专利名称：口蹄疫病毒抗原保存技术的制作方法
技术领域：
本发明属于兽医生物制品保存技术领域，具体说是一种口蹄疫病毒抗原保存技术。
(二)技术背景口蹄疫是世界上最重要的动物疫病之一，被国际兽疫局(OIE)列为A类疫病之首，素有“政治经济病”之称，世界各国极为重视，是广泛研究和防制的重点。为了有效控制和预防口蹄疫，国际上一些消灭或正在控制口蹄疫的国家已建立了区域联防或自己国家的口蹄疫疫苗/抗原库。我国虽然于二十世纪80年代末研制成功了猪、牛口蹄疫O型灭活疫苗并用于实际防疫，但其质量和数量远远不能满足实际防疫的需要，也尚未建立自己国家的疫苗/抗原库。
口蹄疫病毒属小RNA病毒科，不仅极易变异，而且免疫原性弱。而疫苗的免疫效力与其所含的有效抗原-140s颗粒(完整口蹄疫病毒颗粒)直接相关。因此，为避免疫苗中抗原不足引致的免疫失败，提高疫苗效力，减少接种剂量及建立疫苗/抗原库，研究建立一种适合于疫苗工业化生产的口蹄疫病毒抗原浓缩、保存、稀释技术是当前生产急需解决的问题。
口蹄疫病毒抗原保存技术是口蹄疫疫苗工业化大生产和建立疫苗/抗原库的关键技术之一。迄今，国内尚无这方面的专门技术，一般是将病毒抗原在-20℃下冻存，这种保存条件虽然成本低廉、符合我国国情，但由于口蹄疫病毒对不良理化因素耐受性很差，尤其对温度十分敏感，因此，容易造成有效病毒抗原的降解和丢失。国际上已建立口蹄疫区域联防或自己国家的疫苗/抗原库的国家如加拿大、墨西哥、美国、澳大利亚、新西兰、爱尔兰、英国、挪威、瑞典、荷兰、芬兰、德国、法国、意大利、泰国、粮农组织亚泰区域动物生产与保健委员会等主要是对病毒抗原首先高倍浓缩，然后直接在液氮(-196℃)中予以保存，这种方法对口蹄疫病毒抗原的损伤很小，用其保存1年的抗原制备疫苗，仍有很好的免疫原性，但这套技术对整个生产工艺、系统、设施的要求严格，而且造价昂贵，保存量很小，不适宜于我国目前及近期的疫苗工业化生产。
发明内容本发明的目的在于提供一种可操作性强、保存量大、对口蹄疫病毒抗原进行有效保存，能满足口蹄疫疫苗工业化大生产和建立疫苗/抗原库要求的口蹄疫病毒抗原保存技术。上述目的是通过以下技术措施实现的通过三因子、三水平、双重复正交实验研究确定了一种对口蹄疫病毒有效抗原具有良好保护性能的保护剂，将保护剂加入口蹄疫病毒抗原液中保存。即一种对口蹄疫病毒有效抗原具有良好保护性能的保护剂，是用0.5％的水解乳蛋白液做母液，加入2～16％的甘油、2～8％的蛋白胨和5～20％的蔗糖，充分混匀后，10～15磅高压灭菌15min，无菌检验阴性后方可使用。
一种使用上述保护剂对口蹄疫病毒抗原进行保存的方法是给待保存的口蹄疫病毒液中加入50％的保护剂后，置-20℃～-70℃下或液氮(-196℃)中保存。
本发明提供的上述口蹄疫病毒抗原保存技术，是在国家攀登计划和中国农业科学院兰州兽医研究所所长基金的资助下，对口蹄疫病毒抗原进行深入研究而确立的。该保存技术方法简单、便捷，对生产工艺、系统、设施的要求不严，保存量大，可操作性强，能满足口蹄疫疫苗工业化大生产的要求，为口蹄疫疫苗/抗原库的建立和应用提供不可或缺的重要技术支撑。
(四)具体实现方式
