包括因子VII多肽和PAl－1多肽的药物组合物的制作方法

专利名称：包括因子VII多肽和PAl－1多肽的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括因子VII或因子VII相关多肽以及PAI-1或PAI-1相关多肽的组合物。本发明还涉及因子VII或因子VII相关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽的组合在制备用于治疗患有出血发作的受试者或预防他们的出血发作的药物中的应用。本发明还涉及受试者出血发作的治疗方法，并涉及增强受试者内凝块形成的方法。本发明还涉及含有这些化合物的试剂盒。
背景技术：
因血管壁损伤而接触循环血液的组织因子(TF)与以相当于约1％总FVII蛋白质量的量存在于循环中的FVIIa之间形成复合体而启动止血。这种复合体锚定在含有TF的细胞上并使细胞表面上的FX活化成Fxa和FIX活化成FIXa。FXa将凝血酶原活化成凝血酶，而凝血酶使FVIII、FV、FXI和FXIII活化。此外，在止血的起始步骤中形成的有限量的凝血酶也使血小板活化。在凝血酶对血小板起作用后，这些血小板改变形状并暴露其表面上的带电荷的磷脂类。这种活化的血小板表面形成了进一步FX活化和全部凝血酶生成的模板。活化血小板表面上的进一步FX活化是通过活化血小板表面上形成的FIXa-FVIIIa复合体发生的，然后FXa将凝血酶原转化成凝血酶，同时仍然保留在表面上。凝血酶随后将血纤蛋白原转化成不溶性的且使起始血小板塞保持稳定的血纤蛋白。这一过程是区室化的，即该过程定位于TF表达或暴露部位，由此将凝血系统的全身性活化的危害减小到最低限度。形成所述血小板塞的不溶性血纤蛋白通过FXIII-催化的血纤蛋白纤维交联而进一步稳定化。
FVIIa主要作为单链酶原存在于血浆中，它被FXa裂解成其双链活化形式FVIIa。已经将重组活化因子VIIa(rFVIIa)开发为促止血剂(pro-haemostatic agent)。给予rFVIIa可在患有因抗体形成而不能用凝血因子产品治疗的出血的血友病患者中提供快速而高效的促止血反应(pro-haemostatic response)。还可以用FVIIa成功地治疗因子VII缺乏的出血受试者或凝血系统正常、但发生出血过度的受试者。在这些研究中，尚未发现rFVIIa的任何不利副作用(特别是发生血栓栓塞的情况下)。
额外地外部给予FVIIa可增加活化血小板表面上凝血酶的形成。这种情况在缺乏FIX或FVIII、由此丧失了完整凝血酶形成的最有效途径的血友病患者中会发生。此外，在血小板量少或存在功能缺陷的血小板的情况下，额外的FVIIa增加了凝血酶形成。
重组人FVIIa的商品制剂作为NovoSeven(Novo NordiskA/S，Denmark)销售。Novoseven的适应征有治疗A型和B型血友病患者的出血发作。Novoseven是唯一可在市场上得到的、用于有效和可靠治疗出血发作的重组FVIIa。
已经证实纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)在调节纤溶酶介导的蛋白水解中起重要作用。也称作内皮型纤溶酶原激活物抑制剂(e-PAI)的PAI-1可抑制尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)和组织型纤溶酶原激活物(t-PA)，一般获自人内皮细胞、人血小板和大鼠肝细胞瘤细胞(HTC)。PAI-1抑制剂可以如美国专利US6,271,352中所述自HT-1080品系的人纤维肉瘤细胞中纯化，或如van Mourik，J.A.等(1984)在《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)259，14914-14921中所述自牛内皮细胞纯化。PAI-1是具有50kDa分子量的单链糖蛋白(Van Mourik J A等《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)(1984)25914914-14921)，它是目前已知对单链和双链形式的tPA和uPA最有效的抑制剂(Lawrence D等《欧洲生物化学杂志》(Eur J Biochem)(1989)186523-533)。PAI-1还抑制纤溶酶和胰蛋白酶(Hekman C M等《生物化学》(Biochemistry)(1988)272911-2918)，也可抑制凝血酶和活化蛋白C，不过功效极低。
众所周知，发生与手术或严重创伤有关的过度出血且需要输血的受试者比那些未发生任何出血的受试者更易发生并发症。然而，需要给予人血或血液制品(用于治疗凝固缺陷等的血小板、白细胞、来源于血浆的浓缩物)的中度出血也可能导致与人病毒(肝炎、HIV、细小病毒及其它目前未知的病毒)转移的危害相关的并发症。需要大输血的广泛出血可以导致包括肺和肾功能损害在内的多器官衰竭的发生。一旦受试者已经发展了这些严重的并发症，则开始出现一连串涉及许多细胞因子和炎症反应的事件，使得极难进行任何治疗，且通常令人遗憾地不成功。因此，手术和治疗大组织损害中的主要目的在于避免出血或将其减小到最低限度。为了避免这类出血或将其减小到最低限度，重要的是确保形成属于不易被纤维蛋白溶解酶溶解的稳定而坚固的止血塞(haemostatic plugs)。此外，重要的是确保快速而有效地形成这类塞或凝块。
目前，因为FVIIa的半衰期短(2.5小时)，可能需要给药一次以上以便维持一定的止血能力水平，所以通常通过注射或输注FVIIa几次来治疗发生出血发作的受试者，包括创伤受害者和与手术相关的出血的受试者。使出血较迅速的停止对这类受试者而言具有重要的有益作用。所以需要减少给药次数以终止出血并维持止血。
欧洲专利EP225,160(Novo Nordisk)涉及用于治疗并非由凝血因子缺乏或凝血因子抑制剂导致的出血性疾病的FVIIa组合物和方法。
欧洲专利EP 82,182(Baxter Travenol Lab.)涉及用于对抗受试者凝血因子缺乏或抑制剂对凝血因子的影响的因子VIIa组合物。
国际专利公开号WO 93/06855(Novo Nordisk)涉及FVIIa的局部应用。
本领域中仍然需要有对经历出血发作的受试者改进疗法的需求，包括具有下列情况的受试者因手术、创伤或其它形式的组织损害导致的出血发作；诱发的凝血病，包括多次输血受试者的凝血病；先天性或获得性凝血或出血性疾病，包括肝功下降(″肝病″)；血小板功能缺陷或血小板数量减少；必需的凝血″化合物″(例如血小板或冯·维勒布兰德因子蛋白)缺乏或异常；纤维蛋白溶解增加；抗凝疗法或溶栓疗法；或干细胞移植。
本领域中仍旧需要有可增强凝固、增强或确保稳定止血塞(haemostatic plugs)形成或增强受治疗的受试者的便利性或在受试者、特别是在具有凝血酶产生异常的受试者中实现完全止血的改进的可靠和可广泛应用的方法。还需要有缩短了止血时间的方法。
发明概述本发明的一个目的是提供可以有效用于治疗或预防出血发作和凝血性疾病的组合物。
本发明的第二个目的是提供可以有效用于治疗或预防出血发作或用作促凝血剂的单一单位剂型形式的组合物。本发明的另一个目的是提供表现出协同作用的组合物、治疗方法或试剂盒。
本发明的另一个目的是提供没有表现出明显的副作用、诸如高水平全身性凝固系统活化的组合物、治疗方法或试剂盒。
在阅读本说明书时显然可以得出本发明的其它目的。
本发明在第一个方面中提供了包括因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽的药物组合物。
本发明在第二个方面中提供了含有用于治疗出血发作的组成部分的试剂盒，包括a)第一单位剂型形式的有效量的因子VII或因子VII有关多肽和药物上可接受载体的制剂；b)第二单位剂型形式的有效量的PAI-1或PAI-1相关多肽和药物上可接受载体的制剂；和c)用于包含所述第一和第二单位剂型的容器用具。
本发明在第三个方面中提供了因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽的组合在制备用于治疗受试者中的出血发作的药物中的应用。本发明在另一个方面中提供了如权利要求1-18中任意一项所述的组合物在制备用于治疗受试者中出血发作的药物中的应用。
在本发明不同的实施方案中，所述药物可用于减少获得完全止血所需的时间、减少维持止血所需的时间、减少凝固时间、延长凝块溶解时间并增加凝块强度。
在不同的实施方案中，所述的药物用于治疗因下列情况而经历出血发作的受试者手术、创伤或其它形式的组织损害；凝血病，包括多次输血受试者的凝血病；先天性或获得性凝血或出血性疾病，包括肝功下降(″肝病″)；血小板功能缺陷或血小板数量减少；必需的凝血″化合物″(例如血小板或冯·维勒布兰德因子蛋白)缺乏或异常；纤维蛋白溶解增加；抗凝疗法或溶栓疗法；或干细胞移植。在一系列实施方案中，出血发生在诸如脑、内耳区、眼、肝、肺、肿瘤组织、胃肠道这样的器官；在另一系列实施方案中，出血是弥散性出血，诸如出血性胃炎和子宫出血过多。在另一系列实施方案中，出血发作是与具有急性关节积血(关节内出血)、慢性血友病性关节病、血肿(例如肌肉、腹膜后、舌下和咽后)、其它组织中的出血、血尿(从肾道中出血)、大脑出血、手术(例如肝切除术)、拔牙和胃肠出血(例如UGI出血)的受试者中的手术或创伤相关的出血。在一个实施方案中，所述的药物用于治疗因受试者创伤或手术或血小板计数或活性降低所导致的出血发作。
本发明在另一个方面中提供了受试者内出血发作的治疗方法，该方法包括根据受试者需要对其给予第一用量的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和第二用量的PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效治疗出血。
本发明在另一个方面中提供了减少受试者中凝固时间的方法，该方法包括根据受试者需要对其给予第一用量的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和第二用量的PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效减少凝固时间。
本发明在另一个方面中提供了增强受试者内止血的方法，该方法包括根据受试者需要对其给予第一用量的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和第二用量的PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地增强止血。
本发明在另一个方面中提供了延长受试者内凝块溶解时间的方法，该方法包括根据受试者需要对其给予第一用量的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和第二用量的PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效延长凝块溶解时间。
本发明在另一个方面中提供了增加受试者内凝块强度的方法，该方法包括根据受试者需要对其给予第一用量的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和第二用量的PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地增加凝块强度。
在一系列所述方法的实施方案中，以单一剂型形式给予所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽。
在另一系列所述方法的实施方案中，以含有因子VII或因子VII有关多肽的制剂的第一剂型和含有PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂的第二剂型的形式给予所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽。在一系列其实施方案中，给予所述第一剂型与给予所述第二剂型之间的时间间隔不超过15分钟。
本发明在另一个方面中提供了含有用于出血发作的治疗用品的试剂盒，包括d)单一单位剂型的有效量的因子VII或因子VII有关多肽和有效量的PAI-1或PAI-1相关多肽以及药物上可接受载体；和e)用于包含所述单一单位剂型的容器用具。
在本发明的一系列实施方案中，所述的因子VII或因子VII有关多肽是因子VII有关多肽。在本发明的一系列实施方案中，所述的因子VII有关多肽是因子VII氨基酸序列变体。在一个实施方案中，当用如本说明书中所述的″体外水解试验″测定时，所述的因子VII有关多肽的活性与天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之比至少约为1.25。
