-9，1987)，则能够将ES细胞以未分化状态进行传代。
先前已经报导了ES细胞具有许多应用。例如，已经报导了ES细胞可作为分化的体外模型，尤其是用于研究涉及调控早期发育的基因。在导入前植入小鼠胚胎后，小鼠ES细胞能够引起种系嵌合体，由此证明它们的多能性(Bradley等人，Nature，309255-256，1984)。
考虑到它们将它们的基因组转移给下一代的能力，通过使用含或不含期望遗传修饰的ES细胞，ES细胞具有家畜动物种系操作的潜在效用。此外，在家畜动物(如有蹄类)的情况中，来自像前植入家畜胚胎的细胞核支持去核卵母细胞发育至分娩期(Smith等人，Biol.Reprod.，401027-1035，1989；Keefer等人，Biol.Reprod.，50935-939，1994)。这与来自超过八细胞阶段的小鼠胚胎的细胞核相反，据报导后者在移植后不支持去核卵母细胞的发育(Cheong等人，Biol.Reprod.，48958，1993)。因此，来自家畜动物的ES细胞非常有价值，因为它们可以为核移植流程提供全能供体细胞核的潜在来源(可以经过或未经过遗传修饰)。
有些研究小组已经报导了据说多能的胚性细胞系的分离。例如，Notarianni等人，J.Reprod.Fert.Suppl.，43255-260，1991报导了由猪和绵羊胚泡建立据说稳定且多能的细胞系，它们展示的一些形态学和生长特征与通过免疫手术由绵羊胚泡分离的内细胞团的原代培养细胞相似。同样，Notarianni等人，J.Reprod.Fert.Suppl.，4151-56，1990公开了来自猪胚泡的推定多能的胚细胞系在培养中的维持和分化。Gerfen等人，Anim.Biotech.，6(1)1-14，1995公开了由猪胚泡分离胚细胞系。在小鼠胚成纤维细胞饲养层中可稳定维持这些细胞而不使用条件培养基，而且据报导在培养过程中分化成几种不同的细胞类型。
此外，Saito等人，Roux’s Arch.Dev.Biol.，201134-141，1992报导了存活3代但在第4代后丧失的培养牛胚胎干细胞样细胞系。Handyside等人，Roux’s Arch.Dev.Biol.，196185-190，1987公开了通过免疫手术分离的绵羊胚胎内细胞团在能够分离由小鼠内细胞团衍生的小鼠ES细胞系的条件下培养。Handyside等人报导了在这种条件下，绵羊内细胞团贴壁、扩展、并发展ES细胞样细胞和内胚层样细胞两种区域，但是在延长培养后只有内胚层样细胞是明显的。
最近，Cherny等人，Theriogenology，41175，1994报导了在长期培养中维持的据说多能的牛原始生殖细胞衍生细胞系。这些细胞在培养大约7天后生成ES样集落，碱性磷酸酶(AP)染色阳性，展示形成胚状体的能力，并自发分化成至少两种不同的细胞类型。据报导这些细胞还表达转录因子OCT4、OCT6、和HES1的mRNA，这是认为唯独由ES细胞表达的同源异型框基因模式。
同样在最近，Campbell等人，Nature，38064-68，1996报导了在对培养胚盘(ED)细胞(来自在促进在小鼠中分离ES细胞系的条件下培养9天的绵羊胚胎)进行核移植之后生成了活的小羊。作者得出结论，来自第9天的绵羊胚胎的ED细胞通过核移植实现全能，而且全能性在培养中得到维持。
Van Stekelenburg-Hamers等人，Mol.Reprod.Dev，40444-454，1995报导了来自牛胚泡内细胞团细胞的据说永久的细胞系的分离和鉴定。作者在不同条件下由第8或9天的牛胚泡分离并培养内细胞团，以确定哪种饲养细胞和培养培养基对支持牛内细胞团细胞的贴壁和扩展最有效。他们得出结论，培养内细胞团细胞的贴壁和扩展通过STO(小鼠成纤维细胞)饲养细胞(代替牛子宫上皮细胞)的使用和通过在培养培养基中添加经木炭吸收过的血清(而非普通血清)而得到增强。然而，Van Stekelenburg等人报导了他们的细胞系更像上皮细胞而非多能内细胞团细胞。
Smith等人，WO94/24274，发表于1994年10月27日；Evans等人，WO90/03432，发表于1990年4月5日；和Wheeler等人，WO94/26889，发表于1994年11月24日，报导了据说可用于获得转基因动物的动物干细胞的分离、选择、和增殖。Evans等人还报导了由猪和牛物种衍生的据说多能的胚胎干细胞，据说可用于生成转基因动物。另外，Wheeler等人，WO94/26884，发表于1994年11月24日，公开了据说可用于生成嵌合和转基因有蹄类的胚胎干细胞。
因而，根据上文，例如由于ES细胞系在生成克隆或转基因胚胎中和在核移植中的潜在应用，显然许多小组已经试图生成ES细胞系。
还已经有报导了将有蹄类内细胞团(ICM)细胞用于核移植的应用。例如，Collas等人，Mol.Reprod.Dev.，38264-267，1994公开了将经裂解供体细胞显微注射到去核成熟卵母细胞中而进行的牛ICM核移植。Collas等人公开了将胚胎在体外培养7天而生成15个胚泡，在将其移植到牛受体中后导致4次怀孕和2次出生。同样，Keefer等人，Biol.Reprod.，50935-939，1994公开了牛ICM细胞在核移植流程中作为供体细胞核用于生成胚泡的应用，在将胚泡移植到牛受体中后生成数个活的子代。此外，Sims等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906143-6147，1993公开了将细胞核由短期体外培养的牛ICM细胞移植到去核成熟卵母细胞中而生成小牛。
