针对人免疫缺陷病毒的遗传疫苗的制作方法

专利名称：针对人免疫缺陷病毒的遗传疫苗的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及用于刺激人或者其它宿主的免疫应答的疫苗，特别是涉及在宿主中表达人免疫缺陷病毒(HIV)的异源抗原并激发针对HIV感染的免疫应答的重组病毒。
背景技术：
用于开发疫苗的现有技术在很大程度上基于这样的理念使用变性的病毒或者使用由细菌制得的纯化的病毒蛋白。这些类型的疫苗只对有限数目的感染剂有效，而且其保护率也是有限的。
对于包括埃博拉病毒和HIV病毒在内的、含有膜(包膜)糖蛋白(GPs)的病毒，使用变性的病毒或者纯化的病毒蛋白通常达不到满意的效果。这可能是由于以下几个原因。首先，这些病毒的GPs对变性过程敏感，因而蛋白的表位会被变性过程改变。其次，GPs的糖部分是中和抗体的重要的抗原决定簇。比较而言，由细菌制得的蛋白不能被适当的糖基化而且可折叠成具有不同于那些天然病毒蛋白的抗原性的稍微不同的结构。而且，许多基于消弱或者变性病毒的疫苗只能提供对少量免疫抗原的弱免疫应答。此外，这些疫苗制剂常常只能提供有限的保护，而不是我们所期望的终生免疫。
其它疫苗途径通过将质粒直接注射到体内来表达抗原，即所谓的裸DNA或者DNA疫苗技术。这些方法包括在体内通过用质粒转染细胞而将携带抗原编码基因的DNA质粒特意导入。这些质粒表达能够引起免疫应答的抗原。由DNA疫苗所激发的免疫应答可能效率很低，其原因可能是由于摄取质粒的水平低或者抗原在细胞的表达水平低所致。DNA疫苗还存在因载体降解所致的抗原表达时期极短的特征。另外，大量生产DNA疫苗不但困难而且昂贵。
人们已经对可复制型活疫苗进行了修饰，用以表达乙型肝炎病毒(HBV)，人免疫缺陷病毒(HIV)，流感和疟疾抗原的基因。可是在一些情况下，对重组疫苗的免疫应答常常在性质和量度上受限。因此，例如，尽管使用牛痘流感重组体进行的外周免疫能够提供针对下呼吸道感染的良好保护作用，但是却无法在上呼吸道中诱导免疫。另一方面，当需要局部免疫而不是全身免疫的时候，例如在胃肠道中，用重组疫苗进行的外周免疫被证明是低效的。
用表达埃博拉病毒GP的重组体痘苗病毒所进行的免疫已经被用来尝试在豚鼠中进行局部保护。Gilligan，K.J.，等.，Vaccines，9787-92(1997)。用表达GP或者核壳蛋白(NP)的DNA构建体接种保护受到埃博拉病毒致命威胁的小鼠。Vanderzanden，L.，等.，Virology，246(1)134-44(1998)。然而，这些方法每种均有其局限性，从而使得它们不能成为用于人类的埃博拉病毒疫苗的理想选择。例如，痘苗病毒会很快杀死被载体感染的细胞。因此，疫苗抗原只能表达很短的时间。然而，该方法的主要局限性在于痘苗病毒的复制引起免疫系统主要反应于牛痘蛋白，而只有少部分免疫应答指向致病病毒的抗原。这种现象已被定义为“抗原稀释”。
先前试图弥补这些缺陷的方法，包括通过具有较强启动子如痘病毒来表达疫苗抗原，尚未获得显著的成功。
迄今为止，还没有疫苗能够给予针对HIV感染的有效保护。因此，研制疫苗的尝试因此到现在为止还很不成功。某些与HIV反应的抗体，特别是抗GP160/120抗体，在HIV感染的无症状期和症状期都呈现出高水平，这暗示与其说这些抗体起到了保护作用，还不如说它们实际上促进了病毒黏附并进入宿主细胞。更重要的是，目前的疫苗尚不能诱导针对感染细胞-新释放的病毒粒子的来源的有效的细胞反应。
发明概述本发明提供了遗传病毒疫苗。设计这些疫苗以模拟致病病毒的天然感染，而不会在将被免疫的宿主如人、家畜及其它哺乳动物体内引起与这些致病病毒天然相关的疾病。
这些疫苗是复制缺陷或者不能复制的重组体良性病毒。可以对这些良性病毒进行设计以使其表达来自广谱病原体如病毒、细菌和寄生虫的抗原。这样就可以用它们来治疗天然表达这些抗原的广谱病毒、细菌和寄生虫。被感染了这些良性病毒后，宿主细胞会表达这些致病病毒的抗原并且将这些抗原以其天然构象和途径提呈，就好像细胞被致病病毒感染了一样，而且还会在宿主体内诱导出强烈且持久的免疫应答。
