一种人肺癌抗原及其抗体的制作方法

专利名称：一种人肺癌抗原及其抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的人肺癌抗原、编码此抗原的DNA、由此抗原制备或筛选获得的相应抗体以及此抗原和相应DNA、抗体、抗体衍生物在肺癌诊断、治疗和预防中的应用。确切地说是本发明涉及一种采用现代生物学、免疫学技术筛选获得的新的人肺癌细胞抗原及其编码DNA，该抗原特异表达于多数人肺癌细胞表面，而在正常细胞极少表达。该抗原具有刺激人机体产生抗肺癌免疫反应的能力，包括细胞免疫和体液免疫。本发明还涉及由此抗原制备而来的，或是由此抗原筛选而来的相应抗体。另外，本发明提供了该抗原、相应编码DNA、相应抗体在人肺癌诊断、治疗、预防中的应用。
目前大约已经发现了60余种肺癌生物标志物，它们或与人肺癌直接相关，或与不同种类的肺癌相关，或与肺癌预后相关，或与肺癌转移相关，或与肺癌临床分期相关，或与肺癌耐药相关等等。这些抗原包括ACE、ADH、AFP、AgNORs、ANP、AHH、血型抗原(bloodgroup antigens)、BN/GRP、CA125、CA19-9、CA242、CA50、Cadherins、Clcitonin、Cathepsin B、CC10、CEA、缩胆囊素-B/胃泌素受体(Cholecystokinin-B/gastrin receptor)、CK-BB、c-N-L-myc、Cyclin D1、CYFRA 21-1、CYFRA21.1、CYP1A1/GSTM1、EGFR、上皮糖蛋白1(Epithelial glycoprotein 1)、上皮糖蛋白2(Epithelial glycoprotein 2)、铁蛋白(Ferritin)、神经节苷脂岩藻-GM1(Ganglioside fucosyl-GM1(FucGM1))、谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase)、HER2、核内异质核糖蛋白A2/B1(Heterogeneous nuclear ribonucleoproteinA2/B1)、H-K-N-ras、IGF-I、IL-2R、Integrins、Ki-67、刘易斯抗原(Lewisantigens)、Le-y、MMP-9、MUC1、NCAM、NeuAc、NSE、P53、PCNA、肽激素ACTH(Peptide hormones ACTH)、磷酸丙酮酸水合酶(Phosphopyruvate Hydratase)、pro GRP、p21、SCC抗原(SCC antigen)、sialyl SSEA-1、SLX、TA-4、端粒酶(Telomerase)、TGF-a、胸苷激酶(Thymidine kinase)、TPA、运铁蛋白(Transferrin)、uPA等等，(Kulpa，J.，Wojcik，E.，Radkowski，A.，Kolodziejski，L.，and Stasik，Z.等人，CYFRA 21-1，TPA-M，TPS，SCC-Ag和CEA在鳞状细胞肺癌患者和化工产业中工人对照人群中的情况抗癌研究2000，20(6D)5035-5040。Nguyen，V.N.，Mirejovsky，T.，Melinova，L.，and Mandys，V.等人，肺癌中的CD44和其v6剪切变体与NCAM，CEA，EMA和UP1以及预后因子相关意义，赘生物杂志，2000，47(6)400-408。Alatas，F.，Alatas，O.，Metintas，M.，Colak，O.，Harmanci，E.，and Demir，S.等人，CEA，CA15-3，CA 19-9，CYFRA 21-1，NSE and TSA试验在胸水中的诊断价值，肺癌杂志，2001，31(1)9-16.(Kulpa，J.，Wojcik，E.，Radkowski，A.，Kolodziejski，L.，and Stasik，Z.CYFRA 21-1，TPA-M，TPS，SCC-Ag andCEA in patients with squamous cell lung cancer and in chemical industryworkers as a reference group.Anticancer Res.，2000，20(6D)5035-5040.Nguyen，V.N.，Mirejovsky，T.，Melinova，L.，and Mandys，V.CD44 andits V6 spliced variant in lung carcinomasrelation to NCAM，CEA，EMAand UP1 and prognostic significance.Neoplasma，2000，47(6)400-408.Alatas，F.，Alatas，O.，Metintas，M.，Colak，O.，Harmanci，E.，and Demir，S.Diagnostic Value of CEA，CA 15-3，CA 19-9，CYFRA 21-1，NSE andTSA assay in pleural effusions.Lung Cancer，2001，31(1)9-16.)Foa，P.，Fornier，M.，Miceli，R.，Seregni，E.，Santambrogio，L.，Nosotti，M.，Massaron，S.，Cataldo，I.，Oldani，S.，Iurlo，A.，Caldiera，S.，andBombardieri，E.等人，在可切除性非小细胞肺癌中术前CEA，NSE，SCC，TPA和CYFRA 21.1血清水平可作为预后指标，生物标志物国际期刊，1999，14(2)92-98。(Foa，P.，Fornier，M.，Miceli，R.，Seregni，E.，Santambrogio，L.，Nosotti，M.，Massaron，S.，Cataldo，I.，Oldani，S.，Iurlo，A.，Caldiera，S.，and Bombardieri，E.Preoperative CEA，NSE，SCC，TPAand CYFRA 21.1 serum levels as prognostic indicators in resectednon-small cell lung cancer.Int.J.Biol.Markers，1999，14(2)92-98.)Graziano，S.L.，Kern，J.A.，Herndon，J.E.，Tatum，A.，Brisson，M.L.，Memoli，V.，Sugarbaker，D.，Skarin，A.T.，Kreisman，H.，and Green，M.R.等人，IIIA期非小细胞肺癌化疗前后神经内分泌标志，HER2和CEA的分析癌症和淋巴瘤组B研究，肺癌1998，21(3)203-211(Graziano，S.L.，Kern，J.A.，Herndon，J.E.，Tatum，A.，Brisson，M.L.，Memoli，V.，Sugarbaker，D.，Skarin，A.T.，Kreisman，H.，and Green，M.R.Analysis ofneuroendocrine markers，HER2 and CEA before and after chemotherapyin patients with stage IIIA non-small cell lung cancera Cancer andLeukemia Group B study.Lung Cancer，1998，21(3)203-211.)Abe，S.[肺癌的分子生物学预后指标]日本Geka Gakkai Zasshi，1997，98(1)2-7.。(Abe，S.[Molecular biological prognostic markers inlung cancer].Nippon Geka Gakkai Zasshi，1997，98(1)2-7.)Fukuda，M.and Oka，M.等人，[血清肿瘤标志物在肺癌诊断中的作用和不足]，日本Rinsho，1996，54(6)1610-1615.。(Fukuda，M.and Oka，M.[Usefulness and limitation of serum tumor markers in diagnosis of lungcancer].Nippon Rinsho，1996，54(6)1610-1615.)Moro，D.，Villemain，D.，Vuillez，J.P.，Delord，C.A.，and Brambilla，C.等人，CEA，CYFRA21-1和SCC在非小细胞肺癌中，肺癌，1995，13(2)169-176。(Moro，D.，Villemain，D.，Vuillez，J.P.，Delord，C.A.，and Brambilla，C.CEA，CYFRA21-1 and SCC in non-small cell lung cancer.Lung Cancer，1995，13(2)169-176.)Giovanella，L.，Ceriani，L.，Bandera，M.，Beghe，B.，and Roncari，G.等人，血清标志物CEA，NSE，TPS和CYFRA 21.1在肺癌中应用的评估，生物标志物国际期刊，1995，10(3)156-160.
