专利名称：治疗神经退行性疾病的基因治疗药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于治疗神经退行性疾病的治疗药物，它含有作为治疗神经退行性疾病的活性成分的HGF基因，这类疾病例如为帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓小脑变性、播散性脑硬化(disseminated sclerosis)、纹状体黑质变性、脊髓性肌萎缩(SMA)、亨廷顿舞蹈病、Shy-Drager综合征、Charot-Marie-Tooth病、Friedreich共济失调、重度无力(severeadynamia)、Willis环阻塞、淀粉样变、匹克病、脊髓损伤、糖尿病周围神经炎以及缺血性脑血管病(脑梗塞，脑出血等)。
背景技术：
利用神经胶质细胞株来源的神经营养因子(GDNF)进行的尝试表明该因子表现出可用于预防和治疗神经退行性疾病(诸如帕金森病)的神经保护作用。然而，进一步的研究发现GDNF不具有足够有效的作用，因此需要具有更强的神经保护作用的药物来预防和治疗神经退行性疾病。
已经发现肝细胞生长因子(HGF)是成熟肝细胞的一种显著的生长促进因子，并且已经报道了它的各种药理活性(实验医学，第10卷，第3期(增刊)330-339(1992))。另外，利用HGF的药理作用，HGF已经被研究并发展为各种疾病的治疗药物。在另一方面，将HGF基因应用于基因治疗也已经被报道(JP 3-72883A，WO 97/07824，WO 01/26694)。
依照体外实验所报道的HGF对神经的作用包括维持海马神经丛的神经细胞的存活并防止其死亡、促进运动神经元的生长及存活、以及多巴胺能神经元的成熟并维持其存活，这提示HGF对神经的作用在体外要比GDNF更强。
然而，仅有体外实验确认了HGF的作用，尽管体外实验中发现了其对神经的一些作用，但这并不能代表在体内具有神经保护作用。HGF是否对诸如帕金森病等神经退行性疾病具有保护及治疗作用还没有被研究。
另外，HGF在血液中的半衰期短的只有约10分钟，以致难以保持它的血药浓度并且在将有效量的HGF转运到作用部位的能力上也存在问题。本发明的发明者已经清楚地表明将HGF基因应用于各种疾病的治疗可以解决HGF的半衰期的问题并能够将HGF转运到其作用部位(JP3-72883A，WO 97/07824，WO 01/26694)。
因此，预期可将HGF基因应用于神经退行性疾病的预防和治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗帕金森病等神经退行性疾病的治疗方法以及用于该方法的治疗药物，对于这类疾病目前还没有发现有效的治疗方法。具体而言，本发明的目的是提供一种治疗诸如帕金森病等神经退行性疾病的治疗药物，它包括作为活性成分的HGF基因；一种治疗诸如帕金森病等神经退行性疾病的治疗方法，它包括施用HGF基因；以及HGF基因在制备治疗诸如帕金森病等神经退行性疾病的治疗药物中用途。
本发明的发明者已经进行了广泛的研究并发现HGF基因确实能有效地预防和治疗诸如帕金森病等神经退行性疾病，因此实现了本发明。
更具体地，本发明涉及以下项目(1)一种治疗神经退行性疾病的治疗药物，包括作为活性成分的肝细胞生长因子(HGF)基因。
(2)根据项目(1)的治疗药物，其中将该药物施用到神经退行性变部位。
(3)根据项目(1)或(2)的治疗药物，其中神经退行性疾病选自由帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓小脑变性、播散性脑硬化、纹状体黑质变性、脊髓性肌萎缩(SMA)、亨廷顿舞蹈病、Shy-Drager综合征、脊髓损伤、糖尿病周围神经炎和缺血性脑血管病组成的组。
(4)根据项目(3)的治疗药物，其中神经退行性疾病选自由帕金森病、阿尔茨海默病、缺血性脑血管病、糖尿病周围神经炎和脊髓损伤组成的组。