还已经报导了在对培养胚盘细胞进行核移植后生成活的小羊(Campbell等人，Nature，38064-68，1996)。还有，已经报导了牛多能胚性细胞在核移植和生成嵌合胎儿中的应用(Stice等人，Biol.Reprod.，54100-110，1996；Collas等人，Mol.Reprod.Dev.，38264-267，1994)。Collas等人证明了颗粒细胞(成熟细胞)可用于牛克隆流程以生成胚胎。然而，没有证明发育超过了早期胚胎阶段(胚泡阶段)。同样，颗粒细胞不容易培养，而且只能由雌兽获得。Collas等人没有尝试在培养物中增殖颗粒细胞或者遗传修饰那些细胞。
Thomson，美国专利号5,843,780，1998年12月1日颁发，报导了灵长类胚胎干细胞的纯化。据报导，在这些细胞中，细胞表面标记SSEA-1呈阴性，细胞表面标记SSEA-3、SSEA-4、TRA-I-60、TRA-I-81、和碱性磷酸酶呈阳性，而且能够分化成由所有3种胚胎胚层(内胚层、中胚层、和外胚层)衍生的所有组织。Thomson等人，Science，2821145-1147，1998描述了由人胚泡衍生的多能胚胎干细胞系。
另外，Stice等人，美国专利号5,905,042，颁布于1999年5月18日，描述了由有蹄类衍生的培养内细胞团细胞和细胞系。这些培养内细胞团细胞在长期培养期间，具有与未分化、发育中胚胎的内细胞团相似的形态学，而且表达与其相同或基本相似的细胞标记。
胚胎干细胞的潜在应用是将那些细胞作为用于生成用于细胞疗法和用于生成移植用的组织和器官的分化细胞的来源。然而，尚没有稳定的胚胎干细胞系和用于将那些细胞扩增成分化细胞/组织/器官的可靠方法。因此，不管文献中先前已经报导了什么，仍然需要用于细胞疗法和用于生成移植用的组织和器官的改进细胞来源。
发明目的和概述本发明的一个目的是提供用于生成哺乳动物细胞的新的且改进的方法，所述细胞可作为用于细胞疗法和用于生成移植用的组织和器官的细胞来源。
本发明的一个更具体目的是提供用于诱导内细胞团细胞分化成祖细胞的新方法，所述祖细胞可用于细胞疗法或用于生成移植用的组织和器官。
本发明的一个目的是提供用于生成经遗传工程改造的哺乳动物祖细胞的改进方法，所述祖细胞可作为用于细胞疗法和用于生成移植用的组织和器官的细胞的来源。
本发明的一个更具体目的是提供用于诱导经遗传工程改造的内细胞团细胞分化成祖细胞的方法，所述祖细胞可用于细胞疗法或用于生成移植用的组织和器官，其中在经遗传工程改造的内细胞团细胞中插入、消除、或修饰了期望基因。
本发明的一个目的是提供用于由经遗传工程改造的内细胞团衍生祖细胞并将经遗传工程改造的细胞作为用于细胞疗法和用于生成移植用的组织和器官的细胞来源的方法。
本发明的另一个目的是提供用于生成分化祖细胞的新方法，包括使用分化细胞作为细胞核供体用于形成核移植(NT)单位，由核移植单位生成桑椹胚或胚泡，并诱导桑椹胚的细胞或胚泡的内细胞团细胞分化成祖细胞，所述祖细胞可作为用于细胞疗法和用于生成移植用的组织和器官的细胞来源。
本发明的另一个目的是提供如下生成的分化祖细胞使用分化的细胞作为细胞核供体用于形成核移植单位，由核移植单位生成桑椹胚或胚泡，并诱导桑椹胚的细胞或胚泡的内细胞团细胞分化成祖细胞。
本发明的另一个目的是提供如下生成的分化人祖细胞使用分化的人细胞作为细胞核供体用于形成核移植单位，由核移植单位生成桑椹胚或胚泡，并诱导桑椹胚的细胞或胚泡的内细胞团细胞分化成祖细胞。
本发明的另一个目的是培养桑椹胚细胞或内细胞团细胞，从而预防胚胎干细胞的生长同时促进分化祖细胞的生长。
本发明的另一个目的是将这些分化祖细胞用于治疗或诊断。
本发明的一个具体目的是将这些分化祖细胞(包括分化的人和有蹄类祖细胞)用于其中细胞、组织、或器官移植在治疗或诊断上有益的任何疾病的治疗或诊断。分化祖细胞可用于相同物种或不同物种。
本发明的另一个目的是将由NT胚胎衍生的细胞(包括人和有蹄类细胞)用于其中细胞、组织、或器官移植在治疗或诊断上有益的任何疾病的治疗或诊断。组织可用于相同物种或不同物种。
本发明的另一个具体目的是将依照本发明在体外生成的分化细胞用于例如细胞分化研究和检验目的(如用于药物研究)。
本发明的另一个目的是提供移植疗法的改进方法，包括使用由依照本发明生成的分化细胞生成的等基因或同源细胞、组织、或器官。这些疗法包括例如治疗下列疾病和损伤帕金森氏病、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、ALS、脊髓损伤、多发性硬化症、肌肉营养不良症、糖尿病、肝病、心脏病、软骨代换(cartilage replacement)、烧伤、血管疾病、泌尿道疾病，以及用于治疗免疫缺陷、骨髓移植、癌症、其它疾病。
本发明的另一个目的是将依照本发明生成的转基因或经遗传工程改造的分化细胞用于基因疗法，特别是用于治疗和/或预防上文确定的疾病和损伤。
本发明的另一个目的是将依照本发明生成的分化细胞或依照本发明生成的转基因或经遗传工程改造的分化细胞作为核移植的细胞核供体。
因而，一方面，本发明提供了用于生成分化祖细胞的方法，包括(I)获得桑椹胚的细胞或胚泡的内细胞团细胞；并(II)诱导桑椹胚细胞或内细胞团细胞分化以产生分化祖细胞。
分化祖细胞可用于衍生可有利的用于细胞、组织、和/或器官移植领域的细胞、组织、和/或器官。
另一方面，本发明提供了用于生成遗传改变的分化祖细胞的方法，由此在用于生成核移植单位的细胞中插入、消除、或修饰期望基因，以用于生成桑椹胚获得桑椹胚细胞或用于生成胚泡获得内细胞团细胞。