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在这些已知的肺癌标志物中，有一些细胞表面标志物可作为免疫导向治疗的靶点，例如CEA、HER2等。但目前存在的问题是缺乏比较特异、而阳性率又比较高的靶点，往往阳性率高的靶点同时在正常组织存在着一定的表达，导致免疫导向治疗的疗效和安全性下降；而特异性较好的靶点，例如HER2，其阳性率又不是太高，导致免疫导向治疗的应用范围和疗效变低。对于肺癌的免疫导向体内显像来说，也存在同样的问题。
综上所述，目前已知的肺癌生物标志物中，尚缺乏一种针对人肺癌特异性高，而阳性率也高的标志物；对于肺癌主动免疫治疗来说，也缺乏一种较佳的细胞抗原靶点；对于肺癌免疫导向诊断、治疗来说，缺乏一种好的细胞表面标志靶点。因而寻找一种特异性高、在肺癌中表达阳性率高、位于肺癌细胞表面、对人具有抗原性的肺癌抗原对于人肺癌的诊断、预防、治疗都具有十分重要的意义。
本发明要解决的另一个技术问题在于提供一类抗上述的人肺癌抗原的抗体，这类抗体不仅可用于体外诊断人肺癌，其本身或其衍生物也可以用于在体内免疫导向诊断或治疗人肺癌。
本发明要解决的再一个技术问题在于所述的人肺癌抗原及相应抗体或衍生物在人肺癌诊断、治疗、预防中的应用。
根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种新的人肺癌抗原及编码该抗原的DNA，所述抗原的特征在于含有以下氨基酸残基序列(SEQNo.1)NH3-Trp-Asp-Tyr-Arg-His-Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Cys-Ile-Phe-Ser-Arg-Asp-Gly-Val-Ser-Pro-Cys-Trp-Pro-Gly-Trp-Ser-Gly-Thr-Pro-Asp-Leu-Arg-Arg-Ser-Ala-Cys-Leu-Gly-Leu-Pro-Lys-Cys-Thr-Trp-Gly-COOH该抗原表达于多数人肺癌的癌细胞表面，极少表达于人正常细胞表面，并具有刺激人体免疫反应的能力，包括细胞免疫和体液免疫。
所述的抗原为天然抗原或者重组蛋白抗原。该抗原为可刺激人体抗人肺癌免疫反应的抗原。
抗原为可作为抗人肺癌免疫导向治疗的靶的抗原。
本发明还涉及一种编码如上述抗原的氨基酸残基序列的DNA序列。
在本发明中，所述的抗原是指包含上述氨基酸残基序列的任何蛋白质或融合蛋白质；所述的编码该抗原的DNA是指任何根据公认的三联密码子翻译后编码含有氨基酸残基序列NH3-Trp-Asp-Tyr-Arg-His-Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Cys-Ile-Phe-Ser-Arg-Asp-Gly-Val-Ser-Pro-Cys-Trp-Pro-Gly-Trp-Ser-Gly-Thr-Pro-Asp-Leu-Arg-Arg-Ser-Ala-Cys-Leu-Gly-Leu-Pro-Lys-Cys-Thr-Trp-Gly-COOH的任何蛋白质或融合蛋白质的DNA。
本发明所述的抗原是经采用人肺癌原发病灶建立表达cDNA文库，并通过肺癌病人血清筛选、削减抑制杂交筛选、去Ig背景筛选后获得的。对筛选获得的cDNA克隆进行核苷酸序列测定，表明获得的抗原至少，但不限于包含以下核苷酸序列(SEQ NO.2)TGGGATTACAGGCATGCACCACCACGCCTAGCTAATTTCTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTGGAACTCCTGACCTCAGGCGATCTGCCTGCCTCGGCCTCCCAAAGTGTACTTGGGGATGAGTTTTAAGAAAACAAAATCTGAAGTGGGTCAAGTCAATGTACCCAGCGAGAGCCTCGGTGGAAGCCTGTGAACGCGACGGTCCCAGGGACCTGGGCAAAGCTTCCAGGTCCAGCAGAGAGAGTTAAAGGTGGGGCCCCAGCACCTCAGGTGACCACCGAGGAAGGGAGACCCTCCTTGACACCCCAGCTTCATCCCATGCTTCTTCCTGATCCGATAGAAAAGCAAATGGCAATGGGGTGAATCCTGTCTCATCGCTCCTTCTGAAGCCCACCGTGGTCGCTTATGCTGATGGTGAGGCCCCCGGCTGCGTCCACGAGGCCTGCCCTACGCCATCCTCTCCCCAGCACCACCGCTCAGGCCTCCTCTGTGCTGCCCTGCTGCCCACGGAAGGCTCAGAGCAGCCGCTTTGCACATATTTATGGAATGAACGAACGAAGGGCAATAATACAGTAATAGTAATAGTAATGTTGACAGAGGCTGACATCCACTCAATGTCAGTTCCGTGCCGGTCCCTGCTGCGTGCATTCCATGCATATCAACTCATTTTATCCTCACTGCAAGCCTGTGAGGCAGGTCCTGTCATCATCCTCATTTCACAGCTGGGGAAACTGAGGCCCTGAGGCGTGTGCCATGCTGGCCATTGCGGGATCCTCCTGCAGCTTCTGTAACACGTGACCCCAAAGTGGGTGTTCATTCTCCTTCAGCTCTGGAGGCCTGAAGTCCACAGTCAAAGTGTCTCCAGGGCCATGCTCCCTCCGAAGGCCCTAGGAGAGGATCCTTCCTGCCTCTCCCAGCTTCCGGGGGCTCCAGGCGTCCCCTGGCTGTGGCCACATCGCTCCAGCTGCTGGCTCCTTGATGGCATGGCCTCCTCTCCTCGCTGGGTCTCAAATTTCCCTCTGCCATTCTCTGCTATTGGATTTATGGCCCACCTTAAATCCAGGATGATCTCATCCAGAGATGTTTAACTTCATTCCCTCTGCGAAGACCCTTCTTCCAAACAAGGCCACGTTCGCAGGCTCCAGGAGCATGTGGATCGGGGGCCACCGCTCAGCCTCTGCTCCCACCCTGAAGCTGCAGGTTGCGGTCCTGCAGGGCTTTGTGCAGGGGCCTGTCCCAGTGGTTAGGGGAGCTTTGCAGGAGCACGGACCCAGGAGCGGGGGCCTGAAGCTGCTTCAGGGAGACAGCAGGACTAGGCTGCCCCAGGCACGGTGACTGGAGAATGTGCGGCGTGGGGACCCTTGTAGGGGAGCCCAGGGCTGAAGGACATAAGGTGTGGGTTTGGGCTCCCTCTGAGAACTGATGATCTCAGCGTGAACTGGAGGAGGCAGTGCCAGGGGCTCCGGCAAGATGAGCCCAGATCCTTCTGTGGC。