(5)根据项目(4)的治疗药物，其中神经退行性疾病为帕金森病。
(6)根据项目(2)的治疗药物，其中神经退行性变部位选自由大脑、中脑、小脑、脊髓、延髓和周围神经组成的组。
(7)根据项目(2)的治疗药物，其中神经退行性变部位选自由大脑皮层、纹状体、海马和黑质组成的组。
(8)根据项目(6)或(7)的治疗药物，其中退行性变神经为多巴胺能神经元。
(9)根据项目(1)到(8)中任一项的治疗药物，其中HGF基因被掺入一种质粒载体或病毒载体中。
(10)根据项目(1)到(8)中任一项的治疗药物，其中HGF基因以仙台病毒(Sendai virus，HVJ)-脂质体或仙台病毒(HVJ)-E(包膜)的形式存在。
(11)根据项目(1)到(10)中任一项的治疗药物，其中按需多次施用该药物。
(12)根据项目(1)到(11)中任一项的治疗药物，其中使用了药学有效量的所述基因。
(13)一种治疗神经退行性疾病的方法，包括将HGF基因导入人体中。
(14)根据项目(13)的方法，还包括将HGF基因施用到神经退行性变部位。
(15)根据项目(13)或(14)的方法，其中神经退行性疾病选自由帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓小脑变性、播散性脑硬化、纹状体黑质变性、脊髓性肌萎缩(SMA)、亨廷顿舞蹈病、Shy-Drager综合征、脊髓损伤、糖尿病周围神经炎和缺血性脑血管病组成的组。
(16)根据项目(15)的方法，其中神经退行性疾病选自由帕金森病、阿尔茨海默病、缺血性脑血管病、糖尿病周围神经炎和脊髓损伤组成的组。
(17)根据项目(16)的方法，其中神经退行性疾病为帕金森病。
(18)根据项目(13)的方法，其中神经退行性变部位选自由大脑、中脑、小脑、脊髓、延髓和周围神经组成的组。
(19)根据项目(13)的方法，其中神经退行性变部位选自由大脑皮层、纹状体、海马和黑质组成的组。
(20)根据项目(18)或(19)的方法，其中退行性变神经为多巴胺能神经元。
(21)根据项目(13)到(20)中任一项的方法，其中HGF基因被掺入一种质粒载体或病毒载体中。
(22)根据项目(13)到(20)中任一项的方法，其中HGF基因以仙台病毒(HVJ)-脂质体或仙台病毒(HVJ)-E(包膜)的形式存在。
(23)根据项目(13)到(22)中任一项的方法，还包括按需多次施用该药物。
(24)根据项目(13)到(23)中任一项的方法，还包括施用药学有效量的所述基因。
(25)HGF基因在生产用于治疗神经退行性疾病的治疗药物中的用途。
(26)根据项目(25)的用途，其中将治疗神经退行性疾病的治疗药物施用到神经退行性变部位。
(27)根据项目(25)或(26)的用途，其中神经退行性疾病选自由帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓小脑变性、播散性脑硬化、纹状体黑质变性、脊髓性肌萎缩(SMA)、亨廷顿舞蹈病、Shy-Drager综合征、脊髓损伤、糖尿病周围神经炎和缺血性脑血管病组成的组。
(28)根据项目(27)的用途，其中神经退行性疾病选自由帕金森病、阿尔茨海默病、缺血性脑血管病、糖尿病周围神经炎和脊髓损伤组成的组。
(29)根据项目(28)的用途，其中神经退行性疾病为帕金森病。
(30)根据项目(26)的用途，其中神经退行性变部位选自由大脑、中脑、小脑、脊髓、延髓和周围神经组成的组。
(31)根据项目(26)的用途，其中神经退行性变部位选自由大脑皮层、纹状体、海马和黑质组成的组。
(32)根据项目(30)或(31)的用途，其中退行性变神经包括多巴胺能神经元。
(33)根据项目(25)到(32)中任一项的用途，其中HGF基因被掺入一种质粒载体或病毒载体中。
(34)根据项目(25)到(33)中任一项的用途，其中HGF基因以仙台病毒(HVJ)-脂质体或仙台病毒(HVJ)-E(包膜)的形式存在。