还有一个方面，本发明提供了用于生成谱系缺陷型人胚胎干细胞的方法，包括(I)遗传修饰人体细胞，使得所述体细胞不能分化成预先确定的细胞谱系；(II)使用经遗传修饰的人体细胞或细胞核作为细胞核供体，生成核移植单位；(III)激活产生的核移植单位；(IV)培养所述激活的核移植单位直至超过二细胞发育阶段；并(V)在适合于形成谱系缺陷型人胚胎干细胞的条件下，培养由所述培养的核移植单位获得的细胞，所述干细胞不能分化成特定分化谱系，诸如至少一种胚胎胚层。
借助本发明的上述和其它目的以及将在下文中变得清晰的优势、和特征，通过参考下文中本发明优选实施方案的详细描述和所附权利要求，可以更清除的理解本发明的本质。
优选实施方案的详述本发明提供了用于生成分化祖细胞的改进流程，所述祖细胞可用于例如细胞疗法或者作为提供移植用的组织和器官的细胞来源。更具体的说，诱导桑椹胚衍生细胞或由胚泡衍生的内细胞团细胞分化成分化祖细胞，并将那些分化细胞用于细胞疗法或作为提供移植用的组织和器官的细胞来源。
过去通过长期培养内细胞团细胞来生成胚胎干细胞。随后对胚胎干细胞进行培养、遗传修饰、和诱导分化，从而生成用于产生转基因动物的细胞或用于治疗的细胞。通过本发明规避了胚胎干细胞的生成，即诱导桑椹胚衍生细胞或内细胞团细胞直接分化成分化祖细胞，然后将分化祖细胞用于细胞疗法和用于生成移植用的组织和器官。如果需要，可以在进行核移植以生成桑椹胚或胚泡之前，将遗传修饰导入体细胞例如。因而，本发明的分化祖细胞不是多能的，而是本质上是组织特异干细胞。分化祖细胞可生成来自所有3种胚胎胚层(即内胚层、中胚层、和外胚层)的细胞。例如，分化祖细胞可分化成骨、软骨、平滑肌、横纹肌、和造血细胞(中胚层)；肝、原始消化管、和呼吸道上皮(内胚层)；或神经元、神经胶质细胞、毛囊、和牙蕾(外胚层)。
此外，对于本发明的分化祖细胞，不必需是永生的，或者表达在胚胎干细胞上发现的细胞表面标记，诸如灵长类胚胎干细胞的特征性细胞表面标记SSEA-3、SSEA-4、TRA-I-60、TRA-I-81、碱性磷酸酶活性呈阳性，而SSEA-1呈阴性。此外，本发明的分化祖细胞不同于胚状体，即胚状体衍生自胚胎干细胞，而本发明的分化干细胞衍生自桑椹胚衍生细胞或内细胞团细胞。
优选的是，本发明的分化祖细胞是通过在不存在未分化胚胎干细胞培养物的情况中培养桑椹胚衍生细胞或内细胞团细胞而生成的。可以在存在分化诱导剂的情况中培养桑椹胚衍生细胞或内细胞团细胞，或者将能够预防胚胎干细胞生长的遗传修饰导入细胞，由此预防未分化胚胎干细胞的生长。
任何胚泡都可以作为内细胞团来源，包括通过体外受精生成的胚泡和由核移植单位衍生的胚泡。对于通过核移植单位来生成胚泡的方法，参阅授予Stice等人的美国专利号5,945,577，将它的内容收入本文作为参考。
胚泡可以来自任何哺乳动物物种，包括人。当胚泡衍生自核移植单位时，核移植单位可以是“相同物种”移植，如将细胞核由人分化细胞移植到人去核卵母细胞中，或“不同物种”移植，如将细胞核由人分化细胞移植到牛去核卵母细胞中。对于通过不同物种移植来生成核移植单位，参阅例如WO98/07841，将它的内容收入本文作为参考。
来自分化细胞或胚性细胞的细胞核都可用于生成核移植单位。分化哺乳动物细胞指那些发育经过早期胚胎阶段的细胞。更具体的说，分化细胞指那些来自至少经过胚盘阶段(牛胚胎发生第10天)的细胞。
用于由胚泡分离内细胞团细胞的方法对于本领域熟练技术人员而言是众所周知的。参阅例如授予Stice等人的美国专利号5,905,042和授予Thomson的美国专利号5,843,780，将它们的内容收入本文作为参考。依照本发明，可以使用来自早期胚泡阶段的内细胞团细胞，或者可以使用来自胚泡发育晚期的部分分化内细胞团细胞。
在缺乏或存在细胞因子、生长因子、胞外基质成份、和其它因子的情况中，通过适当方法，诱导分离内细胞团细胞的分化。例如，可以在平坦、粘性环境中(液态)或者在三维粘性环境中(如1％胶原凝胶)中诱导内细胞团细胞的分化。微重力环境也可用于诱导内细胞团细胞的分化(Ingram等人，In Vitro Cell Dev Biol Anim，33(6)459-466，1997)。用于诱导内细胞团细胞分化的另一种方法是通过在免疫缺陷的小鼠(Thomson等人，Science，282(5391)1145-1147，1998)或其它动物中生成畸胎瘤。也可以通过将内细胞团细胞包裹并使之在合适宿主中形成畸胎瘤来诱导分化。例如，可以将人内细胞团细胞包裹，并置于与衍生内细胞团细胞相同(等基因)或不同的人(异源)体内。目前有许多系统能够通过合成的选择性通透膜将细胞从身体的免疫系统中分离出来。这种膜允许血液或血浆与包裹细胞之间营养、氧气、和生物治疗物质的自由交换。这些系统还可根据膜和基质支持物的化学特征来调控抗原、细胞因子、和其它免疫学物质的双向扩散(Lanza等人，Nat Biotechnol，14(9)1107-1111，1996)。对于涉及在动物或人体中植入内细胞团的系统，可以在单个动物或人体中植入个别以及多个内细胞团。
优选的是，使用筛选测试来检测可诱导桑椹胚衍生细胞或内细胞团细胞分化成期望分化细胞类型的试剂。构建了多种分化剂组合的文库。分化剂文库包括例如生长因子、细胞因子、胞外基质成份、激素和激素拮抗剂、和针对上述物质的中和抗体。然后对分化剂文库测试诱导桑椹胚衍生细胞或内细胞团细胞分化的能力。可以使用上文讨论的用于诱导细胞分化的任何方法。例如，可以在组织培养孔中培养细胞，其中每个孔含分化因子的独特组合。也可以以裸露DNA的形式涂布编码这些因子的核酸或cDNA，或者通过转染或通过病毒来制备构建物以携带这些核酸。通过分化特异抗体、形态学、使用分化特异引物的PCR、或用于鉴定特定类型的分化细胞的任何其它可用技术来鉴定分化细胞。