此核苷酸序列编码的氨基酸残基序列如下(SEQ No.3)-Trp-Asp-Tyr-Arg-His-Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Cys-Ile-Phe-Ser-Arg-Asp-Gly-Val-Ser-Pro-Cys-Trp-Pro-Gly-Trp-Ser-Gly-Thr-Pro-Asp-Leu-Arg-Arg-Ser-Ala-Cys-Leu-Gly-Leu-Pro-Lys-Cys-Thr-Trp-Gly-COOH。
将此核苷酸序列进行人类染色体同源性分析和人类染色体定位分析，采用的数据库和BLAST分析软件均由美国国立卫生研究院在万维网上提供。人类染色体同源性分析结果表明，该序列与人类第11号染色体工作草图序列片断NT 008992.4(Hsll 9149)中的第945208位到第946726位的核苷酸序列完全相同，同时人类染色体定位分析将该序列定位于人类染色体11q12区带上。进一步，对该抗原基因进行核苷酸序列同源性分析和蛋白质序列同源性分析，结果均显示目前尚未有与该抗原基因或蛋白明显相似的基因或蛋白质；人类染色体草图也显示在该抗原基因所处的位置无任何已知基因，甚至无任何通过初步的生物信息学分析确定的假想基因，这些结果表明该抗原确实是以前从未发现过的新抗原。
本发明还涉及一种含有如上所述的DNA序列的重组载体。
将本发明提供的这种新的人肺癌抗原的基因克隆入带有正确读码框的原核表达载体，通过IPTG诱导表达，提取包函体并初步纯化，获得了该肺癌抗原的重组蛋白。
本发明还涉及一种含有如上所述的SEQ NO.1 DNA序列的重组载体。以及含有该重组载体的宿主大肠杆菌，所述的宿主大肠杆菌已经于2001年9月4日在CGMCC保藏，其保藏号为NO.0620。
另外，本发明还涉及一种诊断试剂，其特征在于至少含有SEQ NO.1抗原。
本发明还涉及一种治疗或预防人肺癌药物组合物，其特征在于至少含有SEQ NO.1所述的抗原。
本发明还涉及一种用于治疗或预防人肺癌的药物，其特征在于其组分至少含有所述的SEQ No.2 DNA。
采用上述重组蛋白免疫家兔，最终获得了抗该抗原的抗血清。采用上述抗血清及免疫组织化学的方法，检测了30例人肺癌组织切片标本，结果显示30例标本中27例呈阳性反应，阳性率达90％，且染色部位位于肺癌细胞的细胞膜上，证明该抗原表达于多数肺癌细胞表面；同时还检测了正常人的各重要脏器、组织的组织切片，包括扁桃体、胸腺、淋巴结、骨髓、血细胞、肺、肝、肾、膀胱、脾、胃、肠、胰、腺、腮腺、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体脑、外周神经、卵巢、睾丸、皮肤、眼，结果在检测的3套正常组织切片中尚未见到阳性染色，证明该抗原至少是极少表达于正常组织。
将前述获得的该抗原的重组蛋白吸附于硝酸纤维素膜上，采用点杂交的方法检测肺癌病人血清中针对该抗原的人抗体。结果显示多数肺癌病人血清中均存在与该抗原结合的抗体，阳性率可达92％(231/250)。这些不仅说明该抗原在肺癌中表达的阳性率高，更说明该抗原具有激活人体体液免疫反应的能力，可以促使人体产生相应的抗体。进一步，收集了10例正常人和10例肺癌病人血标本，分离外周血单核细胞并进一步分离T细胞，将该抗原的重组蛋白加入刺激T细胞，采用3H掺入法测定T细胞的增殖活化。结果该抗原的重组蛋白对于正常人T细胞和肺癌病人T细胞均具有刺激增殖活化的作用。采用人MHC抗原肽分析预测软件分析该抗原的氨基酸残基序列，发现该抗原至少存在以下的可激活人细胞免疫和体液免疫的人MHC抗原肽基序DLRRSACL、PPRLANFCI、PPRLANFCIF、RHAPPRLAN、RHAPPRLANF、PRLANFCIF、LRRSACLGL、PRLANFCIFS、LRRSACLGLP、PRLANFCIF、PRLANFCIFS、DYRHAPPRL、DYRHAPPRLA、PPRLANFCI、HAPPRLANF、PPRLANFCIF、HAPPRLANFC。
综上所述，本发明提供了一种在人肺癌中表达阳性率高，而表达特异性也高，并且位于肿瘤细胞表面，同时又具有抗原性，可以激起人体抗肺癌免疫反应的能力，包括细胞免疫反应和体液免疫反应的新的人肺癌相关抗原。
根据本发明的第二个方面，提供一类抗上述的人肺癌抗原的抗体，这类抗体不仅可用于体外诊断人肺癌，其本身或其衍生物也可以用于在体内免疫导向诊断或治疗人肺癌。这类抗体包括多克隆抗体、鼠单克隆抗体、人-鼠嵌合抗体、全人抗体等，以及这些抗体的片段，和它们的衍生物，所指的衍生物包括但不限于偶联核素的抗体、偶联化学药物的抗体、偶联脂质体的抗体、融合药物前体酶的抗体、融合其它效应分子的抗体等。
根据本发明提供的新的人肺癌抗原，很容易获得其相应的各种抗体及衍生物。可以通过以下方法获得相应的各种抗体，但不只限于下列方法。采用该抗原免疫家兔，在检测兔血清中相应的特异抗体的含量后，处死动物获得抗血清，经过常规的抗体纯化即可获得抗上述的人肺癌抗原的多克隆抗体。采用该抗原免疫小鼠，在检测鼠血清中相应的特异抗体的含量后，处死动物获得脾细胞，经过与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，再经抗原特异性试验筛选，即可获得鼠单克隆抗体。将鼠单克隆抗体的可变区基因克隆，并与相应的人恒定区正确连接后，再次克隆入真核表达载体并导入真核细胞表达，即可获得人-鼠嵌合抗体。采用该抗原筛选人噬菌体抗体库，或采用人外周血单核细胞嵌合小鼠技术，可获得相应的全人抗体。
根据本发明的第三方面，本发明还提供了所述的人肺癌抗原及相应抗体或衍生物在制备人肺癌诊断、治疗、预防药剂中的应用。
该人肺癌抗原本身或其融合蛋白、重组蛋白即可用于肺癌的诊断。采用该抗原可以利用蛋白杂交或酶联免疫吸附试验等方法检测患者血清或其它体液、分泌液、器官洗液中相应抗体的含量，根据其相应抗体含量的高低即可对肺癌进行初步的诊断。该人肺癌抗原本身或其融合蛋白、重组蛋白不仅可以用于诊断，也可以用于治疗、预防肿瘤。根据该抗原的氨基酸残基序列，可以构建含有前述序列的重组蛋白或抗原肽，这些重组蛋白或抗原肽激起的人体免疫反应与该人肺癌抗原所激起的免疫反应相同或极相似。因而该人肺癌抗原本身或其相应的重组蛋白及抗原肽均可以作为肿瘤疫苗，激起人体抗肺癌的免疫反应，加强对肺癌细胞的杀伤作用，从而达到预防或治疗肺癌的目的。
该人肺癌抗原的各种相应抗体均可用于肺癌的诊断之中。例如，可用于组织标本的免疫组化染色来进行诊断，可用于组织匀浆液及各种体液、分泌液中该抗原含量的检测来诊断。此外，单独的相应抗体还可能具有直接治疗肺癌的用途。