在一个实施方案中，提供了一种用于在病毒感染的宿主中激发免疫应答的重组体良性病毒。该重组体病毒包括异源于所述良性病毒的、编码来自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，当宿主被该重组体病毒感染的时候，该病毒抗原在宿主中的表达激发针对所述致病病毒和表达所述病毒抗原的细胞的免疫应答；和，编码免疫刺激因子的、异源于所述良性病毒的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表达提高所述病毒抗原的免疫原性。该重组体病毒是不能复制的而且不会在宿主中引起与致病病毒相关的疾病。
在该实施方案的一个变体中，所述的重组体良性病毒可以是不能复制的病毒如腺病毒、腺相关病毒，SV40病毒，逆转录病毒，单纯疱疹病毒或者痘苗病毒。优选地，所述的良性病毒不具有良性病毒天然祖先的致病区域但是却保留了其传染性。
在一个优选的实施方案中，所述的良性病毒是不能复制的腺病毒，更优选为5型腺病毒。所述的异源抗原序列可以被放置在所述腺病毒的E1，E3或者E4区域中。所述的免疫刺激因子序列可以被放置在所述腺病毒的E4，E3或者E1区域中。
在所述优选实施方案的一个变体中，所述的异源抗原序列和免疫刺激因子序列被放置在腺病毒的E1，E3或者E4区域中，在此区域中，所述的异源抗原序列和免疫刺激因子序列通过内部核糖体进入位点或者通过剪接供体-受体机制从启动子处被双顺反子地表达。
所述病毒抗原或者免疫刺激因子的表达可以由与所述重组体病毒的天然祖先同源的启动子调控。或者，所述病毒抗原的表达可以由与所述重组体病毒的天然祖先异源的启动子调控。例如，与所述重组体病毒的天然祖先异源的启动子可以是真核启动子如胰岛素启动子，人巨细胞病毒(CMV)启动子及其早期启动子，猿猴病毒SV40启动子，劳斯肉瘤病毒LTR启动子/增强子，鸡胞质β-肌动蛋白启动子，和可诱导的启动子如可四环素诱导的启动子。
所述的致病病毒可以是任何在人或其它动物中引起致病效果或者疾病的致病病毒。因此，所述的重组体良性病毒可以被用作使宿主免于致病病毒感染的疫苗。
在一个变体中，所述的致病病毒可以是人免疫缺陷病毒(HIV)的各种菌株，如HIV-1和HIV-2。病毒抗原可以是HIV糖蛋白(或者表面抗原)如HIV GP120和GP41，或者衣壳蛋白(或者结构蛋白)如HIV P24蛋白。
在另一个变体中，所述的致病病毒可以是埃博拉病毒。病毒抗原可以是埃博拉病毒的糖蛋白或表面抗原如埃博拉病毒的GP1或者GP2蛋白。
在另一个变体中，所述的致病病毒可以是肝炎病毒如A，B，C，D或者E型肝炎病毒。例如，所述的病毒抗原可以是B型肝炎病毒的表面抗原或者核心蛋白例如小乙肝病毒表面抗原(SHBsAg)(也称澳大利亚抗原)，中乙肝病毒表面抗原(MHBsAg)和大乙肝病毒表面抗原(LHBsAg)。所述的病毒抗原可以是C型肝炎病毒的表面抗原或者核心蛋白例如NS3，NS4和NS5抗原。
在另一个变体中，所述的致病病毒可以是呼吸道合胞病毒(RSV)。例如，RSV病毒抗原可以是RSV的糖蛋白(G-蛋白)或融合蛋白(F-蛋白)，其序列可以从基因库中得到。
在另一个变体中，所述的致病病毒可以是单纯疱疹病毒(HSV)如HSV-1和HSV-2。例如，所述的HSV病毒抗原可以是来自HSV-2的糖蛋白D。
在另一个变体中，所述的病毒抗原可以是肿瘤抗原如乳腺癌细胞的Her2和淋巴瘤细胞上的CD20，病毒癌基因如人乳头瘤病毒的E6和E7，或者细胞癌基因如突变的ras。
应该注意到，其它的病毒相关蛋白或者抗原对于本领域的技术人员是很容易获得的。对致病病毒和与所述致病病毒相关的病毒抗原的选择不是本发明的限制因素。
