专利名称：诱导中胚层干细胞,es细胞,或无限增殖化的中胚层干细胞分化成神经细胞的方法
技术领域：
本发明涉及诱导中胚层干细胞或ES细胞分化成神经细胞的方法以及诱导无限增殖化的中胚层干细胞分化成神经细胞的方法和这些方法的应用。
背景技术：
少突胶质细胞(即少突神经胶质)(Archer D.R.et al.，1994，Exp.Neurol.125268-77；Blakemore W.F.，和Crang A.J.，1988，Dev.Neurosci.101-11；Gumpel M.et al.1987，Ann.New York Acad.Sci.49571-85)或髓鞘形成细胞如Schwann细胞(Blakemore W.F.，1977，Nature 26668-9；Blakemore W.F.，和Crang A.J.，1988，Dev.Neurosci.101-11；Honmou O.et al.，1996，J.Neurosci.163199-208)或嗅觉ensheating细胞(Franklin R.L.et al.，1996，Glia 17217-24；Imaizumi T.et al.，1998，J.Neurosci.18(16)6176-6185；Kato T et al.，2000，Glia30209-218)的移植可以引发动物模型上的再髓鞘化和电生理功能的恢复(Utzschneider D.A.et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9153-7；HonmouO.et al.，1996，J.Neurosci.163199-208)。从患者或其他人制备这样的细胞用于细胞治疗是可能的。但是，因为必须从或者脑或者神经获得组织物，所以这种方法是相当有问题的。
起源于脑的神经祖细胞或干细胞具有自我更新能力并能分化成神经元和各个系的胶质细胞(Gage F.H.et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9211879-83；Lois C.and Alvarez-Buylla A.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.902074-7；Morshead C.M.et al.，1994，Neuron 131071-82；Reynolds B.A.，andWeiss S.，1992，Science 2551707-10)。当被移植入新生的小鼠脑内，从胚胎组织获得的人类神经干细胞分化成神经元和星形胶质细胞(Chalmers-Redman R.M.et al.，1997.Neurosci.761121-8；Moyer M.P.et al.，1997，Transplant.Proc.292040-1；Svendsen C.N.et al.，1997，Exp.Neurol.148135-46)，和使轴突包有髓鞘(Flax J.D.et al.，1998，Nat.Biotechnol.161033-9)。已经有报道将源于成年人脑的神经祖(干)细胞移植入脱髓鞘的啮齿类脊髓后出现再髓鞘化和脉冲传导的恢复(Akiyama Y.et al.，2001，Exp.Neurol.)。
这些研究激起强大的兴趣，因为这意味着可能在神经系统疾病的再生策略中应用上面提到的细胞(Akiyama Y.et al.，2001，Exp.Neurol.；Chalmers-Redman R.M.et al.，1997.Neurosci.761121-8；Moyer M.P.et al.，1997，Transplant.Proc.292040-1；Svendsen C.N.et al.，1997，Exp.Neurol.148135-46；Yandava B.D.et al.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.967029-34)。
本发明者们以前分离并培养了源于成年人脑的神经干细胞，并且建立了一些细胞系。通过研究它们的功能，发明者们发现神经干细胞具有多能性和自我更新能力(Akiyama Y.et al.，2001，Exp.Neurol.)。特别地，将源于成年人脑的神经祖(干)细胞进行单细胞扩增以建立细胞系；然后将建立的细胞系用于体外克隆分析。结果证明细胞系具有多能性(即，分化成神经元，星形胶质(或星形胶质细胞)，和少突胶质(即，少突胶质细胞))的能力和自我更新能力(即，增殖潜力)。因此，确认这些细胞具有神经干细胞的特征。
在脑缺血模型大鼠或创伤模型大鼠上，这些细胞的移植真正达到非常满意的移植物存活，迁移，和分化。而且，在脊髓脱髓鞘模型大鼠上，这些细胞的移植导致有功能的髓鞘的形成。因此，在脊髓脱髓鞘模型大鼠上的这种移植允许脱髓鞘的轴突再髓鞘化和神经功能的重建。通过组织学的，电生理学的，和行为学的研究确认了使用这些细胞的这种移植治疗的有效性。
从上面描述的发现判断，将从患者大脑获得的少量神经组织分离并培养的神经干细胞移植给患者的脊髓损伤区将会是广泛可应用的自体移植治疗。
尽管这种收集不会导致神经缺陷，但是，从大脑获得含有神经干细胞的组织是困难的。因此，从建立用于治疗今天各种复杂疾病的方法的观点看，建立用于自体移植的更安全更方便的方法是非常重要的。因此，本发明者们已经开发了一种简单的技术用于制备供体细胞，包括从骨髓细胞，脐血细胞，或胎肝细胞(专利申请第2001-160579)收集单核细胞成分或类似物；与前面需要收集神经干细胞的背景方法相比，此技术是非常容易的。特别地，本发明者们发现从骨髓细胞制备的单核细胞具有分化成神经细胞的能力。而且，本发明者们发现从单核细胞部分分离的含有中胚层干细胞的细胞部分，含有间质细胞的细胞部分，和含有AC133-阳性细胞的细胞部分也具有分化成神经细胞的能力。
发明内容
鉴于以下这些情况进行本发明。本发明的目的是提供诱导中胚层干细胞或ES细胞分化成神经细胞的方法，该方法包括允许中胚层干细胞增殖以制备足够数量的细胞，和有效地诱导该细胞分化成神经干细胞或神经细胞；通过该方法获得的神经细胞；治疗神经系统疾病的包含神经细胞的组合物；和用该组合物治疗神经系统疾病的方法。
本发明者们最近发现从骨髓液体或脐血中分离的单核细胞部分里，中胚层干细胞或ES细胞在体外能分化成神经细胞。
特别地，发明者们发现当将从骨髓液体或脐血中分离的单核细胞部分制备的中胚层干细胞或ES细胞在下述情况下悬浮培养时会分化成神经干细胞5％CO2，37℃于培养基1中[50％DMEM(Dulbecco’s改良的基础培养基)/50％F-12/1％FSC；每日添加10ng/ml bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)和10ng/mlEGF(表皮生长因子)]或培养基2中[NPBM(神经祖细胞基本培养基)/2％神经存活因子(Clonetics)/0.2％hEGF(人表皮生长因子)/0.2％庆大霉素-两性霉素B/0.2％hFGF(人成纤维细胞生长因子)；每日添加10ng/mlbFGF和10ng/ml EGF]。
发明者们也发现，当将从骨髓液体或脐血中分离的单核细胞部分制备的中胚层干细胞或ES细胞在培养基1中(50％DMEM/50％F-12/1％FSC)或培养基2中[NPBM(神经祖细胞基本培养基；Clonetics)/2％神经存活因子(Clonetics)/0.2％hEGF(人表皮生长因子)/0.2％庆大霉素-两性霉素B/0.2％hFGF(人成纤维细胞生长因子)]培养时，中胚层干细胞或ES细胞会分化成神经细胞或神经胶质细胞。
而且，发明者们发现，向上述培养基中加入缺血的脑提取物可以进一步促进中胚层干细胞或ES细胞向神经细胞分化。
此外，用脑梗塞模型，痴呆模型，脊髓损伤模型和脱髓鞘模型评价用上述诱导分化方法获得的神经细胞的神经再生潜力。结果，发现该细胞具有与从脑提取并培养的神经干细胞相同程度的再生潜力。
基于以上发现，可将通过上述诱导分化方法获得的神经细胞用于治疗脑梗死，痴呆，脊髓损伤，脱髓鞘疾病，等等。此外，考虑本发明可应用于更为普通和广泛的脑和/或神经损害的神经移植和/或再生治疗。特别地，本发明可被用于中枢神经系统和外周神经系统的缺血性脑和/或神经损伤，外伤性脑和/或神经损伤，脑神经退化性疾病和代谢性神经疾病的自体移植治疗。