该人肺癌抗原的各种相应抗体的衍生物可以用来免疫导向诊断或治疗肺癌。标记有核素或化疗药物的抗体可以将核素或化学药物带到肺癌组织局部，从而减少核素或化疗药物的毒性，大大增加它们杀伤肺癌细胞的作用。标记有核素的抗体还可以将肿瘤的影像在伽玛照相机下显示出来，达到免疫导向诊断的目的。纳米磁性颗粒偶联的抗体将纳米磁性颗粒浓聚于肺癌病灶局部，不仅可在X光、CT、核磁共振下显像肿瘤，起到诊断的作用，还可以在高频交变磁场的作用下发热，杀伤周围的肺癌细胞，起到治疗肺癌的目的。将该抗原相应抗体与效应分子融合，如毒素PE40，可以将效应分子浓聚于肺癌病灶，使效应分子最大程度地发挥作用，起到治疗人肺癌的作用。
总的来说，利用本发明提供的前述人肺癌抗原相应抗体，就可以方便地生产目前已知的各种衍生物用于肺癌的诊断、治疗。
它是标记188Re的新的人肺癌抗原相应单克隆抗体静脉注射荷人肺癌裸小鼠后32小时肿瘤显像的图像，图中“+”表示肿瘤所在的位置。
实施例1新的人肺癌抗原重组蛋白的制备将新的人肺癌抗原的cDNA的5’-端通过平端连接如下接头序列5’-AATTCGGCACGAG-3’3’-GCCGTGCTC-5’加上EcoR I酶切位点粘端，将其3’-端通过poly A互补合成加上Xho I酶切位点。将此cDNA序列采用Xho I酶切后克隆入已预先采用EcoRI和Xho I酶切后的pBluescript SK(+/-)原核表达载体中。EcoR I和XhoI双酶切鉴定重组表达载体，筛选双酶切切出约1.5kb的抗原cDNA片段的克隆。这个克隆就是含有本发明人肺癌抗原cDNA序列的重组表达质粒的克隆，它命名为pBL-51。采用碱裂解法大量提取质粒，以0.1μg的DNA转化DH5α大肠杆菌，得转化后的大肠杆菌pBL-51/DH5α，既大肠杆菌CGMCC NO.0620。碱裂解法小量提取质粒鉴定转化克隆。挑取转化克隆，在LB培养基中培养至OD600约0.6，加入终浓度为2mM的IPTG诱导表达，4小时以后离心收获菌体。超声波震荡破碎菌体，离心收集沉淀，沉淀为含有目的抗原蛋白的包函体。8M尿素溶解沉淀，4度放置12小时以上，离心去除不溶物，上清对含2M尿素的缓冲液透析，4度透析12小时，再对含0.2M尿素的缓冲液透析，4度透析12小时，再对含0.02M尿素的缓冲液透析，4度透析12小时，再对不含尿素的缓冲液透析，4度透析12小时。离心去沉淀，Lowrry法测定蛋白含量，获得新的人肺癌抗原的重组蛋白。
实施例2新的人肺癌抗原相应抗体的制备(一)兔多克隆抗体采用2mg新的人肺癌抗原的重组蛋白混合完全福氏佐剂多点皮下免疫新西兰家兔，4周后采用1mg重组蛋白混合完全福氏佐剂多点肌肉加强免疫，3周后再次采用1mg重组蛋白混合完全福氏佐剂多点肌肉加强免疫，10天后采血测效价，发现效价＞1∶106，处死动物采血，采用凝结法收集血清，低速离心去沉淀。用生理盐水1∶2稀释，上Protein A亲和层析柱纯化，pH2.8的0.1M甘氨酸缓冲液洗脱，1M Tris中和后对PBS透析3次，检测OD280定抗体含量，获得抗新的人肺癌抗原的兔多克隆抗体。
(二)小鼠单克隆抗体采用100μg新的人肺癌抗原的重组蛋白混合完全福氏佐剂皮下免疫BALB/C小鼠，4周后采用50μg重组蛋白混合完全福氏佐剂腹腔加强免疫，4周后再次采用50μg重组蛋白混合完全福氏佐剂腹腔加强免疫，总共3次加强免疫，10天后采血测效价，发现效价＞1∶106，处死动物，收集脾组织，使其通过100目的筛网分离为单细胞。采用50％的PEG促融合法将500万脾细胞与100万SP2/0细胞融合，融合后采用HAT培养基进行筛选培养。培养1周后采用人肺癌抗原的重组蛋白包被的ELISA进行筛选，阳性克隆连续进行亚克隆，筛选稳定分泌特异抗体的克隆，获得抗新的人肺癌抗原的鼠单克隆抗体。
(三)人-鼠嵌合抗体收集杂交瘤细胞，PBS洗涤3次。采用Trizol一步法提取杂交瘤细胞总RNA或mRNA后，用Gibco BRL公司生产的MMLV-反转录酶合成cDNA。以合成的cDNA为模板采用P1和P2引物(P15′-GACAT TCAGC TGACC CAGTC TCCA-3′.P25′-GTTAG ATCTCCAGCT TGGTC CC-3′)在高精度DNA聚合酶Taq+pfu作用下进行聚合酶链式反应(PCR)扩增抗体轻链可变区基因(VL)，约320bp大小；用同样方法，采用P3和P4引物(P35′-AGGTS MARCT GCAGSAGTCW GG-3′(S＝C/G，M＝A/C，R＝A/G，W＝A/T)P45′-TGAGGAGACG GTGAC CGTGG TCCCT TGGCC CCAG-3′)扩增抗体重链可变区基因(VH)，约360bp大小。分别回收PCR扩增获得的抗体VL和VH基因后，用内切酶Pvu II和Bgl II酶切VL基因，用内切酶PstI和BstE II酶切VH基因。将酶切后的VL基因与已经内切酶Pvu II和Bgl II酶切过的该真核高效表达系统pYR-GKES中的通用型配套克隆载体pYR-GCVL的大片段在T4 DNA连接酶(New England公司)作用下连接后，转化大肠杆菌DH5α的感受态细菌。将酶切后的VH基因与已经内切酶Pst I和BstE II酶切过的通用型配套克隆载体pYR-GCVH大片段在T4 DNA连接酶作用下连接作用下连接后，转化大肠杆菌DH5α的感受态细菌。从VL和VH转化后的细菌平板中分别各挑取12个细菌克隆，采用小量快速质粒提取法，提取质粒DNA用Pvu II和Bgl II酶切筛选鉴定分析已插入有抗体VL基因的正确的重组克隆，用Pst I和BstE II酶切筛选鉴定分析已插入有抗体VH基因的正确的重组克隆。用Qiagen公司的中量质粒提取试剂盒，分别提取纯化2个上一步所获得正确的VL和VH重组克隆的质粒DNA。采用P5和P6弓I物(P55′-GCTCG GAAGC TTGAA TTCGG ATCCATGAAT ATGCA AATCC TCTG-3′，P65′-GGGTC CAAGC TTGCGGCCGC AACTG AGGAA GCAAA GTTTA AATTC TACTC ACGTTTGATC ACCA-3)，在Taq-pfu聚合酶的作用下进行PCR扩增反应，从含有抗体VL基因的通用型配套克隆载体中扩增含翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽、抗体VL基因以及5′内含子剪接位点的片段，且该片段两端分别带有BamH I和Not I内切酶酶切位点，大小约0.76kb。分离回收PCR扩增的该0.76kb片段，用内切酶BamH I和Not I酶切该片段。用BamH I和Not I内切酶酶切全分子抗体轻链表达载体pYR-GCEVL质粒DNA(该载体含PhCMV-IE强启动子、BGH polyA强终止子、多克隆酶切位点、选择标志基因neo基因、被弱化的驱动选择标志基因neo表达的SV40启动子和增强子以及人抗体轻链恒定区基因组序列Cκ，分离回收酶切后的大片段。在T4 DNA连接酶的作用下，经过BamHI和Not I酶切过的0.76kb的VL PCR片段与用同样内切酶酶切回收的pYR-GCEVL的DNA片段连接，再转化大肠杆菌DH5α感受态细菌。