所述的重组体病毒还表达免疫刺激因子，以模拟当病毒感染宿主细胞时的细胞因子释放反应，并进一步扩大对来自所述重组体病毒共表达的病毒抗原的免疫应答。所述的免疫刺激因子可以优选为细胞因子。细胞因子的实例包括但不限于白细胞介素-2，白细胞介素-8，白细胞介素-12，β-干扰素，λ-干扰素，γ-干扰素，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
所述的病毒抗原可以是全长的抗原病毒蛋白，或者是含有主要抗原、中和抗原或者致病病毒表位的抗原病毒蛋白的一部分。或者，所述的病毒抗原含有至少两个所述致病病毒毒株的糖蛋白的恒定区。
在一个变体中，所述的病毒抗原可以是突变自所述致病病毒糖蛋白的、被修饰的抗原，所述突变使得所述的病毒抗原成了无功能的病毒组分但却保留了其抗原性。所述对病毒抗原的修饰作用包括缺失糖蛋白的蛋白水解切割位点，以及对所述糖蛋白免疫抑制肽区域的复制和重排。
在另一个实施方案中，提供了一种用来在被病毒感染的宿主体内激发免疫应答的重组体腺病毒。所述的重组体病毒包括异源于腺病毒并编码来自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，当宿主被该重组体腺病毒感染的时候，该病毒抗原的表达激发针对所述病毒抗原的免疫应答。
在该实施方案的一个优选的变体中，所述的重组体病毒是不能复制的腺病毒。特别地，所述的致病病毒是HIV，包括HIV的各种类型(例如HIV-1和HIV-2)、毒株(例如HIV-1的毒株BH10和pNL4-3)、分离物(isolate)、一组分离物内的进化枝(例如M组HIV-1分离物的A，B，C，D，E，F，和G进化枝)。所述的病毒抗原可以是1)HIV糖蛋白(或者表面抗原)如HIV包膜蛋白Env，其或是全长的野生型(gp160)、被截短型(如gp120或者gp41)，或是被插入、缺失或取代的修饰型；2) HIV结构蛋白Gag，其或是全长的野生型、被修饰型，或是各种类型的蛋白酶加工的产物或片段(例如天然的、分泌的或者膜结合形式的HIV衣壳蛋白如HIVp24和p17)；和3)HIV调控蛋白如Tat，Vif，Nef，和Rev。
根据此变体，所述的HIV抗原是由选自由SEQ ID NOs14，16，20，21，22，23和24组成的组的多核苷酸所编码的HIV包膜蛋白。该多核苷酸还可以编码HIV调控蛋白Tat，Vif，Nef和Rev。
同样根据此变体，所述的HIV抗原是被修饰了的HIV包膜蛋白，该包膜蛋白包括多进化枝的可变环。优选地，所述多进化枝的可变环是来自各种进化枝如M组HIV-1分离物的进化枝A，B，C，D，E，F，和G的V3环。所述被修饰的、包括多进化枝可变环的HIV包膜蛋白可以含有来自不同HIV进化枝的两个或者多个V3环，优选由选自由SEQ ID NOs25，26，27，28，29，30，和31组成的组的多核苷酸所编码的V3环。更优选地，所述的被修饰的、包含多进化枝可变环的HIV包膜蛋白由选自由SEQ ID NOs32，52和54组成的组的多核苷酸所编码。
同样根据此变体，所述的HIV抗原是HIV结构蛋白。该HIV结构蛋白可以是由SEQ ID NO17编码的全长野生型Gag，或者是Gag的蛋白水解片段如p17/24，p17和p24。片段p17/24可以是天然形式且由SEQ ID NO34编码，分泌形式且由SEQ ID NO34编码，或者是膜结合形式且由SEQID NO36编码。片段p17可以是天然形式且由SEQ ID NO40编码，分泌形式且由SEQ ID NO41编码，或者是膜结合形式且由SEQ ID NO42编码。同样，p24可以是天然形式且由SEQ ID NO46编码，分泌形式且由SEQ ID NO47编码，或者是膜结合形式且由SEQ ID NO48编码。
所述的重组体病毒还可以包含编码HIV蛋白酶PI的多核苷酸如SEQ ID NO56，此序列的表达能促进对表达自相同重组体病毒或另一载体的Gag的蛋白水解加工。PI可以与Gag作为融合蛋白一起表达，或者从不同的启动子分开地表达，或者从Gag相同的启动子经由IRES或者剪接供体/受体机制表达。