而且，上面提及的诱导分化的方法可能利于阐明中胚层干细胞和ES细胞向神经细胞分化的潜在机制。一旦指导此分化的基因被鉴定和分析，用该基因可以将足够数量的中胚层干细胞和ES细胞有效转化成神经细胞。因此，本发明显示出建立促进神经组织再生的“基因治疗”方法的巨大希望。
而且，本发明者们成功开发了确保大量细胞稳定增殖的神经系统中诱导分化的方法。一般地，中胚层干细胞在神经再生的医学领域中是有用的；然而这些细胞的增殖程度在培养条件下受到限制。但是，按照本发明者们的研究，发现将含有无限增殖化基因如端粒酶作为插入物的病毒载体体外导入基质细胞，导致宿主细胞的连续细胞增殖，甚至在细胞分裂周期之后，且保持与正常细胞相同形态的细胞有明显延长的寿命。本发明者们注意到通过向细胞内导入无限增殖化基因使中胚层干细胞无限增殖化，而使大量细胞可以稳定增殖。而且，发明者们继续研究发现，可以在合适的培养条件下有效诱导经细胞内导入无限增殖化基因而无限增殖化的中胚层干细胞分化成神经干细胞和神经细胞。
特别地，发明者们成功诱导经导入无限增殖化基因hTERT而无限增殖化的中胚层干细胞分化成脂肪细胞，成软骨细胞，成骨细胞，等等。而且，发明者们诱导导入hTERT基因而无限增殖化的中胚层干细胞分化成含有高比例神经干细胞的神经细胞。本发明者们进一步揭示向脊髓中脱髓鞘区域移植这些细胞(中胚层干细胞本身；从中胚层干细胞分化的神经干细胞；从中胚层干细胞分化的神经干细胞再分化成的神经细胞；和从中胚层干细胞分化来的神经细胞)可使之修复。
此外，按照本发明上述方法，预期从其中导入无限增殖化基因的中胚层干细胞分化的神经干细胞和神经细胞在完成神经再生上是非常有用的。
当细胞是通过导入癌基因等而无限增殖化时，细胞的特征也被转化。相反，当细胞是通过如本发明导入无限增殖化基因而无限增殖化时，细胞保持其原有特征。此外，如果某处已经导入无限增殖化基因，在细胞足量增殖后该基因可被去除。
如上所述，本发明者们开发出用于有效诱导中胚层干细胞分化成神经细胞的新方法，并因此完成发明。
特别地，本发明涉及诱导中胚层干细胞或ES细胞分化成神经细胞的方法；诱导中胚层干细胞有效分化成神经细胞，包括神经干细胞的方法，其包括中胚层干细胞的无限增殖化；通过该方法获得的神经细胞；包含神经细胞的治疗神经系统疾病的组合物；和用该组合物治疗神经细胞疾病的方法。更具体地，本发明涉及[1]通过在基础培养基中于33℃至38℃保温诱导中胚层干细胞或ES细胞分化成神经细胞的方法，其中中胚层干细胞或ES细胞源于从脊椎动物收集的骨髓液体或脐血分离的单核细胞部分。
诱导中胚层干细胞分化成神经细胞的方法，其包括以下步骤(a)经高表达或激活无限增殖化基因而提供无限增殖化中胚层干细胞；和(b)通过将中胚层干细胞在基础培养基中培养而诱导步骤(a)中无限增殖化中胚层干细胞分化成神经细胞；[3]按照[2]的方法，其中通过将无限增殖化基因导入中胚层干细胞使无限增殖化基因被高度表达或激活；[4]按照[3]的方法，其中用逆转录病毒载体向中胚层干细胞导入无限增殖化基因使其永生。
按照[4]的方法，其中逆转录病毒是pBabe；[6]按照[2]至[5]任何一项的方法，其中神经细胞的无限增殖化基因可以或已经通过基因去除处理而去除；[7]按照[6]的方法，其中无限增殖化基因的基因去除处理通过将无限增殖化基因夹心于一对loxP序列或loxP-样序列中，然后用重组酶处理；[8]按照[2]至[7]任何一项的方法，其中无限增殖化基因选自端粒酶基因，端粒酶衍生的基因，或调节端粒酶表达或活性的基因中的任何一种；[9]按照[2]至[8]任何一项的方法，其中中胚层干细胞源于骨髓液体，脐血，外周血，皮肤，皮肤的发根细胞，肌肉组织，ES细胞或ES细胞衍生的细胞；[10]按照[2]至[8]任何一项的方法，其中中胚层干细胞包含在从脊椎动物骨髓液体或脐血分离的单核细胞部分里；[11]按照[1]至[10]任何一项的方法，其中单核细胞部分的制备可通过将从脊椎动物收集的骨髓液体或脐血在溶液中进行密度梯度离心，2000rpm维持确保根据比重分离的足够时间，然后回收比重范围1.07g/ml至1.1g/ml的细胞部分；[12]按照[1]至[11]任何一项的方法，其中中胚层干细胞具有下列特征SH2(+)，SH3(+)，SH4(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD34(-)，和CD45(-)；[13]按照[2]至[12]任何一项的方法，其中培养在33℃至38℃完成；[14]按照[1]至[13]任何一项的方法，其进一步包括向基础培养基中添加bFGF，EGF，或缺血的脑提取物；[15]按照[1]至[14]任何一项的方法，其中神经细胞选自神经干细胞，神经祖细胞，神经元，或神经胶质细胞；[16]按照[1]至[15]任何一项的方法获得的细胞；[17]治疗神经系统疾病的组合物，其包括[16]的细胞；[18]按照[17]的组合物，其中神经系统疾病选自中枢和外周神经系统退化性疾病和脱髓鞘疾病，脑卒中，脑肿瘤，高位脑机能障碍(higher braindysfunction)，精神疾病，癫痫，创伤性神经疾病，炎症性疾病，感染性疾病和脊髓梗死；[19]治疗神经系统疾病的方法，其中包括给受体移植按照[16]的细胞或按照[17]的组合物；[20]按照[19]的方法，其中神经系统疾病选自包括下列者中枢和外周神经系统退化性疾病和脱髓鞘疾病，脑卒中，脑肿瘤，高位脑机能障碍，精神疾病，癫痫，创伤性神经疾病，炎症性疾病，感染性疾病或脊髓梗塞；和[21]按照[19]或[20]的方法，其中用来移植的细胞来源于受体。
首先，本发明提供通过在基础培养基中于33℃至38℃保温诱导中胚层干细胞或ES细胞分化成神经细胞的方法，其中中胚层干细胞或ES细胞源于从脊椎动物收集的骨髓液体或脐血分离的单核细胞部分。
本发明也提供用于有效诱导中胚层干细胞分化成神经干细胞和神经细胞的新方法，该方法包括向中胚层干细胞导入无限增殖化基因而制备大量中胚层干细胞的步骤。在本发明的优选实施方案中，通过在中胚层干细胞中高表达或激活无限增殖化基因使中胚层干细胞永生，然后通过培养该细胞诱导中胚层干细胞分化成神经细胞。
按照上面描述的本发明的方法，首先，通过高表达或激活无限增殖化基因(immortalization gene)(步骤(a))提供无限增殖化(immortalized)中胚层干细胞。
如这里使用的，短语“中胚层干细胞”指构成胚胎学分类为中胚层类组织的细胞，包括血细胞。“中胚层干细胞”也指可以自我复制(分裂和增殖)的具有与其起源细胞相同潜力的细胞，并且其具有分化成构成中胚层组织的所有类型细胞的能力。中胚层干细胞表达细胞标志，例如，SH2(+)，SH3(+)，SH4(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD34(-)，和CD45(-)，但是这类细胞不局限于这些标志。而且，所谓的间质-相关干细胞也包括在本发明的中胚层干细胞内。
短语“间质-相关细胞”指间质干细胞，间质细胞，间质前体细胞和源于间质细胞的细胞。
短语“间质干细胞”指可以从骨髓，外周血，皮肤，发根，肌肉组织，子宫内膜，血液，脐血和各种组织的原代培养物获得的干细胞。
短语“间质细胞的前体细胞”指从间质干细胞分化的细胞，并且处于向间质细胞分化的过程中。
间质细胞是通过间质干细胞分化产生。不像干细胞，间质细胞没有多能性。但是，间质细胞在有限的方向上具有分化潜力和增殖潜力。正常地，间质细胞停滞在G0期，但是在刺激时可以进入G1期(分裂开始)。间质细胞包括，例如基质细胞和具有基质细胞特点的细胞。间质细胞存在于每种器官，包括例如，皮下组织，肺和肝，存在于间质组织，例如骨，软骨，脂肪，肌腱，骨骼肌和骨髓的基质。
源自间质细胞的细胞包括(1)心血管系统的细胞，例如内皮细胞和心肌细胞，心血管系统细胞的前体细胞，和具有这些细胞特征的细胞；(2)骨，软骨，肌腱和骨骼肌的任何细胞，骨，软骨，肌腱和骨骼肌和脂肪组织任何细胞的前体细胞，和具有这些细胞特征的细胞；(3)神经系统的细胞(神经细胞)，它们的前体细胞和具有这些细胞特征的细胞；(4)内分泌细胞，它们的前体细胞和具有这些细胞特征的细胞；(5)造血细胞，它们的前体细胞和具有这些细胞特征的细胞；和(6)肝细胞，它们的前体细胞和具有这些细胞特征的细胞。