(35)根据项目(25)到(34)中任一项的用途，其中使用了药学有效量的HGF基因。
此外，本发明涉及肝细胞生长因子(HGF)基因在生产用于治疗神经退行性疾病的治疗药物的用途，以及一种治疗神经退行性疾病的方法，它包括将药学有效量的肝细胞生长因子(HGF)基因施用于患者。
另外，本发明涉及一种治疗神经退行性疾病的治疗药物，所述疾病选自由帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓小脑变性、播散性脑硬化、纹状体黑质变性、脊髓性肌萎缩(SMA)、亨廷顿舞蹈病、Shy-Drager综合征、Charot-Marie-Tooth病、Friedreich共济失调、重度无力、Willis环阻塞、淀粉样变、匹克病、亚急性脊髓视神经病(SMON)、皮肌炎、多发性肌炎、Creutzfeld-Jakob病、白塞病、系统性红斑狼疮、结节病、结节性周围动脉炎、后纵韧带钙化、弥漫性椎管狭窄、混合性结缔组织病、脊髓损伤、糖尿病周围神经炎以及缺血性脑血管病(包括脑梗塞和脑出血等)组成的组，以及涉及一种治疗这些疾病的方法，和在生产用于治疗这些疾病的治疗药物中的用途。
神经退行性疾病可以是一种选自由帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓小脑变性、播散性脑硬化、纹状体黑质变性、脊髓性肌萎缩(SMA)、亨廷顿舞蹈病、Shy-Drager综合征、脊髓损伤、糖尿病周围神经炎和缺血性脑血管病组成的组的疾病。
具体实施例方式
下面将详细地阐述本发明。
这里使用的“HGF基因”是指一种能表达HGF(HGF蛋白)的基因。特别的，它包括HGF cDNA，如在自然，342，440(1989)、JP 2777678B；生物化学生物物理研究通讯，163，967(1989)、生物化学生物物理研究通讯，172，321(1990)等所描述的，并结合于一种合适的表达载体(非病毒载体，病毒载体)，后面将描述这些载体。在先前提及的文献中描述有编码HGF的DNA碱基序列，该序列并在包括基因库(GenBank)等的数据库中进行了登记。因此，利用依照先前提及的序列信息的合适DNA部分作为引物进行PCR能克隆HGF cDNA，例如通过用来自肝细胞或白细胞的mRNA进行RT-PCR反应。本领域人员依照基础教科书能容易地进行克隆，例如分子克隆，第二版，冷泉港实验出版社(1989)等。另外，本发明的HGF基因不限定于上面所描述的基因，只要基因所表达的蛋白具有和HGF基本一样的作用，任何基因都可以作为本发明的HGF基因。这就是，包括1)在严格的条件下和先前提及的cDNA杂交的DNA，和2)编码具有用一个或多个(1到10个，优选1到5个，更优选1或2个)氨基酸取代、缺失和/或添加到先前提及的cDNA所编码的氨基酸序列后的氨基酸序列的蛋白的DNA，等等。本发明的HGF基因范围包括那些编码具有HGF活性的蛋白的DNA。另外，本发明的HGF基因也包括那些编码具有HGF样活性的HGF亚型和编码HGF变体的DNA。HGF变体的实例包括天然发生的具有5个氨基酸缺失的突变体，表示为delta5HGF，以及另外的NK2和NK1。这里HGF的作用指的是维持海马神经丛的神经细胞存活并防止其死亡、促进运动神经元的生长及存活、和多巴胺能神经元的成熟并维持其存活的作用。利用定点诱变方法、PCR方法和通常的杂交方法等能容易地获得先前提及的DNA 1)和2)。具体而言，参照于诸如先前提及的分子克隆等基础教科书可以进行这些操作。
现在将详细地描述本发明的基因治疗中所使用的基因导入方法、导入形式、和导入数量。
当将含有HGF基因作为活性成分的基因治疗药物施用于患者时，它的施用形式大致被分为两种形式，一种是使用非病毒载体，而另一种是使用病毒载体。实验手册等详细地描述了它们的制备方法和施用方法(实验医学增刊，“基因治疗的基本技术”，Yodosha，1996；实验医学增刊，“基因导入和表达分析的实验技术”，Yodosha，1997；日本基因治疗协会，“基因治疗发育研究手册”，N.T.S.，1999)、下面将详细描述。