用内切酶BamH I和Not I酶切筛选分析鉴定含有0.76kb的VL片段的重组克隆，这时所获得正确重组克隆即为完整的鼠-人嵌合抗体轻链真核高效表达重组载体，称为pYR-GCEVL-C。它含选择标志基因neo、被弱化了的驱动选择标志基因表达的启动子SV40启动子和增强子、翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽、5＇内含子剪接位点序列、VEGF鼠单抗的VL基因、人抗体轻链恒定区基因组序列Cκ和3′内含子剪接位点序列、驱动嵌合抗体轻链基因高表达的强启动子PhCMV-IE、强转录终止子BGH poly A。提取纯化该重组克隆的质粒DNA。与嵌合抗体轻链真核高效表达重组载体的构建程序相同，以获得的经核苷酸序列测定证明是含有已重排的、具有功能的VH基因的通用型配套重组克隆载体质粒DNA为模板，采用P7和P8引物(P75′-GCTCG GAAGC TTGAA TTCGGATCCA TGAAT ATGCA AATCC TCTG-3′，P85′-GGGTC CGAATTCGCG GCCGC TATAA ATCTC TGGCC ATGAA G-3′)，在Taq-pfuDNA聚合酶作用下进行PCR扩增反应，扩增含翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽、VEGF抗体VH基因及5′内含子剪接位点序列的约0.96kb的DNA片段，分离回收该0.96kb的片段后，用内切酶BamHI和Not I酶切该片段。用内切酶BamH I和Not I酶切本发明的全分子抗体重链表达载体pYR-GCEVH质粒DNA(该载体含有PhCMV-IE启动子、强转录终止子BGH poly A、多克隆酶切位点、可扩增选择标志基因dhfr、被弱化的驱动dhfr基因表达的SV40启动子和增强子以及人抗体重链恒定区基因组序列Cγl，分离回收酶切后的大片段DNA。用T4 DNA连接酶连接经BamH I和Not I酶切后的0.96kb的VH PCR片段和pYR-GCEVH的大片段，转化DH5α感受态细菌，用内切酶BamH I和Not I酶切筛选分析鉴定含有0.96kb大小的VH片段的重组克隆，这时所获得的正确重组克隆即为完整的鼠-人嵌合抗体重链直核高效表达重组载体，称为pYR-GCEVH-C。它含有可扩增选择标志基因dhfr基因、被弱化的驱动dhff基因表达的SV40启动子和增强子、翻译型增强子、优化的抗体分泌信号肽、5′内含子剪接位点序列、VEGF鼠单抗VH基因、人抗体重链恒定区基因组序列Cγ1和3’内含子剪接位点序列、驱动嵌合抗体重链基因高表达的强启动子PhCMV-IE、强转录终止子BGH poly A。提取纯化该重组克隆的质粒DNA。将含有抗体VL基因以及人抗体轻链恒定区基因组序列Cκ的嵌合抗体轻链基因的真核高效表达重组克隆pYR-GCEVL-C的质粒DNA与含有抗体VH基因及人抗体重链恒定区基因组序列Cγl的嵌合抗体重链基因的真核高效表达重组克隆pYR-GCEVH-C的质粒DNA，在LipofectAMINE的作用下共转染CHO-dhfr-细胞，然后在含10％胎牛血清的DMEM培养基中5％CO2、37℃培养72小时。转染并培养72小时后的CHO-dhfr-细胞，采用含200μg/ml G418和撤除HT(H，次黄嘌呤；T，是胸腺嘧啶)的培养基选择培养，以筛选neo基因和dhfr基因表型均阳性的抗性细胞。这些抗性细胞既含有带选择标志基因neo的嵌合抗体轻链基因，也含有带有可扩增选择标志基因dhfr的嵌合抗体重链基因，故能表达完整的嵌合抗体。待抗性细胞生长良好后，用夹心ELISA法检测抗性克隆细胞上清中嵌合抗体的表达量。将生长良好的抗性细胞用有限稀释法进行亚克隆，抗性细胞按1.5个细胞/孔接种96孔培养板，共接种5-10块板，在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，约2-3周长出单个抗性克隆。用夹心ELISA法检测单个抗性克隆上清中嵌合抗体的表达量，选择表达产量最高的单个克隆扩大培养，加含3×10-8mol/L的MTX(氨甲喋呤)的DMEM培养基进行加压扩增培养，待细胞适应3×10-8mol/LMTX的培养后，采用夹心ELISA法检测细胞培养上清中嵌合抗体产量。按前述方法再进行亚克隆，选择表达产量最高的克隆细胞，再加含1×10-7mol/L的MTX的培养基进一步加压扩增表达培养，亚克隆后，同前再进行1×10-6mol/L MTX的加压扩增表达培养，同前再进行1×10-5mol/L MTX加压扩增表达培养，完成嵌合抗体的高效表达，获得抗新的人肺癌抗原的人-鼠嵌合抗体。
(四)全人抗体选取10个在点杂交中血清滴度大于1∶500的病人，各抽取10ml血，分别采用Ficol 400密度梯度离心的方法分离外周血单核细胞，分离后合并使用。具体的，采用1倍体积的PBS稀释血标本，在50ml离心管中加入2倍体积的Ficol 400淋巴细胞分离液，再小心加入稀释后的血标本，1700rpm水平离心20min，小心吸取发白的单核细胞层，采用20ml PBS洗涤3次，每次2000rpm离心10min。所有样品合并计数备用。6周龄雌性SCID小鼠于移植前1日经250cGy致死性放射照射，次日于腹腔注射1×108肿瘤病人外周血单核细胞。嵌合小鼠于移植的次日接受腹腔注射50μg/0.4ml的该抗原重组蛋白，并在2周后再次接受腹腔注射50μg/0.4ml的抗原重组蛋白。小鼠分别在移植的-1，1，7，14，17天取尾静脉血检测血清中相应特异人抗体的含量。具体的，采用抗原包被的直接ELISA法进行测定。断颈法处死小鼠，将小鼠固定在平板上解剖。剪开腹部皮肤和腹膜，以RNase free的眼科剪刀剪下脾脏，并剪去其它非脾组织。精确称量200mg脾组织，置于RNase free的研钵中。先以RNase free的眼科剪刀初步剪碎组织，加入1ml的TRIZOL试剂，冰上研磨至细胞完全裂解、无明显细胞团块，将裂解后的液体吹打均匀后以0.5ml/管吸至RNase free的1.5ml微量离心管中，再以1ml的TRIZOL试剂洗涤研钵和研棒，吹打均匀后以0.5ml/管吸至先前的离心管中。室温(15℃-30℃)静置5min，每管加入0.2ml RNase free的氯仿，盖好盖子，用手有力地摇震15s，室温(15℃-30℃)静置3min。4℃下12000g(12000rpm)离心15min，小心地吸取上层无色的水相大约0.45ml，转移至新的RNase free的1.5ml微量离心管中。加入0.5ml RNase free的异丙醇，混匀，室温(15℃-30℃)静置10min。4℃下12000g(12000rpm)离心10min，小心地吸弃上清，加入1ml RNase free的75％乙醇，室温(15℃-30℃)静置1min。4℃下7500g(9000rpm)离心5min，小心地吸弃上清，空气干燥5-10min，至RNA沉淀已经开始干燥，但又不能完全干燥。加入50μl RNase free的水，吹打溶解RNA沉淀。