专利名称：得自纤毛虫类的酶作为促进消化的药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗消化性病症的含有得自纤毛虫类(Ciliaten)的酶的药物。
消化性病症在一般的医疗和内科中所占的比重正不断增大。在许多病例中，这样的消化性病症是由于或多或少显著缺乏所谓的胰酶所致。在健康状态下，这些酶是由高度特异性的细胞-所谓的腺泡细胞在胰腺中合成的，并且通过胞吐作用经由涎腺和主要的胰腺管分泌到十二指肠内。胰腺每天的分泌量约为2升。除了消化脂肪的脂肪酶以外，胰腺分泌物还含有消化蛋白的酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶)以及消化碳水化合物的酶(α-淀粉酶)。胰酶的分泌是由内源性控制机制通过激素例如胃泌素、胰泌素和促胰酶素精确控制的。该控制系统可被多种原因扰乱，导致胰酶分泌减少或者外分泌胰腺功能完全平息。这会引起食糜在小肠中没有被消化，并发生消化性病症。还称为外分泌胰腺机能不全的这种消化道疾病可具有不同原因。除了由药物引起的消化不良以外，慢性萎缩性胃炎和慢性的通常由酒精消耗引起的胰腺炎、由手术(例如Billroth I和II、迷走神经切断术、胰腺切除术)引起的病症和囊性纤维变性是胰腺机能不全的病因学因素。无论如何，慢性消化性病症是严重的社会医疗问题，并由此引起经济损失，因为该病症经常引起患者工作能力受到限制或不能工作，并且预期寿命缩短。
胰原性消化性病症在患者中引起多种疾病例如腹泻、粪便结块、充满感、上腹部病、体重减轻等。
不论胰原性消化性病症或胰腺机能不全的原因和表现，用酶进行的替代治疗总是减轻消化性病症所必需的。这意味着缺乏的酶，主要是脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶以及其它酶必须从外面补充。在这样的治疗中，酶是由患者口服摄取的-主要是在吃饭中间服用，并经由胃到达小肠，在小肠中它们将食糜消化，并由此行使所缺乏的内源性胰酶的功能。所采用的制剂必须含有足量的酶。此外，酶必须在肠制剂中提供，具有小的粒径，并且可被消化道完全生物吸收。
为了治疗基于胰酶、尤其是主要的酶-脂肪酶和蛋白酶缺乏的消化道病症，市场上已经有了多种不同的酶制剂。这些酶制剂是部分基于得自猪的胰酶，例如制剂Combizym、Festal、Pankreon、Kreon、Panzytrat、Meteozym或Enzym-Lefax N，或基于胃酶例如Citrapepsin。部分地，酶制剂还含有得自霉菌提取物的酶例如Combizym和Festal。此外，现有技术中已描述了得自鱼或其它海洋动物的酶的应用(FR 1015566)，以及得自磷虾(磷虾目的甲壳纲动物)和毛鳞鱼胃肠道的酶制剂(US 4,695,457)。含有胰酶的制剂大部份是得自屠宰场废料例如猪的胰腺。制剂加工的终产品是胰酶。胰酶是得自胰腺组织(通常是猪的胰腺组织)的细胞的均化物。由于大量腺泡细胞被破裂，所以除了胰酶之外，其还含有多种其它酶和蛋白以及另外的高分子量和低分子量化合物。胰酶的组成取决于其工业化制备过程。为了获得胰酶，在屠宰后将猪的胰腺尽可能快地深度冷冻，收集并机械破碎。为了稳定和激活酶，向匀化物中加入各种添加剂。然后用有机溶剂例如丙酮脱脂，除去纤维性物质，脱水并通过冻干来干燥。为了制备特定剂型，将进行盖仑加工，将其制成微丸剂、片剂、胶囊、糊剂、霜剂、凝胶剂、油质制剂或其它制剂。通常将胰酶与各种载体材料和缓冲物质混合。此外，用酸稳定的膜或漆将粒状胰酶包衣以保护它们抗人胃液的低pH值。后两个加工步骤是为了保证酸不稳定的胰酶可在靶位点-十二指肠(小肠)实现其消化功能。