本发明的间质干细胞可以从源自下列物质的细胞制备例如源自脊椎动物骨髓液体，脐血，外周血，皮肤，皮肤的发根细胞，肌肉组织，ES细胞或源自ES细胞的细胞。这种细胞的制备可以从皮肤，例如，按照Young等的方法(Young et al.，2001，Anat.Rec.264(1)51-62；Campagnli et al.，2001，Blood 98(8)2396-2402)；从肌肉，例如按照Asakura等的方法(Asakura A et al.，2001，Differentiation 68(4-5)245-253)；从脂肪组织，例如按照Zuk等的方法(Zuk PA et al.，Tissue Eng.7(2)211-228)；和从滑膜，例如按照De Bari等的方法(De Bari et al.，2001，Arthritis Rheum.44(8)1928-1942)。
在本发明上下文中，优选的脊椎动物包括哺乳动物(例如，小鼠，大鼠，兔，猪，狗，猴，人，等等)，但本发明不限于此。
本发明使用的骨髓液体的收集可以通过，例如，将脊椎动物(包括人)麻醉(局部麻醉或全身麻醉)，骨穿刺并用注射器抽吸细胞。合适的骨来源包括但不局限于例如股骨，胸骨和形成骨盆的髂骨。而且，在分娩时直接穿刺脐带并用注射器抽取血液以收集和贮存脐血的方法已经成为建立好的技术。
本发明的ES细胞可以通过本领域技术人员已知的方法制备(Doetschman TC et al.，1985，J.Embryol.Exp.Morphol.8727-45；Williams RLet al.，1988，Nature 336684-687)。按照本发明，按照上述方法制备的ES细胞在实施例中描述的条件下可以分化成神经细胞。
按照本发明，中胚层干细胞的制备可以通过将从脊椎动物收集的骨髓液体或脐血在溶液中进行密度梯度离心，900g维持确保根据比重分离的足够时间，然后回收比重范围1.07g/ml至1.1g/ml的细胞部分。如这里使用的，短语“确保根据比重分离的足够时间”指在密度梯度离心的溶液中根据细胞的比重足以使细胞达到位置的时间，一般约10-30分钟。根据细胞来源动物的类型(例如人，大鼠，小鼠等等)不同，要收集的细胞的比重可以变化。密度梯度离心使用的溶液包括但不局限于Ficoll溶液和Percoll溶液。
具体例子如下。将从脊椎动物收集的骨髓液体(25ml)或脐血与等体积的PBS混合。将混合物在900g离心10分钟。通过向细胞中加入PBS(细胞密度＝约4×107细胞/ml)去除其他血液成分以回收沉淀的细胞。然后，每份5ml细胞悬液置于Percoll溶液上(1.073g/ml)，并于900g离心30分钟以提取单核细胞成分。为洗涤细胞，将提取的单核细胞成分与下列物质混合例如，培养基1[DMEM(Dulbecco’s改良的Eagles培养基-低糖)/10％FBS(胎牛血清)/1％抗生素-抗真菌溶液]，培养基2[MSCBM(间质干细胞基础培养基)/10％MCGS(间质细胞生长添加物)/4mM L-谷氨酰胺/1％青霉素-链霉素]，或培养基3[DMEM(Sigma)/10％FBS(Gibco)/1％青霉素-链霉素/2mM L-谷氨酰胺(Gibco)]，然后于900g离心15分钟或2000转/分钟离心15分钟。然后，弃掉离心后的上清并收集沉淀的细胞，培养于37℃，5％CO2的空气中。
间质干细胞的获得也可以通过，例如，选择具有上面提及的细胞表面标志的细胞，即SH2(+)，SH3(+)，SH4(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD34(-)，和CD45(-)，和用抗体从上面提及的单核细胞部分选择。选择的方法没有限制，而且这里包括使用磁珠或一般的细胞分选(FACS等)方法。
或者，按照本发明，可以从单核细胞部分(包括在培养液中者)制备中胚层干细胞。单核细胞部分的制备可以通过将从脊椎动物收集的骨髓液体或脐血在溶液中进行密度梯度离心，900g维持确保根据比重分离的足够时间，然后回收比重范围1.07g/ml至1.1g/ml的细胞部分。如这里使用的，短语“确保根据比重分离的足够时间”指在密度梯度离心的溶液中根据细胞的比重足以使细胞达到位置的时间，一般约10-30分钟。要回收的细胞部分的比重优选在1.07g/ml至1.08g/ml范围内(例如，1.077g/ml)。密度梯度离心使用的溶液包括但不局限于Ficoll溶液和Percoll溶液。
具体的例子如下。首先，将从脊椎动物收集的骨髓液体(5-10μl)与溶液(2ml L-15和3ml的Ficoll)混合。然后，通过将混合物在900g离心15分钟提取单核细胞部分(约1ml)。将单核细胞部分与培养液(2ml NPBM)混合并再于900g离心15分钟以洗涤细胞。然后，弃去上清，收集沉淀的细胞。
也可以将本发明的单核细胞部分的培养液按照下述用于制备中胚层干细胞。这种含有单核细胞部分的培养液的制备可以通过，例如在上面提及的培养基1，培养基2，或培养基3中于37℃，5％CO2条件培养单核细胞部分的细胞，但本发明不限制特殊的培养条件。
本发明的神经细胞的类型没有限制，而且本发明包括神经干细胞，神经祖细胞，神经元，和神经胶质细胞。
如这里使用的，短语“细胞无限增殖化”指一种状态，其中细胞甚至在一定次数的细胞分裂之后仍连续增殖，而正常时，细胞在一定次数分裂后停止增殖。因此，如这里使用的，短语“无限增殖化基因”指甚至在这样的细胞分裂次数之后指导细胞继续细胞分裂的基因。这种基因包括但不局限于端粒酶基因，源于端粒酶的基因，和调节端粒酶表达或活性的基因(例如，已经报道myc基因能增强端粒酶活性)。在本发明中，人端粒酶基因(hTERT)是尤其优选的实施方案。
按照本发明，高表达或激活无限增殖化基因的方法包括但不局限于将无限增殖化基因导入中胚层干细胞的方法。将无限增殖化基因导入中胚层干细胞可以通过本领域已知的任何方法进行。典型的方法包括将无限增殖化基因插入质粒载体然后将载体在磷酸钙存在时转化导入中胚层干细胞的方法；通过将基因连同如脂质体的囊泡与细胞接触而将无限增殖化基因导入中胚层干细胞的方法；用电穿孔将无限增殖化基因导入中胚层干细胞的方法；和将无限增殖化基因导入各种病毒载体然后将载体感染中胚层干细胞以达到基因转移。使用病毒载体的方法包括用逆转录病毒，腺病毒，腺病毒-相关病毒的方法；使用逆转录病毒载体的方法包括用MoMLV病毒的方法，等等。在本发明中，可以优选使用pBabe载体。
按照上面描述的方法使中胚层干细胞无限增殖化的步骤对本发明不是必需的，而且用上面描述的方法等以前无限增殖化的中胚层干细胞可以用于下面描述的步骤(b)。
按照本发明的方法，在上面描述的步骤(a)之后，通过在基础培养基中培养无限增殖化中胚层干细胞使之分化成神经细胞(步骤(b))。
在此步骤的优选实施方案中，通过在基础培养基中培养无限增殖化中胚层干细胞使之分化成神经干细胞。
在本发明的优选实施方案中，将上面提到的中胚层干细胞或上面提到的ES细胞在基础培养基中于33℃至38℃保温。
对本发明使用的基础培养基的类型没有限制，只要是可以用于细胞培养的一般培养基即可。优选的培养基包括DMEM(Dulbecco’s改良的基础培养基)和NPBM(神经祖细胞基础培养基；Clonetics)。对上面提到的基础培养基中可能含有的其他组份类型没有限制，优选的成分包括F-12，FCS和神经存活因子(Clonetics)。在这类培养基中，例如，F-12和FCS的浓度分别是50％和1％。在这类培养基中CO2的浓度优选是5％，但本发明不限于此。
而且，在本发明的另一个优选实施方案中，向上面提到的基础培养基中添加bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)或EGF(表皮生长因子)。在这种情况下，可以加入一种或者两者都加入。上面提到的bFGF或EGF的举例浓度是1ng/ml至100ng/ml，优选的浓度为10ng/ml。对添加的时间和方法没有限制。优选地，在将上面提到的中胚层干细胞在基础培养基中培养时每天加入试剂。当中胚层干细胞向神经干细胞分化时，优选向上面提到的基础培养基中既加入bFGF又加入EGF。
按照本发明，向上面提到的基础培养基或含有其它成分的基础培养基中添加缺血的脑提取物可以促进上面提到的中胚层干细胞分化成上面提到的神经细胞包括神经干细胞。一般地，缺少这种缺血的脑组织提取物，分化成神经干细胞要用一星期或更长时间。但是，当加入这种提取物，诱导可以仅在几天完成，而且，分化效率大大改善。本发明也提供这种用于促进向神经细胞包括神经干细胞分化的诱导方法。