可依照本发明使用的分化剂包括细胞因子，诸如干扰素-αA、干扰素-αA/D、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-γ诱导蛋白-10、白介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-15、白介素-17、角质细胞生长因子、leptin、白血病抑制因子、巨噬细胞集落刺激因子、和巨噬细胞炎性蛋白-1α。
依照本发明的分化剂还包括生长因子，诸如6Ckine(重组体)、活化素A、干扰素-αA、干扰素-α、双调蛋白、血管生成素、内皮细胞生长因子-β、动物纤维素-β、干扰素-β、脑衍生神经营养因子、C10(重组体)、促心脏激素-1(cardiotrophin-1)、睫状神经营养因子、细胞因子诱导嗜中性化学引诱物-1、内皮细胞生长补充物、eotaxin、表皮生长因子、上皮嗜中性激活肽-78、促红细胞生成素、雌激素受体-α、雌激素受体-β、成纤维细胞生长因子(酸性/碱性、肝素稳定的、重组体)、FLT-3/FLK-2配体(FLT-3配体)、干扰素-γ、神经胶质细胞系衍生神经营养因子、Gly-His-Lys、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、GRO-α/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC-1、肝素结合表皮生长因子样生长因子、肝细胞生长因子、heregulin-α(EGF结构域)、胰岛素生长因子结合蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白-1/IGF-1复合物、胰岛素样生长因子、胰岛素样生长因子II、2.5S神经生长因子(NGF)、7S-NGF、巨噬细胞炎性蛋白-1β、巨噬细胞炎性蛋白-2、巨噬细胞炎性蛋白-3α、巨噬细胞炎性蛋白-3β、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、NGF-B(人或大鼠重组体)、制瘤素M(人或小鼠重组体)、垂体提取物、胎盘生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、pleiotrophin、rantes、干细胞因子、基质细胞衍生因子1B/前B细胞生长刺激因子、血小板生成素、转化生长因子-α、转化生长因子-β1、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、肿瘤坏死因子(α和β)、和血管内皮生长因子。
依照本发明的分化剂还包括激素和激素拮抗剂，诸如17B-雌二醇、促肾上腺皮质激素、肾上腺髓质素(adrenomedullin)、黑素细胞刺激激素-α、绒毛膜促性腺激素、皮质类固醇结合球蛋白、皮质酮、地塞米松、雌三醇、促卵泡激素、胃泌素-1、胰高血糖素、促性腺激素、氢化可的松、胰岛素、胰岛素样生长因子结合蛋白、L-3，3’，5’-三碘甲状腺原氨酸、L-3，3’，5-三碘甲状腺原氨酸、leptin、促黄体生成激素、L-甲状腺素、褪黑激素、MZ-4、催产素、甲状旁腺激素、PEC-60、垂体生长激素、孕酮、促乳素、胰泌素、性激素结合球蛋白、促甲状腺素、促甲状腺素释放因子、甲状腺素结合球蛋白、和加压素。
依照本发明的分化剂还包括胞外基质成份，诸如纤连蛋白、纤连蛋白的蛋白水解片段、层粘连蛋白、血小板反应蛋白、聚集蛋白聚糖、和多配体蛋白聚糖。
依照本发明的分化剂还包括针对各种因子的抗体，诸如抗低密度脂蛋白受体抗体、抗孕酮受体、内在抗体、抗α干扰素受体链2抗体、抗c-c趋化因子受体1抗体、抗CD118受体、抗CD119抗体、抗集落刺激因子-1抗体、抗CSF-1受体/c-fms抗体、抗表皮生长因子(AB-3)抗体、抗表皮生长因子受体抗体、抗表皮生长因子受体、磷特异抗体、抗表皮生长因子(AB-1)抗体、抗促红细胞生成素受体抗体、抗雌激素受体抗体、抗雌激素受体C端抗体、抗雌激素受体-β抗体、抗成纤维细胞生长因子受体抗体、抗碱性成纤维细胞生长因子抗体、抗γ干扰素受体链1抗体、抗γ干扰素人重组体抗体、抗GFRα1C端抗体、抗GFRα2C端抗体、抗粒细胞集落刺激因子(AB-1)抗体、抗粒细胞集落刺激因子受体抗体、抗胰岛素受体抗体、抗胰岛素样生长因子-1受体抗体、抗白介素-6人重组体抗体、抗白介素-1人重组体抗体、抗白介素-2人重组体抗体、抗leptin小鼠重组体抗体、抗神经生长因子受体抗体、抗p60鸡抗体、抗甲状旁腺激素样蛋白抗体、抗血小板衍生生长因子受体抗体、抗血小板衍生生长因子受体-β抗体、抗血小板衍生生长因子-α抗体、抗孕酮受体抗体、抗视黄酸受体-α抗体、抗甲状腺激素核受体抗体、抗甲状腺激素核受体-α1/Bi抗体、抗转铁蛋白受体/CD71抗体、抗转化生长因子-α抗体、抗转化生长因子-β3抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体、和抗血管内皮生长因子抗体。
一旦进行分化方案，则可以通过常规技术由分化内细胞团衍生物分离来自特定胚性谱系的原始细胞。如果需要，可以扩增分离的分化祖细胞，例如通过细胞培养或其它适当方法。通过本发明由分化内细胞团细胞获得了分化祖细胞而不必生成胚胎干细胞。
还可以转染分化祖细胞。可以在生成分化祖细胞的过程中在任何合适阶段进行转染。例如，可以在形成胚泡之前转染作为细胞核供体用于形成核移植单位的分化细胞。另一种可能性是在分离了分化祖细胞之后再转染它们，如转染造血系统的CD34+、CD38-细胞。