所述的重组体病毒还可以包含这样的多核苷酸，其编码HIV蛋白酶PI及HIV逆转录酶RT的融合蛋白-PI-RT。PI可以与Gag作为融合蛋白一起表达，或者从不同的启动子分开地表达，或者从Gag相同的启动子经由IRES或者剪接供体/受体机制表达。
所述的重组体病毒还可以包括多核苷酸，其是HIV pol基因，且编码HIV酶蛋白HIV蛋白酶PI，逆转录酶RT和整合酶IN。Pol可以与Gag作为融合蛋白一起表达，或者从不同的启动子分开地表达，或者从Gag相同的启动子经由IRES或者剪接供体/受体机制表达。
任选地，所述的重组体病毒还可以包含异源于该重组体病毒的免疫刺激因子序列，该序列编码的免疫刺激因子在宿主中的表达能够增强病毒抗原的免疫原性。
本发明还提供了将多种抗原提呈给宿主的病毒疫苗，以进一步模拟天然致病病毒的天然感染并且在宿主中诱导针对各种毒株或类型致病病毒的强烈且持久的免疫应答。
在一个实施方案中，提供了这样一种重组体病毒，其被用作病毒疫苗以在被该病毒感染的宿主内诱导免疫应答。该重组体病毒包含异源于该重组体病毒的多个抗原序列，每个序列编码来自相同致病病毒、不同毒株致病病毒、或者不同种类致病病毒的病毒抗原，当宿主被该重组体病毒感染的时候，所述多个抗原序列的表达能够在宿主中激发针对所述病毒抗原和表达所述病毒抗原的细胞的免疫应答。所述的重组体病毒可以优选为不能复制的，而且其不能在宿主中引起与致病病毒天然相关的恶性肿瘤。
根据此实施方案，重组体病毒可以是任何病毒，优选为不能复制的腺病毒、腺相关病毒、SV40病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒或者痘苗病毒。所述的良性病毒也可以优选将良性病毒天然祖先的致病区缺失但却保留了其传染性。
同样根据此实施方案，所述的多个抗原序列可以是相同抗原序列的多个拷贝或者是相互不同的多个抗原序列。
在所述实施方案的一个变体中，所述的多个抗原序列中至少有两个是经由内部核糖体进入位点或者经由剪接供体受体机制从启动子双顺反子地表达的。
任选地，所述的多个抗原序列中至少有两个从一个启动子表达而产生融合蛋白。
同样根据此实施方案，所述的病毒基因组还包含至少一个异源于所述重组体病毒天然祖先的启动子，其控制所述多个抗原序列中至少两个序列的表达。异源于重组体病毒天然祖先的启动子的实例包括但不限于，胰岛素启动子，CMV启动子及其早期启动子，SV40启动子，逆转录病毒LTR启动子/增强子，鸡胞质β-肌动蛋白启动子，和可诱导的启动子如可四环素诱导的启动子。
同样根据此实施方案，所述的多个抗原序列可以是来自至少两个致病病毒毒株的抗原组合。
任选地，所述的多个抗原序列可以是来自至少两个不同致病病毒的抗原组合。例如，所述的多个抗原序列可以是来自HIV-1，HIV-2，单纯疱疹病毒1型，单纯疱疹病毒2型，埃博拉病毒，马尔堡病毒，虫媒病毒(一组由蚊子携带的病毒，可引起脑炎、黄热病和登革热)以及肝炎A，B，C，D，和E病毒。
在所述实施方案的一个变体中，所述的重组体病毒还可以含有一个或者多个免疫刺激因子序列，这些序列异源于良性病毒且编码免疫刺激因子，该刺激因子在宿主中的表达提高所述病毒抗原的免疫原性。例如，所述的免疫刺激因子可以是细胞因子。细胞因子的实例包括但不限于白细胞介素-2，白细胞介素-4，白细胞介素-12、β-干扰素，λ-干扰素，γ-干扰素，G-CSF，和GM-CSF。
根据此变体，所述的一个或者多个免疫刺激因子序列可以是相同免疫刺激因子序列的多个拷贝，或者是相互不同的多个免疫刺激因子序列。
任选地，免疫刺激因子序列中至少有两个可以是经由内部核糖体进入位点或者经由剪接供体受体机制从一个启动子多顺反子地表达的。或者，免疫刺激因子序列中至少有两个可以从一个启动子表达而产生融合蛋白。