制备本发明的缺血的脑提取物可以通过，例如，将脊椎动物缺血的脑碾碎裂解物离心。特别地，从全脑缺血动物模型(大鼠等)上切下全脑，从脑制备小块并与NPBM(神经干细胞培养基)混合。将小块在匀浆器内机械碾碎。然后，将样品在300g离心5分钟或800转/分离心5分钟，收集所得上清，并将上清通过滤膜过滤以去除细胞碎片来制备缺血的脑提取物。但是，本发明不限于此方法。将用于全脑缺血动物模型的动物用戊巴比妥钠(Nembutal)麻醉，然后用生理盐水灌注动物。之后将用上面提到的方法制备的缺血脑提取物加入上面提到的基础培养基或含有其它成分的基础培养基。同样，不限制添加的时间。
按照本发明，通过在上面描述的条件下培养，使上面提到的中胚层干细胞或上面提到的ES细胞分化成神经细胞。所得的神经细胞的具体例子包括神经干细胞，神经祖细胞，神经元，和胶质细胞。
本发明方法中使用的培养温度在33℃至38℃之间，且优选的温度是37℃。
不限制培养条件的其它参数。细胞可以是悬浮状态(神经球状态)或粘附于培养容器。合适的培养容器包括例如，未包被的平皿等。
而且，通过去除无限增殖化基因，可以改进用本发明方法诱导分化的神经细胞的安全性。在本发明中，可以用已建立的技术从细胞中去除导入的无限增殖化基因。特别地，无限增殖化基因可以经例如Cre重组酶的重组酶处理而去除，例如，通过将无限增殖化基因置于一对loxP序列或loxP-样序列之间。
按照本发明，也可以使中胚层干细胞直接分化成神经元或神经胶质细胞(不转变成神经干细胞)，其通过将上面提到的中胚层干细胞培养基换成新鲜培养基[50％DMEM(Dulbecco’s改良的基础培养基)/50％F-12/1％FSC]或培养基2中[NPBM(神经祖细胞基本培养基；Clonetics)/2％神经存活因子(Clonetics)/0.2％hEGF(人表皮生长因子)/0.2％庆大霉素-两性霉素B/0.2％hFGF]并进一步培养大约几天至约4周。因此，本发明也包括诱导中胚层干细胞直接分化成神经元或胶质细胞的方法。
本发明进一步提供用本发明上面提到的方法制备的细胞。本发明提供神经细胞并且包括但不局限于神经干细胞，神经祖细胞，神经元，和胶质细胞。
本发明也提供用于治疗神经系统疾病的组合物，该组合物包括用上面提到的方法制备的细胞。可以将本发明的细胞直接用于移植。但是，为改善治疗效果，可以将细胞作为添加各种试剂的组合物或其中导入基因的组合物移植。
打算制备本发明的组合物时，例如，可以<1>加入改善本发明细胞增殖率或促进向神经细胞分化的物质，或导入指导这些作用的基因；<2>在损伤的神经组织中加入改善本发明细胞活力的物质，或导入指导此作用的基因；<3>加入抑制损伤神经组织对本发明细胞的不良影响的物质，或导入指导此作用的基因；<4>加入延长供体细胞寿命的底物，或导入指导此相同作用的基因；<5>加入调节细胞周期的底物，或导入指导此作用的基因；<6>加入用于抑制免疫反应的底物，或导入指导此作用的基因；<7>加入激活能量代谢的底物，或导入指导此作用的基因；<8>加入改善在宿主组织内供体细胞迁移能力的底物，或导入指导此作用的基因；<9>加入改善血流的底物，或导入指导此作用(包括血管生成的诱导)的基因；和<10>加入对宿主脑和/或神经有治疗作用的底物(患有需治疗的疾病包括，例如，脑肿瘤，中枢和外周神经系统脱髓鞘疾病，中枢和外周神经系统退化性疾病，脑卒中(包括脑梗塞，脑出血和蛛网膜下出血)，高位脑机能障碍包括痴呆，精神疾病，癫痫，创伤性神经疾病(包括头部外伤，脑挫伤和脊髓损伤)，炎症性疾病，感染性疾病等等)，或导入指导此作用的基因。但是，本发明不限于这些例子。
为治疗神经系统疾病的目的，可以将本发明的细胞和组合物移植给受体。需治疗的疾病包括但不限于中枢和外周神经系统脱髓鞘疾病，中枢和外周神经系统退化性疾病，脑卒中(包括脑梗塞，脑出血和蛛网膜下出血)，脑肿瘤，高位脑机能障碍包括痴呆，精神疾病，癫痫，创伤性神经疾病(包括头部外伤(head injury)，脑挫伤和脊髓损伤)，炎症性疾病，感染性疾病(例如Creutzfeldt-Jakob疾病)和脊髓梗塞。
按照本发明，可以将源于受体的细胞作为供体细胞移植(自体移植治疗)，该细胞例如从骨髓液，脐血，外周血，皮肤，肌肉组织，脂肪组织，滑膜和发根分离。由于低排斥风险和避免免疫抑制剂的使用，自体移植治疗是优选的。一旦自体移植治疗困难，可以使用为医疗目的培养的其他人或动物的细胞。
本发明者也检测细胞移植时间和治疗效果的关系，并发现在超急性期(几小时内)进行移植治疗获得最好的治疗效果。仅次于超急性期进行治疗，在急性期(几天后)进行的治疗可以获得好的治疗效果，在慢性期(几周后)进行治疗居于第三。因此，考虑在超急性期移植治疗是优选的。所以，提前收集并培养细胞，向细胞中导入基因，扩增细胞，诱导细胞分化和贮存细胞是非常有用的。特别地，优选提前从受体收集细胞，按照本发明的方法向细胞导入无限增殖化基因，和通过培养为移植而适当储存的细胞，诱导其分化成神经细胞。可以在下列任何状态贮存细胞。考虑到要治疗的疾病的类型，本领域的技术人员可以适当选择细胞的合适状态1.未经任何处理的收集的细胞(粗提部分)；2.部分纯化的细胞；3.纯化的细胞并且然后经培养扩增；4.纯化的，无限增殖化的，和扩增的细胞；5.向神经干细胞分化的细胞；和
6.向神经细胞分化的细胞。
而且，在骨髓库，脐血库注册的细胞等也可用于移植。可以将这些细胞冻存。
此外，本发明显示，当将中胚层干细胞(包括无限增殖化细胞)不经任何进一步处理移植给受体时，中胚层干细胞向神经组织迁移并分化成神经细胞，导致功能恢复。相应地，向受体直接给予(移植)中胚层干细胞并诱导其体内分化成神经细胞的方法也包括在本发明中。不限制本方法中使用的给药方法的类型。合适的给药方法包括，例如，局部给药，静脉内给药，动脉内给药和脑脊髓内给药(例如，腰椎穿刺和脑室内给药)。
细胞移植给患者的完成可以通过，例如，注射器内充满待移植的悬于人工脑脊液，生理盐水或类似物内的细胞，手术暴露损伤的神经组织，和直接用注射针向损伤区注射细胞。然后本发明的细胞由于高迁移性可以向神经组织迁移。因此，可以将细胞移植入邻近损伤区的部位。将细胞注射入脑脊液内也是有效的。在这种情况下，可以用一般的腰椎穿刺注射细胞，并且是优选的，因为患者只需局部麻醉且不必在病房手术。而且，动脉内注射和静脉内注射也是有效的，并因此可以用与一般输血相同的方法进行移植。与需要使用病房的那些移植方法相比，这些方法是优选的。
此外，由于高迁移性，本发明的细胞可以用作基因的载体(载体)。可以将这些细胞用作各种神经系统疾病基因治疗的载体，疾病例如，脑肿瘤，中枢和外周神经系统脱髓鞘疾病，中枢和外周神经系统退化性疾病，脑卒中(包括脑梗塞，脑出血和蛛网膜下出血)，高位脑机能障碍包括痴呆，精神疾病，癫痫，创伤性神经疾病(包括头部损伤，脑挫伤和脊髓损伤)，炎症性疾病，感染性疾病(例如Creutzfeldt-Jakob疾病)。
图1显示描述培养的中胚层干细胞的照片。细胞表达中胚层细胞标志SH3(A)，但是神经干细胞标志巢蛋白(nestin)阴性(B)。在培养条件下诱导分化后，细胞形态变为神经干细胞样形态并且成为中胚层细胞标志SH3阴性(C)，和巢蛋白阳性(神经干细胞标志)(D)。(A)和(B)中的标尺(scale bar)表示10μm，(C)和(D)中表示200μm。
图2显示描述从中胚层干细胞分化的神经干细胞分化的照片，在培养条件下分化成神经元(A，D)，分化成星形胶质细胞(B，E)，和进一步诱导分化成少突胶质细胞(C，F)。细胞的免疫染色用NSE(神经元特异的烯醇酶)(D)；GFAP(胶质纤维酸性蛋白)(E)；和GalC(半乳糖脑苷脂)(F)。标尺表示25μm。
图3显示描述移植的细胞使脑梗塞损伤的修复的照片。将供体细胞，即，从中胚层干细胞在培养条件下诱导分化的神经干细胞，用LacZ基因(表达E.coliβ-半乳糖苷酶)遗传标记。因此，当用底物X-gal处理时细胞被染成蓝色。这可以追踪宿主脑组织内的供体细胞。用LacZ基因标记的供体细胞移植给大鼠脑梗塞模型(短暂大脑中动脉梗塞模型；脑梗塞发生在大脑基底神经节，颞叶，海马等等)，结果细胞进入受脑梗塞影响的大脑基底神经节，颞叶，海马等部位并修复组织。
图4显示移植的细胞使脊髓损伤区域修复的照片。用LacZ基因标记的供体细胞移植给大鼠脊髓损伤模型(在第一胸椎水平切断脊髓的模型)，结果，供体细胞不仅向损伤区迁移，而且向脑(A)，颈髓(B)，腰髓(C)，和修复的组织迁移。图(D)、(E)、(F)是分别与图(A)、(B)、(C)相对应的高倍观察。(A)-(C)中的标尺表示200μm，(D)-(E)中表示10μm。