除了常规胰酶制备以外，可通过依次用氯仿、丁醇和丙酮连续萃取来提高终产品中的脂肪酶含量。按照与制备胰酶类似的方法，由磷虾Euphausia suberba和毛鳞鱼的肠获得了酶组合物(参见US-A-4,695,457)。对于这种情况，也是首先由组织制得匀化物，然后通过离心、用氯仿萃取、冷冻干燥和色谱步骤来进一步纯化。在每种情况下，加工的目的都是获得尽可能高的胰酶例如脂肪酶、蛋白酶和α-淀粉酶含量。此外，酶组合物应当尽可能地耐胃液以治疗消化性病症。此外，酶应当尽可能快地在消化道、尤其是十二指肠中释放，并表现出其生理活性。为了防止变应性，如果可能的话酶组合物应当不含有无效蛋白，或者具有高纯度。此外，胰酶加工应当在制药经济方面是低成本的。
对于胰酶，一般不进行通过色谱法的进一步纯化，这样所需的酶既不是以纯化的形式也不是以均一状态获得的。这样的得自细胞均化物的蛋白混合物的一个缺点是，它们含有多种得自猪胰腺细胞的细胞内隔室(例如胞质溶胶、细胞核、细胞器膜)的蛋白。这些蛋白不具有酶活性或不具有需要的酶活性，并因此降低了所提供的每个剂型中的活性物质的量。如果所考虑的细胞均化物是得自磷虾或毛鳞鱼的胃肠道，情况也是如此。
得自屠宰场废料(胰腺、鱼的胃肠道)和磷虾的酶制剂和酶组合物的另一个缺点是回收的不连续加工方式。通常是在不同的步骤中将器官(胰腺)粉碎并均化。然后将均化物脱脂和干燥。这些酶回收步骤不能连续操作，因为总是采用高含量的固体，这由于提取和离心步骤而排除了连续的进一步加工。然而，对于酶的回收，连续和半连续制备方法是最佳的，这是因为在这样的方法中时空产率较高，并且成本因此而降低。然而，连续回收酶需要它们在细胞外和呈溶解形式，并且无需通过粉碎或均化细胞才释放出来。因此，胰酶制备方法不适于连续回收酶。
从胰腺中获得的酶的另一个缺点是它们的酸不稳定性。胰酶是中性或碱性水解酶。这意味着，另一方面，它们的活性在pH7至pH8之间最大，并且其活性在酸性条件下显著下降。另一方面，低的pH值通过可逆或不可逆的变性使它们的催化功能失活。因此，必须通过包封或加入缓冲物质这样的特殊方法将得自胰腺的酶(胰酶)保护起来以在经过胃期间抗低pH值。这样的方法还增加了基于胰酶活性的药物的成本。
此外，对于特定的患有消化性疾病的患者组，使用胰酶的一个缺点是胰酶的起源。通常使用的是猪的胰腺，由于宗教指令的原因其不能被犹太人或伊斯兰教徒接受。
最后，得自猪的胰酶不能被具有猪蛋白变应性反应的消化性病症患者使用。此外，猪被认为是人致病性流感病毒的天然储藏者，这样不能排除具有这样的病毒的胰酶污染。
因此，本发明的目的是提供用于医药的酶或酶组合物，其中所述酶或酶组合物1)呈细胞外状态，并且可不用将组织或细胞均化(裂解)来由不含细胞的上清液获得和纯化；2)可由没有进行基因工程加工的无害微生物在生物技术方法中连续获得；3)是酸性水解酶，即在酸性pH值下具有其最大活性，并且对于酸的稳定性比得自胰腺的酶强；4)不是得自猪的组织或器官。
含有选自下列的得自纤毛虫类的酶的药物实现了本发明目的水解酶、脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、糖苷酶、磷脂酶、磷酸二酯酶、磷酸酶。
本发明特别涉及用于促进消化和用于治疗消化性病症的药物。
本发明药物优选含有用于在人或动物胃肠道中消化包含在食物中的大分子例如蛋白、核酸和碳水化合物以及其它食品组分例如脂肪和磷脂的酶。
本领域技术人员知道，不属于此前应用的脂肪酶、蛋白酶或淀粉酶的得自纤毛虫类的酶也可用于依据本发明促进消化或治疗消化性病症，因为其它酶也可以通过催化裂解食物组分来促进胃肠道中的消化。
在一个本发明实施方案中，酶的最佳pH是pH 4-6。
本发明药物优选含有源自四膜虫属(Tetrahymena)、豆形虫属(Colpidium)和草履虫属(Paramecium)的纤毛虫类的酶。
本发明药物优选含有药物安全的辅助剂和载体。
本发明药物特别是以片剂、微丸剂、油质制剂、汁液剂、凝胶剂、栓剂、胶囊、包衣片剂的形式使用。