本发明还提供了激发针对致病细菌的强烈且持久的免疫应答的遗传疫苗。在一个实施方案中，提供了一种被用作遗传细菌疫苗的重组体病毒以在被此重组体病毒感染的宿主中激发免疫应答。所述的重组体病毒包括异源于该重组体病毒的多个抗原序列，每个序列编码来自相同致病细菌的细菌抗原，当宿主被该重组体病毒感染的时候，所述多个细菌抗原序列的表达在宿主中激发针对所述细菌抗原和表达所述细菌抗原的细胞的免疫应答。所述的重组体病毒可优选为不能复制的，而且其不能在宿主中引起与致病细菌天然相关的恶性肿瘤。
所述的致病细菌可以是任何在宿主中引起致病效果或者疾病的致病细菌，例bacillus tuberculoses，炭疽杆菌(bacillus anthracis)(引起植物性炭疽)，和在动物中引起莱姆病的螺旋体布氏疏螺旋菌(spirochete Borreliaburgdorferi)。所述的多个抗原序列可以编码致病细菌的致死因子，保护性抗原，水肿因子，或其组合。
本发明还提供了激发针对致病性寄生虫的强烈且持久的免疫应答的针对寄生虫的疫苗。在一个实施方案中，提供了一种被用作寄生虫疫苗的重组体病毒以在被此重组体病毒感染的宿主的激发针对免疫应答。所述的重组体病毒包括异源于该良性病毒的多个抗原序列，每个序列编码来自致病性寄生虫的寄生虫抗原，当宿主被该重组体病毒感染的时候，所述多个寄生虫抗原序列的表达在宿主中激发针对所述寄生虫抗原和表达所述寄生虫抗原的细胞的免疫应答。所述的重组体病毒可优选为不能复制的，而且其不能在宿主中引起与致病性寄生虫天然相关的恶性肿瘤。
所述的致病性寄生虫可以是任何在宿主中引起致病效果或者疾病的致病性寄生虫，如疟疾和原生动物例如隐孢子虫属(Cryptosporidium)、艾美球虫属(Eimeria)、组织滴虫属(Histomonas)、白细胞虫属(Leucocyozoon)、疟原虫属(Plasmodium)、弓形虫属(Toxoplasma)、毛滴虫属(Trichomonas)、利什曼虫属(Leishmania)、锥虫属(Trypanosoma)、贾第鞭毛虫属(Giardia)、巴贝虫属(Babesia)和泰累尔梨浆虫属(Theileria)。所述的多个抗原序列可以编码致病性寄生虫的外壳蛋白、附着蛋白、或其组合。
本发明还提供了包含本发明病毒疫苗的药物组合物。该药物组合物可以包含任何上文描述的重组体病毒及药用载体或稀释剂。
所述的药物组合物还可以包含用来增强针对表达自所述重组体病毒的病毒抗原的免疫应答的佐剂。佐剂的实例包括但不限于结核菌苗(bacillus Calmette-Guerin)、内毒素脂多糖、钥孔血蓝蛋白、白细胞介素-2、GM-CSF以及环磷酰胺。
本发明还涉及试剂盒，这些试剂盒可以含有本发明的任何一种或者多种疫苗并结合以把所述疫苗递送至宿主的组合物，和/或将所述疫苗递送至宿主的装置如注射器。
本发明还提供了用上述的重组体病毒来增强宿主免疫力的方法。
在一个实施方案中，所述的方法包括将重组体病毒以有效剂量给予宿主以诱导免疫应答。所述的重组体病毒包含异源于所述重组体病毒的、编码来自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，当宿主被该重组体病毒感染的时候，该病毒抗原在宿主中的表达激发针对所述致病病毒和表达所述病毒抗原的细胞的免疫应答；和，编码免疫刺激因子的、异源于所述良性病毒的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表达提高所述病毒抗原的免疫原性。该重组体病毒可优选为不能复制的病毒而且不会在宿主中引起与致病病毒天然相关的恶性肿瘤。
可以经由任何药用给药途径将所述的重组体病毒给予宿主。可以经由肌肉内、气管内、皮下、鼻内、皮内、粘膜内、直肠、口和胃肠外(parental)给药。