A.使用非病毒载体的情况利用下面描述的技术，通过使用一种其中掺入了常规的基因表达载体的重组表达载体，可以将靶基因导入到细胞或组织内。
将基因导入细胞的方法包括脂染法、磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、使用微玻璃管的DNA直接注射法等。
将基因导入组织的方法包括籍内在脂质体的基因导入方法、籍静电形式的脂质体基因导入法、HVJ-脂质体法、改进HVJ-脂质体法(HVJ-AVE脂质体法)、使用HVJ-E(包膜)载体的方法、受体介导的基因导入法、利用基因枪将DNA分子和载体(金属微粒)一起导入到细胞的方法、直接导入裸DNA的方法、籍正电荷聚合物的导入法等等。通过这些方法的任何一种可以将重组表达载体导入细胞中。
通过利用双层脂质膜构成的脂质体包裹DNA并将组合后的脂质体与仙台病毒(日本红细胞凝集病毒，HVJ)融合后可以得到HVJ-脂质体。
比较于常规的脂质体法，HVJ-脂质体法的特点是它与细胞膜具有很高的融合活性，它是优选的导入形式。在文献(实验医学增刊，“基因治疗的基本技术”，Yodosha，1996；实验医学增刊，“基因导入和表达分析的实验技术”，Yodosha，1997；J.Clin.Invest.93，1458-1464(1994)；Am.J.Physiol.，271，R1212-1220(1996)等等)中详细描述了HVJ-脂质体的制备方法。在另一方面，HVJ脂质体法是例如在分子克隆，30，1440-1448(1993)；实验医学，1，1822-1826(1994)；蛋白核酸和酶，42，1806-1813(1997)等等所描述的方法，优选的是在循环，92(增刊II)，479-482(1995)中所描述的方法。
HVJ优选的是Z株(来自ATCC)。其他的HVJ株(例如，ATCC VR-907，ATCC-105等)基本上也可以使用。
通过将失活的外源基因导入到仙台病毒包膜中可以得到HVJ-E(包膜)载体，可以依照WO 01/57204所描述的进行制备。
另外，裸DNA的直接导入法是先前提及的技术中最简单的技术，在这方面它是优选的导入方法。
这里的表达载体可以是任何表达载体，只要它能在有机体中表达靶基因。这些表达载体的实施例包括pCAGGS(基因108，793-200(1991))，pBK-CMV，pcDNA3.1，pZeoSV(Invitrogen公司，Stratagene)，和pVAX1。
B.使用病毒载体的情况使用诸如重组腺病毒和逆转录病毒的病毒载体的方法是典型的方法。更特异地，一个靶基因可以被导入到DNA病毒或RNA病毒中，比如失活的(neutralized)逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、新培斯病毒(Sindbis virus)、仙台病毒、SV40、免疫缺陷病病毒(HIV)等等。用重组病毒感染细胞从而将基因导入细胞内。
已知在先前提及的病毒载体中，腺病毒表现出比其他任何的病毒载体更高的感染效率，因此优选使用腺病毒载体体系。
将本发明的基因治疗药物导入患者体内的方法包括体内(in vivo)方法，其中基因治疗药物被直接导入到人体内；以及离体(ex vivo)方法，其中基因治疗药物在体外被导入到来自人体的某种细胞中，然后将该细胞重新导入人体内(见Nikkei科学，4月，1994，页20-45；Gekkan Yakuji(每月药物事件)，36(1)，23-48(1994)；实验医学增刊，12(15)，(1994)；日本基因治疗学会编，“基因治疗发育研究手册”，N.T.S.，1999)。在本发明中优选体内方法。
