专利名称：一种核糖核酸注射液及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药配制品，具体地说是一种用于防治动脉硬化症的药物制剂。
核糖核酸(RNA)是一类十分重要的生物大分子，它不仅在基因的表达和蛋白质的生物合成起着关键作用，而且还能促进细胞的诸多功能。随着人们对核糖核酸研究的深入，其在医药行业中的应用越来越多。早在1982年林单坤等人就把从免疫羊肝中提取得到的免疫核糖核酸做成制剂注入体内，用于治疗肿瘤和癌症，并取得了明显疗效(参见林卓、肖天昆。抗肿瘤免疫动物肝RNA的研制[1]。脏器生化制药。1982.3(2)1-8)。有人把从脾脏中提取得到的免疫核糖核酸做成的制剂注入体内，用于治疗与免疫功能下降有关的疾病如慢性支气管炎、哮喘病、慢性乙型肝炎等，也取得了显著的疗效(参见沈郁。人脾免疫核酸的临床应用[J]。中国生化药物杂志。1996.17(1)34-36)。有人把从酵母(白地霉)提取出来的核糖核酸制成片剂，用来治疗黄疸型肝炎(参见许剑秋。核糖核酸生产工业化及其它临床应用探讨[J]。食品科学。1997.18(4).46-48)。核糖核酸在医药领域中的应用研究虽然很多，但目前人们尚未研制出适于治疗心、脑血管疾病的核糖核酸药物。
本发明的目的之一就是提供一种新的核糖核酸药物；其目的之二是提供一种制备该药物注射液的方法；其目的之三是提供一种该药物的用途。
本发明的第一个目的是这样实现的本发明所提供的核糖核酸药物是由动物血管内皮为原料制成的血管内皮核糖核酸注射液，其紫外吸收260nm有一吸收高峰，230nm和280nm为吸收低谷。
本发明的第二个目的是这样实现的以动物血管内皮为原料，采用以下步骤提取制得a、选用动物血管，在5-20℃温度下，剥离血管内皮；动物血管可选用年轻、健康的猪、牛、羊等动物的血管。进行剥离时，应在低温状态下操作，以免原料酸腐变质。
b、按重量份比计，取血管内皮1-2份，加入蛋白变性剂和去垢剂各5-10份，混合后绞切打碎，在4-8℃温度下放置1-2小时(该温度可保证蛋白变性，并使酶失去活性，可以避免在以后加热过程中造成的降解)；
蛋白变性剂可选盐酸胍、苯酚，但最好选用饱和酚。
去垢剂可选用十二烷基肌酸钠、十二烷基磺酸钠，但最好选用十二烷基磺酸钠。
c、将b步骤中制备成的混合物，振摇10一30分钟，在56-60℃水浴中，加热15-20分钟后，冷却；该步骤可使蛋白变性更充分。
d、离心，收集上清液；该上清液中含有RNA和少量混浊物。该混浊物可能是脂类，其不影响制剂的效果。
为了使d步骤中收集的上清液进一步纯化，最好在该步骤收集的上清液中加入b步骤中蛋白变性剂的1/4体积量的饱和酚，再次在56-60℃水浴15-20分钟，冷却后，加入b步骤中蛋白变性剂的1/4体积量的氯仿，振摇15-20分钟。以使没有变性的蛋白质进一步变性、沉淀，再次离心，提取上清液。
e、按1∶3的体积比，在上清液中加入1-2％无机盐-无水乙醇液，在4-8℃温度下，放置10-16小时；无机盐可选用氯化钠、硫酸镁等，但最好选用乙酸钾。
f、离心机离心，收集沉淀物，沉淀物加乙醇洗1-3次后，加入等渗盐水溶解沉淀物(加至沉淀物全部溶解)，低温、高速离心(一般可在8-12℃，10000rpm，10分钟)，收集上清液；g、测定上清液的紫外线吸收260/280nm的比值，计算核糖核酸的含量。
h、包装、贮存。
由于上清液中所溶解的核糖核酸不稳定，故一般要以一种适当的贮存形式将其进行包装。如采用乙酸钾-无水乙醇沉淀后加乙醇悬起，存贮其悬浊液；或者在上清液中加入赋形剂(如右旋糖酐)后，冻干。
该方法制备的血管内皮核糖核酸注射液，性能稳定、疗效好。
本发明的第三个目的是这样实现的血管内皮核糖核酸注射液，在制备治疗动脉硬化症药物中的应用。