在另一个实施方案中，提供了一种用多个抗原增强宿主对致病性病毒的免疫力的方法。所述的方法包括将重组体病毒以有效剂量给予宿主以诱导免疫应答。所述的重组体病毒包含异源于该良性病毒的多个抗原序列，每个序列编码来自致病病毒的病毒抗原，当宿主被该重组体病毒感染的时候，所述多个抗原序列的表达在宿主中激发针对所述病毒抗原和表达所述病毒抗原的细胞的免疫应答。该重组体病毒可以优选为不能复制的，而且不会在宿主中引起与致病病毒天然相关的恶性肿瘤。
任选地，所述的重组体病毒还可以含有一个或者多个异源于所述重组体病毒的免疫刺激因子序列，该序列所编码的免疫刺激因子在宿主内的表达提高所述病毒抗原的免疫原性。
在另一个实施方案中，提供了一种通过使用复合重组体病毒疫苗(或者病毒)来增强宿主对致病病毒的免疫力的方法。该复合重组体病毒可以在每个重组体病毒中携带不同的抗原。可以同时或者分步地将所述的复合重组体病毒给予宿主。
所述的方法包括将有效剂量的第一和第二重组体病毒给予宿主以诱导免疫应答。第一重组体病毒包括异源于第一重组体病毒的、编码来自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，当宿主被该重组体病毒感染的时候，该病毒抗原在宿主中的表达激发针对所述病毒抗原和表达所述病毒抗原的细胞的免疫应答。第二重组体病毒包含编码免疫刺激因子的、异源于所述重组体病毒的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表达能提高所述病毒抗原的免疫原性。所述的第一和第二重组体病毒优选是不能复制的而且不会在宿主中引起与致病病毒天然相关的恶性肿瘤。
根据此实施方案，第一和第二重组体病毒可以是任何良性病毒，例如不能复制的腺病毒、腺相关病毒(AAV)、SV40病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、Alpha病毒、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒和痘苗病毒。
任选地，第一和第二重组体病毒均可以是不能复制的腺病毒。同样任选地，第一和第二重组体病毒中的一个可以是重组体腺病毒，另一个可以是重组体AAV、SV40病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、Alpha病毒、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒和痘苗病毒。
在另一个实施方案中，提供了一种用来增强宿主对病原体免疫力的方法。该方法包括给予宿主重组体病毒和一个或多个免疫刺激因子。所述的重组体病毒可以是任何上述的重组体病毒。特别地，所述的重组体病毒含有一个或者多个异源于所述重组体病毒的、编码来自该病原体的一个或多个抗原的抗原序列。当宿主被所述重组体病毒感染的时候，所述抗原在宿主中的表达激发针对所述抗原和表达所述抗原的细胞的免疫应答。所述的重组体病毒优选为不能复制的而且不会在宿主中引起与所述病原体天然相关的恶性肿瘤。所述的病原体可以是致病病毒如HIV、肝炎病毒和埃博拉病毒，致病细菌或寄生虫。
根据此实施方案，所述的免疫刺激因子可以是任何这样的分子，其能够增强被所述重组体病毒感染的细胞所表达的抗原的免疫原性。优选地，所述的免疫刺激因子是细胞因子，其包括但不限于白细胞介素-2，白细胞介素-8，白细胞介素-12，β-干扰素，λ-干扰素，γ-干扰素，粒细胞集落刺激因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子及其组合。所述细胞因子可以以纯化蛋白的方式单独给予宿主，也可以将其与一种或者多种药用赋形剂一起配制。或者，可以将所述细胞因子以表达载体的方式给予宿主，该表达载体在转染或者导入宿主细胞时能够表达所述细胞因子的编码序列。