在本发明的一系列实施方案中，所述的因子VII或因子VII有关多肽是因子VII。在一个实施方案中，所述的因子VII是牛、猪、犬、马、鼠或鲑鱼的因子VII。在另一个实施方案中，因子VII是以重组方式制备的。在另一个实施方案中，所述的因子VII来源于血浆。在优选的实施方案中，所述的因子VII是重组人因子VII。在本发明的一系列实施方案中，所述的因子VII或因子VII有关多肽是其活化形式。在本发明的一个优选实施方案中，所述的因子VII是重组人因子VIIa。
在一系列实施方案中，所述的PAI-1或PAI-1相关多肽是PAI-1相关多肽。在一个实施方案中，所述的PAI-1相关多肽是PAI-1氨基酸序列变体。在一个实施方案中，当用如本说明书中所述的″PAI-1试验″测定时，所述的PAI-1相关多肽的活性与天然人血浆PAI-1(野生型PAI-1)的活性之比至少约为1.25。在一个实施方案中，所述的PAI-1或PAI-1相关多肽是PAI-1多肽。在一个实施方案中，所述的PAI-1是人PAI-1。在一个实施方案中，所述的PAI-1是牛、猪、犬、马、鼠或大鼠的PAI-1。在优选的实施方案中，所述的PAI-1是以重组方式制备的。在一个实施方案中，所述的PAI-1来源于血小板；在另一个实施方案中，它来源于内皮细胞。在优选的实施方案中，所述的PAI-1是重组人PAI-1。在一个实施方案中，所述的PAI-1相关多肽是PAI-1片段。在一个实施方案中，所述的PAI-1相关多肽是杂合PAI-1多肽，例如猪/人杂合体。
在一个实施方案中，所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽存在的重量比约为100∶1-约1∶100(w/w因子VII∶PAI-1)。
在一个实施方案中，所述的VII相关多肽是与野生型因子VII(即具有美国专利US4,784,950中所公开的氨基酸序列的多肽)相比具有不超过20个氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列变体。在另一个实施方案中，所述的因子VII变体与野生型因子VII相比具有不超过15个氨基酸取代、缺失或插入；在其它实施方案中，所述的因子VII变体与野生型因子VII相比具有不超过10个氨基酸、诸如8个、6个、5个或3个氨基酸取代、缺失或插入。在一个实施方案中，所述的因子VII变体选自L305V-FVIIa、L305V/M306D/D309S-FVIIa、L305I-FVIIa、L305T-FVIIa、F374P-FVIIa、V158T/M298Q-FVIIa、V158D/E296V/M298Q-FVIIa、K337A-FVIIa、M298Q-FVIIa、V158D/M298Q-FVIIa、L305V/K337A-FVIIa、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVIIa、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVIIa、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII和S336G-FVII的组。
在另一个实施方案中，VII相关多肽与天然人凝血因子VIIa相比具有增加的组织因子非依赖性活性。在另一个实施方案中，这种增加的活性并不伴有底物特异性的改变。在本发明的另一个实施方案中，VII相关多肽和组织因子的结合并未受到损害，且VII相关多肽在与组织因子结合时至少具有野生型因子VIIa的活性。
在优选的实施方案中，所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽是重组人因子VIIa和重组人PAI-1。
在一个实施方案中，哺乳动物血液的凝固时间得到减少。在另一个实施方案中，哺乳动物血液中的止血得到增强。在另一个实施方案中，哺乳动物血液中的凝块溶解时间得到延长。在另一个实施方案中，哺乳动物血液中的凝块强度得到提高。在一个实施方案中，所述的哺乳动物血液是人血液。在另一个实施方案中，所述的哺乳动物血液是正常人血液。在一个实施方案中，所述的血液来自凝血酶产生异常的受试者。在一个实施方案中，所述的血液是来自其中一种或多种凝血因子缺乏的受试者的血液；在另一个实施方案中，所述的血液是来自具有针对一种或多种凝血因子的抑制剂的受试者的血液；在一个实施方案中，所述的血液来自具有血纤蛋白原浓度降低的受试者；在一个实施方案中，所述的血液是PAI-1-缺陷型人血液。在一系列实施方案中，所述的血液是血浆。
在本发明的一个实施方案中，所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽是包含在所述组合物中的仅有止血剂。在另一个实施方案中，所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽是包含在所述组合物中的仅有活性止血剂。在另一个实施方案中，所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽是给予受试者的仅有凝血因子。在本发明的一个实施方案中，所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽是给予患者的仅有活性剂。在一个实施方案中，所述的组合物基本上不含凝血酶或凝血酶原；在另一个实施方案中，所述的组合物基本上不含FX；在另一个实施方案中，所述的组合物基本上不含FXa。
在另一个实施方案中，药物组合物被配制成用于静脉内给药，优选注射或输注，特别是注射。在一个实施方案中，所述的组合物含有至少一种药物上可接受的赋形剂或载体。
在本发明的一个实施方案中，所述的组合物是单一单位剂型，其中该单一单位剂型含有这两种凝血因子。在本发明的一个实施方案中，所述的组合物是包括VII或因子VII有关多肽的制剂作为第一单位剂型和PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂作为第二单位剂型、并包括用于包含所述第一和第二单位剂型的容器用具的试剂盒。在一个实施方案中，所述的组合物或试剂盒可以适当地进一步包含用于分别给予所述组合物或独立成分的说明书。
在本发明的一个实施方案中，以单一剂型形式给予所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽。在本发明的一个实施方案中，以包括VII或因子VII有关多肽的制剂的第一单位剂型和包括PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂的第二单位剂型的形式给予所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽。
在本发明的一个实施方案中，同时给予所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽。在另一个实施方案中，依次给予所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽。在一个实施方案中，以不超过15分钟、优选10分钟、更优选5分钟、更优选2分钟的时间间隔给予所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽。在一个实施方案中，以至多2小时、优选1-2小时、更优选至多1小时、更优选30分钟-1小时、更优选至多30分钟、更优选15-30分钟的时间间隔给予所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽。
在一个实施方案中，所述的因子VII或因子VII有关多肽的有效量约为0.05mg/天-约500mg/天(70-kg受试者)。在一个实施方案中，PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂的有效量约为0.01mg/天-约500mg/天(70-kg受试者)。
在一个实施方案中，所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽以重量比约为100∶1-约1∶100(w/w因子VII∶PAI-1)的比例存在。
在本发明的一个实施方案中，所述的药物组合物是单一单位剂型，主要由因子VII或因子VII有关多肽的制剂、PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂和一种或多种选自药物上可接受载体、稳定剂、去污剂、中性盐、抗氧化剂、防腐剂和蛋白酶抑制剂的组中的成分所组成。
在本发明的另一个实施方案中，所述的药物组合物是由组成部分组成的试剂盒形式，其中包含第一单位剂型和第二单位剂型，所述的第一单位剂型主要由因子VII或因子VII有关多肽的制剂和一种或多种选自药物上可接受载体、稳定剂、去污剂、中性盐、抗氧化剂、防腐剂和蛋白酶抑制剂的组中的成分组成；所述的第二单位剂型主要由PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂和一种或多种选自药物上可接受载体、稳定剂、去污剂、中性盐、抗氧化剂、防腐剂和蛋白酶抑制剂的组中的成分组成。
在另一个实施方案中，所述的受试者是人；在另一个实施方案中，所述的受试者具有凝血酶产生异常；在一个实施方案中，所述的受试者的血纤蛋白原血浆浓度降低(例如多次输血的受试者)；在一个实施方案中，所述的受试者中因子VIII或FIX血浆浓度降低。
本发明在另一个方面中涉及与用因子VII作为唯一凝固蛋白来治疗受试者对相比在患有因子VII反应性综合征的受试者中增强止血的方法，该方法包括根据受试者需要对其给予第一用量的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和第二用量的PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地增强止血。
本发明在另一个方面中涉及增强受试者内凝血酶形成的方法，该方法包括根据受试者需要对其给予第一用量的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和第二用量的PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地增强凝血酶形成。
本发明在另一个方面中涉及与用因子VII作为唯一凝固蛋白来治疗受试者时相比在患有因子VII反应性综合征的受试者中增强凝血酶形成的方法，该方法包括根据受试者需要对其给予第一用量的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和第二用量的PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地增强凝血酶形成。
本发明在另一个方面中涉及与用因子VII作为唯一凝固蛋白来治疗受试者时相比在患有因子VII反应性综合征的受试者中减少完成止血所需的凝血因子给药次数的方法，该方法包括根据受试者需要对其给予第一用量的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和第二用量的PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地减少凝血因子蛋白给药次数。
本发明在另一个方面中涉及对患有因子VII反应性综合征的受试者中的出血进行治疗的方法，该方法包括根据受试者需要对其给予第一用量的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和第二用量的PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地治疗出血。
在一个实施方案中，所述的因子VII是人重组因子VIIa(rFVIIa)。在另一个实施方案中，rFVIIa是NovoSeven(NovoNordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)。
本发明在另一个方面中涉及因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1的组合在制备可用于增强哺乳动物血浆中血纤蛋白块形成的药物中的应用。
本发明在另一个方面中涉及增强受试者中血纤蛋白块形成的方法，该方法包括根据受试者需要对其给予第一用量的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和第二用量的PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地治疗出血。
附图目录附

图1添加FVIIa导致凝块溶解时间以剂量依赖性方式延长。这种作用在10nM FVIIa下最佳。