图5显示移植的细胞使脊髓脱髓鞘区域修复的照片。(A)显示将神经干细胞移植入成熟大鼠脊髓脱髓鞘区域后再髓鞘化的照片。神经干细胞已经从来自成年人的人中胚层干细胞分化完成。(B)显示用高倍观察的再髓鞘化的轴突的照片。
图6显示从ES细胞分化的神经干细胞的巢蛋白-阳性神经球的照片。
图7显示用于向基质细胞导入基因的载体结构的图解描述。
图8显示转染基质细胞的图解描述。
图9显示基于中胚层干细胞(原代培养)和导入hTERT而无限增殖化的中胚层干细胞细胞分裂产生的细胞数。
图10显示导入hTERT而无限增殖化的中胚层干细胞(A)和从无限增殖化的中胚层干细胞分化来的脂肪细胞(B油红O-染色)的照片。
图11显示导入hTERT而无限增殖化的中胚层干细胞(A)和从无限增殖化的中胚层干细胞分化来的成软骨细胞(BAlcian蓝-染色)的照片。软骨基质中(冰冻切片)的软骨素被染成蓝色。
图12显示导入hTERT而无限增殖化的中胚层干细胞(A)和从无限增殖化的中胚层干细胞分化来的成骨细胞(Bvon Kossa-染色，矿物质沉积)的照片。
图13显示从导入hTERT而无限增殖化的中胚层干细胞分化来的巢蛋白-阳性神经干细胞的照片。标尺表示100μm。
图14显示从神经干细胞分化来的NSE-阳性神经元(A)和GFAP-阳性神经胶质细胞(B)，而该神经干细胞是从导入hTERT而无限增殖化的中胚层干细胞分化来的。(A)中标尺表示20μm，(B)中表示10μm。
图15显示移植导入hTERT而无限增殖化的中胚层干细胞使脊髓脱髓鞘区域修复的照片。(A)显示将导入hTERT基因的中胚层干细胞移植入成熟大鼠脊髓脱髓鞘区域后再髓鞘化的照片。(B)显示用高倍观察的再髓鞘化的轴突的照片。(A)中标尺表示250μm，(B)中表示10μm。
图16显示按照本发明的方法诱导各种细胞向神经干细胞分化获得的结果照片。在未处理的平皿中将各种细胞在神经祖细胞基础培养基中悬浮状态保温。48小时后观察细胞。所有细胞在悬浮状态是活的。仅MSC-hTERT，间质-hTERT，和PDF显示神经球样形态。
图17显示确认巢蛋白表达的RT-PCR测定结果照片，其中用本发明的方法在诱导向神经干细胞分化的处理后，从各自的细胞制备总RNA用于RT-PCR。泳道A对应于DMEM-10％FBS/培养皿；B，NPBM/未处理的平皿/1天；C，NPBM/未处理的平皿/2天；D NPBM/未处理的平皿/5天。NPBM指神经祖细胞基础培养基。
图18显示确认从MSC分化的神经干细胞分化成神经元的RT-PCR测定结果的照片。上图显示用GAPDH(GAPDH用作内对照)标准化的结果；下图显示用神经丝(NF)亚单位，NF-M标准化的结果。泳道1相应于DDW；泳道2，神经干细胞；泳道3，MSC-hTERT；泳道4，间质-hTERT；泳道5，PDF-hTERT；泳道6，MSC-hTERT BHA，DMSO；泳道7，间质-hTERT BHA，DMSO；泳道8，PDF-hTERT BHA，DMSO；泳道9，MSC-hTERT NPBM(-)；泳道10，间质-hTERT NPBM(-)；泳道11，PDF-hTERT NPBM(-)；泳道12，NSC NPBM(-)PDL/层粘连蛋白；泳道13，MSC-hTERT NPBM(-)PDL/层粘连蛋白；泳道14，间质-hTERT NPBM(-)PDL/层粘连蛋白；和泳道15，PDF-hTERT NPBM(-)PDL/层粘连蛋白。
图19显示按照本发明方法诱导用载体导入的MSC-hTERT向神经干细胞分化的结果的照片。在巢蛋白阳性细胞中载体表达EGFP。在激光共聚焦显微镜下观察细胞。结果，显示MSC-hTERT在向神经干细胞分化前不表达EGFP，但是在诱导后强表达EGFP。
图20显示确认MSC-hTERT中巢蛋白表达的RT-PCR测定结果照片。泳道1，含有导入的巢蛋白增强子/启动子EGFP的MSC-hTERT细胞；和泳道2，含有导入的巢蛋白增强子/启动子EGFP并然后分化成神经干细胞的MSC-hTERT细胞。
发明的最佳实施方案参考以下实施例详细描述本发明，但是不应理解为本发明受此限制。
实施例1单核细胞部分和中胚层干细胞的制备(1)单核细胞部分和单核细胞部分的培养溶液将从小鼠(或人)收集的标本用含有3毫升Ficoll的L-15培养基(2毫升)稀释，并于2,000rpm离心15分钟。从单核细胞部分分离细胞，并悬于2毫升无血清培养基中(神经祖细胞维持培养基(NPMM))。将悬液于2,000rpm离心15分钟。弃上清并收集沉淀的细胞。将细胞重悬于NPMM中制备单核细胞部分。
进一步，单核细胞部分的培养溶液的制备通过在37℃，5％CO2条件下将单核细胞部分分别在下列培养基中保温培养基1[DMEM(Dulbecco’s改良的Eagles培养基-低糖)/10％FBS(胎牛血清)/1％抗生素抗霉菌溶液]，培养基2，和培养基3。
(2)中胚层干细胞使用抗体，从上面(1)描述的方法制备的单核细胞部分或单核细胞部分的培养溶液中挑选具有下列特征的细胞SH2(+)，SH3(+)，SH4(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD34(-)，和CD45(-)。挑选通过使用磁珠或一般的细胞分类器(FACS等等)的方法进行。
实施例2中胚层干细胞向神经细胞分化的诱导(1)中胚层干细胞向神经干细胞分化的诱导首先，洗涤细胞并然后将培养基中的细胞用酶(试剂0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；室温5分钟)处理收集。加入等量培养基后，吹吸几次使细胞分散成单个细胞。然后，将细胞于600rpm离心5分钟。用吸管吸出沉淀的细胞。然后，在培养容器内(未处理的聚苯乙烯平皿)中将细胞进一步培养在悬浮状态，于37℃，5％CO2条件下，用新鲜的下列培养基培养基1[50％DMEM(Dulbecco’s改良的基础培养基)/50％F-12/1％FSC；每日添加10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和10ng/ml表皮生长因子(EGF)]或培养基2中[NPBM(神经祖细胞基本培养基；Clonetics)/2％神经存活因子(Clonetics)/0.2％hEGF(人表皮生长因子)/0.2％庆大霉素-两性霉素B/0.2％hFGF(人成纤维细胞生长因子)；每日添加10ng/ml bFGF和10ng/ml EGF]。
(2)中胚层干细胞向神经元或胶质细胞分化的诱导在培养状态将中胚层干细胞的培养基用新鲜培养基[50％DMEM(Dulbecco’s改良的基础培养基)/50％F-12/1％FSC]或培养基2[NPBM(神经祖细胞基本培养基；Clonetics)/2％神经存活因子(Clonetics)/0.2％hEGF(人表皮生长因子)/0.2％庆大霉素-两性霉素B/0.2％hFGF]更换。培养约4周成功达到中胚层干细胞向神经元或胶质细胞的直接分化(不转变成神经干细胞)。
通过确认中胚层细胞标志SH2和SH3的消失(细胞起初是神经干细胞标志巢蛋白阴性)和神经干细胞标志巢蛋白的出现判断用上面提到的方法(1)或(2)使中胚层干细胞向神经细胞分化的诱导(图1)。
此外，由于向神经细胞分化，培养的中胚层干细胞形态改变。特别地，分散的细胞形成神经球(图1)。而且，确认这些神经干细胞分化成神经元(NSE阳性)和神经胶质细胞(GFAP阳性)(图2)。
实施例3用缺血的脑提取物促进中胚层干细胞向神经细胞分化的诱导在中胚层干细胞的培养期间，发现加入缺血的脑提取物使中胚层干细胞更高效率地向神经干细胞分化，该提取物从暴露于缺血应激的脑制备。发现该方法仅用几天的培养就确保中胚层干细胞高效地向神经干细胞分化。
(1)缺血的脑提取物的制备首先，将大鼠用戊巴比妥钠深麻醉并从前腹壁切开心前区以暴露心脏和升主动脉。切开心尖并将插管从左心室插入升主动脉。然后，在心脏的右心耳作切口，并用生理盐水从插管灌注3分钟使足够的血液流出。灌注后，将大鼠保持4-5小时并用作全脑缺血模型。接下来，从上面提到的全脑缺血模型大鼠上切下大脑和中脑并用雕刻刀切成约1-2mm的小块。将制备的小块与NPMM混合并在匀浆器内机械碾碎以制备悬液。然后，将悬液转移到离心管中，于800rpm离心5分钟，收集所得上清。用0.22μm膜的滤器去除细胞成分并将过滤物用作缺血的脑提取物。