可以将在哺乳动物细胞中插入、删除、或修饰期望基因的任何已知方法用于生成经转染分化祖细胞。这些流程可除去整个或部分基因，而且基因可以是异源的。包括同源重组技术，这种技术能够在细胞基因组的特定位点插入、删除、或修饰基因。
逆转录病毒高通量筛选流程也可用于鉴定涉及胚胎干细胞中谱系决定的基因。然后可以在用于生成分化祖细胞的桑椹胚衍生细胞或内细胞团细胞中插入和/或诱导那些谱系决定基因。由逆转录病毒介导的筛选的范例如下A.逆转录病毒文库的构建由分化组织(如神经元、心肌细胞、造血干细胞(CD34+细胞)、或其它分化细胞)构建逆转录病毒cDNA文库。可以使用任何基于Moloney的载体系统来构建这些文库。商品化的范例是pBabe和pLIB载体(Clontech)。也可以由商业来源(Clontech)获取早已由肌肉、肝、和脑构建的文库。此外，可以容易的实现特化文库的构建。
B.ES细胞中功能筛选的发展用报告基因构建物转染灵长类或哺乳动物ES细胞，所述构建物包含组织特异基因的启动子，例如连接GFP蛋白的CD34启动子。然后将该启动子报告基因构建物转染到ES细胞中。选择具有最小背景活性的克隆，并将阳性对照细胞系(KG-1)用于确认启动子构建物的表达。
C.逆转录病毒文库的包装随后将逆转录病毒cDNA文库有效(＞80％频率)转染到基于293的EcoPack或AmphoPack细胞系(Clontech)中。这些细胞系表达有效包装所需要的Gag-pol和包膜蛋白。在这些细胞系中高滴度(＞106)的病毒生成使之对于文库展示是理想的。在出现与这些细胞系有关的问题的情况中，可以通过将Gag-pol和Env基因稳定转染到293细胞中来构建候选系统。
D.筛选随后用包装好的逆转录病毒以感染复数1(MOI＝1)感染ES-Rep(报告基因)细胞。感染后，使ES-Rep细胞恢复并分裂。然后对这些细胞进行荧光激活细胞分拣(Fluorescent Activated Cell Sorting，FACS)，并选择GFP+细胞，再次培养，并使之恢复。由这些细胞制备基因组DNA，并使用扩增逆转录病毒cDNA插入片段的引物进行PCR扩增。然后将这些插入片段个别测序，并测试在ES-Rep细胞中上调GFP的能力。或者，可以作为集合来回收cDNA，然后感染到未处理型ES-Rep细胞中以富集目的事件(GFP+)。然后对单个cDNA克隆进一步鉴定引发期望表型的能力，即将ES细胞转变成神经元、肌肉、或其它期望谱系的能力。参阅L.P.Deiss等人，Genes Dev，915，1995；I.Whitehead等人，MCB，15704，1995；J.R.Rayner等人，同上，14880，1994；M.Goldfarb等人，Nature，296404，1982；A.V.Gudkov等人，PNAS，903231，1993；和L.P.Deiss和A.Kimchi，Science，252117，1991；将它们的内容收入本文作为参考。
已知移植的胚胎干细胞不仅能够形成良性畸胎瘤，而且能够形成恶性肿瘤。为了在本发明的方法中消除患良性和恶性肿瘤二者的风险，在细胞(如作为核移植的细胞核供体的细胞)中导入或删除可预防未分化胚性细胞在培养中生长的基因是有用的。例如，可以将诱导型启动子诸如MMTV启动子导入细胞，随后导入地塞米松来诱导可阻断未分化细胞生长或诱导它们分化的基因的表达。另一种可能性是导入生殖系特异基因的启动子来驱动细胞周期阻断物或凋亡基因的表达。或者，可以鉴定并消除未分化胚胎干细胞。
用于生成分化祖细胞的优选方法包括通过体外受精或通过核移植获得人胚胎，在G1.2/G2.2培养基中培养胚胎直至胚泡阶段。通过链霉蛋白酶的温和消化，由胚胎除去透明带。通过免疫手术，由胚胎除去滋养层细胞。使用或不用细胞因子，通过下列方式，诱导内细胞团细胞的分化a)平坦、粘性环境；b)三维粘性环境；c)微重力；d)在免疫缺陷小鼠中生成畸胎瘤；或e)在同基因或异基因人体中由包裹内细胞团细胞形成畸胎瘤。然后由分化内细胞团衍生物分离特定胚性谱系的分化祖细胞。
产生的本发明的分化祖细胞，优选人分化祖细胞，具有许多治疗和诊断应用。最特别的是，这些分化祖细胞可用于细胞移植疗法。人分化祖细胞可用于治疗许多疾病状况。
本发明的分化祖细胞可用于获得任何期望的分化细胞类型。这些分化人细胞的治疗性用途是空前的。例如，人造血干细胞可用于需要骨髓移植的医学治疗。这些流程可用于治疗许多疾病，如晚期癌症(诸如卵巢癌和白血病)以及损害免疫系统的疾病(诸如AIDS)。例如可以如下获得造血干细胞将癌症或AIDS患者的成熟体细胞(如上皮细胞或淋巴细胞)与去核卵母细胞融合，如上所述获得内细胞团细胞，并在促使分化的条件下培养这些细胞，直至获得造血干细胞。这些造血细胞可用于治疗包括癌症和AIDS在内的疾病。
或者，可以将来自神经学紊乱患者的成熟体细胞与去核卵母细胞融合，由其中获得人内细胞团细胞，并在分化条件下培养这些细胞以生成神经细胞系。可以通过移植这样的人神经细胞来治疗的具体疾病包括例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、ALS和脑性瘫痪等。在帕金森氏病的具体情况中，已经证明移植的胎脑神经细胞建立了与周围细胞的正确联系并可生成多巴胺。这能够导致帕金森氏病综合症的长期逆转。
本发明的主要优势是可以提供实质上无限的等基因或同源人细胞适合于移植。因此，它将消除与当前移植方法有关的重大问题，即由于宿主对移植物或移植物对宿主的排斥而可能发生的移植组织排斥。常规的是，通过施用抗排斥药物诸如环孢菌素来预防或降低排斥。然而，这些药物具有显著的不利副作用，如免疫遏制、致癌特性、以及非常昂贵。本发明应当消除或者至少大大降低对抗排斥药物的需要。