可以采用各种与先前提及的相应的施用方式所相匹配的剂型(例如，液体药物)。例如，采用含有基因作为活性成分的注射溶液，可以通过常规方法制备注射溶液；例如通过将基因溶解在合适的溶剂中(缓冲液如PBS、生理盐水、无菌水或类似物)制备注射溶液，将溶液按需要通过滤膜等除菌，然后将无菌溶液放置于无菌容器中。注射溶液可以包括所需的常规载体等。可以以脂质体产品的形式提供诸如HVJ-脂质体的脂质体，例如悬浮液、冰冻产物和离心浓缩的冰冻产物。可以根据WO 01/32220、WO 01/26694等的阐述制备HVJ-脂质体。
这里提及的疾病指的是那些伴有神经退行性变的疾病，包括各种疾病例如那些神经细胞进行性进展的疾病，以及那些外在损伤或其他疾病引起的疾病。它们中间包括罕见的所谓的不可治的神经疾病。尽管神经疾病可以是各种原因造成的以及可以在各种部位或神经中出现，但是本发明的治疗药物引起的受损神经本身的修复和功能的改善提示本发明的治疗药物在治疗和改善伴有不同类型的神经退行性变的疾病方面是有效的。本发明所应用的疾病包括神经疾病例如帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓小脑变性、播散性脑硬化、纹状体黑质变性、脊髓性肌萎缩(SMA)、亨廷顿舞蹈病、Shy-Drager综合征、Charot-Marie-Tooth病、Friedreich共济失调、重度无力、Willis环阻塞、淀粉样变、匹克病、亚急性脊髓视神经病(SMON)、皮肌炎、多发性肌炎、Creutzfeld-Jakob病、白塞病、系统性红斑狼疮、结节病、结节性周围动脉炎、后纵韧带钙化、弥漫性椎管狭窄、混合性结缔组织病、脊髓损伤、糖尿病周围神经炎以及缺血性脑血管病(脑梗塞，脑出血等)。所有的疾病都伴有神经退行性变。例如，帕金森病伴有中脑多巴胺能神经元退行性变；阿尔茨海默病伴有大脑皮层和海马退行性变；脊髓损伤伴有脊髓的运动神经或感觉神经退行性变；糖尿病周围神经炎伴有感觉神经退行性变；缺血性脑血管病(脑梗塞、脑出血等)伴有大脑皮层和海马退行性变；脊髓小脑变性伴有小脑退行性变；播散性脑硬化伴有大脑、中脑、小脑和延髓等的神经鞘退行性变；纹状体黑质变性伴有纹状体、黑质、frustule、尾状核等退行性变以及小脑和脊髓等退行性变；脊髓性肌萎缩伴有脊髓运动神经退行性变；亨廷顿舞蹈病伴有大脑基底节退行性变；肌营养不良伴有大脑和脊髓退行性变；匹克病伴有大脑退行性变；Sky-Drager综合征伴有脊髓、自主神经神经节、小脑、锥体外束和锥体束等退行性变。本发明的基因治疗药物不仅可以应用于治疗和消除那些严重神经疾病患者的症状也可以应用于那些轻度神经疾病患者，并且是有效的。
通过适当的施用方法将本发明的基因治疗药物施用到合适的施用部位，施用部位的选择依赖于治疗的疾病和治疗的症状。例如，对于那些主要伴有大脑退行性变的疾病，建议将本发明的基因治疗药物施用到大脑中。对于那些伴有局灶的纹状体退行性变的疾病，可以将药物施用到纹状体。对于那些具有全身性神经退行性变的患者，可以全身施用。优选的施用方式是诸如注射的合适方法。优选的将本发明的基因治疗药物施用到神经退行性变发生的部位，以及动脉内和静脉内施用，例如通过施用到脑部、施用到脊髓内等。
神经退行性变部位，例如，帕金森病累及中脑多巴胺能神经元部位；阿尔茨海默病累及大脑皮层和海马部位；脊髓损伤累及脊髓的运动神经或感觉神经部位；糖尿病周围神经炎累及感觉神经部位；缺血性脑血管病(脑梗塞、脑出血等)累及大脑皮层和海马部位；脊髓小脑变性累及小脑部位；播散性脑硬化累及大脑、中脑、小脑和延髓等的神经鞘部位；纹状体黑质变性累及纹状体、黑质、frustule、尾状核等部位以及小脑和脊髓等部位；脊髓性肌萎缩累及脊髓运动神经部位；亨廷顿舞蹈病累及大脑基底节部位；肌营养不良累及大脑和脊髓部位；匹克病累及大脑部位；Sky-Drager综合征累及脊髓、自主神经神经节、小脑、锥体外束和锥体束等部位。通过将HGF基因施用到神经退行性变部位和它的邻近部位、或包括神经退行性变部位的较大范围内对神经退行性疾病具有治疗作用。
