专利名称：治疗肿瘤的自体免疫细胞及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学生物工程技术领域，是一种治疗肿瘤的自体免疫细胞及其制备方法。
背景技术：
众所周知，肿瘤目前已成为人类的第一杀手。正常人每天都可能产生突变的瘤细胞，只因为有自身免疫系统的防御监控作用而不发生肿瘤。大量研究资料表明肿瘤的发生和肿瘤细胞逃避免疫反应的主要机制有两方面，一方面是肿瘤细胞的免疫原性低，其主要组织相容性复合体MHC分子表达异常，使T细胞对抗原不能识别，因而不能激活T细胞杀伤肿瘤细胞；另一方面，由于肿瘤病人的抗原递呈细胞功能缺陷，无法有效地递呈肿瘤抗原，因此不能激发机体混合淋巴细胞反应和肿瘤特异性细胞毒性效应CTL反应，从而影响机体产生特异性的抗瘤排斥作用，造成肿瘤在体内不断生长，并广泛播散，最终影响多脏器功能。目前，临床上主要的治疗手段采用手术切除瘤体，放疗，化疗。放疗、化疗存在特异性差，毒副作用强，效果不确定等缺点，对于已发生转移的肿瘤病人，手术切除也不能取得令人满意的疗效。
发明内容
本发明针对肿瘤病人的抗原递呈细胞功能缺陷，以及肿瘤细胞免疫原性低，不能激发自身免疫系统的防御监控作用的特点，采用病人自体外周血中获得的单核细胞，加细胞因子，诱导并扩增出有效数量的抗原递呈细胞，并用自体肿瘤中提取的mRNA致敏此细胞制备出能够特异表达自体肿瘤抗原，并能高表达抗原递呈作用的抗原递呈细胞，进而调动自身免疫功能诱导出强烈的抗肿瘤免疫效应，实现抑瘤，杀瘤作用。其优点有(1)由于采用的是自体肿瘤抗原，其特异性强，安全性高，可明显诱导出抗自体肿瘤的特异性CTL，而对体内正常细胞无损伤作用，并有利于重建对该肿瘤的防御监控能力，防止复发。(2)由于治疗过程中所用细胞和mRNA均来源于病人自身组织，没有外源基因的导入，故可杜绝感染其他疾病的可能。(3)毒副作用小，和传统的放疗、化疗相比，运用该法无恶心、呕吐、脱发等不良反应，经试用可显著提高病人的生存质量。(4)从病人外周血中分离获得单核细胞，加入细胞因子来诱导并扩增有效数量的抗原递呈细胞的方法，易于操作。
本发明制备方法如下一、制备肿瘤组织mRNA1、制备组织匀浆将手术当时取下的鲜活瘤体组织，立即放置在液氮罐中，然后取出称重，并在低温状态下超声粉碎，得组织匀浆。
2、制备mRNA以每克组织加1ml的比例将mRNA提取试剂TRI201 REAGENT加入组织匀浆，混匀后吸到无菌离心管，在15-30℃孵育5分钟。再以每毫升TRI201 REAGENT加0.2ml氯仿的比例加入氯仿，加盖后快速颠倒混匀，在15-30℃孵育2-3分钟。在2-8℃下，以12000g离心15分钟，取上层无色水相至处理过的无菌离心管中。根据前面的TRI201 REAGENT加入量按每毫升加0.5ml异丙醇的比例在上清液中加入异丙醇，置15-30℃孵育10分钟。在2-8℃下以12000g离心10分钟。弃上清，沉淀中加75％酒精洗涤，加入量与前面加入的TRI201 REAGENT相同，混匀后在2-8℃下以7500g离心5分钟，弃上清，得mRNA沉淀，温室干燥后，溶于无RNA酶的去离子水中，置-70℃低温保存备用。
二、制备抗原递呈细胞1、制备白细胞在无菌条件下由静脉抽取病人外周血400ml，加柠檬酸-右旋葡萄糖ACD-A 125u/ml抗凝，用水平离心机以2800转/分离心10分钟，取白膜层得1-2×109个白细胞悬液备用。余下血浆及红细胞回输病人。
2、制备单核细胞用淋巴细胞分离液从上述收集的白细胞悬液中分离得到单核细胞，或直接用血细胞分离机从病人外周血收集3×107个单核细胞。用完全培养基悬浮细胞，以1×107个细胞/袋的数量分装入血袋培养，共三袋。37℃5％CO2孵箱培养2小时后，用贴壁法从单核细胞中分离获得贴壁的单核细胞。
3、制备抗原递呈细胞在获得的单核细胞中再加入含有细胞因子升白能(rhGM-CSF)20ug/ml，和白细胞介素-4(rhIL-4)8ug/ml的完全培养基100ml/袋，培养过程中，每3天以半量培养基换液一次，诱导生成所需的抗原递呈细胞。
三、制备治疗肿瘤的自体免疫细胞——负载肿瘤抗原的抗原递呈细胞在诱导生成所需的抗原递呈细胞期间，进行脂质体介导的肿瘤细胞mRNA转染抗原递呈细胞。首先将分离所得的单核细胞培养48小时，然后将制备好的肿瘤细胞mRNA20ul和脂质体20ul混匀，加入培养细胞中，进行脂质体介导的肿瘤细胞mRNA转染抗原递呈细胞，转染时间为4小时。按以上方法于培养的第5天再转染一次。培养第8天加肿瘤坏死因子TNF-α250ng/袋，促进负载肿瘤抗原的抗原递呈细胞的成熟。常规培养至该细胞成熟，收集成熟细胞，用生理盐水洗2次，以1500转/分钟离心10分钟。制备的细胞以5×105个/袋分装，每天静脉输入一袋，连输三天。