必要时置于55℃水浴中温浴10min。精确地取lμl进行0.7％的琼脂糖电泳，对照分子量标准、各条带的荧光强度以及条带间的弥散带情况判断总RNA降解情况。精确地取5μl，以RNase free的水稀释至500μl，测量OD260、OD280，计算RNA浓度，以及A260/280，判断RNA的纯度。合成cDAN按MMLV-反转录酶说明书进行。简要的步骤如下在20μl的体系中加入5′缓冲液4μl，10mM DDT，10μg总RNA，终浓度0.5mM的dNTP，终浓度10μg/ml的Oligo d(T)15，40u RNasin，200u MMLV-反转录酶，混匀。37℃水浴1小时，沸水浴5分钟灭活反转录酶。采用PCR的方法扩增抗结肠癌人抗体可变区基因，具体的，准备好PCR反应离心管、枪头、冰。准备好cDNA模板、引物、dNTP Mix、10×缓冲液、MgSO4，置于冰上化冻。在冰上准备PCR反应，依次在0.5ml离心管中加入68μl水，10μl 10×缓冲液，10μl cDNA模板，各3μl相应引物，3μl 10mmol/LdNTP Mix，2μl 50mM MgSO4，1μl(2.5u)Pfx酶，混匀，再加50μl矿物油封闭。将混合好的样品管放入Techgene型PCR仪上，设定好程序94℃预变性5min，94℃变性20s，55℃退火40s，68℃延伸1min，35个循环，最后一个循环延伸时间为10min。启动程序。待程序结束后取出样品管，取出5μl样品进行核酸琼脂糖电泳分析，拍照存档，其余样品冻存于-20℃备用。采用1％的琼脂糖凝胶上样电泳，在紫外分析仪下观察，记录结果，拍照存档。在可分泌型Fab噬菌体抗体库的构建中，由于PCR扩增κ链所用的5’引物和3’引物分别含有内切酶SacI和XbaI的识别序列；扩增Fd段所用的5’引物和3’引物为分别含有内切酶XhoI和SpeI的识别序列，载体p3MH上也有相应的酶切点，所以构建x链库时选用SacI和xbaI酶切载体和κ链基因的PCR产物，构建Fd段库时选用SpeI和XhoI酶切载体和Fd段基因的PCR产物，构建抗体库的具体的过程如下200μl反应体系中加入经纯化的5μg质粒或2μgPCR产物、相应的内切酶(用量见下表)和厂商提供的缓冲液，37℃消化3hr，琼脂糖凝胶电泳分离，电洗脱纯化。限制性内切酶质粒(1μg)PCR产物(1μg)Spel 3U 17UXhol 9U 70USacl 5U 35UXbal 9U 70U然后将Fd和κ链基因先后重组到载体相应的内切酶位点，重组程序如下将酶切、纯化的1.5μg载体，加入经酶切、纯化的600ng抗体基因片段(Fd或κ)酶切产物，在T4DNA连接酶的作用下连接过夜，酚/氯仿抽提后，加1/10体积的3M NaAc(pH5.2)，2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀2hr，4℃离心15000rpm 10min，弃上清，70％乙醇漂洗，干燥后溶于20μl去离子水中，与300μl电穿孔感受态细菌混合，冰上静置10min后，加入电穿孔杯，2.5KV电穿孔转化，立即加入5ml SOC培养液，培养1hr后，取1μl适当稀释铺Amp盘(次日计算库容)。在组装第一条抗体基因链(Fd或κ)时，将剩余的细菌加到100ml含100μg/ml Amp和1％葡萄糖的LB中，培养过夜，次日提取质粒，作为载体继续按以上操作装入第二条链。在组装第二条抗体基因链(κ或Fd)的过程中，在完成电穿孔并培养1hr后，将细菌铺到2个直径15cm的Amp盘上，37℃培养过夜，次日各加10ml LB，刮下菌苔后混匀，取0.5ml加入含100μg/ml Amp的SB培养液中，37℃振荡培养2hr，加入约1012pfu的辅助病毒VCSM13后继续培养2hr，加入Km到70μg/ml过夜培养。离心收集上清，加入PEG8000至4％，NaCl至3％，冰浴30min后，12000rpm 4℃离心20min弃上清，以2ml冷的1％BSA/PBS溶解沉淀，再以12000rpm离心5min弃去不溶物，收集上清即为噬菌体抗体库。在构建含抗体一条链基因的载体时，用XL-1 Blue细菌电穿孔转化，以利于提取质粒作为下一步的载体，而构建含抗体两条链基因的载体时，选用TG-1细菌电穿孔转化，以利于抗体片段的折叠和分泌。将l-10μl经适当稀释的噬菌体抗体库加到100μl OD600约1的新鲜菌液中，室温放置15min，铺Amp盘，37℃培养过夜，计数集落，计算集落形成单位(cfu)。将该抗原重组蛋白以0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释至50μg/ml，以每孔100μl 4℃包被过夜。吸去包被液，以3％BSA 37严封闭1hr，吸去封闭液，加入100μl噬菌体抗体库液，37℃孵育2hr，弃去噬菌体抗体库液，以含0.05％Tween-20的PBS洗1次(第二轮筛选洗5次，以后各轮筛选洗10次，每次间隔5min)，蒸馏水洗一次，加入100μl洗脱液，室温静置10min，将洗脱液稍加吹打后立即加入6μl中和液中，移入2ml新鲜制备的TG-1细菌，室温静置15min进行感染，加入100ml含50ug/ml Amp的SB培养液37℃培养lhr，取1μl铺盘测定cfu，剩余培养液中补加Amp至100μg/ml，37℃继续培养1hr。加100ml含100μg/ml Amp的SB培养液在37℃培养1hr后，加入辅助病毒VCSM13，继续培养2hr，加入Km至70μg/ml，37℃培养过夜。用PEG8000和NaCl沉淀噬菌体，所得次级噬菌体抗体库可进行下一轮的筛选。挑取含有噬菌体抗体表达载体的TG-1菌落，接种于2ml含100μg/ml Amp的SB培养液中，37℃培养至OD600为0.3-0.4，加入辅助病毒VCSM13 10μl，振荡培养2hr，加入Km至70μg/ml培养过夜。次日离心收集上清，即为单克隆噬菌体抗体，4℃保存。最后获得抗新的人肺癌抗原的全人抗体基因及噬菌体抗体。
实施例3新的人肺癌抗原相应抗体衍生物的制备(一)核素-抗体偶联物(1)188Re标记新的人肺癌抗原相应鼠单抗SnCl2直接还原法标记抗体，立即快速薄层层析(ITLC)测定抗体的标记效率及放化纯度。标记后，ITLC实验表明188Re-抗体标记率为90％，放化纯度大于95％。188Re-抗体比活为356MBq/mg。ELISA测得188Re-抗体免疫活性为65％。标记抗体的体外稳定性实验表明，抗体在37℃孵育24hr，无论是在生理盐水还是人血清白蛋白中，放射性脱落都小于5％，示其在体外稳定。
(2)131I标记新的人肺癌抗原相应鼠单抗氯胺T法标记抗体，立即快速薄层层析(ITLC)测定抗体的标记效率及放化纯度。标记后，ITLC实验表明131I-抗体标记率为90％，放化纯度大于95％。131I-抗体比活为74MBq/mg，ELISA测得131I-抗体免疫活性67.3％。