可以通过等基因细胞疗法来治疗的其它疾病和状况包括例如脊髓损伤、多发性硬化症、肌肉营养不良症、糖尿病、肝病(即高胆固醇血症)、心脏病、软骨代换、烧伤、脚部溃疡、胃肠疾病、血管疾病、肾病、泌尿道疾病、和与衰老有关的疾病和状况。
这种方法学可用于取代缺陷基因(如缺陷的免疫系统基因、囊性纤维化基因)，或者用于导入导致治疗有利蛋白(转染生长因子、淋巴因子、细胞因子、酶等)表达的基因。例如，可以将编码由脑衍生的生长因子的基因导入人内细胞团细胞，使细胞分化成神经细胞，并将细胞移植到帕金森氏病患者体内，从而延迟这种疾病过程中神经细胞的损失。
以前，用BDNF转染的细胞类型可以是原代细胞或永生化细胞，或是神经衍生细胞或是非神经(成肌细胞和成纤维细胞)衍生细胞。例如，已经使用逆转录病毒载体用BDNF基因转染了星形胶质细胞，并将细胞移植到帕金森氏病的大鼠模型中(Yoshimoto等人，BrainResearch，69125-36，1995)。
移植后32天，这种离体疗法将大鼠中帕金森氏病样综合症降低了高达45％。同样，已经将酪氨酸羟化酶基因置于星形胶质细胞中而获得相似结果(Lundberg等人，Develop.Neurol.，13939-53，1996及其引用的参考文献)。
然而，这些离体系统有问题。具体而言，目前使用的逆转录病毒载体在体内被下调，而转基因只是瞬时表达(回顾见Mulligan，Science，260926-932，1993)。同样，这些研究使用寿命有限且复制缓慢的原代细胞，星形胶质细胞。这些特性对转染率有不利影响，且阻止对稳定转染细胞的选择。此外，几乎不可能增殖大群基因打靶的原代细胞用于同源重组技术。相比之下，通过使用分化祖细胞应当能够消除与逆转录病毒系统有关的困难。
可导入本发明分化祖细胞的基因包括例如表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质衍生神经营养性生长因子、胰岛素样生长因子(I和II)、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4/5、睫状神经营养因子、AFT-1、细胞因子基因(白介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子(α和β)等)、编码治疗酶的基因等。
除了人分化祖细胞在细胞、组织、和器官移植中的用途以外，本发明还包括非人细胞在人类疾病治疗中的用途。因而，任何物种的分化祖细胞都可用于治疗批准进行细胞、组织、或器官移植的人类疾病状况。一般而言，本发明的分化祖细胞可用于相同物种(自体、同基因、同种异体移植)或不同物种(异种移植)。
同样，本发明的分化祖细胞，优选人细胞，可用作分化的体外模型，特别是用于研究涉及早期发育调控的基因。
同样，使用本发明分化祖细胞生成的分化细胞、组织、和器官也可用于药物研究。
本发明还提供了生成谱系缺陷型人胚胎干细胞的方法。这些细胞是由通过核移植生成的人胚前期衍生的。若假设将这种胚胎移植到女性子宫内，则它绝不会发育成人。
为了生成谱系缺陷型胚胎干细胞，优选谱系缺陷型人胚胎干细胞，可通过基因工程改造体细胞使之不能分化成特定细胞谱系。这些遗传修饰包括敲除所选择的基因，或者表达合适的反义核酸或核酶。敲除基因或不许表达的基因的范例是血清应答因子(SRF)(Arsenian等人，EMBO J，17(21)6289-6299，1998)、MESP-1(Saga，Mech Dev，75(1-2)53-66，1998)、HNF-4(Chen等人，Genes Dev，8(20)2466-2477，1994)、整联蛋白-β1(Rohwedel等人，Dev Biol，201(2)167-184，1998)、和MSD(Holdener等人，Development，120(5)1335-1346，1994)，用于中胚层；GATA-6(Morrisey等人，Genes Dev，12(22)3579-3590，1998)和GATA-4(Soudais等人，Development，121(11)3877-3888，1995)，用于内胚层；和RNA解旋酶A(Lee等人，Proc Natl Acad Sci USA，95(23)13709-13713，1998)和Hβ58(Radice等人，Development，111(3)801-811，1991)，用于外胚层。本发明还涵盖导入一种或多种可预防特定细胞谱系分化(如神经细胞)的遗传修饰。用于进行基因敲除的方法和载体是许多专利的主题，包括美国专利号5,110,735、6,074,853、5,998,144、5,948,653、5,945,339、5,925,544、5,869,718、5,830,698、5,780,296、5,614,396、5,612,205、5,468,629、5,093,257，将所有这些完整收入本文作为参考。
特定细胞谱系中涉及的可以删除或灭活的其它基因包括例如ICSBP、hedgehog、Cbfal、VASA、HESXI、转录因子、以及许多其它基因。最近，Sato等人，Mol Reprod Devel，56(1)34-44，2000报导了使用Cre-LoxP系统来鉴定涉及特定细胞谱系的基因的遗传方法，将其完整收入本文作为参考。