本发明还涉及选自水解酶、脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、糖苷酶、磷脂酶、磷酸二酯酶和/或磷酸酶的得自纤毛虫类的酶在制备用于治疗消化性病症的药物中的应用，所述消化性病症尤其是由药物引起的消化不良、慢性萎缩性胃炎、慢性胰腺炎、急性胰腺炎、由手术引起的消化性病症(消化不良)或由囊性纤维变性引起的消化性病症。
由纤毛目原生动物产生的用于本发明药物中的酶非常适于治疗消化性病症。此外，包含在本发明药物中的得自纤毛虫类的酶和酶组合物及其制备不具有上述胰酶或得自毛鳞鱼或磷虾的酶的缺点。
酶由纤毛虫类释放到其周围的培养基内。例如，表1显示了不同酶纤毛虫类在培养基中的酶活性。表1所示的酶活性是用文献中描述的常规方法测定的。为了测定脂肪酶，使用偶氮酪蛋白试验(Muricane，1986)。脂肪酶和淀粉酶的测定是通过类似于FIP有关真菌淀粉酶和微生物脂肪酶的方法进行的(Demeester等人，“Pharmaceutical En-zymes”，A.Lauwers和S.Scharpé[编者]，Marcel Dekker，NewYork，1997，第372-382页)。为了测定酸性磷酸酶和β-氨基己糖苷酶，如Kiy等人(1996)所述，分别使用磷酸对硝基苯酯底物和对硝基苯基-N-乙酰基-β-D-葡糖胺底物。磷脂酶A1活性是用放射性酶试验(Hartmann等人，2000)测定的。
把酶释放到培养基中的纤毛虫类可以以低成本在便宜的发酵培养基中以高细胞密度连续发酵。可经由灌注组件(微滤器)将酶从发酵器中过滤出来以除去细胞，因此可将酶连续地从发酵培养基中取出。可通过不断补充便宜的营养培养基(组分脱脂乳培养基和酵母提取物)来在延长的时间内维持发酵过程。
实施例1附
图1显示了纤毛虫类的分泌动物学，是用14天的发酵时间代表的。对于具有灌注组件的连续发酵，采用下列操作生物反应器系统是基于具有数字式DCU控制部件和泵部件的处理器控制的2升发酵器(Biostat MD，Braun Diessel Biotech，Melsungen，Germany)。通过灌注组件收获不含细胞的上清液，使用桨式叶轮作为搅拌器。使用浓度为1ml/l的硅油。将搅拌器的每分钟转数限制为800rpm以防止破坏细胞。通过级联控制将溶解的氧的浓度保持在60％的恒定值。选择换气速度作为第一优先的控制量，选择搅拌器的每分钟转数作为第二优先的连续控制。通过安培O2电极(Ingeld Messtechnik，Steinbach)来测定氧浓度。通过双壁容器和恒温器将发酵器的温度保持在30℃，并且在连续发酵期间，通过使用4M乙酸的DCU控制校正剂泵来将pH调控为pH7。在连续的培养期中，向发酵器中补充脱脂乳培养基，并且从发酵过程中取出含有酶的消耗的培养基。通过使用电导探针来控制的泵，将工作体积保持在2升的恒定值。经由具有孔径为约0.3μm的膜的灌注组件收获不含细胞的上清液以除去颗粒。灌注组件由缠绕在载体上的S 6/2聚丙烯毛细管(Enka，Wuppertal)组成，其外直径和内直径分别为2和1mm，并且长度为2.8m。将每单位时间交换的培养基体积定义为灌注速度。可通过蠕动泵的转数以下述方式控制脱脂乳的补充速度，使得调节每天一个发酵器体积(2升)的灌注速度。在高压灭菌之前，用泡沫捕集器将发酵器完全固定，加入没有葡萄糖的1.8 l脱脂乳培养基。高压灭菌后，经由入口泵入200ml 10％葡萄糖。在无菌柜中通过快速连接将培养基与收获罐连起来。在无菌柜中，将接种培养基转移到具有底部排放口的500ml Erlenmeyer烧瓶中，并经由易弯曲的管和独立的接种片泵送到生物反应器内。
纤毛虫类在发酵中保持未损害，这样培养基仅含有纤毛虫类分泌的蛋白，并不含任何细胞内组分。因此，可通过较少的色谱纯化步骤将得自发酵或培养基的酶纯化至高纯度。