(二)纳米磁性颗粒-抗体偶联物以纯水将直径约20-50nm的铁氧化物磁性颗粒超声分散，形成胶体状。按0.2g纳米磁性颗粒加入16mg抗体的比例加入溶于纯水的抗体，迅速搅拌混合，5min后加入终浓度为1％的BSA，离心并采用1％的BSA洗涤后备用。
实施例4采用新的人肺癌抗原直接诊断肺癌取浓度为400μg/ml的新的人肺癌抗原重组蛋白，点样于0.45μm硝酸纤维素膜上。经过含1％BSA的TBS封闭(25℃温育1小时)，加入1∶200的肺癌患者血清反应，对照组加入1∶200的婚检健康者血清反应(25℃温育2小时)，患者与对照组血清均经过细菌吸收处理。然后用TBST充分漂洗3次，每次洗5分钟，然后加入1∶12000稀释度的羊抗人IgG-碱性磷酸酶反应(25℃温育1小时)，用TBST充分漂洗3次，每次洗5分钟，最后再用TBS漂洗1次，NBT/BCIP显色2分钟。
结果250例患者标本中有231例呈现阳性显色反应，而200例正常人中阳性率仅为4.5％。
实施例5采用新的人肺癌抗原作为肿瘤疫苗取肺癌患者术前外周血每例4ml，肝素抗凝，将抗凝血用pH 7.4Hanks液1∶1稀释，取比重为1.076聚蔗糖-泛影葡胺分层液置于无菌离心管内，用毛细吸管吸取与分层液等体积的稀释液，在离分层液1cm处，沿试管壁缓慢加入，使稀释血液重叠于分层液上。用水平离心机以1750转/分离心15分钟，用毛细吸管轻轻插至白膜层，沿试管壁周缘吸出界面层细胞，移入另一试管中。用5倍体积的Hanks液离心洗涤三次，每次以1500转/分离心10分钟。最后将细胞重悬于1mlRPMI1640培养基中。制备尼龙毛柱，用0.2M盐酸浸5小时，用双蒸水冲洗后，将尼龙毛置于烧杯内，加去离子水煮沸10分钟，将尼龙毛置于漏斗内滴干，重复上述过程6次。称取0.5g，松散均匀地装入10ml注射器内，高压灭菌。用前时柱内加入培养基，关闭阀门，37℃静置1小时，用RPMI1640培养基10ml洗柱。将上述细胞悬液加入柱内，关闭阀门，置37℃孵育1小时。然后用37℃预温的RPMI1640培养基10ml洗柱2次，流速为每秒1滴。洗脱液中富含T细胞。最后用冷的RPMI1640培养基10ml洗柱2次，边洗边挤压，洗脱液中富含非T细胞。上述收集的细胞悬液离心后，计数并调整细胞浓度至1×106/ml，非T细胞管内加入丝裂霉素C处理，终浓度为25mg/ml，37℃、5％CO2、饱和湿度下孵育30分钟，用RPMI1640完全培养基洗3次，并调整细胞浓度至2×106/ml，此细胞作为自身抗原递呈细胞。在96孔圆底细胞培养板内，每孔加入100ml T细胞悬液和50μl抗原递呈细胞悬液。每孔分别加入50μl新的肺癌抗原重组蛋白，终浓度分别为0、100、200、400、800、1,600、3,200、6,250、12,500、25,000、50,000ng/ml。37℃、5％CO2孵育8天。结束培养前18小时掺入3H-标记甲基胸腺嘧啶，每孔掺入0.5μCi。用96孔细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤纸上，反复冲洗培养孔，滤纸静置过夜干燥。将干燥的滤纸片加入液闪杯内，每杯含5ml闪烁液。在液体闪烁计数仪上测定cpm值。采用χ2检验、t检验和方差分析统计相关资料。
结果10例肺癌患者和10例正常人的结果如下蛋白浓度 患者cpm(X±SD)正常cpm(X±SD)(μg/ml)0.1 1232±734 5605±11460.2 1420±302 6687±12530.4 1748±507 8284±14890.8 2637±10108393±15271.6 5889±26809815±17413.2 8870±37599943±23476.4 14765±4439 12170±298412.8 17382±4960 16913±365825.6 19444±5955 20584±407251.2 20830±5386 27005±5925结果经过统计学的方差分析显示，肺癌患者T细胞能够对自身抗原递呈细胞加工处理的新的肺癌抗原重组蛋白发生应答反应，而且，这种应答反应呈明显的计量依赖关系，随着蛋白浓度的增加T细胞增殖也随之增加，当新的肺癌抗原重组蛋白浓度为1.6μg/ml时，T细胞增值反应更为明显，而相应各浓度的菌体蛋白对T细胞增值均无明显的刺激作用。显示新的肺癌抗原重组蛋白是免疫原性较强的肺癌肿瘤抗原，具有激活人T细胞的能力，因而具有作为治疗性和预防性肺癌肿瘤疫苗的潜力。
实施例6采用新的人肺癌抗原相应抗体诊断肺癌采用常规免疫组化方法，石蜡切片，以马血清封闭，一抗采用实施例2制备的兔抗新的人肺癌抗原抗体，二抗采用羊抗兔IgG-HRP，DAB显色，苏木精复染。
结果30例肺癌标本中可见27例标本呈阳性染色，且染色部位位于细胞膜上及少量胞浆。而3套正常人的扁桃体、胸腺、淋巴结、骨髓、血细胞、肺、肝、肾、膀胱、脾、胃、肠、胰、腺、腮腺、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体脑、外周神经、卵巢、睾丸、皮肤、眼切片均未见阳性染色。
以上结果说明该人肺癌抗原在肺癌组织多数表达，而在正常组织至少是极少表达，对肺癌来说特异性好，阳性率高。
实施例7采用新的人肺癌抗原相应抗体衍生物体内诊断肺癌采用实施例3制备的188Re-抗体，尾静脉注射18.5MBq(0.1ml)/只荷人肺癌的SCID小鼠(肿瘤直径0.5-1.0cm)，分别于9、20、32、47小时在伽玛相机下观察。
结果注射188Re-抗体9hr后，肿瘤区域即可见到明显浓聚，肿瘤开始显影，但腹腔仍有较强的放射性浓聚，应为肾脏所致。随时间延伸，肿瘤区域进一步浓聚，其余部位则有所降低。20hr后即可获得清晰的图像，此时肿瘤部位已呈现为最强的放射性热区，可清晰显示出肿瘤的轮廓及大小，肾脏显影已明显减弱，表现为次强的放射性热区。至32hr后，肿瘤显影效果进一步加强，肾脏部位放射性只表现为比背景区域稍强。至47hr后，背景放射性进一步减弱，肿瘤部位仍显示为最强的放射性热区，肾脏部位放射性已与背景放射性基本持平，但由于同位素的衰变，所需显影时间已明显延长。附

图1为一只鼠在32hr时显影的图像。结果同时显示对于最大径达0.5cm的肿瘤就可获得清晰的图像。以上结果显示抗新的人肺癌抗原抗体偶联核素在免疫导向诊断肺癌中有非凡的应用潜力。
实施例8采用新的人肺癌抗原相应抗体衍生物体内导向治疗肺癌取荷人肺癌SCID鼠24只，测量并计算肿瘤体积后，按肿瘤体积随机分为3组，每组8只。第一组为PBS对照组，每只腹腔注射200μlPBS；第二组为人IgG对照组，每只腹腔注射9.25MBq(200μl)131I-人IgG；第三组为131I-抗体治疗组，每只腹腔注射9.25MBq(200μl)131I-抗体。治疗后10天，处死动物，分离肿瘤，称取肿瘤重量，计算抑瘤率，抑瘤率＝(对照组瘤重量-治疗组瘤重量)/对照组瘤重量×100％。显著性检验采用t检验。