附图2在有10nM FVIIa存在的情况下，添加PAI-1导致凝块溶解时间进一步延长。这种作用是剂量依赖性的，且在10nM PAI-1下为最佳。
附图3利用血栓弹性描记法(roTEG)测定值分析FVIIa与PAI-1的组合对最大凝块硬度(Maximal Clot Firmness，MCF)和凝块对t-PA介导的溶解的耐受性的影响。在正常人血浆中，添加PAI-1(30nM)不会改变MCF，但可将半数凝块溶解时间延长至16.1分钟。时间标度按分钟计。
附图4利用血栓弹性图描记法(roTEG)测定值分析FVIIa与PAI-1的组合对最大凝块硬度(MCF)和凝块对t-PA介导的溶解的耐受性的影响。在血友病患者的血浆中，单独添加PAI-1将MCF增加至5mm，并将半数凝块溶解时间延长至32.4分钟。时间标度按分钟计。
发明详述因手术或大型创伤而过度出血、由此需要输血的受试者比那些未发生任何出血的受试者更易产生并发症。然而，如果需要给予人血液或血液制品(用于治疗凝血缺陷等的血小板、白细胞、来源于血浆的浓缩物)，则中度出血也可以导致并发症，这是因为它与转移人病毒(肝炎、HIV、细小病毒及其它目前未知的病毒)以及非病毒病原体的危害相关。需要大输血的广泛出血可以导致包括肺和肾功能损害在内的多器官衰竭的发生。一旦受试者发生这些严重的并发症，则开始出现一连串涉及许多细胞因子和炎症反应的事件，使得极难进行任何治疗，且通常令人遗憾地不成功。发生大失血的患者在临床上变得不稳定。这类患者有发生心房纤维性颤动的风险，这可以导致致命性的心脏功能停止、肾功能异常或肺中流体外渗(所谓的″肺积水″或ARDS)。因此，手术和治疗主要组织损害的主要目的在于避免出血或将其减小到最低限度。为了避免这类不期望的出血或将其减小到最低限度，重要的是确保形成不易被纤维蛋白溶解酶溶解的稳定、坚固的止血塞(haemostatic plugs)。此外，重要的是确保快速而有效地形成这类止血塞或凝块。
患有血小板减少(血小板计数或活性下降)的受试者也存在凝血酶产生异常和纤维蛋白塞难于稳定的问题，从而使止血塞倾向于过早溶解。此外，发生大型创伤或器官损害、因而已经进行频繁输血的受试者通常具有低血小板计数和低血纤蛋白原、因子VIII和其它凝固蛋白水平。这些受试者中凝血酶产生异常(或低下)。因此，这些受试者在止血能力上存在缺陷或效力较低，导致形成的血纤蛋白塞可很容易并过早地被蛋白水解酶溶解，而这类酶还在以广泛创伤和器官损害为特征的情况中广泛释放。
组织中的出血还可以导致血肿形成。血肿(特别是颅间和脊椎血肿)的大小与神经功能丧失、恢复困难和/或恢复后神经功能永久性损伤的严重性和程度密切相关。当血肿位于大脑中时，可观察到最严重的后果，甚至可以导致患者死亡。
因此，治疗出血的主要目的在于在最短时间内达到止血，由此使失血保持在最低水平上。
本发明由此提供了可用于治疗有此需要的受试者内出血发作的有益的组合物、应用和治疗方法。所述的组合物、应用和方法可以带来有益作用，诸如在获得止血前就减少失血；在手术过程中需要的血液量减少；将血压保持在可接受的水平上直至获得止血；使血压较快速地保持稳定；对所治疗的患者而言恢复时间缩短；减少血肿形成或形成更小的血肿(包括脑内血肿)；更快速地制止出血；减少使出血停止并维持止血所需的给药次数。
与单独给予因子VIIa或PAI-1相比，联合给予因子VII或因子VII有关多肽、例如因子VIIa的制剂与PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂时凝固时间缩短，凝块较硬且对纤维蛋白溶解的耐受性增加。
联合给予因子VII或因子VII有关多肽(例如因子VIIa)的制剂与PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂时，与单独给予因子VIIa或PAI-1之一的情况相比，前者达到止血的时间减少，且维持止血所需的给药次数减少。本发明提供了同时或依次给予因子VII或因子VII有关多肽的制剂与PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂的有益作用。本发明的药物组合物可以是单一组合物形式，或它可以是多成分试剂盒(多组成部分组成的试剂盒)的形式。本发明的组合物可用作包括诸如人这样的灵长类在内的哺乳动物中的治疗和预防性促凝血剂。本发明进一步提供了治疗包括人类在内的受试者内的出血发作的方法(包括预防性治疗或预防)。
本说明书的上下文中无论在何种情况下提及第一或第二或第三单位剂量等时，这一剂量并不表示给药的优选顺序，而仅仅是为了便于说明。
因子VII或因子VII有关多肽的制剂与PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂的组合是确保凝固时间缩短、止血塞快速形成和形成稳定止血塞(haemostatic plugs)的有利产品。本发明者已经发现，因子VII或因子VII有关多肽的制剂与PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂的组合是确保坚固、稳定且快速形成的止血塞形成的有利产品。
本发明者已经证实，与单独的因子VIIa或PAI-1相比因子VIIa与PAI-1的组合可以更有效地增加凝块的硬度。还证实与单独的因子VIIa或PAI-1相比，因子VII或因子VII有关多肽与PAI-1的组合可以更有效地延长正常人血浆的体外凝块溶解时间。另外证实与单独的因子VIIa或PAI-1相比，因子VII或因子VII有关多肽与PAI-1的组合可以更有效地延长正常人血浆中的半数凝块溶解时间。也证实与单独的因子VIIa或PAI-1之一相比，因子VII或因子VII有关多肽与PAI-1的组合可以更有效地防止正常人血浆中凝块发生纤维蛋白溶解，特别是tPA-介导的纤维蛋白溶解。因此，通过增强凝固作用，可以在受试者中更有效地治疗出血。
不希望受到理论束缚，据信完整的凝血酶产生是形成坚实、稳定的止血塞、由此维持止血所必不可少的。这类塞的纤维蛋白结构依赖于形成的凝血酶的量和开始凝血酶产生的速率。在凝血酶产生异常的情况下，形成高渗透性的多孔纤维蛋白塞。血纤蛋白表面上通常存在的纤维蛋白溶解酶易于溶解这类血纤蛋白塞。稳定的血纤蛋白塞的形成也依赖于被凝血酶活化的因子XIIIa的存在，由此也依赖于完整的凝血酶产生。此外，近来描述的凝血酶可活化纤维蛋白溶解抑制剂TAFI要求相当高的凝血酶量用于其活化。因此，在凝血酶的形成并非完全合适的情况下，TAFI可能不活化，导致形成通常更易于被正常纤维蛋白溶解活性所溶解的止血塞。在血小板数量下降、即血小板减少症的情况中，通过给予额外的外源性因子VIIa可以启动快速凝血酶产生。然而，因子VIIa即使在高浓度下也不可能使总凝血酶产生正常化。
在血纤蛋白原的血浆浓度低的受试者(因多创伤或广泛手术而导致多次输血的受试者)中，不会发生完整凝血酶活化。更有效的止血通过联合给予因子VII或因子VII有关多肽与PAI-1而达到。
患有血小板减少的受试者中凝血酶产生异常，血纤蛋白塞的稳定化有缺陷，导致止血塞(haemostatic plugs)倾向于过早溶解。此外，发生大创伤或器官损害、由此频繁输血的受试者通常具有低血小板计数和低血纤蛋白原、因子VIII和其它凝固蛋白水平。这些受试者的凝血酶产生异常(或低下)。此外，其降低的血纤蛋白原水平对因子XIII的活化产生了负面的干扰作用。因此，这些受试者的止血能力存在缺陷或效力较低，导致形成可容易并过早地被蛋白水解酶所溶解的血纤蛋白塞，而这类酶还在以广泛创伤和器官损害为特征的情况中广泛释放。
为了有利于形成具有维持受试者内止血的完整能力的完全稳定化的塞，给予本发明的组合物。该组合物对血小板数量低的受试者和血纤蛋白原和/或其它凝固蛋白的血浆水平低的受试者尤其有利。
因子VII多肽在实施本发明的过程中，可以使用有效预防或治疗出血的任何因子VII多肽。包括来源于血液或血浆或者通过重组方式生产的因子VII多肽。
本发明包括因子VII多肽，诸如例如那些具有美国专利US4,784,950中所公开的氨基酸序列的因子VII(野生型人因子VII)。在某些实施方案中，所述的因子VII多肽是如美国专利US4,784,950中所公开的人因子VIIa(野生型因子VII)。在一系列实施方案中，因子VII多肽包括表现出人因子VIIa的特异性生物活性的至少约10％、优选至少约30％、更优选至少约50％且最优选至少约70％的多肽。在一系列实施方案中，因子VII多肽包括表现出人因子VIIa的特异性生物活性的至少约90％、优选至少约100％、优选至少约120％、更优选至少约140％且最优选至少约160％的多肽。在一系列实施方案中，因子VII多肽包括表现出与美国专利US4,784,950中所公开的野生型因子VII序列具有至少约70％、优选至少约80％、更优选至少约90％且最优选至少约95％同一性的多肽。
本文所用的″因子VII多肽″包括、但不限于因子VII和因子VII有关多肽。术语″因子VII″用以包括、但不限于具有野生型人因子VII(如美国专利US4,784,950所公开的)第1-406位氨基酸序列的多肽以及来源于其它种类的野生型因子VII，诸如来自牛、猪、犬、鼠或鲑鱼的因子VII，所述的因子VII来源于血液或者血浆，或者通过重组方式产生。该术语进一步包括可以在个体之间存在并出现的因子VII的天然等位变化形式。此外，糖基化或其它翻译后修饰的程度和位置可以随所选择的宿主细胞和宿主细胞环境的性质的不同而改变。术语″因子VII″还用以包括未裂解(酶原)形式的因子VII多肽和那些已经经蛋白酶解加工成其相应的生物活性形式的多肽，可以将它们命名为因子VIIa。一般来说，裂解因子VII的第152位-第153位残基而得到因子VIIa。
″因子VII有关多肽″包括、但不限于相对于人因子VII而言已经进行化学修饰和/或相对于人因子VII而言含有一个或多个氨基酸序列改变(即因子VII变体)和/或相对于人因子VII而言含有截短的氨基酸序列(即因子VII片段)的因子VII多肽。这类因子VII有关多肽可以表现出与人因子VII不同的特性，包括稳定性、磷脂结合、改变的比活性等。术语″因子VII有关多肽″用以包括这类未裂解形式(酶原)的多肽和那些已经经蛋白酶解加工成其相应的生物活性形式的多肽，可以将它们命名为″因子VIIa相关多肽″或″活化的因子VII相关多肽″。
本文所用的″因子VII有关多肽″包括、但不限于与野生型人因子VII表现出基本上相同或改善的生物活性的多肽，以及相对于野生型人因子VIIa而言因子VIIa生物活性已经实质上改变或降低的多肽。这些多肽包括、但不限于已经进行化学修饰的因子VII或因子VIIa和已经导入了改变或破坏所述多肽的生物活性的特定氨基酸序列改变的因子VII变体。
其中进一步包括具有轻微修饰的氨基酸序列的多肽，例如，带有修饰的N-末端、包括N-末端氨基酸缺失或添加的多肽和/或相对于人因子VIIa而言已经进行化学修饰的多肽。
包括因子VII变体在内的因子VII有关多肽，无论是表现出与野生型因子VII基本上相同或更好的生物活性，还是与野生型因子VII相比表现出实质上改变或降低的生物活性，都包括、但不限于因插入、缺失或取代一个或多个氨基酸而具有不同于野生型因子VII序列的氨基酸序列的多肽。
当用如上所述的凝血试验、蛋白水解试验或TF结合试验中的一种或多种测试时，包括变体在内的因子VII有关多肽包括表现出在相同细胞类型中产生的野生型因子VIIa的比活性的至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约120％或至少约130％的那些多肽。
当用如上所述的凝血试验、蛋白水解试验或TF结合试验中的一种或多种测试时，与野生型因子VIIa具有基本上相同或有所改善的生物活性的因子VII有关多肽(包括变体在内)包括表现出在相同细胞类型中产生的野生型因子VIIa的比活性的至少约25％、优选至少约50％、更优选至少约75％、更优选至少约100％、更优选至少约110％、更优选至少约120％且最优选至少约130％的那些多肽。
当用如上所述的凝血试验、蛋白水解试验或TF结合试验中的一种或多种测试时，与野生型因子VIIa相比具有实质上降低的生物活性的因子VII有关多肽(包括变体在内)是表现出在相同细胞类型中产生的野生型因子VIIa的比活性的低于约10％、更优选低于约5％且最优选低于约1％的那些多肽。与野生型因子VII相比具有实质上改变的生物活性的因子VII变体包括、但不限于表现出TF非依赖性因子X蛋白水解活性的因子VII变体和那些结合TF、但不裂解因子X的因子VII变体。
在某些实施方案中，因子VII多肽是因子VII有关多肽，特别是在用″体外水解试验″(参见下面的″试验″)测试时其活性与天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之比至少约为1.25的变体；在其它实施方案中，该比值至少约为2.0；在其它实施方案中，该比值至少约为4.0。在本发明的某些实施方案中，因子VII多肽是因子VII有关多肽，特别是在用″体外蛋白水解试验″(参见下面的″试验″)测试时其活性与天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之比至少约为1.25的变体；在进一步实施方案中，该比值至少约为2.0；在进一步实施方案中，该比值至少约为4.0；在进一步实施方案中，该比值至少约为8.0。