大量研究证实动脉硬化疾病属于由年龄增长引起的衰老性疾病。通常衰老细胞与年轻细胞比较，DNA的一级结构并没有发生显著变化。一般认为衰老发生的原因主要是因为基因表达失调。有人检查了年轻血管和年老血管的基因表达，发现有百余种基因表达出现差异，且衰老细胞染色质浓缩。衰老细胞的染色质对Dnasel(DNA酶1)的抵抗性上升，Dnasel的抵抗性上升说明染色质的疏松程度减弱，而表达基因均位于染色体组织的疏松区段。
既然动脉硬化疾病与衰老有关，而衰老发生的原因是因为细胞的染色质空间结构发生改变。那么如何打开这些衰老细胞染色质，可能是有效治疗动脉硬化症的关键。
本发明所提供的血管内皮核糖核酸注射液可在染色质重组系统中特异性地增加基因对Dnasel的敏感性，特异性地改变细胞形态、增加蛋白质表达。在制备治疗动脉硬化症药物的应用中取得了显著的效果。
本发明药物经动物实验证明，其可使老年动物血管内膜光滑，血细胞附着减少；使高脂饲料引起的家兔动脉粥样硬化程度减轻。
本发明药物在治疗动脉硬化及由动脉硬化引起的多种疾病如高血压、腔隙性脑梗塞、冠心病、末梢循环障碍等疾病中具有显著的治疗效果，且无毒副作用。
本发明药物的用法用量为肌肉或静脉注射，一般每周注射一次，每次1-4mg，溶于2-4ml等渗盐水中。静脉注射时，务须缓慢注射。一般要5分钟注完。轻症病人可以4周注射一次。
本发明药物也可制备成粘膜透入剂，粘膜给药。
本发明药物经急性毒性实验给予小鼠相当于人体用量的300-600倍剂量，未见毒性反应。经长期毒性试验，给予大鼠相当于人体用量的10倍剂量，连续给药三个月，未见毒性反应。
本发明中的注射液，经豚鼠实验不发生过敏反应。但对过敏体质的个体病人，间隔2周以上用药，注射时应在10分钟以上注射完毕。
本发明药物的有益效果通过以下实验得到了证实。
本发明药物在治疗家兔高脂血症动脉硬化中的应用材料和方法家兔体重2kg(1.8-2.2)皮毛白色的家兔，购自正定家兔饲养厂。
高脂饲料配方常规饲料加胆固醇和猪油。
本发明注射液 紫外吸收260/280nm OD值≥2.0。
制备动物模型 购来的家兔喂普通饲料1周，然后换为高脂饲料喂4周，接着喂减量的高脂饲料2周。
给药方案 家兔分为4组，每组3-6只，其中3组饲喂高脂饲料组，1组饲喂普通饲料。饲喂高脂饲料的三组分别为本发明注射液组(2mg/0.8m1)、复方丹参注射液组(0.8ml为阳性对照)，盐水对照组(阴性对照)；饲喂普通饲料组为正常对照组(注射盐水)。每周注射一次共注射8次，末次注射后3天，取血测血脂(取静脉血分离血清测血脂)，取主动脉测动脉斑块病变。
实验结果见表1、表2、表3表1饲喂高脂饲料前，4组动物的胆固醇和甘油三脂值
喂高脂饲料前各组血脂比较测家兔血脂后按血脂的量随机分层分组，分组结果如表1，结果表明各组之间无显著统计学差异，各组家兔具有可比性。
表2治疗后，4组动物的胆固醇和甘油三脂值
实验表明，本发明药物可明显降低动物胆固醇。与其它组相比具有显著差异(P＜0.5)。
表3 动脉壁动脉粥样硬化斑块改变
表3表明，用本发明注射液组其动脉斑块程度小于其他高脂饲料组。经配对T检验，具有显著差异。
综上述动物实验表明，本发明药物可以防治家兔高脂饲料引起的动脉硬化，其疗效优于复方丹参注射液。
本发明对30例病例进行了临床观察，观察结果见表4。
表4临床观察
诊断依据龚兰生主编，上海科学技术出版社出版《内科手册》P495，P823。
临床观察表明，本发明注射液对动脉硬化导致的各种症状和体征均有显著疗效，且疗效巩固、持久。它能改善包括头晕、震颤、末梢循环障碍、无力、视物不清，记忆力减退、夜尿增多、大便干燥等多种老年动脉硬化所致症状。
实施例1 血管内皮核糖核酸注射液一、制备血管内皮取新鲜的猪血管1kg(18条)，在15-18℃温度下进行分离，获血管内皮98.6g。
二、制备饱和酚分析纯重结晶酚500g，放于水浴中加热(60℃)融化，加入8羟基奎林0.5g，加0.1MpH5.0乙酸钠缓冲液200ml，过夜后吸出上清，再加100ml 0.1MpH5.0乙酸钠缓冲液，过夜吸出上清，下层酚相即可以使用。
三、制备十二烷基磺酸钠(SDS)液0.3％SDS用pH5.0，0.1M乙酸钠配制，加热灭菌后保存。