例如，在治疗帕金森病上，可以将本发明的基因治疗药物直接施用到纹状体。
将药学有效量的本发明的治疗药物施用于患者。这里使用的“施用药学有效量”表示施用于患者后能产生适当水平的多肽或蛋白以治疗神经退行性疾病的HGF基因的足够剂量。具体的剂量可能有所不同，这依赖于患者的症状等，剂量选自每个成人患者约1μg到约50mg HGF基因量的范围，优选的为约10μg到约5mg，更优选的为约50μg到约5mg。
尽管依赖于患者的症状施用次数的数目可以改变，但是优选的为每数天或每数周施用一次本发明的治疗药物。本发明的治疗药物可以非侵入性使用，因此本发明的特点为可以根据患者的症状多次施用所述的药物。
下面将通过实施例详细地描述本发明。但是本发明不应当被实施例所限定。
如同在实施例中所特别显示的那样，本发明通过预先施用HGF预防了多巴胺能神经元的变性和病变。帕金森病是一种慢性和进展性疾病，通过施用HGF可以减缓疾病进展或抑制疾病，这归功于HGF对多巴胺能神经元的保护作用。因此HGF可以作为帕金森病的预防和保护药物。另外，将HGF作为治疗药物来治疗神经损伤造成的疾病是有效的，包括神经退行性疾病例如阿尔茨海默病、脊髓损伤、缺血性脑血管病、周围神经炎等。
图1显示了HGF对安非他明诱发的回转现象(gyration)的作用(回转数量的改变)的图。
图2显示了HGF对帕金森病模型大鼠的神经保护作用(放大倍数3.3×10(目镜放大倍数×物镜放大倍数))。
图3显示了HGF对帕金森病模型大鼠的神经保护作用(放大倍数3.3×20(目镜放大倍数×物镜放大倍数))。
图4显示了HGF对帕金森病模型大鼠的神经保护作用(放大倍数3.3×40(目镜放大倍数×物镜放大倍数))。
图2、3和4各包括四张照片，这些照片相应地显示了模型大鼠组和HGF治疗组的正常侧及6-OHDA注射侧。图2、3和4彼此只是在放大倍数上有所不同。
实施例实施例1 用HGF治疗帕金森病利用帕金森病模型大鼠检测HGF对模型大鼠行为学和组织学的影响。
使用的药物诱导的帕金森病模型大鼠为4周大的雄性Wister大鼠，重约100g。给每只Wister大鼠的纹状体的两个位点总共注射10μl(100μg)HGF质粒(每个位点5μl)。对照组为注射相同剂量的β-gal的Wister大鼠。
在注射药物5天后，将3μl(9μg)的6-OHDA(6-羟基多巴胺)注射到中脑的黑质致密斑中，6-OHDA是一种特异性地损坏多巴胺神经元的神经毒物。
在注射6-OHDA的2、4、6、8和10周后，相应地观察来自正常大鼠组、模型大鼠组、注射了β-gal的对照大鼠组以及HGF注射组的每组五只动物的回转现象。这里，正常大鼠组包括未处理的正常大鼠；模型大鼠组包括那些黑质已经注射6-OHDA的帕金森病模型大鼠；对照组包括在注射β-gal后注射6-OHDA的大鼠；而HGF注射组包括在注射HGF后注射6-OHDA的大鼠。
相应的，在注射6-OHDA的2、4、6、8和10周后，将5mg/kg体重鼠的安非他明(或阿朴吗啡)经腹腔注射到各组大鼠中以诱发回转现象。在此，安非他明可使多巴胺能神经元释放出多巴胺。然而，在纹状体的6-OHDA注射侧没有出现多巴胺的释放，这是因为神经末梢已经被损坏。以致只有正常侧的纹状体被刺激，造成往损伤侧的回转。
8周后，从各组的鼠中取出脑并用抗TH(酪氨酸羟化酶)抗体进行免疫染色。其中TH是儿茶酚胺的限速酶并被作为多巴胺能神经元的标记物。计数各组鼠的五个黑质位点的细胞并计算比较于正常黑质的多巴胺能神经元的存活率。
对回转现象的观察得出了以下结果。
和帕金森病模型组一样，注射了β-gal的对照组表现出了不正常的回转。HGF施用组基本上没有表现出回转，如同正常大鼠一样(图1)。在任何一个组中都观察了安非他明刺激引起的兴奋性(毛发竖立、对声音或噪音敏感)。结果说明预先施用HGF对抗了神经毒物6-OHDA对中脑黑质多巴胺能神经元的作用，因此抑制了帕金森病模型大鼠的症状。