在某些实施方案中，所述的因子VII多肽是如美国专利US4,784,950中所公开的人因子VII(野生型因子VII)。在某些实施方案中，所述的因子VII多肽是人因子VIIa。在一系列实施方案中，因子VII多肽是表现出人因子VIIa的特异性生物活性的至少约10％、优选至少约30％、更优选至少约50％且最优选至少约70％的因子VII有关多肽。在某些实施方案中，所述的因子VII多肽具有因插入、缺失或取代一个或多个氨基酸而不同于野生型因子VII的序列的氨基酸序列。
具有与野生型因子VIIa基本上相同或优于它的生物活性的因子VII变体的非限制性实例包括、但不限于丹麦专利申请PA 2000 00734和PA 2000 01360(相当于WO 01/83725)以及PA 2000 01361(相当于WO 02/22776)中所述的因子VII变体。具有与野生型因子VII基本上相同或改善的生物活性的因子VII变体的非限制性实例包括S52A-FVII、S60A-FVII(lino等《生物化学与生物物理学档案》(Arch.Biochem.Biophys.)352182-192，1998)；L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V1 58D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII和S336G-FVII；如美国专利US5,580,560中所公开的表现出增加的蛋白水解稳定性的FVIIa变体；已经在第290-291位残基或第315-316位残基上进行了蛋白水解切割的因子VIIa(Mollerup等《生物技术与生物工程》(Biotechnol. Bioeng.)，48501-505，1995)；和因子VIIa的氧化形式(Kornfelt等《生物化学与生物物理学档案》(Arch.Biochem.Biophys.)36343-54，1999)。与野生型因子VII相比具有实质上降低或改变的生物活性的因子VII变体的非限制性实例包括R152E-FVIIa(Wildgoose等《生物化学》(Biochem)293413-3420，1990)、S344A-FVIIa(Kazama等《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)27066-72，1995)、FFR-FVIIa(Hoist等《欧洲血管与血管内手术杂志》(Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.)15515-520，1998)和缺乏Gla结构域的因子VIIa(Nicolaisen等《FEBS通讯》(FEBS Letts.)317245-249，1993)。化学修饰的因子VII多肽和序列变体的非限制性实例描述在例如美国专利US5,997,864中。
因子VIIa在血液凝固中的生物活性来源于其(i)结合组织因子(TF)和(ii)催化因子IX或因子X的蛋白水解切割而产生活化因子IX或X(分别为因子IXa或Xa)的能力。
为了本发明的目的，可以如美国专利US5,997,864中所述通过使用缺乏因子VII的血浆和组织促凝血酶原激酶测定制剂增强血液凝固的能力来对因子VII多肽的生物活性(″因子VII生物活性″)定量。在该试验中，将生物活性表示为与对照样品相比凝固时间的减少，通过与含有1单位/ml因子VII活性的合并人血清标准品比较而转化成″因子VII单位″。或者，可以通过下列步骤对因子VIIa生物活性定量(i)测定因子VIIa或因子VIIa相关多肽在包括包埋在脂膜中的TF和因子X的系统中产生活化因子X(因子Xa)的能力。(Persson等《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)27219919-19924，1997)；(ii)在含水系统中测定因子X水解(″体外蛋白水解试验″，参见下文)；(iii)使用基于表面胞质基因共振的仪器测定因子VIIa或因子VIIa相关多肽与TF的物理结合(Persson，《FEBS通讯》(FEBSLetts.)413359-363，1997)；和(iv)测定因子VIIa和/或因子VIIa相关多肽对合成底物的水解(″体外水解试验″，参见下文)；和(v)测定非TF依赖性体外系统中凝血酶的产生。
术语″因子VII生物活性″或″因子VII活性″用以包括产生凝血酶的能力；该术语还包括在没有组织因子存在的情况下在活化血小板的表面上产生凝血酶的能力。
可以按照本发明使用的因子VIIa制剂是、但不限于NovoSeven(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)。
PAI-1多肽本发明包括PAI-1多肽的应用，诸如例如那些具有Gils等在《生物化学与生物物理学学报》(Biochim Biophys Acta.)1998年9月8日；1387(1-2)291-7、Sui等在《生物活性杂志》(Biochem J.)19984月15日；331(Pt2)409-15、Ginsburg等在《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)，第78卷，pp.1673-1680(1986)中所公开的氨基酸序列的PAI-1多肽；那些描述在美国专利US6,303,338、美国专利6,103,498或如Pannekoek等在《欧洲分子生物学协会杂志》(JOURNAL EMBOJ.)5(10)，2539-2544(1986)中所公开的PAI-1多肽(野生型PAI-1)。
在实施本发明的过程中，可以使用有效预防或治疗出血的任意PAI-1多肽。这包括来源于血液或血浆或者通过重组方式产生的PAI-1多肽。术语″PAI-1″用以包括活性形式(包括组成型活性形式，例如PAI-1(14-1b，Molecular Innovations))和潜在构象的天然出现的PAI-1多肽。
本文所用的″PAI-1多肽″包括、但不限于PAI-1以及PAI-1-相关多肽。
术语″PAI-1″用以包括、但不限于具有Pannekoek等在《欧洲分子生物学协会杂志》(JOURNAL EMBO J.)5(10)，2539-2544(1986)、Gils等在《生物化学与生物物理学学报》(Biochim BiophysActa.)1998 9月8日；1387(1-2)291-7、Sui等在《生物活性杂志》(Biochem J.)1998 4月15日；331(Pt2)409-15、Ginsburg等在《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)，第78卷，pp.1673-1680(1986)中所述的氨基酸序列的多肽；或那些描述在美国专利US6,303,338、美国专利6,103,498中的多肽；和来源于其它物种的野生型PAI-1，诸如牛、猪、犬、鼠和大鼠PAI-1。
其中进一步包括可能在个体之间存在且出现的PAI-1的天然等位变化形式。此外，糖基化或其它翻译后修饰的程度和位置可以随所选择的宿主细胞和宿主细胞环境性质的不同而改变。术语″PAI-1″还用以包括酶原形式的PAI-1多肽和那些已经加工成其相应的生物活性形式的多肽。
″PAI-1相关多肽″包括、但不限于相对于人PAI-1而言已经进行化学修饰和/或相对于人PAI-1而言含有一个或多个氨基酸序列改变(即PAI-1变体)和/或相对于人PAI-1而言含有截短的氨基酸序列(即PAI-1片段)的PAI-1多肽。这类PAI-1相关多肽可以表现出与人PAI-1不同的特性，包括稳定性、磷脂结合、改变的比活性等。
术语″PAI-1相关多肽″用以包括酶原形式的这类多肽和那些已经加工成其相应的生物活性形式的多肽。
本文所用的″PAI-1相关多肽″包括、但不限于表现出与野生型人PAI-1基本上相同或有所改善的生物活性的多肽，以及与野生型人PAI-1的活性相比其PAI-1生物活性已经实质上改变或降低的多肽。这些多肽包括、但不限于已经化学修饰的PAI-1和已经导入了改变或破坏所述多肽的生物活性的特定氨基酸序列改变的PAI-1变体。
其中进一步包括具有轻微修饰的氨基酸序列的多肽，例如，带有修饰的N-末端、包括N-末端氨基酸缺失或添加的多肽和/或相对于人因子PAI-1而言已经进行化学修饰的多肽。
包括因子PAI-1变体在内的因子PAI-1相关多肽，无论是表现出与野生型PAI-1基本上相同或优于它的生物活性，还是与野生型PAI-1相比表现出实质上改变或降低的生物活性，均包括、但不限于具有因插入、缺失或取代一个或多个氨基酸而不同于野生型PAI-1的序列的氨基酸序列的多肽。
当用本说明书中所述的PAI-1活性试验测试时，包括变体在内的PAI-1相关多肽包括表现出在相同细胞类型中产生的野生型PAI-1的比活性的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约120％和至少约130％的那些多肽。
与野生型PAI-1具有基本上相同或改善的生物活性的PAI-1相关多肽(包括变体在内)包括，在用如上所述的特异性PAI-1活性试验中的一种或多种测试时，表现出在相同细胞类型中产生的野生型人PAI-1的特异性生物活性的至少约25％、优选至少约50％、更优选至少约75％、更优选至少约100％、更优选至少约110％、更优选至少约120％且最优选至少约130％的那些多肽。为了本发明的目的，可以通过例如如本文所述测定制剂抑制tPA-介导的凝块溶解或纤溶酶介导的凝块溶解的能力来对PAI-1的生物活性进行定量。在两种试验中，将生物活性表示为与对照样品相比凝块溶解时间的减少。或者，可以通过例如Chandler等在《临床化学》(Clinical Chemistry)，35(5)787-793(1989)中所述或用于功能性人PAI-1的酶联免疫吸附测定(HPAIKT，Molecular Innovations)或本领域中公知的其它试验测定PAI-1和/或PAI-1等同物对tPA酰胺水解活性(amidolytic activity)的抑制作用来对PAI-1的生物活性定量。
当用如上所述的特异性PAI-1活性试验中的一种或多种测试时，具有实质性低于野生型PAI-1生物活性的PAI-1相关多肽(包括变体在内)是表现出在相同细胞类型中产生的野生型PAI-1的比活性的低于约25％、优选低于约10％、更优选低于约5％且最优选低于约1％的那些多肽。
PAI-1等同物的非限制性实例包括例如美国专利US6103498中所述的PAI-1等同物。
在某些实施方案中，所述的PAI-1多肽是当用″PAI-1试验″(Chandler等《临床化学》(Clinical Chemistry)，35(5)787-793(1989)，参见上文)测试时其活性与天然人PAI-1(野生型PAI-1)的活性之比至少约为1.25的PAI-1等同物；在其它实施方案中，该比值至少约为2.0；在进一步的实施方案中，该比值至少约为4.0。
PAI-1相关多肽还包括保持其特征性止血相关活性的PAI-1或PAI-1相关多肽的片段。例如，可以使用本说明书中所述的PAI-1活性试验测定PAI-1多肽的止血相关活性。
定义在本说明书的上下文中，按照表1中所示的常规含义使用三字母或单字母氨基酸表示法。除非详细说明，本文中所提及的氨基酸是L-氨基酸。应理解例如在K337中的第一个字母代表天然出现在野生型因子VII指定位置上的氨基酸，并且，例如[K337A]-FVIIa指其中由单字母代码K代表的天然出现在指定位置上的氨基酸被由单字母代码A代表的氨基酸取代的FVII-变体。
表1氨基酸缩写
术语″因子VIIa″或″FVIIa″可以互换使用。
在本说明书的上下文中，“具有凝血酶产生异常的受试者”指的是不能在活化血小板表面上使凝血酶完全爆发的受试者，包括凝血酶的产生少于具有完全有功能的正常止血系统的受试者体内凝血酶产生的受试者，所述的完全有功能的正常止血系统包括凝血因子、血小板和血纤蛋白原的正常量和功能(例如在汇集的正常人血浆中)；包括、但不限于缺乏因子VIII的受试者；具有低血小板数量或具有功能缺陷的血小板的受试者(例如血小板减少或格兰兹曼血小板机能不全或过度出血的受试者)；具有低水平凝血酶原、FX或FVII的受试者；几种凝血因子的水平降低(例如因创伤或广泛手术导致的过度出血)的受试者；和血纤蛋白原血浆浓度低的受试者(例如多次输血的受试者)。
所谓″凝血酶产生水平″或″正常凝血酶产生″指的是与健康受试者体内的水平相比患者内凝血酶的产生水平。将该水平表示成正常水平的百分比。如果合适，这些术语可以互换使用。