(2)培养的中胚层干细胞向神经干细胞分化的诱导将MSCs进一步在100-mm未包被的平皿上(IWAKI)用条件培养基(3类本文其他处描述的)于37℃，5％CO2中培养直至90％汇合。然后，用Pasteur吸管吸出培养液并将细胞用Dulbecco’s PBS洗涤3次。向平皿中加入含有0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的PBS 2毫升，于37℃保温2-5分钟直至细胞分开。向平皿中加入2毫升条件培养基以终止胰蛋白酶的反应。用Pasteur吸管将上清和分开的细胞转移入离心管中，吹吸几次，然后于1000rpm离心5分钟。弃上清，将细胞在NPMM中重悬。将细胞置于37℃预温的培养基(50％NPMM和50％缺血脑提取物)中，然后于37℃，5％CO2条件在100-mm未包被的平皿上(IWAKI)悬浮状态培养，每日添加10ng/mlbFGF和10ng/mlEGF。
实施例4神经再生潜力的评价评价用上面描述的诱导分化的方法获得的神经细胞的神经再生潜力使用脑梗塞模型(图3)，痴呆模型(图3)，脊髓损伤模型(图4)和脱髓鞘模型(图5)。结果，接受评价的细胞具有和从脑提取并和培养的神经干细胞相当的再生潜力。
实施例5ES细胞向神经细胞分化的诱导将小鼠ES细胞在100-mm明胶包被的平皿上(IWAKI)用20毫升条件培养基(DMEM，10％FCS，100μM 2-巯基乙醇，1000单位/mlESGRO(CHEMICON))于37℃，5％CO2中连续培养直至90％汇合。然后，用Pasteur吸管吸出培养基并将细胞用PBS洗涤3次。向平皿中加入含有0.25％胰蛋白酶和0.03％EDTA的PBS 2毫升，于37℃保温2-5分钟直至细胞分开。加入400μl FCS终止胰蛋白酶的反应。用Pasteur吸管将上清和分开的细胞转移入离心管中，吹吸几次，然后于1000rpm离心5分钟。弃上清，将细胞在NPMM中重悬。将细胞置于37℃预温的培养基(50％NPMM和50％缺血脑提取物)中，然后于37℃，5％CO2条件在100-mm未包被的平皿上(IWAKI)悬浮状态培养，每日添加10ng/ml bFGF和10ng/mlEGF。
实施例6向细胞内导入hTERT基因下面描述通过向细胞内导入hTERT基因使基质细胞无限增殖化的方法1.原代基质细胞的收集从健康成年男性髂骨获得的10ml骨髓液体分离单核细胞。过夜培养后粘附于瓶底的细胞用做基质细胞。
2.将编码人端粒酶催化亚基(hTERT)的基因导入基质细胞。hTERT的序列，例如Science 277955-959所发表。Ras基因和SV40 T基因都是已知的和细胞肿瘤发生有关的基因，也将其导入基质细胞。
3.用作基因导入基质细胞的载体pBABE-hygro-hTERT(Robert A.Weinberg博士惠赠；图7)通过将hTERT克隆入pBABE-hygro构建，其中hTERT EcoRV-SalI片段如Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9514723-14728所描述的用PCR从pCI-Neo-hTERT-HA获得。载体pBABE-puro-rasV12(Scott WLowe博士惠赠)的制备按照Cell，88593-602，1997描述的方法。载体pMFG-tsT-IRES-neo的制备通过将IRES-neo的BamHI片段(通过消化pRx-hCD25-ires-neo获得(Human gene therapy 91983-1993，1998))克隆入MFG-tsT(通过将pZIPtsU19片段(R.McKay博士惠赠)插入MFG载体制备(Lab.Invest.781467-1468，1998))。
4.产逆转录病毒细胞的制备和用该细胞的病毒感染按照“ExperimentalMedicine，SupplementThe Protocal Series-Experimental Methods forGeneDelivery & Expression Analysis(Eds.，I.Saito and S.Sugano；Yodosha)(pp.58-62)”描述的方法进行。
特别地，通过下面描述的方法用BOSC23包装(packaging)细胞(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908392-8396，1993)制备ψCRIP包装细胞Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908392-8396，1993)。
4-1.产生重组逆转录病毒载体的细胞的制备i)转染前18-24小时将BOSC23细胞以密度5.5×106细胞/平皿种于10cm平皿中。
ii)向15μg DNA(逆转录病毒载体)中轻轻加入800μlOPTI-MEM(Gibco/BRL)并搅拌混合物制备溶液A。
iii)在无菌试管中放入750μl OPTI-MEM，向其中加入50μlLIPOFECTAMINE(2mg/ml Gibco/BRL)并轻轻振摇混合物以制备溶液B。
iv)将溶液B轻轻混入溶液A并然后在室温放置30-45分钟制备溶液C。
v)将BOSC23细胞用37℃预温的无抗生素，无FBS培养基洗涤一次。
vi)将溶液C(1.6ml)轻轻加入BOSC23细胞。
vii)再向混合物中加入2.4 ml OPTI-MEM。
viii)将所得混合物在5％CO2条件下保温5小时。
ix)加入含有20％胎牛血清的DMEM 4ml并将混合物保温过夜。
x)将培养基换成用37℃预温的含有10％胎牛血清的新鲜培养基，同时将ψCRIP包装细胞以密度1-2×106细胞/平皿种于10cm平皿中。
xi)24小时后，将BOSC23细胞的培养基通过0.45μm或0.20μm的注射器滤器过滤。同时，以终浓度8μg/ml加入polybrene(Hexadimethrine Bromide，SIGMA H-9268)。
xii)4-24小时培养后，加入5ml培养基并将细胞继续保温过夜。
xiii)最后，用药物筛选制备产逆转录病毒的ψCRIP细胞。
然后，将上面提到的三种载体分别在产逆转录病毒的细胞(ψCRIP/P131)中扩增。将基质细胞如下转染(图8)。
首先，转染前1天，将基质细胞以密度5×104细胞/10cm平皿再次接种，并将产逆转录病毒的ψCRIP/P131的培养基由含10％牛血清的DMEM换成含12.5％灭活的马血清，12.5％灭活的胎牛血清，2-巯基乙醇，和氢化可的松(hydrocortisone)的α-MEM培养。转染当天，将培养上清通过0.20μm的滤器过滤并以终浓度8μg/ml加入1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)。接着，将上清中产生的重组逆转录病毒载体感染基质细胞。4小时后，用新鲜培养基更换培养上清并继续培养2天。然后进行药物筛选，分别是对pBABE-hygro-hTERT用100μg/ml潮霉素5天；对pBABE-puro-rasV12用1μg/ml嘌呤霉素5天；对pMFG-tsT-IRES-neo用1mg/ml G4185天。
用3类逆转录病毒载体以下列组合完成感染(1)对照；(2)单独pBABE-hygro-hTERT；(3)单独pMFG-tsT-IRES-neo；(4)单独pBABE-puro-rasV12；(5)两种载体pMFG-tsT-IRES-neo和pBABE-hygro-hTERT；(6)两种载体pBABE-puro-rasV12和pBABE-hygro-hTERT；(7)两种载体pMFG-tsT-IRES-neo和pBABE-puro-rasV12；(8)三种载体pBABE-puro-rasV12，pMFG-tsT-IRES-neo和pBABE-hygro-hTERT。
发明者保存有这些病毒和载体，而且在获得此申请的专利后可以进行这样的公开利用。
实施例7间质干细胞的分化潜力间质干细胞，其具有分化成骨，软骨，肌肉，等等的能力和自我更新能力，检测其分化潜力和支持血液干细胞的能力。