具体实施例方式一、制备肿瘤组织mRNA。
1、制备组织匀浆将手术当时取下的鲜活瘤体组织，立即放置在液氮罐中。然后取出称重，按常规在低温状态下超声粉碎，每次超声30秒，共50次，注意防止RNA的降解，得组织匀浆。
2、制备mRNA以每克组织加1ml的比例将TRI201 REAGENT加入组织匀浆，混匀后吸到无菌离心管，在15-30℃孵育5分钟。再以每毫升TRI201 REAGENT加0.2ml氯仿的比例加入氯仿，加盖后快速颠倒混匀，在15-30℃孵育2-3分钟。在2-8℃下，以12000g离心15分钟，取上层无色水相至处理过的无菌离心管中。根据前面的TRI201 REAGENT加入量按每毫升加0.5ml异丙醇的比例在上清液中加入异丙醇，置15-30℃孵育10分钟。在2-8℃下12000g离心10分钟。弃上清，沉淀中加75％酒精洗涤，加入量与前面加入的TRI201 REAGENT相同，混匀后在2-8℃下7500g离心5分钟，弃上清，得mRNA沉淀，温室干燥后，溶于无RNA酶的去离子水中，置-70℃低温保存备用。
二、制备抗原递呈细胞1、制备白细胞在无菌条件下由静脉抽取病人外周血400ml，加125u/mlACD-A抗凝，用水平离心机以2500g离心10分钟，取白膜层，得1-2×109个白细胞的细胞悬液。余下血浆和红细胞由静脉回输给病人。
2、制备单核细胞用淋巴细胞分离液从上述收集的白细胞悬液中分离单核细胞。具体方法为将获得的1-2×109个白细胞悬液以1∶1的比例用PH7磷酸缓冲液稀释，加入淋巴细胞分离液中，用水平离心机2500转/分钟离心15分钟，弃上清，用PH7.2的D-Hank’s缓冲液10ml分别洗细胞3次，以去除血小板，用完全培养基悬浮细胞，以1×107个细胞/袋的数量分装入血袋培养，共三袋。在37℃ 5％CO2孵箱培养2小时后，吸弃培养上清，用培养基轻轻洗培养板以去除非贴壁细胞，即获得贴壁的单核细胞。
3、制备抗原递呈细胞在每袋贴壁的单核细胞中加入含有细胞因子rh/GM-CSF20ug/ml和rhIL-48ug/ml的完全培养基100ml，培养过程中，每3天以半量培养液换液一次。诱导生成所需的抗原递呈细胞。
三、制备治疗肿瘤的自体免疫细胞——负载肿瘤抗原的抗原递呈细胞在诱导生成所需的抗原递呈细胞期间，进行脂质体介导的肿瘤细胞mRNA转染抗原递呈细胞。首先将分离所得的单核细胞在37℃ 5％CO2孵箱培养48小时，将培养基更换为无血清、无抗菌素的1640培养基，然后将制备好的肿瘤细胞mRNA20ul和脂质体20ul混匀，加入培养的单核细胞中，进行脂质体介导的肿瘤细胞mRNA转染抗原递呈细胞，转染时间为4小时。转染后立即更换含rhGM-CSF20ug/ml和rhIL-48ug/ml的完全培养基100ml继续培养。按以上方法于培养的第5天再转染一次。培养第8天，加入TNF-d 250ng/袋，促进负载肿瘤抗原的抗原递呈细胞的成熟。培养第11天，收集细胞。此细胞为肿瘤细胞mRNA致敏的抗原递呈细胞。经流式细胞仪鉴定此细胞的特异表面标志HLA-DR、HLA-ABC、CD83、CD40、CD80、Cdla，确定其为负载肿瘤抗原的成熟的抗原递呈细胞，亦即为本发明治疗肿瘤的自体免疫细胞。
临床使用时，收集成熟细胞，用10ml生理盐水分别洗2次，以1500转/分钟离心10分钟，所得细胞分装成5×105个/袋，由静脉输给病人，每天1袋连输三天。
权利要求
1.一种制备肿瘤自体免疫细胞的方法，其特征在于包括如下步骤(1)制备自体肿瘤组织mRNA；(2)从自体血分离制备单核细胞；(3)加细胞因子诱导扩增抗原递呈细胞；(4)用上述mRNA转染抗原递呈细胞得负载肿瘤抗原的抗原递呈细胞即肿瘤自体免疫细胞。
2.权利要求1所述制备方法所制得的肿瘤自体免疫细胞用于治疗肿瘤的用途。
全文摘要
本发明涉及医学生物工程技术领域,是一种治疗肿瘤的自体免疫细胞及其制备方法,包括制备自体肿瘤组织mRNA;由自体血分离制备单核细胞;加细胞因子诱导扩增抗原递呈细胞;再用肿瘤mRNA转染抗原递呈细胞即得负载肿瘤抗原的抗原递呈细胞,亦即治疗肿瘤的自体免疫细胞。本发明所得的免疫细胞因采用自体肿瘤和自体血制备,故特异性强、安全性高,毒副作用小,经试用可显著提高病人的生存质量。
文档编号A61P35/00GK1360025SQ01139230
公开日2002年7月24日 申请日期2001年12月26日 优先权日2001年12月26日
发明者许琳, 卢是月, 戴荣, 徐江英 申请人:中国人民解放军第二军医大学