术语″增强止血系统″指的是增强产生凝血酶的能力。术语″增强止血″用以包括在相同凝血酶产生试验测试时，分别与仅含有因子VII或因子VII有关多肽或者PAI-1或PAI-1相关多肽的对照样品中各自的凝血酶产生相比，含有因子VII或因子VII有关多肽的制剂和PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂的测试样品中测定的凝血酶产生得到延长的情形。可以如本说明书中的凝血酶产生试验(参见″试验部分″)中所述检测凝血酶产生。
本文所用的″仅有″活性剂或因子指的是因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽彼此共同为包含在药物组合物或试剂盒中的唯一止血剂或活性止血剂或凝血因子，或者是在特定治疗过程中、诸如在特定的出血发作过程中对患者给予的唯一止血剂或活性止血剂或凝血因子的情况。应理解这些情况包括其它止血剂或凝血因子在使用时不以量或活性足以显著影响一种或多种凝固参数存在的那些情况。
凝块溶解时间、凝块强度、血纤蛋白块形成和凝固时间是用以检测患者止血系统状态的临床参数。以适当的间隔从患者体内取血样，且如下列文献中所述通过例如血栓弹性描记法检测这些参数中的一种或多种例如Meh等《血液凝固和纤维蛋白溶解》(Blood Coagulation& Fibrinolysis)2001；12627-637；Vig等《血液学》(Hematology)，第6卷(3)pp.205-213(2001)；Vig等《血液凝固和纤维蛋白溶解》(Blood Coagulation & Fibrinolysis)，第12卷(7)pp.555-561(2001)10月；Glidden等《临床和应用血栓形成/止血》(Clinical andapplied thrombosis/hemostasis)，第6卷(4)pp.226-233(2000)10月；McKenzie等《心脏病学》(Cardiology)，第92卷(4)pp.240-247(1999)4月；或Davis等《美国肾病学协会杂志》(Journal of theAmerican Society of Nephrology)，第6卷(4)pp.1250-1255(1995)。
术语″延长凝块溶解时间″用以包括在相同凝块溶解试验中测试时，含有因子VII或因子VII有关多肽的制剂和PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂的测试样品的凝块溶解时间测定值相对于比仅分别含有因子VII或因子VII有关多肽或者PAI-1或PAI-1相关多肽的对照样品的各凝块溶解时间有所延长的情况。可以如上所述检测凝块溶解时间。
术语″增加凝块强度″用以包括在相同凝块强度试验中测试时，对含有因子VII或因子VII有关多肽的制剂和PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂的测试样品测定的凝块强度、例如机械强度比仅含有因子VII或因子VII有关多肽或者PAI-1或PAI-1相关多肽的对照样品的各凝块裂解时间有所增加的情况。可以如Carr等1991所述(Carr ME，Zekert SL.“血浆凝块形成过程中血小板介导的力发生的测定”(Measurement of platelet-mediated force development duringplasma clot formation.)-《美国药物科学杂志》(AM J MED SCI)1991；30213-8)或如上所述通过血栓弹性描记法检测凝块强度。
术语″增强血纤蛋白凝块形成″用以包括在相同凝血试验中测试时，对含有因子VII或因子VII有关多肽的制剂和PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂的测试样品测定的血纤蛋白凝块形成速率或程度比对仅含有因子VII或因子VII有关多肽或PAI-1或PAI-1相关多肽的对照样品测定的血纤蛋白凝块形成速率或程度有所增加的情况。可以如上所述检测血纤蛋白凝块形成。
术语″缩短凝固时间″用以包括在相同凝血试验中测试时，含有因子VII或因子VII有关多肽的制剂和PAI-1或PAI-1相关多肽制剂的测试样品的凝块形成时间(凝固时间)测定值比分别仅含有因子VII或因子VII有关多肽或者PAI-1或PAI-1相关多肽的对照样品的个体凝固时间有所增加的情况。可以通过本领域普通技术人员所公知的标准PT og aPTT试验测定凝固时间。
术语″降低的血小板计数或活性″指的是存在于受试者血浆中的血小板数量(血小板)和这类血小板的凝血相关生物活性。降低的计数可能是由于例如血小板破坏增加、血小板产生减少和脾中汇集了高于正常的血小板级分所造成的。例如，将血小板减少定义为血小板计数低于150,000个血小板/微升；一般正常血小板计数的上限为350,000-450,000个血小板/微升。可以通过自动化血小板计数器测定血小板计数；这是本领域技术人员众所周知的方法。因血小板计数降低所导致的综合征包括、但不限于血小板减少、凝血病。″活性″包括、但不限于血小板的聚集、粘着和凝固活性。活性降低可能是由于例如糖蛋白异常、膜-细胞骨架相互作用异常、血小板颗粒异常、血小板凝固活性异常、信号传导和分泌异常导致的。可通过本领域技术人员所公知的方法测定血小板活性，包括聚集、粘着和凝固活性，例如，参见《血细胞那-实用手段》(Platelets.A Practical Approach)，Ed.S.P.Watson & K.S.Authi《血小板疾病的临床方面》(Clinical Aspects ofPlatelet Disorders)(K.J.Clemetson)15299-318，1996，OxfordUniversity Press；WilliamsHematology，第6版，Eds.Butler，Lichtman，Coller，Kipps & Selig-sohn，2001，McGraw-Hill。因血小板活性降低导致的综合征包括、但不限于格兰兹曼血小板机能不全、伯-索综合征、抗凝疗法和溶栓疗法。″降低的″指的是当在相同试验中测定时，与正常的汇集血浆样品中的计数或活性相比较，测试样品中的计数或活性降低。
本文所用的术语″出血疾病″反映了表现出出血发作的细胞或分子来源的任何缺陷，可以是先天性的、获得性的或诱发性的。出血疾病的实例包括、但不限于凝血因子缺乏(例如凝血因子VIII、IX、XI或VII缺乏)；凝血因子抑制；血小板功能缺陷(例如格兰兹曼血小板机能不全和伯-索综合征)；血小板减少；冯·维勒布兰德氏病；和凝血病，诸如因凝固蛋白稀释、纤维蛋白溶解增加和因出血和/或输血造成血小板数量降低(例如在已经进行了手术或发生创伤的多次输血的患者中)所导致的凝血病。
出血指的是血液从循环系统的任何成分中外渗。术语″出血发作″用以包括与手术、创伤或其它形式的组织损害相关的不需要的、未受控制且通常是过度的出血，以及患有出血疾病的受试者中不需要的出血。出血发作可以在具有基本上正常的凝固系统、但发生(暂时性)凝血病的受试者和患有先天性或获得性凝固或出血疾病的受试者中发生。在患有血小板功能缺陷的受试者中，出血可能与血友病导致的出血相似，这是因为与血友病一样，其中止血系统缺乏必需的凝血″化合物″(例如血小板或冯·维勒布兰德因子蛋白质)或这样的化合物异常。在发生例如与手术或大量创伤相关的广泛组织损害的受试者中，正常的止血机制可能不能满足即刻止血的需要，因此，尽管这些机制基本上(创伤前或手术前)正常，但他们仍然可能发生过度出血。通常进一步输血的这类受试者会发生因出血和/或输血导致的(暂时性)凝血病(即因出血和/或输血导致的凝固蛋白稀释、纤维蛋白溶解增加和血小板计数降低)。出血还可以在诸如脑部、内耳区和眼部这样的器官中发生；它们是手术止血可能性很小，从而难于获得令人满意的止血效果的区域。类似的问题可能在从不同器官(肝、肺、肿瘤组织、胃肠道)中取活检组织的过程中产生，也可能在腹腔镜手术和耻骨后前列腺根除术(radical retropubic prostatectomy)的过程中产生。就所有这些情况而言，常见的是难以通过手术技术(缝合线、钳等)止血，当出血是弥散性的(例如出血性胃炎和子宫大出血)时也是如此。出血还可以在进行抗凝疗法的受试者中发生，其中已经因给予的疗法而诱导了止血缺陷；这些出血通常是急性的和大量的。抗凝疗法通常是为了预防血栓栓塞性疾病。这类疗法可包括使用肝素、其它形式的蛋白聚糖、华法令或其它形式的维生素K-拮抗剂以及阿司匹林和其它血小板聚集抑制剂、诸如GP IIb/IIIa活性的抗体或其它抑制剂。出血还可以因所谓的溶栓疗法而发生，该溶栓疗法包括用抗血小板药(例如乙酰水杨酸)、抗凝剂(例如肝素)和纤维蛋白溶解剂(例如组织纤溶酶原激活物tPA)进行联合疗法。出血发作还用以包括、但不限于与患有下列疾病的受试者中的手术或创伤相关的未受控制和过度的出血急性关节积血(关节内出血)、慢性血友病性关节病、血肿(例如肌肉、腹膜后、舌下和咽后)、其它组织中的出血、血尿(从肾道中出血)、脑部出血、手术(例如肝切除术)、拔牙和胃肠出血(例如UGI出血)。出血发作可能与下列情况相关抗因子VIII的抑制剂；A型血友病；抑制剂结合A型血友病；B型血友病；因子VII缺乏；PAI-1缺乏；血小板减少；冯·维勒布兰德因子缺乏(冯维勒布兰德病)；严重组织损害；重度创伤；手术；腹腔镜手术；出血性胃炎；取活检组织；抗凝疗法；胃肠道上部出血(UGI)；或干细胞移植。出血发作可以是子宫大出血、发生在机械止血可能性较小的器官中的出血、发生在脑部的出血、发生在内耳区域的出血或发生在眼内的出血。如果合适，术语″出血发作″和″出血″可以互换使用。
在本说明书的上下文中，术语″治疗″用以包括预防预计的出血、诸如手术中的出血，和调节已经发生的出血、诸如创伤中的出血，目的在于抑制出血或将其减少到最低限度。上文提及的″预计的出血″可以是预计在特定组织或器官中发生的出血，或可以是未指明的出血。因此，预防性给予因子VII或因子VII有关多肽的制剂与PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂包括在术语″治疗″的范围内。
本文所用的术语″受试者″用以指任何动物，特别是哺乳动物，诸如人，如果合适的话则可以与术语″患者″互换使用。本发明还包括因子VII或FVII相关多肽和tPA抑制剂在兽医手术中的应用。
可以同时或依次给予如本说明书中所定义的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽。可以将所述的因子作为单一剂型形式提供，其中所述的单一剂型含有这两种凝血因子；或可以将所述的因子作为组成部分试剂盒(kit-of-parts)形式提供，所述的组成部分试剂盒中包括因子VII或因子VII有关多肽的制剂作为第一单位剂型，并包括PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂作为第二单位剂型。本说明书的上下文中无论在何种情况下提及第一或第二或第三种等单位剂量时，这一剂量并不表示给药的优选顺序，而仅是为了便于说明。
所谓″同时″给予因子VII或因子VII有关多肽的制剂与PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂指的是以单一剂型形式给予这些凝血因子蛋白，或先给予第一凝血因子，随后以不超过15分钟、优选不超过10分钟、更优选不超过2分钟的时间间隔给予第二凝血因子蛋白。可以首先给予两种因子中任何一种。
所谓″依次″给药指的是给予第一凝血因子蛋白，随后给予第二凝血因子蛋白，其时间间隔为至多2小时，优选1-2小时，更优选至多1小时，更优选30分钟-1小时，更优选至多30分钟，更优选15-30分钟。可以首先给予其中任何一种单位剂型或凝血因子蛋白。优选通过相同的静脉内途径注射这两种产品。
所谓″PAI-1的水平″或″PAI-1水平″指的是与健康受试者的水平相比患者的PAI-1活性水平。将该水平表示为正常水平的百分比。如果合适，这些术语可以互换使用。
所谓″PAI-1水平降低″或″降低的PAI-1水平″指的是与不存在PAI-1缺乏或PAI-1抑制剂的受试者群体中的平均PAI-1水平相比，血流中PAI-1的存在水平或活性下降。可以通过促凝剂或免疫试验测定循环PAI-1的水平。通过患者血浆校正PAI-1缺乏型血浆的凝固时间的能力来确定PAI-1活性(例如APTT试验，参见下文；另外参见本说明书的″试验部分″)。
已经将1个单位的PAI-1定义为1毫升正常(汇集的)人血浆中所含的PAI-1的量(相当于100％的PAI-1水平)。
已经将1个单位的因子VII定义为1毫升正常血浆中所含的因子VII的量，相当于约0.5μg蛋白质。活化后，50个单位相当于约1μg蛋白质。
所谓″缺乏″指的是与正常健康个体相比血浆中诸如PAI-1的存在水平或其活性下降。如果合适，该术语可以与″降低的PAI-1水平″互换使用。