四、血管内皮核糖核酸的提取a血管内皮80g加饱和酚和SDS液各400ml，高速绞切打碎组织，4-8℃操作，维持2小时。
b、振摇15分钟，60℃水浴15分钟，自来水冷却。
c、制备离心机离心，室温，2500rpm30分钟。
小心吸出上清，共360ml。
d、上清中加入100ml饱和酚(相当于蛋白变性剂量的1/4)，再次60℃水浴加热，15分钟，自来水冷却，加入100ml的氯仿，振摇15分钟。
e、制备离心机离心，室温，2500rpm，30分钟。
吸出上清360ml，加入2％乙酸钾-无水乙醇，1080ml，4℃放置12小时。
f、制备离心机离心，室温，2500rpm，30分钟，慢停。
g、75％乙醇洗2次，每次50ml。等渗盐水4ml溶解沉淀，高速离心，(8℃，10000rpm，10分钟)。
h、包装存贮，即取上清液加2％乙酸钾-无水乙醇12ml，4℃过夜。高速离心，(8℃，10000rpm，10分钟)。沉淀用95％乙醇8ml洗一次。再用95％乙醇8ml悬起，即为血管内皮核糖核酸悬浊液。
比色皿中加3ml蒸馏水，加血管内皮RNA悬浊液20微升，260nm/280nm比值＝0.488/0.231＝2.113RNA总量＝0.488(260nmOD值)/24×150(稀释倍数)×8ml(体积)＝24.4mg。
每安瓶加血管内皮RNA悬浊液0.33ml，2000rpm，离心，吸出上清0.23ml，融封安瓶，共制备24支。
权利要求
1.一种核糖核酸注射液，其特征在于它是由动物血管内皮为原料制成的血管内皮核糖核酸注射液，其紫外吸收；260nm有一吸收高峰，230nm和280nm为吸收低谷。
2.根据权利要求1所述的核糖核酸注射液的制备方法，其特征在于它以动物血管内皮为原料，采用以下步骤制得a、选用动物血管，在5-20℃温度下，剥离血管内皮；b、按重量份比计，取血管内皮1-2份，加入蛋白变性剂和去垢剂各5-10份，混合后绞切打碎，在4-8℃温度下放置1-2小时；c、将b步骤中制备成的混合物振摇10-30分钟，56-60℃水浴加热15-20分钟后，冷却；d、离心，收集上清液；e、按1∶3的体积比，在上清液中加入1-2％无机盐-无水乙醇液，4-8℃温度下，放置10-16小时；f、离心机离心，收集沉淀物，沉淀物加乙醇洗1-3次后，加入等渗盐水溶解沉淀物，低温、高速离心，收集上清液；g、测定上清液的紫外线吸收260/280nm的比值，计算核糖核酸的含量；h、包装存贮。
3.根据权利要求2所述的核糖核酸注射液的制备方法，其特征在于所说的蛋白变性剂为饱和酚，去垢剂为0.3％十二烷基硫酸钠；
4.根据权利要求2或3所述的核糖核酸注射液的制备方法，其特征在于所说的无机盐为乙酸钾。
5.根据权利要求3所述的核糖核酸注射液的制备方法，其特征在于所说的在d步骤收集的上清液，加入b步骤中蛋白变性剂的1/4体积量的饱和酚，再次在60℃水浴15-20分钟，冷却后，加入b步骤中蛋白变性剂的1/4体积量的氯仿，振摇15-20分钟。
6.根据权利要求1所述的核糖核酸注射液，其特征在于该注射液适于制备治疗动脉硬化症的药物。
全文摘要
本发明公开了一种核糖核酸注射液，同时公开了其的制备方法和用途。它是由动物血管内皮为原料制成的血管内皮核糖核酸注射液，其紫外吸收；260nm有一吸收高峰，230nm和280nm为吸收低谷。制备方法是在5－20℃温度下，剥离血管内皮；按重量份比计，取血管内皮1－2份，加入蛋白变性剂和去垢剂各5－10份，混合后绞切打碎，在4－8℃温度下放置1－2小时；振摇10－30分钟，56－60℃水浴加热15－20分钟后，冷却；离心、纯化、收集上清液；该注射剂可在制备治疗动脉硬化症药物中的得到应用。本发明药物在治疗动脉硬化及由动脉硬化引起的多种疾病如高血压、腔隙性脑梗塞、冠心病、末梢循环障碍等疾病中具有显著的治疗效果，且无毒副作用。
文档编号A61K31/7105GK1500493SQ0214866
公开日2004年6月2日 申请日期2002年11月15日 优先权日2002年11月15日
发明者吕占军 申请人:吕占军