在健康成年人进行髂骨穿刺。接着，通过密度离心收集单核细胞并在含10％灭活的胎牛血清的DMEM中培养过夜。从第2天开始培养粘附的细胞。2周后，将用T-E(胰蛋白酶-EDTA)收集的细胞保存为冰冻的原代间质干细胞。然后，同实施例1导入hTERT基因。然后对比原代间质干细胞和通过导入hTERT基因无限增殖化的间质干细胞的生长曲线。结果如图9所示。如图9所示，42天后(代数，17(PD＝17))原代间质干细胞的细胞分裂停止(临界(crisis))。另一方面，无限增殖化的间质干细胞保持最初的细胞分裂速率并可以传代至270天之后(代数，54(PD＝54))。因此，推测已经建立稳定的细胞系。
接下来，检测制备的间质干细胞多潜能性。
(1)首先，(用1μM地塞米松(dexamethasone)，60μM indomethacin，0.5μM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和5μg/ml胰岛素诱导向脂肪细胞的分化。培养约一周后，将细胞用油红O染色(图10；脂滴染成红色)。
(2)然后，用1μM地塞米松，50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸盐，6.25μg/ml胰岛素，6.25μg/ml转铁蛋白，5.35μg/ml硒酸，1.25mg/ml亚油酸和10ng/mlTGF-β诱导向软骨分化。培养2-3周后，将细胞用Alcian蓝染色。软骨基质(冰冻切片)中的软骨素被染成蓝色(图11)。
(3)而且，用1μM地塞米松，50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸盐和10mM β-磷酸甘油诱导骨分化。培养2-3周后，将细胞进行von Kossa染色(矿物质的沉积)。结果如图12所示。
实施例8中胚层干细胞向神经细胞分化的诱导(1)中胚层干细胞向神经干细胞的分化将上面实施例中通过导入hTERT基因无限增殖化的中胚层干细胞(MSC)用作下面实验中的间质干细胞。
首先，将永生细胞洗涤，然后用酶处理(试剂0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；室温5分钟)收集培养基中的细胞。加入等量的培养基并吹吸几次使细胞分散成单个。然后将悬液于900g离心5分钟。用吸管吸取沉淀的细胞。然后，在培养容器内(未处理的聚苯乙烯平皿)中将细胞进一步培养在悬浮状态，于37℃，5％CO2条件下，用新鲜的下列培养基培养基1[50％DMEM(Dulbecco’s改良的基础培养基)/50％F-12/1％FSC；每日添加10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和10ng/ml表皮生长因子(EGF)]或培养基2中[NPBM(神经祖细胞基本培养基；Clonetics)/2％神经存活因子(Clonetics)/10ng/ml hEGF(人表皮生长因子)/0.2％庆大霉素-两性霉素B/10ng/ml hFGF(人成纤维细胞生长因子)；每日添加10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和10ng/ml表皮生长因子(EGF)]。
用这种方法使中胚层干细胞向神经干细胞的分化用中胚层干细胞标志SH2和SH3(细胞最初是神经干细胞标志巢蛋白阴性)的消失和神经干细胞标志巢蛋白的出现(细胞变成此标志阳性)来评估(图13)。
此外，分化成神经干细胞时培养的中胚层干细胞形态学发生变化。特别地，分散的细胞形成神经球(图7)。此外，发现这些神经干细胞向神经元(NSE阳性)和神经胶质细胞(GFAP阳性)分化(图14)。
(2)中胚层干细胞向神经元或神经胶质细胞的分化[1]将上面培养中胚层干细胞的培养基换成新鲜培养基[50％DMEM(Dulbecco’s改良的基础培养基)/50％F-12/1％FSC]或培养基2[NPBM(神经祖细胞基本培养基；Clonetics)/2％神经存活因子(Clonetics)/10ng/ml hEGF(人表皮生长因子)/0.2％庆大霉素-两性霉素B/10ng/mlhFGF]，培养约4周。结果，成功诱导中胚层干细胞直接分化成神经元或胶质细胞(不经过神经干细胞的转变)。
(3)中胚层干细胞向神经元或胶质细胞的分化[2]也可以用下面方法诱导中胚层干细胞向神经元的分化。按照以前报道完成神经的诱导(Journal of Neuroscience Research 61364-370，2000)。首先，调节MSC KYhTERT的细胞密度。特别地，将细胞在10-cm平皿中预培养直至70-80％汇合，吸弃上清，用5ml PBS洗涤，加入1ml胰蛋白酶/EDTA收集细胞。在210g离心10分钟使细胞沉淀，然后以2×104细胞/ml密度用含10％胎牛血清的DMEM重悬细胞。按照2ml等份将溶液置于6孔板的每个孔中(4×104细胞)。24小时后，弃掉含10％胎牛血清的DMEM，并将培养基换成含1mM 2-ME和10％胎牛血清的DMEM 2ml(预诱导)。再过24小时，弃去血清并用下列三类培养基完成神经的诱导(1)含1mM 2-ME的DMEM 2ml；(2)含10mM 2-ME的DMEM 2ml；和(3)含200μM丁醇改性的hydroxyanisole(BHA，Sigma)和2％二甲基亚砜(DMSO，NACALAI)。用上面的培养基诱导24小时后观察细胞的形态。
结果，用(1)的培养基，有扁平胞质的MSC KY hTERT的细胞质退化并显示与相邻细胞接触的具有双极或多极形态的形态学。与用(1)的培养基获得的结果相比，用(2)或(3)的培养基观察到更多的细胞展现出几乎相同的形态。这些形态学的改变与以前报道中描述的相似。进一步用神经标志的免疫染色分析细胞。将3类抗体的溶液，即，抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP；Cappel)抗体，髓磷脂碱性蛋白(MBP；Chemicon)抗体；和神经元特异的烯醇酶抗体(NSE；ARP)分别稀释50，200，200倍用于实验。进一步，用Vectastain EliteABC试剂盒(VECTOR laboratories)和DAB底物试剂盒作底物完成免疫染色。将细胞用2％多聚甲醛固定细胞并用0.3％过氧化氢抑制内源性过氧化物酶。如上描述的完成神经的诱导并在诱导后24小时进行免疫染色。
实施例9神经再生潜力的评价用上述诱导分化方法获得的神经细胞的神经再生潜力用脑梗塞模型，痴呆模型，脊髓损伤模型和脱髓鞘模型来评价。结果，发现该细胞具有与从脑提取并培养的神经干细胞相同的再生潜力(图15)。
实施例10神经球样细胞的向神经细胞分化按照上面实施例的方法将hTERT基因导入中胚层干细胞使间质干细胞无限增殖化(MSC-hTERT)。进一步，将hTERT基因同样导入基质细胞(基质-hTERT)，PDF细胞，Hella细胞和HepG2细胞。然后，将每种细胞分别悬于神经祖细胞基础培养基中并在未处理的平皿中培养。48小时后，观察细胞的形态。MSC-hTERT，基质-hTERT和PDF细胞显示球样形态(图16)。
而且，按照本发明的方法(即，在未处理的平皿中于神经祖细胞基础培养基里悬浮培养1，2，或5天)将上面提到的各种细胞诱导分化成神经干细胞后，从细胞制备总RNA并用RT-PCR检测巢蛋白的表达。
将仅培养在含10％FBS的DMEM中的细胞用作对照。判定用这种方法诱导的中胚层干细胞向干细胞的分化如实施例8所描述，是通过确认细胞变成神经干细胞标志巢蛋白阳性。
结果，在培养2或5天的MSC-hTERT，MSC，基质-hTERT和PDF细胞的泳道检测到巢蛋白的表达(图17)。
实施例11向神经元的分化和神经球的形成将实施例10中使用的各种细胞以5×104细胞/孔密度用含10％FBS的DMEM种于6孔板上。过夜培养后，将培养基换成含10％FBS和1mMβ-ME的DMEM，继续将细胞培养过夜。然后，将培养基换成含2％DMSO/200μM叔丁对甲氧酚(butylated hydroxyanisole)(BHA)的DMEM进行诱导。4天后，收集细胞并提取RT-PCR用的总RNA。
进一步，将上面提到的各种细胞以5×105细胞/10-cm密度种于含有NPBM(FGF(20ng/ml)和EGF(20ng/ml))培养基的未包被平皿上以形成神经球。4天后，收集细胞并用NPBM(FGF，EGF(-))以1×105细胞/孔密度种板(用多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的6孔板)。10天后，收集细胞并提取RT-PCR用的总RNA。