所谓″APTT″或″aPTT″指的是部分组织凝血酶原激酶活化时间(例如由Proctor RR，Rapaport SI所述“使用高岭土的部分组织凝血酶原激酶时间-用于第一阶段血浆凝血因子缺乏的简单筛选试验”(The partial thromboplastin time with kaolin；a simple screeningtest for first-stage plasma clotting factor deficiencies.)-《美国临床病理学杂志》(Am J Clin Pathol)36212，1961)。
所谓″PAI-1反应性综合征″指的是对有此需要的受试者给予外源性PAI-1后可以预防、治愈或改善任何由该综合征导致的预计或已存在的任何症状、情况或疾病的综合征。包括、但不限于因PAI-1水平降低所导致的综合征，例如由PAI-1的抑制剂导致的出血疾病。还可以用本发明的组合物治疗PAI-1-反应性综合征。
所谓″因子VII-反应性综合征″指的是对有此需要的受试者给予外源性因子VII、优选因子VIIa后可以预防、治愈或改善任何由该综合征导致的预计或已存在的任何症状、情况或疾病的综合征。包括、但不限于因凝血因子VIII、IX、XI或VII水平降低、凝血因子抑制剂、血小板功能缺陷(例如格兰兹曼血小板机能不全和伯-索综合征)、血小板减少、冯维勒布兰德病和诸如因凝固蛋白稀释、纤维蛋白溶解增加和因出血和/或输血造成血小板数量降低(例如在已经进行了手术或发生创伤的多次输血的患者中)造成的凝血病所导致的综合征。
″半衰期″指的是因子VII或因子VII有关多肽或者PAI-1或PAI-1相关多肽的血浆浓度从特定值减少至该值一半所需的时间。
所谓″初步止血″指的是开始由FXa和TF因子VIIa产生凝血酶，随后血小板活化并形成初部的松散并活化、粘着、但尚未被血纤蛋白稳定化的血小板塞，并最后由交联的血纤蛋白稳定。如果未被止血第二步的过程中形成的血纤蛋白稳定化(维持止血)，那么它易于被纤维蛋白溶解系统溶解。
所谓″次级止血″或″维持止血″指的是在活化的血小板表面上发生并由因子VIIIa和因子VIIIa催化的凝血酶次级、完全且大量的爆发或产生，随后形成血纤蛋白，稳定初期血小板塞。血纤蛋白对该塞的稳定化可导致完全止血。
所谓″完全止血″指的是在损伤部位上形成稳定和坚固的血纤蛋白凝块或塞，该凝块或塞可使出血有效停止且不易于被纤维蛋白溶解系统溶解。在本说明书的上下文中，术语止血用于代表如上所述的完全止血。
可以通过一般公知的方法、例如通过测定光密度来测定制剂中蛋白质的总量。可以通过一般公知的方法、诸如标准Elisa免疫试验测定PAI-1-或因子VII蛋白质(″抗原″)的量。一般来说，通过下列步骤来进行这类试验使例如含有PAI-1蛋白的制剂溶液与固定在elisa平板上的抗-凝血调节蛋白抗体接触，随后使固定的抗体-PAI-1复合物与携带标记的二次抗PAI-1抗体接触，在第三步中测定它们的量。可以按照类似方式、使用适宜的抗体测定各凝血因子的量。通过添加一定量的各凝血因子蛋白来测定制剂中所含的凝血因子蛋白总量。在一个实施方案中，所述制剂包括分离的凝血因子。在另一个实施方案中，所述制剂基本上不含凝血因子II和凝血因子IIa(凝血酶原和凝血酶)和/或因子X或Xa。
本文所用的术语″分离的″指的是已经自合成凝血因子(例如PAI-1或PAI-1相关多肽的细胞中或天然存在它们的培养基(例如血浆或血液)中分离出来了的凝血因子，如PAI-1或PAI-1相关多肽。可以通过本领域中任意公知的方法从来源细胞中分离多肽，包括、但不限于从粘着细胞培养物中取出含有所需产物的细胞培养基、离心或过滤除去未粘着的细胞等。可以通过本领域中任意公知的方法从天然存在它们的培养基中分离所述多肽，包括、但不限于亲和色谱法，诸如分别在抗因子VII或抗PAI-1抗体柱上进行的亲和色谱法；疏水相互作用色谱法；离子交换色谱法；大小排阻色谱法；电泳法(例如制备型等电聚焦(IEF))；差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)；或提取法等。
在本发明中，因子VII或因子VII有关多肽以及PAI-1或PAI-1相关多肽的″有效量″定义为一起足以预防或减少出血或失血以治愈、缓解疾病及其并发症或使其部分抑制的因子VII或因子VII有关多肽(例如FVIIa)和PAI-1或PAI-1相关多肽的用量。
术语″因子VIIa的活性″或″因子VIIa活性″包括产生凝血酶的能力；该术语还包括在没有组织因子存在的情况下在活化的血小板表面上产生凝血酶的能力。
缩写TF组织因子FVII 单链、未活化形式的因子VIIFVIIa 活化形式的因子VIIrFVIIa活化形式的重组因子VIITAFI 酶原、未活化形式的TAFIPAI-1 纤溶酶原激活物抑制剂化合物的制备优选通过例如Hagen等在《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)832412-2416，1986或如欧洲专利EP 200.421(ZymoGenetics，Inc.)中所述的DNA重组技术制备适用于本发明的纯化人因子VIIa。
还可以通过Broze和Majerus在《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)255(4)1242-1247，1980以及Hedner和Kisiel在《临床研究杂志》(J.Clin.lnvest.)，711836-1841，1983中所述的方法生产因子VII。这些方法得到了因子VII，而没有可检测量的其它凝血因子。通过包括附加凝胶过滤作为最终的纯化步骤甚至可以得到进一步纯化的因子VII制品。然后通过已知方式，例如使用几种不同的血浆蛋白、诸如PAI-1Ia、IXa或Xa将因子VII转化成活化因子VIIa。另一方面，如Bjoern等(研究公开(Research Disclosure)，269，1986年9月，pp.564-565)所述，通过使因子VII通过离子交换色谱柱、诸如MonoQ(Pharmacia fine Chemicals)等使其活化。
可以通过修饰野生型因子VII或通过重组技术生产因子VII有关多肽。可以通过修饰编码野生型因子VII的核酸序列来生产与野生型因子VII相比具有改变的氨基酸序列的因子VII有关多肽，其中所述的修饰步骤既可以通过改变氨基酸密码子来进行，也可以通过经已知方式、例如通过定点诱变除去编码天然因子VII的核酸上的某些氨基酸密码子来进行。
本领域技术人员显然可以在对因子VIIa或PAI-1-分子功能而言比较关键的区域的外部进行取代而仍然可以得到活性多肽。可以按照本领域中公知的方法、诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定对因子VII或因子VII有关多肽或者PAI-1或PAI-1相关多肽的活性所必需、因此优选不被取代的氨基酸残基(例如，参见Cunningham和Wells，1989，《科学》(Science)2441081-1085)。在后一种技术中，在分子中每一个带正电荷的残基处引入突变，对所得突变体分子测试相应促凝剂的交联活性，以鉴定对该分子的活性而言关键的氨基酸残基。还可以通过分析诸如由核磁共振分析、结晶学或光亲和标记这类技术测定的三维结构来确定底物-酶相互作用位点(例如，参见de Vos等，1992，《科学》(Science)255306-312；Smith等，1992，《分子生物学杂志》(Journal of Molecular Biology)224899-904；Wlodaver等，1992，《FEBS通讯》(FEBS Letters)30959-64)。
可以通过定点诱变、使用本领域中公知的任意方法将突变导入核酸序列来更换核苷酸。特别有用的是使用超螺旋双链DNA载体与感兴趣插入物和两个含有所需突变的合成引物的方法。各自与所述载体的相反链互补的寡核苷酸引物通过Pfu DNA聚合酶在温度循环过程中延伸。在掺入引物时，生成含有交错切口的突变质粒。在温度循环后，用对甲基化和半甲基化DNA具有特异性的Dpnl处理产物以便消化亲代DNA模板并选择含有突变的合成DNA。还可以使用本领域中已知用于产生、鉴定和分离变体的其它方法，诸如例如基因改组法或噬菌体展示技术。
可以通过本领域中任意公知的方法从来源细胞中分离多肽，包括、但不限于从粘着细胞培养物中取出含有所需产物的细胞培养基；离心或过滤以除去未粘着的细胞等。
任选地，可以进一步纯化因子VII或因子VII有关多肽。可以使用本领域中任意公知的方法进行纯化，包括、但不限于亲和色谱法，诸如在抗-因子VII抗体柱上进行的亲和色谱法(例如，参见Wakabayashi等《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)26111097，1986；和Thim等《生物化学》(Biochem.)277785，1988)；疏水相互作用色谱法；离子交换色谱法；大小排阻色谱法；电泳法(例如制备型等电聚焦(IEF))；差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)；或提取法等。一般参见Scopes，《蛋白质纯化》(Protein Puri-fication)，Springer-Verlag，NewYork，1982；和《蛋白质纯化》(Protein Purification)，J.C.Janson和Lars Ryden编辑，VCH Publishers，New York，1989。纯化后，该制品中优选含有低于约10％重量、更优选低于约5％重量、最优选低于约1％重量的来源于宿主细胞的非因子VII或因子VII有关多肽。
可以通过蛋白水解切割，使用PAI-1Ia或其它具有胰蛋白酶样特异性的蛋白酶(诸如因子IXa、激肽释放酶、因子Xa和凝血酶)使因子VII或因子VII有关多肽活化。例如，参见Osterud等《生物化学》(Biochem.)112853(1972)；Thomas，美国专利US4,456,591；和Hedner等《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)711836(1983)。或者，可以通过使因子VII或因子VII有关多肽通过离子交换色谱柱，诸如MonoQ(Pharmacia)等而使其活化。然后如下所述配制并给予所得的活化因子VII或因子VII有关多肽。
例如，可以按照已知方法从血小板或内皮细胞中分离用于本发明的PAI-1；不过，优选使用重组PAI-1以避免使用有疾病传播危险的血液或组织衍生产物。分离PAI-1和制备重组PAI-1的方法在本领域中是公知的；例如，参见Pannekoek等《欧洲分子生物学协会杂志》(JOURNAL EMBO J.)5(10)，2539-2544(1986)；Gils等《生物化学与生物物理学学报》(Biochim Bio-phys Acta.)1998Sep 8；1387(1-2)291-7；Sui等《生物化学杂志》(Biochem J.)1998 Apr 15；331(Pt2)409-15；Gins-burg等《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)，第78卷，pp.1673-1680(1986)；或美国专利US 6,303,338和US6,103,498。可以通过如上所述的定点诱变生产PAI-1变体。
可以通过修饰野生型PAI-1或通过重组技术生产PAI-1相关多肽。可以通过修饰编码野生型PAI-1的核酸序列来生产与野生型PAI-1相比具有改变的氨基酸序列的PAI-1相关多肽，其中所述的修饰的步骤既可以通过改变氨基酸密码子来进行，也可以通过已知方式、例如上文详述的定点诱变除去编码天然PAI-1的核酸上的某些氨基酸密码子来进行。可以通过本领域中任意公知的方法从来源细胞中分离多肽，包括、但不限于从粘着细胞培养物中取出含有所需产物的细胞培养基；离心或过滤以除去未粘着的细胞等。任选地，可以进一步纯化PAI-1或PAI-1相关多肽。可以使用本领域中任意公知的方法进行纯化，包括、但不限于上文中详述的亲和色谱法，诸如在抗-PAI-1抗体柱上进行的亲和色谱法；疏水相互作用色谱法；离子交换色谱法；大小排阻色谱法；电泳法(例如制备型等电点聚焦(IEF))；差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)；或提取法等。纯化后，该制品中优选含有低于约10％重量、更优选低于约5％重量、最优选低于约1％重量的来源于宿主细胞的非-PAI-1或PAI-1相关多肽。然后可以如下所述配制并给予所得的活化PAI-1或PAI-1相关多肽。
正如本领域技术人员可以理解的，优选使用与受试者同源的PAI-1多肽和因子VII多肽，以便减少诱导免疫反应的危险。本发明还包括这类PAI-1多肽和因子VII多肽在兽医中的应用。