然后将经遗传工程改造的细胞作为细胞核供体用于生成核移植单位。人卵母细胞或任何其它哺乳动物(如牛)卵细胞可用作细胞核供体的受体。如上所述使核移植单位发育成胚泡，并由其衍生谱系缺陷型人胚胎干细胞。对于涉及生成人胚胎干细胞的方法参阅例如Thomson等人，Science，2821145-1147，1998和美国专利号5,843,780。在诱导分化后，谱系缺陷型人胚胎干细胞不会分化成至少一种胚胎胚层(中胚层、内胚层、或外胚层)。如果需要，也可以将谱系缺陷型人胚胎干细胞改造成“必死的”，例如通过表达反义或核酶端粒酶基因。
虽然上文已经针对谱系缺陷型人胚胎干细胞描述了本发明，本发明还包括任何哺乳动物物种的谱系缺陷型胚胎干细胞。
实施例为了更清楚的描述本发明而提供下列实施例。这些实施例是为了例示绝非限制而提供的。
B.组织的解离和培养1)由锥形管中取出样品，并置于装有新鲜温热溶液1的100mm培养皿中；2)使用无菌镊和剪修整任何毛发，并转移到装有溶液1的另一个皿中；3)使用无菌镊和解剖刀小心的切出非常薄的组织切片。切片越薄，产生的细胞越多；4)将切片平坦的置于组织培养皿的底部中央，并覆盖无菌载玻片；5)用约10ml普通培养基注满盘，并置于5％CO2、37℃恒温箱中；6)将外植体样品培养10天，更换一次培养基；7)除去培养基，用DPBS漂洗，加入5ml胰蛋白酶溶液(0.08％胰蛋白酶和0.02％EDTA)；
8)置于加热板上直至细胞松开；9)由盘中除去溶液，并置于装有等量温热培养基(10％FBS)的50ml锥形管中；10)旋转沉降细胞；11)除去上清液，并将细胞重悬于普通培养基中；12)培养。溶液1DPBS(Biowhittaket，04-479Y) 200ml环丙沙星IICL(Mediatech，61-277) 2.33mg两性霉素(Gibco，15295-017) 1.5ml牛卵母细胞的体外成熟在屠宰场收集卵巢，置于温热的PBS(34℃)中，并在8小时内运送至实验室。在无菌条件下用18G针头抽吸直径超过2mm的每个滤泡。在修改后的Tyrode氏培养基(TL Hepes)中挑选卵母细胞。将具有均相细胞质、相当大的卵周隙、和完整卵丘细胞的卵母细胞置于成熟培养基M199(Gibco)和10％FCS、5μl/ml bFSH(Nobl)、5μl/ml bLH(Nobl)、和10μl/ml Penstrep(Sigma)中，于38.5℃、5％CO2保温22小时。核移植成熟18小时后，将卵母细胞置于矿物油(Sigma)下的一滴100μlTL HECM Hepes中。使用直径25μm的斜面玻璃移液管进行卵母细胞去核(抽取染色体)。通过将事先在含1μg/ml bisBENZIMIDE(Hoechst33342，Sigma)的TL HECM-Hepes中培养15分钟的各个卵母细胞在UV灯下暴露来进行去核评价。成熟23小时后，将供体细胞置于卵周隙中并与卵的细胞质融合。胚胎培养受精后的前3天，在500μl孔板中培养胚胎，饲养层是小鼠胚胎成纤维细胞(MF)，培养基是含10％胎牛血清的ACM。第4天，将胚胎转移至装有小鼠胚胎成纤维细胞(MF)饲养层和新鲜ACM培养基(含10％胎牛血清)的500μl孔板中直至胚泡阶段。ES样细胞培养物将胚泡置于装有有丝分裂灭活MF饲养层和ES培养基(DMEM-高葡萄糖，15％胎牛血清、4μl/ml抗生素-抗霉菌素、2.8μl/ml 2-巯基乙醇、0.3mg/ml L-谷氨酰胺、10μl/ml非必需氨基酸、和1μl/ml泰洛星酒石酸盐)(提前1天于38.5℃、5％CO2平衡)的32mm板(Nunc)中。使用22G针头，机械的除去胚泡的透明带和滋养细胞。将剩余内细胞团(ICM)置于MF的上面。培养1-2周后，将ES样细胞传代至新鲜的有丝分裂灭活MF的上面。MF的灭活是通过将它们暴露于伽马照射(2956rad)来进行的。使用拉过的巴斯德移液管，切下一小片集落(50-100个细胞)并将其置于MF饲养层的上面，由此对ES样细胞进行传代。
通过上述流程，由转基因成熟体细胞重建了41个牛胚胎。当在上述条件下培养内细胞团细胞时，在那41个胚胎中，15个(或37％)生成胚胎干细胞样细胞。然而，26个胚胎不能生成胚胎干细胞样细胞，尽管是在干细胞生成的理想条件下培养内细胞团细胞。
尚不清楚胚胎发育的时间安排、各胚胎的内在差异、或具体的培养条件(如存在或缺乏各种生长因子)是否对只有一部分内细胞团发育成胚胎干细胞样细胞负有责任。尽管如此，这些结果指出，存在不能或不发育成胚胎干细胞的多能内细胞团细胞。这些不发育成胚胎干细胞的内细胞团细胞也应当具有治疗价值。应当注意，Thompson等人，Science，2821145-1147，1998报告了人胚胎干细胞的生成，其中14个内细胞团细胞中只有5个(或36％)发育成ES细胞系。因而，存在不发育成胚胎干细胞的内细胞团细胞这一现象似乎是哺乳动物物种中的普遍现象。实施例2由Thomas Morris公司(马里兰)购买了3头大约8-10月龄的成年Hostein牛(体重大约500-1000磅)，并运送至马萨诸塞大学(Amherst)的South Deerfield农场。为了获得用于核移植的成纤维细胞，使用耳科钳由每只动物采集皮肤活组织。将表达编码增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的报告基因的质粒转染到细胞中，并使用新霉素选择经转染细胞。如先前Nature Biotechnol.，16642-646，1998(收入本文作为参考)中所述，将通过PCR和/或FISH分析的纯化细胞用于核移植。
然后将由牛胚泡生成的分离内细胞团细胞注射到供体牛的腰旁筋膜中(在每只动物中，3个位点用来自3个10日胚胎的内细胞团，3个位点用来自3个12日胚胎的内细胞团，3个位点用来自3个14日胚胎的内细胞团)。内细胞团衍生自注射的相同动物，因而内细胞团对于牛是免疫相容的。2个月后，对肌肉检查畸胎瘤形成。切下任何经鉴定肿瘤用于组织学分析。