结果PBS瘤重0.86±0.4g，人IgG对照组0.83±0.37g，标记抗体治疗组0.36±0.15g，标记抗体的抑瘤率为58.9％，P值小于0.01。这些结果显示抗新的人肺癌抗原抗体偶联核素在免疫导向治疗肺癌中有重要的应用价值。
权利要求
1.一种人肺癌细胞表面抗原，其特征为含有以下氨基酸残基序列(SEQ No.1)NH3-Trp-Asp-Tyr-Arg-His-Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Cys-Ile-Phe-Ser-Arg-Asp-Gly-Val-Ser-Pro-Cys-Trp-Pro-Gly-Trp-Ser-Gly-Thr-Pro-Asp-Leu-Arg-Arg-Ser-Ala-Cys-Leu-Gly-Leu-Pro-Lys-Cys-Thr-Trp-Gly-COOH。
2.如权利要求1所述的抗原，其中所述的抗原为天然抗原或者重组蛋白抗原。
3.如权利要求1所述的抗原，其中所述的抗原为可刺激人体抗人肺癌免疫反应的抗原。
4.如权利要求1所述的抗原，其中所述的抗原为可作为抗人肺癌免疫导向治疗的靶的抗原。
5.一种编码如权利要求1所述抗原的氨基酸残基序列的DNA序列。
6.如权利要求5所述的DNA序列，它至少可以包括以下核苷酸(SEQ NO.2)TGGGATTACAGGCATGCACCACCACGCCTAGCTAATTTCTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTGGAACTCCTGACCTCAGGCGATCTGCCTGCCTCGGCCTCCCAAAGTGTACTTGGGGATGAGTTTTAAGAAAACAAAATCTGAAGTGGGTCAAGTCAATGTACCCAGCGAGAGCCTCGGTGGAAGCCTGTGAACGCGACGGTCCCAGGGACCTGGGCAAAGCTTCCAGGTCCAGCAGAGAGAGTTAAAGGTGGGGCCCCAGCACCTCAGGTGACCACCGAGGAAGGGAGACCCTCCTTGACACCCCAGCTTCATCCCATGCTTCTTCCTGATCCGAIAGAAAAGCAAATGGCAATGGGGTGAATCCTGTCTCATCGCTCCTTCTGAAGCCCACCGTGGTCGCTTATGCTGATGGTGAGGCCCCCGGCTGCGTCCACGAGGCCTGCCCTACGCCATCCTCTCCCCAGCACCACCGCTCAGGCCTCCTCTGTGCTGCCCTGCTGCCCACGGAAGGCTCAGAGCAGCCGCTTTGCACATATTTATGGAATGAACGAACGAAGGGCAATAATACAGTAATAGTAATAGTAATGTTGACAGAGGCTGACATCCACTCAATGTCAGTTCCGTGCCGGTCCCTGCTGCGTGCATTCCATGCATATCAACTCATTTTATCCTCACTGCAAGCCTGTGAGGCAGGTCCTGTCATCATCCTCATTTCACAGCTGGGGAAACTGAGGCCCTGAGGCGTGTGCCATGCTGGCCATTGCGGGATCCTCCTGCAGCTTCTGTAACACGTGACCCCAAAGTGGGTGTTCATTCTCCTTCAGCTCTGGAGGCCTGAAGTCCACAGTCAAAGTGTCTCCAGGGCCATGCTCCCTCCGAAGGCCCTAGGAGAGGATCCTTCCTGCCTCTCCCAGCTTCCGGGGGCTCCAGGCGTCCCCTGGCTGTGGCCACATCGCTCCAGCTGCTGGCTCCTTGATGGCATGGCCTCCTCTCCTCGCTGGGTCTCAAATTTCCCTCTGCCATTCTCTGCTATTGGATTTATGGCCCACCTTAAATCCAGGATGATCTCATCCAGAGATGTTTAACTTCATTCCCTCTGCGAAGACCCTTCTTCCAAACAAGGCCACGTTCGCAGGCTCCAGGAGCATGTGGATCGGGGGCCACCGCTCAGCCTCTGCTCCCACCCTGAAGCTGCAGGTTGCGGTCCTGCAGGGCTTTGTGCAGGGGCCTGTCCCAGTGGTTAGGGGAGCTTTGCAGGAGCACGGACCCAGGAGCGGGGGCCTGAAGCTGCTTCAGGGAGACAGCAGGACTAGGCTGCCCCAGGCACGGTGACTGGAGAATGTGCGGCGTGGGGACCCTTGTAGGGGAGCCCAGGGCTGAAGGACATAAGGTGTGGGTTTGGGCTCCCTCTGAGAACTGATGATCTCAGCGTGAACTGGAGGAGGCAGTGCCAGGGGCTCCGGCAAGATGAGCCCAGATCCTTCTGTGGCC。
7.一种含有如权利要求5或6所述的DNA序列的重组载体。
8.一种含有如权利要求7所述的重组载体的宿主大肠杆菌，它已经于2001年9月4日在CGMCC保藏，其保藏号为NO 0620。
9.一种诊断试剂，其特征在于至少含有如权利要求1所述的抗原。
10.一种治疗或预防人肺癌药物组合物，其特征在于至少含有如权利要求1所述的抗原。
11.一种用于治疗或预防人肺癌的药物，其特征在于其组分至少含有如权利要求5或6所述的DNA。
12.一种可与如权利要求1所述的抗原特异性结合的抗体。
13.如权利要求12所述的抗体，其特征在于该抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体。
14.如权利要求12所述的抗体，其特征在于该抗体为人抗体或者人抗体的片段。
15.一种由如权利要求12所述的抗体衍生而来抗体衍生物，包括核素-抗体偶联物、化学药物-抗体偶联物、毒素-抗体偶联物、前体药物酶-抗体偶联物、纳米颗粒-抗体偶联物。
16.一种如权利要求12所述的抗体在制备可用于体外诊断人肺癌或者免疫导向诊断或治疗人肺癌的药剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种新的人肺癌抗原的蛋白产物及其编码DNA，以及由此人肺癌抗原制备或筛选获得的抗体。构建肺癌组织与正常组织差异表达的cDNA表达文库，经削减抑制杂交等一系列手段去除背景，采用自体血清结合异体血清筛选的技术，最后获得了一种在人肺癌中特异表达，而正常组织极少表达的，且可以激起人体免疫反应的新的人肺癌抗原，该抗原以及编码该抗原的DNA片段可用于肺癌的诊断、预防和治疗。本发明进一步提供了该抗原的相应抗体、抗体片断及衍生物等在肺癌的诊断、预防和治疗中的应用。
文档编号A61K31/7088GK1406950SQ01131169
公开日2003年4月2日 申请日期2001年9月5日 优先权日2001年9月5日
发明者杨治华, 冉宇靓 申请人:中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所