药物组合物和使用方法本发明的制剂可以用于治疗任何因子VII反应性综合征，诸如，例如出血疾病，包括、但不限于因凝血因子VIII、IX、XI或VII水平降低、凝血因子抑制剂、血小板功能缺陷(例如格兰兹曼血小板机能不全和伯-索综合征)导致的综合征；血小板减少；冯维勒布兰德病；和诸如因凝固蛋白稀释、纤维蛋白溶解增加和因出血和/或输血造成血小板数量降低(例如在已经进行了手术或发生创伤的多次输血的患者中)所导致的凝血病。包括本发明因子VII或因子VII有关多肽的制剂和PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂的药物组合物主要用于预防和/或治疗用非肠道给药。优选经非肠道给予该药物组合物，即通过静脉内、皮下、或肌内给药，最优选静脉内给药。还可以通过连续或搏动输注给药。
本发明的药物组合物或制剂包括因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽，可以将它们配制成单一单位剂型或组成部分试剂盒形式，优选溶于药物上可接受的载体、优选含水载体或稀释剂中。简单的说，通过将因子VII或因子VII有关多肽、或者PAI-1、或者因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1的组合(优选纯化形式)与合适的佐剂和合适的载体或稀释剂混合来制备适用于本发明的药物组合物。可以使用各种含水载体，诸如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。还可以使用非水载体配制本发明的制剂，例如配制成凝胶或脂质体形式来转运或靶向至损伤部位。脂质体制剂一般描述在例如美国专利US 4,837,028、US4,501,728和US4,975,282中。可以通过常规的众所周知的灭菌技术该这些组合物灭菌。可将所得水溶液包装应用，或在无菌条件下过滤并冻干，在给药前将冻干制剂与无菌水溶液混合。
这些组合物可以含有药物上可接受的辅助物质或佐剂，包括、但不限于pH调节剂和缓冲剂和/或张力调节剂，诸如例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。
制剂可以进一步包括一种或多种稀释剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、赋形剂等，且可以将它们制成诸如液体、粉末、乳剂、控释等剂型。本领域技术人员可以适宜方式并按照接受的实践配制本发明的组合物，诸如公开在《Remington氏药物科学》(Remington′sPharmaceutical Sciences)Gennaro编辑，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990中的那些方式。因此，可以将静脉内输注用的典型药物组合物制成含有250ml无菌林格液和10mg制剂的形式。
可以给予含有本发明制剂的组合物用于预防和/或治疗性疗法。在治疗应用中，对已经患有如上所述疾病的受试者给予组合物，其用量足以治愈、缓解或部分抑制疾病及其并发症的临床表现。将足以达到该目的的用量定义为″治疗有效量″。用于每一目的的有效量取决于疾病或损伤的严重程度以及受试者的体重和一般状况。应理解可以使用常规实验、通过构建数值矩阵并测试该矩阵中的不同点来确定适宜剂量。
例如，可以通过喷雾、灌注、双气囊导管、斯滕特固定模、掺入血管移植物或斯滕特固定模、用于涂敷气囊导管的水凝胶或其它充分建立的方法来局部投递本发明的制剂，诸如局部施用。在任何情况下，所述的药物组合物均应提供足以有效治疗所述疾病的制剂用量。
因子VII或因子VII有关多肽、PAI-1或PAI-1相关多肽、或者因子VII或因子VII有关多肽与PAI-1或PAI-1相关多肽的组合在这些制剂中的浓度可以广泛改变，即从低于约0.5％重量、通常为或至少约为1％重量至多达15或20％重量，主要根据流体体积、粘度等、并按照所选择的特定给药方式来选择。优选通过注射或输注方式给药，特别是注射。因此，将因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽制成适合于静脉内给药的形式，诸如这样一种制剂，即在一种剂型中既含有因子VII或因子VII有关多肽又含有PAI-1或PAI-1相关多肽的溶解的冻干粉制剂或液体制剂，或者在一种剂型中含有因子VII或因子VII有关多肽的溶解的冻干粉或液体制剂、而在另一种剂型中含有PAI-1或PAI-1相关多肽的溶解的冻干粉或液体制剂。
应理解因子VII或因子VII有关多肽的量和PAI-1或PAI-1相关多肽的量共同构成治疗出血发作的总计有效量。
必须注意本发明的物质一般可以用于严重的疾病或损伤状态，即威胁生命或对生命有潜在威胁的情况。在这类情况中，由于已将异物减小到最低限度和在人体内总体缺乏对因子VIIa和PAI-1的免疫原性，能够由参与治疗的临床医师给予实质上过量的这些组合物，并且有可能这样做比较理想。
在预防应用中，对易感或是处于疾病情况或损伤危险中的受试者给予含有因子VII或因子VII有关多肽的制剂和PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂的组合物以增强受试者自身的凝血能力。将这类用量定义为″预防有效剂量″。应理解因子VII或因子VII有关多肽的量和PAI-1或PAI-1相关多肽的量共同构成预防出血发作的总计有效量。
可以使用由参与治疗的临床医师选择的剂量水平和方案对所述组合物进行单一或多次给药。可以每天或每周将所述组合物给予一次或多次。这类药物组合物的有效量为对出血发作提供临床显著作用的用量。这类用量部分取决于所治疗的特定疾病、受试者的年龄、体重和一般健康情况以及对本领域技术人员显而易见的其它因素。
一般在预计出血前或开始出血时给予单剂量的本发明组合物。然而，也可以反复(分多次剂量)、优选以2-4-6-12小时的间隔给予本发明的组合物，这取决于给予的剂量和受试者的状况。
为了用于与计划干预相关的治疗，一般在进行干预前的约24小时内给予因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽，且此后持续7天或7天以上。可以如本文所述通过各种途径将其作为促凝剂给药。
组合物可以是包括适宜浓度的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂二者的单一制剂形式(单一剂型)。该组合物还可以是组成部分试剂盒形式，其中包括因子VII或因子VII有关多肽制品的制剂的第一单位剂型和包括PAI-1或PAI-1相关多肽制品的制剂的第二单位剂型。在这种情况中，应依次、优选彼此间隔不到约15分钟内、例如10分钟内或优选在5分钟内或更优选彼此在2分钟内给予因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽。可以首先给予两种单位剂型中的任一种。
所述的试剂盒至少包括两种独立的药物组合物。该试剂盒包括用于包含各独立组合物的容器用具，诸如分开的小瓶或分开的小箔包。该试剂盒一般包括用于给予独立成分的说明书。当优选以不同剂型给予各独立成分、以不同剂量间隔给予独立成分时或当开据处方的临床医师需要确定组合中的各成分时，试剂盒剂型是特别有利的。
按照本发明给予的因子VII或因子VII有关多肽的量和PAI-1或PAI-1相关多肽的量可以在约1∶100-约100∶1(w/w)的比例之间改变。因此因子VII与PAI-1之比可以为例如约1∶100或1∶90或1∶80或1∶70或1∶60或1∶50或1∶40或1∶30或1∶20或1∶10或1∶5或1∶2或1∶1或2∶1或5∶1或10∶1或20∶1或30.1或40∶1或50∶1或60∶1或70∶1或80∶1或90∶1或100∶1或约1∶90-约1∶1或约1∶80-约1∶2或约1∶70-约1∶5或约1∶60-约1∶10或约1∶50-约1∶25或约1∶40-约1∶30或约90∶1-约1∶1或约80∶1-约2∶1或约70∶1-约5∶1或约60∶1-约10∶1或约50∶1-约25∶1或约40∶1-约30∶1。
就70-kg受试者而言，作为负荷和维持剂量因子VII或因子VII有关多肽的剂量相当于约0.05mg-约500mg/天野生型因子VII的范围，例如约1mg-约200mg/天或例如约5mg-约175mg/天，这取决于受试者的体重、疾病和疾病的严重程度。
就70-kg受试者而言，作为负荷和维持剂量PAI-1或PAI-1相关多肽的剂量相当于约0.05mg-约500mg/天野生型PAI-1的范围，例如约1mg-约200mg/天或例如约1mg-约175mg/天，这取决于受试者的体重、疾病和疾病的严重程度。
因子VII或因子VII有关多肽与PAI-1或PAI-1相关多肽的组合在体外凝块硬度和纤维蛋白溶解时间试验中表现出协同作用。此外，因子VII或因子VII有关多肽与PAI-1或PAI-1相关多肽的组合在形成稳定的血纤蛋白凝块、增加半数凝块溶解时间、增加凝块强度和增加耐纤维蛋白溶解能力的方面均表现出协同作用。
组合物可以是包括适宜浓度的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽的单一制剂形式。该组合物还可以是由包括因子VII或因子VII有关多肽的第一单位剂型和包括PAI-1或PAI-1相关多肽的第二单位剂型组成的试剂盒形式。在这种情况中，应依次、优选彼此间隔约1-2小时内、例如彼此间隔30分钟内或优选在10分钟内或更优选彼此间隔5分钟内给予因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽。可以首先给予两种单位剂型中的任一种。
由于本发明涉及出血发作的预防或治疗方法，或者联合给予多种活性组分(可以单独给予)的凝血疗法，所以本发明还涉及以试剂盒形式组合各独立的药物组合物。该试剂盒至少包括两种独立的药物组合物。该试剂盒包括用于包含独立组合物的容器用具，诸如分开的小瓶或分开的小箔包。该试剂盒一般包括用于给予各独立成分的说明书。当优选以不同剂型给予各独立成分、以不同剂量间隔给予各独立成分时或当开据处方的临床医师需要滴定组合中的各成分时，试剂盒剂型是特别有利的。
试验因子VIIa活性试验可以进行测试因子VIIa活性、由此选择适宜因子VIIa变体的合适试验作为简单的体外前期试验体外水解试验可以测试天然(野生型)因子VIIa和因子VIIa变体(下文统称为″因子VIIa″)的比活性。还可以平行测试它们以便直接比较其比活性。该试验在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)上进行。将终浓度为1mM的显色底物D-Ile-Pro-Arg-P-nitroanilide(S-2288，Chromogenix，Sweden)加入到溶于含有0.1M NaCl、5mMCaCl2和1mg/ml牛血清清蛋白的50mM Hepes(pH 7.4)的因子VIIa(终浓度100nM)中。在SpectraMaxTM340平板读数器(Molecular Devices，USA)上连续测定405nm处的吸光度。将在20分钟保温过程中显示的吸光度减去不含酶的空白孔中的吸光度后得到的值用于计算变体与野生型因子VIIa的活性之比比值＝(因子VIIa变体的A405nm)/(因子VIIa野生型的A405nm)。
基于上述结果，可以鉴定具有与天然因子VIIa相当或更高的活性的因子VIIa变体，诸如例如所述变体活性与天然因子VII(野生型FVII)活性之比约为1.0上下的变体。
还可以使用浓度适宜在100-1000nM的诸如因子X这样的生理底物测定因子VIIa或因子VIIa变体的活性，其中在添加适当的显色底物(例如S-2765)后测定产生的因子Xa。此外，可以在生理温度下进行活性试验。
体外蛋白水解试验可以平行测试天然(野生型)因子VIIa和因子VIIa变体(下文统称为″因子VIIa″)以便直接比较其比活性。该试验在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)上进行。将因子VIIa(10nM)和因子X(0.8μM)在含有0.1M NaCl、5mMCaCl2和1mg/ml牛血清清蛋白的100μl 50mM Hepes(pH 7.4)中保温15分钟。然后通过添加含有0.1M NaCl、20mM EDTA和1mg/ml牛血清清蛋白的50μl 50mM Hepes(pH7.4)终止因子X裂解。通过添加终浓度为0.5mM的显色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide(S-2765，Chromogenix，Sweden)测定产生的因子Xa的量。在SpectraMaxTM340平板读数器(Molecular De-vices，USA)上连续测定405nm处的吸光度。将在10分钟保温过程中显示的吸光度减去不含FVIIa的空白孔中的吸光度后的值用于计算变体与野生型因子VIIa之间的蛋白水解活性之比比值＝(因子VIIa变体的A405nm)/(因子VIIa野生型的A405nm)。