为使样品间cDNA浓度差异标准化，用同样方法分析甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为标准化的内对照。
结果，观察到从MSC-hTERT分化的神经元(图18中泳道6；BHA和DMSO)和从MSC-hTERT经神经干细胞分化的神经元(图18中泳道13；NPBM(-)PDL/层粘连蛋白)强表达NF-M。
实施例12巢蛋白的表达当宿主变成巢蛋白阳性时，向MSC-hTERT导入表达EGFP的载体制备细胞系。体外诱导向神经干细胞的分化，然后在激光共聚焦显微镜下观察细胞。结果，发现巢蛋白阳性的MSC-hTERT细胞发射绿色荧光(图19)。
而且，也用RT-PCR证实巢蛋白的表达(图20)。
工业实用性本发明提供诱导中胚层干细胞或ES细胞分化成神经细胞的方法，一种新方法其包括扩增中胚层干细胞获得大量细胞和有效诱导细胞分化成神经干细胞，神经细胞；用该方法获得的神经细胞；包含神经细胞的治疗神经系统疾病的组合物；和用该组合物治疗神经系统疾病的方法。
当在培养条件下培养的人中胚层干细胞的扩增受到某种程度限制时，可以非常稳定地大规模扩增已经导入hTERT基因的本发明的中胚层干细胞。而且，不象导入原癌基因等修饰的细胞，本发明的细胞未出现细胞特征的可见变化。因此，在不丢失细胞原始特性的情况下可以完成细胞的无限增殖化。此外，细胞充分扩增后可以去除hTERT基因。
本发明的方法对各种神经系统疾病的治疗是有用的，这些疾病例如中枢和外周神经系统脱髓鞘疾病，中枢和外周神经系统退化性疾病，脑卒中(包括脑梗塞，脑出血和蛛网膜下出血)，脑肿瘤，高位脑机能障碍包括痴呆，精神疾病，癫痫，创伤性神经疾病(包括脑损伤，脑挫伤和脊髓损伤)，炎症性疾病，感染性疾病(例如Creutzfeldt-Jakob疾病)和脊髓梗塞。此外，打算将本发明用于更普通的和弥散的脑和/或神经损伤的神经移植和/或再生治疗。特别地，可以将本发明用于下列疾病的自体移植治疗中枢和外周神经系统脱髓鞘疾病，中枢和外周神经系统退化性疾病，脑卒中(包括脑梗塞，脑出血和蛛网膜下出血)，脑肿瘤，高位脑机能障碍包括痴呆，精神疾病，癫痫，创伤性神经疾病(包括脑损伤，脑挫伤和脊髓损伤)，炎症性疾病，感染性疾病(例如Creutzfeldt-Jakob疾病)和脊髓梗塞。
而且，本发明的诱导分化方法提供理解中胚层干细胞向神经细胞分化潜在机制的可能。一旦指导这种分化的基因被鉴定和分析，就可以用这种基因将足量的中胚层干细胞有效地转化成神经细胞。因此，非常期望本发明使促进神经组织再生的“基因治疗”成为可能。
此外，本发明的方法可应用于药物开发的功能试验，毒性试验，和cDNA克隆。通常，在开发作用于神经的治疗性药物中的评价系统需要大量神经元，如用于功能试验和毒性试验的评价系统，或者用于对修饰人神经细胞功能的新cDNA的研究的评价系统。以前，提供足量的人神经元是非常困难的。而且，这里的无限增殖化细胞系可以相当简单地从小鼠细胞等获得。然而，多数地，人的神经元和源自非人类动物种属的细胞具有很大差异(种属特异性)，而且用动物细胞或动物个体获得的实验结果经常难于替代人类细胞的而应用于人。使用本发明的细胞和方法，可以容易地大规模制备足量的人类神经细胞来完成所有实验。而且，可以制备这种细胞来保留原始的人神经元的特点和功能。因此，考虑到药物开发的功能试验，毒性试验和cDNA克隆的方法，和以前常常受到量的限制的方法，按照本发明，可以完成明显的技术革新。
例如，当化合物(药物)的功能试验和毒性试验已经通过将化合物给予实验动物如大鼠来进行时，许多实验结果不能对应于人。因此，本领域中希望使用人类标本检测。在所有的人类细胞中，神经细胞是难于得到的。因此，当可以获得足量的人类神经细胞时，用人类神经细胞的可以容易地进行功能试验和毒性试验。因此，这种细胞在药物开发中是非常有用的。通过用本发明的无限增殖化的人MSC获得大量细胞，并按照本发明的方法使制备的细胞向神经细胞分化就可以制备大量的人神经细胞。
本发明提供使中胚层细胞分化成神经细胞的技术。进一步，通过克隆可以鉴定分化中表达水平改变的基因，调节生长/增殖的基因。此外，尽管需要大量细胞完成这种研究，由于可以按照本发明的方法制备大量的无限增殖化的人MSC的事实，本发明具有例如方便的完成基因克隆的价值。
权利要求
1.通过在基础培养基中于33℃至38℃保温诱导中胚层干细胞或ES细胞分化成神经细胞的方法，其中中胚层干细胞或ES细胞源于从脊椎动物收集的骨髓液体或脐血分离的单核细胞部分。
2.诱导中胚层干细胞分化成神经细胞的方法，其包括以下步骤(a)经高表达或激活无限增殖化基因而提供无限增殖化中胚层干细胞；和(b)通过将中胚层干细胞在基础培养基中培养而诱导步骤(a)中无限增殖化中胚层干细胞分化成神经细胞。
3.按照权利要求2的方法，其中通过将无限增殖化基因导入中胚层干细胞使无限增殖化基因被高度表达或激活。
4.按照权利要求3的方法，其中用逆转录病毒载体向中胚层干细胞中导入无限增殖化基因使其永生。
5.按照权利要求4的方法，其中逆转录病毒载体是pBabe。
6.按照权利要求2至5中任何一项的方法，其中神经细胞的无限增殖化基因可以或已经通过基因去除处理而去除。
7.按照权利要求6的方法，其中无限增殖化基因的基因去除处理通过将无限增殖化基因夹心于一对loxP序列或loxP-样序列中，然后用重组酶处理。
8.按照权利要求2至7中任何一项的方法，其中无限增殖化基因选自端粒酶基因，端粒酶衍生的基因，或调节端粒酶表达或活性的基因中的任何一种。
9.按照权利要求2至8中任何一项的方法，其中中胚层干细胞源于骨髓液体，脐血，外周血，皮肤，皮肤的发根细胞，肌肉组织，ES细胞或ES细胞衍生的细胞。
10.按照权利要求2至8中任何一项的方法，其中中胚层干细胞包含在从脊椎动物骨髓液体或脐血分离的单核细胞部分里。
11.按照权利要求1至10中任何一项的方法，其中单核细胞部分的制备可通过将从脊椎动物收集的骨髓液体或脐血在溶液中进行密度梯度离心，2000rpm维持确保根据比重分离的足够时间，然后回收比重范围1.07g/ml至1.1g/ml的细胞部分。
12.按照权利要求1至11中任何一项的方法，其中中胚层干细胞具有下列特征SH2(+)，SH3(+)，SH4(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD34(-)，和CD45(-)。
13.按照权利要求2至12中任何一项的方法，其中培养在33℃至38℃完成。
14.按照权利要求1至13中任何一项的方法，其进一步包括向基础培养基中添加bFGF，EGF，或缺血的脑提取物。
15.按照权利要求1至14中任何一项的方法，其中神经细胞选自包括神经干细胞，神经祖细胞，神经元，和胶质细胞。
16.按照权利要求1至15任何一个的方法获得的细胞。
17.治疗神经系统疾病的组合物，其包括按照权利要求16的细胞。
18.按照权利要求17的组合物，其中神经系统疾病选自中枢和外周神经系统退化性疾病和脱髓鞘疾病，脑卒中，脑肿瘤，高位脑机能障碍，精神疾病，癫痫，创伤性神经疾病，炎症性疾病，感染性疾病或脊髓梗塞。
19.一种治疗神经系统疾病的方法，其中包括给受体移植按照权利要求16的细胞或按照权利要求17的组合物。
20.按照权利要求19的方法，其中神经系统疾病选自中枢和外周神经系统退化性疾病和脱髓鞘疾病，脑卒中，脑肿瘤，高位脑机能障碍，精神疾病，癫痫，创伤性神经疾病，炎症性疾病，感染性疾病或脊髓梗塞。
21.按照权利要求19或20的方法，其中用来移植的细胞来源于受体。
全文摘要
发现将从骨髓液体或脐血分离的单核细胞部分制备的中胚层干细胞或ES细胞培养在液体基础培养基中时向神经干细胞，神经细胞，或神经胶质细胞分化。此外，通过向上面提到的液体基础培养基中加入缺血脑提取物促进中胚层干细胞或ES细胞向神经细胞分化。而且，在脑梗塞模型，痴呆模型，脊髓损伤模型和脱髓鞘模型上，发现用上面描述的诱导分化方法获得的神经细胞具有神经再生潜力。此外，按照本发明，通过使中胚层干细胞无限增殖化可以将其分化成神经系统细胞，而无限增殖化通过在中胚层干细胞中高表达或激活无限增殖化基因并在适当条件下培养该细胞。本发明的方法在神经再生的医学领域中是非常有用的。
文档编号A61P25/00GK1610738SQ02826599
公开日2005年4月27日 申请日期2002年10月30日 优先权日2001年10月30日
发明者本望修, 滨田洋文 申请人:株式会社雷诺再生医学研究所