②效果分析将实施例1配制的保护剂，按50％的量加入到口蹄疫病毒液中，并设未加保护剂的对照病毒，然后将它们同时在37℃下分别静置40hr和50hr，测定病毒的感染性滴度(TCID50)，结果，加入保护剂的口蹄疫病毒液，对敏感细胞TCID50的仍可分别达到10-6.0和10-3.0，而未加保护剂的对照病毒则分别降至10-1.67和0。众所周知，口蹄疫病毒对温度十分敏感，60℃15分钟就可使其完全失活，所以我们选择了37℃下静置40和50小时这一容易使口蹄疫病毒降解的环境来验证保护剂对口蹄疫病毒的保护性能。为进一步验证保护剂对口蹄疫病毒的保护性能，将加入保护剂的病毒和未加保护剂的对照病毒分别在-20℃下保存8个月后，未加保护剂的病毒其140s抗原含量比加保护剂的下降了13.67％，对敏感细胞的半数感染量下降了10倍；动物试验表明，用加入保护剂后-20℃下保存300天的病毒抗原配制的疫苗免疫豚鼠的中和抗体效价(log10SN50)2.4，比未加保护剂的高0.6个滴度，实验表明，加入保护剂后-20℃下保存8个月的病毒抗原仍然具有良好的免疫原性；-20℃下保存3年的已灭活超滤浓缩病毒其140s抗原含量比液氮中保存的下降了6.45％。以上表明，加入保护剂后口蹄疫病毒的保存效果明显优于未加保护剂的，液氮保存效果略优于-20℃保存的，若将二者结合起来，即加入保护剂后在液氮中保存，保存效果更佳。
②效果分析将实施例2配制的保护剂，按50％的量加入到口蹄疫病毒液中，并设未加保护剂的对照病毒，然后将它们同时在37℃下分别静置40hr和50hr，测定病毒的感染性滴度(TCID50)，结果，加入保护剂的口蹄疫病毒液，对敏感细胞TCID50的仍可分别达到10-4.5和10-2.3，而未加保护剂的对照病毒则分别降至10-1.67和0。
②效果分析将实施例3配制的保护剂，按50％的量加入到口蹄疫病毒液中，并设未加保护剂的对照病毒，然后将它们同时在37℃下分别静置40hr和50hr，测定病毒的感染性滴度(TCID50)，结果，加入保护剂的口蹄疫病毒液，对敏感细胞TCID50的仍可分别达到10-5.0和10-1.5，而未加保护剂的对照病毒则分别降至10-1.67和0。
权利要求
1.一种对口蹄疫病毒有效抗原具有良好保护性能的保护剂配制方法，其特征在于用0.5％的水解乳蛋白液做母液，加入2～16％的甘油、2～8％的蛋白胨和5～20％的蔗糖，充分混匀后，10～15磅高压灭菌15min，无菌检验阴性后方可使用。
2.根据权利要求1所述的保护剂配制方法，其特征在于用0.5％的水解乳蛋白液做母液，加入4％的甘油、4％的蛋白胨和10％的蔗糖，充分混匀后，12磅高压灭菌15min，无菌检验阴性后方可使用。
3.一种使用权利要求1配制的保护剂对口蹄疫病毒抗原进行保存的方法，其特征在于给待保存的口蹄疫病毒液中加入50％的保护剂后，置-20℃～-70℃下或液氮(-196℃)中保存。
全文摘要
一种口蹄疫病毒抗原保存技术，即将口蹄疫病毒液中加入一种对口蹄疫病毒有效抗原具有良好保护性能的保护剂中进行保存。该保护剂的配制方法及口蹄疫病毒抗原保存方法是用0.5％的水解乳蛋白液做母液，加入2～16％的甘油、2～8％的蛋白胨和5～20％的蔗糖，充分混匀后，10～15磅高压灭菌15min，无菌检验阴性后，按50％的量加入到口蹄疫病毒液中，置－20℃～－70℃下或液氮(－196℃)中保存。该保存技术是在国家攀登计划和中国农业科学院兰州兽医研究所所长基金的资助下，对口蹄疫病毒抗原进行深入研究而确立的。其方法简单、便捷，对生产工艺、系统、设施的要求不严，保存量大，可操作性强，能满足口蹄疫疫苗工业化大生产的要求，为口蹄疫疫苗/抗原库的建立和应用提供了不可或缺的重要技术支撑。
文档编号A61K39/125GK1413733SQ02124649
公开日2003年4月30日 申请日期2002年6月19日 优先权日2002年6月19日
发明者王永录, 张永光, 方玉珍, 蒋守田 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所