基于上述结果，可以鉴定出具有与天然因子VIIa相当或更高的活性的因子VIIa变体，诸如例如所述变体活性与天然因子VII(野生型FVII)活性之比约为1.0上下的变体。
凝血酶产生试验可以用包括所有相关凝血因子和生理浓度下的抑制剂和活化血小板的试验测定因子VII或因子VII有关多肽或者PAI-1或PAI-1相关多肽(例如变体)产生凝血酶的能力(如Monroe等在(1997)《英国血液学杂志》(Brit.J.Haematol.)99，542-547中第543页上所述，将该文献引入本文作为参考)。
PAI-1活性试验例如，可以用如Chandler等《临床化学》(Clinical Chemistry)，35(5)787-793(1989)所述的体外试验作为简单试验或本领域中公知的其它试验(所述的″PAI-1试验″)进行测试PAI-1活性、由此提供合适本发明所用的PAI-1变体的筛选方式的合适试验。
通过下列实施例进一步解释本发明，不过，这些实施例并不用来限定保护范围。上述描述和下面的实施例中所公开的特征既可以单独也可以以其任意组合方式成为以不同形式实现本发明的材料。
实施例实施例1通过联用凝血因子VIIa和PAI-1来改善止血凝块的稳定性方法凝块溶解试验将用含有Innovin(Dade Behring，稀释2000-倍)、rFVIIa(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark；不同浓度)和t-PA(American Diagnostics，8nM)的缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，5mMCaCl，pH7.4)稀释10-倍的正常人血浆加入到96-孔ELISA平板上，并在室温下在一段时间内测定650nm处的浊度。在指明处，则包括纯化人PAI-1(American Diagnostica，不同浓度)。
旋转血栓弹性描记法(roTEG)用加入了5nM t-PA的柠檬酸盐化正常人血浆或因子VIII缺乏血浆(George King Bio-Medical，Inc.#0800)进行各项测定，并分析单独添加1nM FVIIa或者加入1nMFVIIa与30nM PAI-1组合的效果。通过在20mM HEPES、150mMNaCl、pH 7.4缓冲液中添加Innovin(稀释2000-倍的终浓度，DadeBehring#526945)和钙(终浓度15mM)启动凝血。
结果
凝块溶解试验添加FVII-a导致凝块溶解时间以剂量依赖性方式延长(附图1)。这种作用在10nM FVIIa下最佳。在有10nM FVIIa存在的情况下，添加PAI-1导致凝块溶解时间进一步延长(附图2)。这种效果是剂量依赖性的，且在10nM PAI-1下达到最佳。
血栓弹性图将roTEG测定值用于分析FVIIa与PAI-1的组合对最大凝块硬度(MCF)以及凝块对t-PA介导的溶解的耐受性所产生的效果。用正常和缺乏FVIII的人血浆进行测定。在添加FVIIa/PAI-1前，在正常和血友病血浆中的MCF分别为25mm和4mm，而半数凝块溶解时间分别为12.3分钟和14.3(附图3和4)。在正常人血浆中，添加PAI-1(30nM)不会改变MCF，但会将半数凝块溶解时间延长至16.1分钟(附图3)。在血友病血浆中，单独添加PAI-1时将MCF增加至5mm并将半数凝块溶解时间延长至32.4分钟(附图4)。添加FVIIa(1nM)防止了凝块发生t-PA-介导的溶解(半数凝块溶解时间16.7min)，而对正常血浆中的MCF没有任何显著影响(附图3)，而向血友病血浆中添加FVIIa防止了凝块发生溶解(半数凝块溶解时间21.3min)且MCF值显著增加(15mm)(附图4)。然而，在正常和血友病血浆中一起添加FVIIa与PAI-1二者分别使半数凝块溶解时间增加至29.8分钟和45分钟，并使MCF值分别增加至27.4mm和16.9mm。
结论这些结果表明，向血浆中添加FVIIa和PAI-1可以协同方式改善凝块的机械强度和对纤维蛋白溶解的耐受性。
权利要求
1.一种药物组合物，其中包括因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽。
2.权利要求1的组合物，其中所述的因子VII或因子VII有关多肽是因子VII有关多肽。
3.权利要求1的组合物，其中所述的因子VII有关多肽是因子VII氨基酸序列变体。
4.权利要求2或3的组合物，其中当用如本说明书中所述的″体外水解试验″测定时，所述的因子VII有关多肽的活性与天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之比至少约为1.25。
5.权利要求1的组合物，其中所述的因子VII或因子VII有关多肽是因子VII。
6.权利要求5的组合物，其中所述的因子VII是人因子VII。
7.权利要求6的组合物，其中所述的因子VII是重组人因子VII。
8.权利要求1-7中任意一项的组合物，其中所述的因子VII或因子VII有关多肽是其活化形式。
9.权利要求8的组合物，其中所述的因子VII是重组人因子VIIa。
10.权利要求1-9中任意一项的组合物，其中所述的PAI-1或PAI-1相关多肽是PAI-1相关多肽。
11.权利要求10的组合物，其中所述的PAI-1相关多肽是PAI-1氨基酸序列变体。
12.权利要求10或11的组合物，其中当用如本说明书中所述的″PAI-1试验″测定时，所述的PAI-1相关多肽的活性与天然人PAI-1(野生型PAI-1)的活性之比至少约为1.25。
13.权利要求1-9中任意一项的组合物，其中所述的PAI-1或PAI-1相关多肽是PAI-1多肽。
14.权利要求13的组合物，其中所述的PAI-1是人PAI-1。
15.权利要求14的组合物，其中所述的PAI-1是重组人PAI-1。
16.权利要求15的组合物，其中所述的PAI-1是活化构象形式。
17.权利要求1-16中任意一项的组合物，其中所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽存在的比例按重量计为约100∶1-约1∶100(w/w因子VIIPAI-1)。
18.权利要求1-17中任意一项的组合物，其中该组合物中进一步包括适合于注射或输注、特别是注射的药物上可接受的赋形剂。
19.含有用于治疗出血发作的组成部分的试剂盒，包括f)第一单位剂型形式的有效量的因子VII或因子VII有关多肽和药物上可接受载体的制剂；g)第二单位剂型形式的有效量的PAI-1或PAI-1相关多肽和药物上可接受载体的制剂；和h)用于包含所述第一和第二剂型的容器用具。
20.权利要求19的试剂盒，其中所述的因子VII或因子VII有关多肽是因子VII有关多肽。
21.权利要求20的试剂盒，其中所述的因子VII有关多肽是因子VII氨基酸序列变体。
22.权利要求20或21的试剂盒，其中当用如本说明书中所述的″体外水解试验″测定时，所述的因子VII有关多肽的活性与天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之比至少约为1.25。
23.权利要求19的试剂盒，其中所述的因子VII或因子VII有关多肽是因子VII。
24.权利要求23的试剂盒，其中所述的因子VII是人因子VII。
25.权利要求24的试剂盒，其中所述的因子VII多肽是重组人因子VII。
26.权利要求19-25中任意一项的试剂盒，其中所述的因子VII或因子VII有关多肽是其活化形式。
27.权利要求26的试剂盒，其中所述的因子VII是重组人因子VIIa。
28.权利要求19-27中任意一项的试剂盒，其中所述的PAI-1或PAI-1相关多肽是PAI-1相关多肽。
29.权利要求28的试剂盒，其中所述的PAI-1相关多肽是PAI-1氨基酸序列变体。
30.权利要求28或29的试剂盒，其中当用如本说明书中所述的″PAI-1试验″测定时，所述的PAI-1相关多肽的活性与天然人PAI-1(野生型PAI-1)的活性之比至少约为1.25。
31.权利要求19-27中任意一项的试剂盒，其中所述的PAI-1或PAI-1相关多肽是PAI-1。
32.权利要求31的试剂盒，其中所述的PAI-1是人PAI-1。
33.权利要求32的试剂盒，其中所述的PAI-1是重组人PAI-1。
34.权利要求33的试剂盒，其中所述的PAI-1是活化构象形式。
35.权利要求19-34中任意一项的试剂盒，其中所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽存在的比例按重量计为约100∶1-约1∶100(w/w因子VIIPAI-1)。
36.因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽的组合在制备用于治疗出血发作的药物中的应用。
37.权利要求1-18中任意一项的组合物在制备用于治疗出血发作的药物中的应用。
38.权利要求36或37的应用，其中所述的药物用于减少凝固时间。
39.权利要求36或37的应用，其中所述的药物用于延长凝块溶解时间。
40.权利要求36或37的应用，其中所述的药物用于增加凝块强度。
41.权利要求36-40中任意一项的应用，其中将所述的药物配制成注射或输注、特别是注射用药剂。
42.权利要求36-41中任意一项的应用，其中所述的出血发作是因创伤或手术或者血小板计数或活性下降所导致的。
43.权利要求36-42中任意一项的应用，其中所述的药物是单一剂型。
44.权利要求36-42中任意一项的应用，其中将所述的药物制备成含有因子VII或因子VII有关多肽的制剂的第一单位剂型和含有PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂的第二单位剂型的形式。
45.受试者内出血发作的治疗方法，该方法包括根据受试者需要对其给予第一用量的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和第二用量的PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地治疗出血。
46.减少受试者内凝固时间的方法，该方法包括根据受试者需要对其给予第一用量的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和第二用量的PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效地减少凝固时间。
47.增强受试者内止血的方法，该方法包括根据受试者需要对其给予第一用量的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和第二用量的PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效增强止血。
48.延长受试者内凝块溶解时间的方法，该方法包括根据受试者需要对其给予第一用量的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和第二用量的PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效延长凝块溶解时间。
49.增加受试者内凝块强度的方法，该方法包括根据受试者需要对其给予第一用量的因子VII或因子VII有关多肽的制剂和第二用量的PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂，其中所述的第一用量和第二用量一起可有效增加凝块强度。
50.权利要求45-49中任意一项的方法，其中以单一剂型形式给予因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽。
51.权利要求45-49中任意一项的方法，其中以含有因子VII或因子VII有关多肽的制剂的第一剂型和含有PAI-1或PAI-1相关多肽的制剂的第二剂型的形式给予所述的因子VII或因子VII有关多肽和PAI-1或PAI-1相关多肽。
52.权利要求51的方法，其中给予第一剂型与给予第二剂型之间的时间间隔不超过15分钟。
53.含有用于出血发作的治疗用品的试剂盒，包括a)单一单位剂型的有效量的因子VII或因子VII有关多肽和有效量的PAI-1或PAI-1相关多肽以及药物上可接受载体；和b)用于包含所述单一单位剂型的容器用具。
全文摘要
本发明涉及包括因子VII或因子VII有关多肽和PAI－1或PAI－1相关多肽的组合物及其在治疗出血发作中的应用。
文档编号A61P17/02GK1596122SQ02823677
公开日2005年3月16日 申请日期2002年11月5日 优先权日2001年11月9日
发明者R·罗伊克耶尔 申请人:诺和诺德医疗保健公司