当黑质多巴胺能神经元水平减少到正常水平的20％或更少时，认为会出现帕金森病症状。当黑质多巴胺能神经元水平减少到正常水平的10％或更少时，会出现诸如异常回转现象的独特行为。
以下是组织学检查的结果。
比较于正常的黑质，在黑质注射了神经毒物6-OHDA的模型大鼠中几乎所有的黑质细胞都是退行性变或死亡的(见图2到4，相应地显示了不同放大倍数的观察结果)。对一些视野的观察及对存活细胞的计数显示存活细胞率低到约为正常黑质的10％。在HGF注射组，存活细胞率为20到30％，这与异常回转是一致的。另外，将HGF注射到正常黑质对细胞的正常性没有影响。
实施例2 HGF对神经修复的作用检测了HGF对黑质多巴胺能神经元的再生和修复的作用。
将3μl(9μg)6-OHDA注射到Wister大鼠中脑的黑质致密斑中，然后将10μl(100μg)HGF质粒注射到它们的纹状体的两个位点(每个位点5μl)。在本实施例中，将注射了β-gal的Wister大鼠作为对照大鼠。
权利要求
1.一种治疗神经退行性疾病的治疗药物，其包含一种肝细胞生长因子(HGF)基因作为活性成分。
2.根据权利要求1的治疗药物，其中将该药物施用到神经退行性变部位。
3.根据权利要求1或2的治疗药物，其中所述的神经退行性疾病选自由帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓小脑变性、播散性脑硬化、纹状体黑质变性、脊髓性肌萎缩(SMA)、亨廷顿舞蹈病、Shy-Drager综合征、Charot-Marie-Tooth病、Friedreich共济失调、重度无力、Willis环阻塞、淀粉样变、匹克病、亚急性脊髓视神经病(SMON)、皮肌炎、多发性肌炎、Creutzfeld-Jakob病、白塞病、系统性红斑狼疮、结节病、结节性周围动脉炎、后纵韧带钙化、弥漫性椎管狭窄、混合性结缔组织病、脊髓损伤、糖尿病周围神经炎和缺血性脑血管病(包括脑梗塞和脑出血)组成的组。
4.根据权利要求3的治疗药物，其中所述的神经退行性疾病选自由帕金森病、阿尔茨海默病、缺血性脑血管病、糖尿病周围神经炎和脊髓损伤组成的组。
5.根据权利要求4的治疗药物，其中所述的神经退行性疾病为帕金森病。
6.根据权利要求2的治疗药物，其中所述的神经退行性变部位选自由大脑、中脑、小脑、脊髓、延髓和周围神经组成的组。
7.根据权利要求2的治疗药物，其中所述的神经退行性变部位选自由大脑皮层、纹状体、海马和黑质组成的组。
8.根据权利要求6或7的治疗药物，其中退行性变神经为多巴胺能神经元。
9.根据权利要求1到8中任一项的治疗药物，其中HGF基因被掺入一种质粒载体或病毒载体中。
10.根据权利要求1到8中任一项的治疗药物，其中HGF基因以仙台病毒(HVJ)-脂质体或仙台病毒(HVJ)-E(包膜)的形式存在。
11.根据权利要求1到10中任一项的治疗药物，其中所述的药物被施用至少一次。
12.根据权利要求1到11中任一项的治疗药物，其中使用药学有效量的所述基因。
13.肝细胞生长因子(HGF)基因在生产用于治疗神经退行性疾病的治疗药物中的用途。
14.一种治疗神经退行性疾病的方法，包括将药学有效量的肝细胞生长因子(HGF)基因施用于患者。
全文摘要
本发明提供了一种含有HGF基因作为活性成分的治疗药物，该药物用于治疗诸如帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓损伤、糖尿病周围神经炎以及缺血性脑血管病(脑梗塞、脑出血等)等神经退行性疾病。更具体地，本发明提供了一种用于治疗神经退行性疾病的治疗药物，其包含一种肝细胞生长因子(HGF)基因作为活性成分。
文档编号A61P25/14GK1596130SQ0282374
公开日2005年3月16日 申请日期2002年11月27日 优先权日2001年11月28日
发明者森下竜一 申请人:安琪士多摩奇株式会社