对直立动物进行流程，在尾部静脉进行静脉内施用20mg甲苯噻嗪/8mg酒石酸环丁羟吗喃。夹住腰旁筋膜区，并进行手术准备，作为腰旁小块施用100ml 2％利多卡因作为局部麻醉剂。手术后3天内应当给动物以抗生素作为预防性措施(50mg/cc Ceftlofur HCl，1cc/100磅)。手术后立即给予一次氟胺烟酸葡胺注射(1cc/100磅)以控制疼痛和手术部位的肿大。若腰旁筋膜没有发生畸胎瘤形成，则可以分析其它部位，即皮下。
预计在畸胎瘤中将观察到来自所有3种胚层(即外胚层、中胚层、和内胚层)的细胞。
在详细的且通过具体实施方案描述了本发明之后，本领域熟练技术人员将领会到可以对本发明进行多种变动和更改而不背离本发明的精神和范围。
权利要求
1.用于生成分化祖细胞的方法，包括(I)获得桑椹胚衍生细胞或胚泡的内细胞团细胞；并(II)诱导桑椹胚衍生细胞或内细胞团细胞分化成分化祖细胞。
2.权利要求1的方法，还包括分离所述分化祖细胞。
3.权利要求1的方法，其中诱导所述桑椹胚衍生细胞或内细胞团细胞的分化而不存在未分化胚胎干细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述胚泡是通过体外受精生成的。
5.权利要求1的方法，其中所述胚泡是人的胚泡。
6.权利要求1的方法，其中所述胚泡是由核移植单位生成的。
7.权利要求6的方法，其中在所述核移植单位中插入、消除、或修饰期望DNA，由此生成遗传改变的分化祖细胞。
8.权利要求1的方法，其中在平坦、粘性环境中诱导所述内细胞团细胞分化。
9.权利要求1的方法，其中在三维粘性环境中诱导所述内细胞团细胞分化。
10.权利要求1的方法，其中在微重力下诱导所述内细胞团细胞分化。
11.权利要求1的方法，其中通过在免疫缺陷小鼠中生成畸胎瘤来诱导所述内细胞团细胞分化。
12.权利要求1的方法，其中通过将所述内细胞团细胞包裹在等基因人患者内并由所述包裹细胞生成畸胎瘤来诱导所述内细胞团细胞分化。
13.权利要求1的方法，其中通过将所述内细胞团细胞包裹在异基因人患者内并由所述包裹细胞生成畸胎瘤来诱导所述内细胞团细胞分化。
14.权利要求1的方法，其中分化祖细胞衍生自中胚层。
15.权利要求1的方法，其中分化祖细胞衍生自外胚层。
16.权利要求1的方法，其中分化祖细胞衍生自内胚层。
17.依照权利要求2的方法获得的分化祖细胞。
18.权利要求17的分化祖细胞，其是人的分化祖细胞。
19.依照权利要求7获得的转基因分化祖细胞。
20.权利要求19的转基因分化祖细胞，其是人的转基因分化祖细胞。
21.治疗方法，包括对需要细胞移植疗法的患者施用权利要求18的等基因分化细胞。
22.权利要求21的方法，其中所述细胞移植疗法用于治疗选自下组的疾病或状况帕金森氏病、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、ALS、脊髓缺陷或损伤、多发性硬化症、肌肉营养不良症、囊性纤维化、肝病、糖尿病、心脏病、软骨缺陷或损伤、烧伤、脚部溃疡、血管疾病、泌尿道疾病、AIDS、和癌症。
23.权利要求21的方法，其中分化人细胞是造血细胞或神经细胞。
24.权利要求21的方法，其中该疗法用于治疗帕金森氏病，而且分化细胞是神经细胞。
25.权利要求21的方法，其中该疗法用于治疗癌症，而且分化细胞是造血细胞。
26.治疗方法，包括对需要细胞移植疗法的人患者施用权利要求17的异种分化细胞。
27.权利要求23的方法，其中异种分化细胞是牛细胞。
28.权利要求24的方法，其中所述细胞移植疗法用于治疗选自下组的疾病或状况帕金森氏病、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、ALS、脊髓缺陷或损伤、多发性硬化症、肌肉营养不良症、囊性纤维化、肝病、糖尿病、心脏病、软骨缺陷或损伤、烧伤、脚部溃疡、血管疾病、泌尿道疾病、AIDS、和癌症。
29.用于生成谱系缺陷型胚胎干细胞的方法，包括(I)遗传修饰体细胞，使得所述体细胞不能分化成预定的细胞谱系；(II)使用经遗传修饰的体细胞或细胞核作为细胞核供体，生成核移植单位；(III)激活产生的核移植单位；(IV)培养所述激活的核移植单位直至超过二细胞发育阶段；并(V)在适合于形成谱系缺陷型胚胎干细胞的条件下，培养由所述培养的核移植单位获得的细胞，所述干细胞不能分化成至少一种胚胎胚层。
30.权利要求29的方法，其中生成所述核移植单位包括在适合于形成核移植单位的条件下将经遗传修饰的人体细胞或细胞核插入去核哺乳动物卵母细胞中。
31.权利要求29的方法，其中所述谱系缺陷型人胚胎干细胞不能分化成中胚层。
32.权利要求29的方法，其中所述谱系缺陷型人胚胎干细胞不能分化成内胚层。
33.权利要求29的方法，其中所述谱系缺陷型人胚胎干细胞不能分化成外胚层。
34.依照权利要求29的方法生成的谱系缺陷型人胚胎干细胞。
35.权利要求29的方法，其中所述谱系缺陷型胚胎干细胞是人的。
全文摘要
用于生成分化祖细胞的改进方法，包括由胚泡获得内细胞团细胞，并诱导内细胞团细胞分化产生分化祖细胞。可以转染分化祖细胞，从而添加、删除、或改变期望基因。分化祖细胞可用于细胞疗法和作为生成移植用的组织和器官的细胞来源。还提供了用于生成谱系缺陷型人胚胎干细胞的方法。
文档编号A61P31/00GK1413250SQ00817477
公开日2003年4月23日 申请日期2000年10月13日 优先权日1999年10月15日
发明者J·西贝里, M·D·维斯特, R·P·兰扎 申请人:先进细胞技术公司