实施例2附图2示例性显示了用于从四膜虫属纤毛虫类的培养基纯化磷脂酶的柱色谱步骤。显示了3个依次柱色谱步骤的洗脱情况。附图2a详细地显示了作为步骤1的疏水相互作用色谱的洗脱情况，附图2b显示了作为步骤2的阴离子交换色谱的洗脱情况，附图2c显示了作为步骤3的尺寸排阻色谱的洗脱情况。对于随后的色谱，使用各个前面色谱的活性级分。因此，在最后一个步骤之后，可将酶纯化至几乎完全均一(没有外来活性、低的外来蛋白含量)。通过与该纯化方案类似的方法，也可以纯化其它得自纤毛虫类的酶例如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶或β-氨基己糖苷酶。
除了一个兼性致病代表(结肠小袋虫(Balantidium coli))以外，纤毛虫类是自由生长的(非寄生的)非致病微生物。因此，例如文献中(Tiedtke，1994)陈述了四膜虫属纤毛虫类的GRAS状态(“通常认为是安全的”)。此外，肯定纤毛虫类不藏匿任何可转移到其它生物体上的内寄生物。另外，对于在生物技术上有重要价值的纤毛虫类例如四膜虫属或豆形虫属，不存在任何病毒或其它内寄生物。因此，可排除毒性或致热性杂质对酶组合物的污染。
附图3显示了得自四膜虫属纤毛虫类的培养基的3种酶在不同pH值的相对酶活性(a-磷脂酶A1，b-三酰基甘油-脂肪酶，c-β-氨基己糖苷酶)。
作为酸性水解酶，得自纤毛虫类的酶在酸性pH具有最佳活性。附图3显示了得自四膜虫属纤毛虫类的培养基的3种酶在不同pH值的酶活性。具体地说，呈现了磷脂酶A1的相对酶活性(附图3a)和β-氨基己糖苷酶的相对酶活性(附图3b)以及脂肪酶的绝对酶活性(附图3c)。
从中可清楚看出，得自纤毛虫类的酶的最佳pH在pH4.1至6.5之间。得自纤毛虫类的蛋白酶甚至在低至3的pH值也表现出高的酶活性。在下表2中，显示了与pH值有关的得自不含细胞的上清液(培养基)的纤毛虫类蛋白酶的活性。如上所述，酶活性是通过类似于FIP有关真菌淀粉酶和微生物脂肪酶的方法测定的。
表2
因此，纤毛虫类酶对于酸的稳定性也比胰酶强。所以，与胰酶相比，通过胃之后，它们在十二指肠中的活性要高得多。
附图4显示了在如胃液中存在的典型pH值(pH1.5)下作用10分钟后，与胰酶相比，得自四膜虫属纤毛虫类的蛋白酶的酸稳定性。该低的pH值是通过高体积摩尔浓度的酸性缓冲液(1M甘氨酸/HCl，pH1.5)在37℃的作用来模拟的。
权利要求
1.含有选自下列的得自纤毛虫类的酶的药物水解酶、脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、糖苷酶、磷脂酶、磷酸二酯酶、磷酸酶。
2.按照权利要求1的药物，其特征在于，所述酶的最佳pH为pH4-6。
3.按照权利要求1和/或2的药物，其特征在于，所述酶源自四膜虫属、豆形虫属和草履虫属纤毛虫类。
4.按照权利要求1-3任一项的药物，其特征在于，所述药物还含有可药用辅料和载体。
5.按照权利要求1-4任一项的药物，其特征在于，所述药物呈片剂、微丸剂、油质制剂、汁液剂、凝胶剂、栓剂、胶囊、包衣片剂的形式。
6.选自下列的得自纤毛虫类的酶在制备用于治疗消化性病症的药物中的应用水解酶、脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、糖苷酶、磷脂酶、磷酸二酯酶和/或磷酸酶。
7.按照权利要求6的应用，其特征在于，所述消化性病症是由药物引起的消化不良、慢性萎缩性胃炎、慢性胰腺炎、急性胰腺炎、手术引起的消化性病症(消化不良)或囊性纤维变性引起的。
全文摘要
本发明涉及含有得自纤毛虫类的酶的药物，所述酶选自水解酶、脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、糖苷酶、磷脂酶、磷酸二酯酶和磷酸酶。
文档编号A61K9/14GK1484530SQ01821710
公开日2004年3月24日 申请日期2001年11月2日 优先权日2000年11月2日
发明者M·哈特曼, M 哈特曼 申请人:茨利安公司