根据所述方法的任何上述实施方案，所述方法还可以包括再次给予宿主所述的重组体病毒以加强免疫应答。优选在首次接种后几周到几个月的时间内，使用重组体病毒进行这种加强接种。为了保证对感染持续高水平的保护作用或者保证对病原体感染引发疾病的有效治疗作用，定期如每几年进行一次再次给予宿主加强免疫可能是有益的。在加强免疫中所给予的重组体病毒可以与在初次免疫中所给予的重组体病毒相同或者不同。
同样根据所述方法的任何上述实施方案，所述方法还可以包括给予宿主编码这样的抗原的质粒载体，所述的抗原与所述重组体病毒所编码的抗原相同或者不同。该质粒载体优选为能够在转染宿主细胞时表达抗原的真核质粒表达载体。
同样根据所述方法的任何上述实施方案，所述方法还可以包括给予所述宿主第二重组体病毒以加强免疫应答和/或使宿主免疫系统对重组体病毒的中和作用减到最低。
任选地，所述的第二重组体病毒包含来自第二病原体的第二抗原序列，其不同于在初次免疫中给予的第一重组体病毒所包含的第一抗原序列。优选地，所述的第二抗原序列编码的抗原与由第一抗原序列编码的抗原类型相同，但来自相同病原体的不同菌株、血清型、或者亚型/进化枝。或者，与第一抗原相比，所述的第二抗原可以是不同类型的抗原，例如，第一抗原是表面蛋白，而第二抗原是相同或者不同病原体的核心蛋白。
同样根据所述方法的任何上述实施方案，所述方法还可以包括在给予宿主任何上述实施方案中的重组体病毒的之前、同时或之后，将病毒载体给予所述宿主，以将宿主的免疫系统对所述重组体病毒的中和作用降到最低。优选地，病毒载体的给予后于重组体病毒的给予。
所述的病毒载体可以是所述重组体病毒的天然后代。例如，病毒载体可以是5型野生型腺病毒(Ad5)，而重组体病毒是遗传修饰的Ad5。
任选地，病毒载体可以是重组体病毒不同血清型的野生型病毒或者是遗传修饰的病毒。例如，重组体病毒可以是遗传修饰的Ad5，而病毒载体是血清型不同于Ad5例如血清型1-4或者6-51的野生型或遗传修饰的腺病毒载体。应该注意，其它以后发现和/或分类的血清型也在本发明的范围内。
同样任选地，病毒载体可以是与所述重组体病毒不同的病毒。例如，所述的重组体病毒可以是遗传修饰的Ad5，而病毒载体可以是遗传修饰的AAV、SV40病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、Alpha病毒、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒或痘苗病毒。该病毒载体可以含有或可以不含有异源抗原序列。优选地，该病毒载体可以含有与所述重组体病毒携带的抗原序列相同或者不同的另一段抗原序列。
同样任选地，病毒载体可以是基于重组体病毒的天然祖先进行了修饰的嵌合载体。例如，如果重组体病毒的天然祖先是5型腺病毒，那么病毒载体可以是嵌合的5型腺病毒，其骨架的某些区域从5型变成了其它腺病毒血清型的相应区域。例如，可以用来自腺病毒血清型1-4和6-51骨架的相应区域来替代5型腺病毒骨架中的纤维结(fiber knot)、干(shaft)和/或五邻体基底(penton base)。
同样任选地，病毒载体还可以含有一个或者多个与重组体病毒中的那些相同或者不同的异源抗原序列和/或免疫刺激因子序列。
上述的方法可以被用于疾病的防治或者治疗。在治疗方法中，给药本发明的重组体病毒可以用于“预防性”或者“治疗性”目的。当用于预防的时候，可将所述的重组体病毒在任何症状呈现之前提供给患者。预防性给予所述的重组体病毒可用来预防或者改善任何后来的感染或疾病。当用于治疗的时候，可以在感染或者疾病症状呈现之时(或者之后)提供该重组体病毒。因此，可以在下列情况下提供本发明预计到将被暴露于引发疾病制剂以前，或者在感染或疾病开始和/或进展之后。
应该注意的是，本发明的创新方法也可被用于癌症疫苗的构建。例如，可以用编码肿瘤特异性抗原的序列替代上述重组体病毒实施方案及其使用方法中编码病毒抗原的抗原序列。在宿主中表达肿瘤特异性抗原应该激发特异的免疫应答，以防止患者患有癌症发展的风险增加(即预防性免疫)或者联合其它治疗来增进癌症治疗，预防首次手术后的疾病复发(抗转移接种)，或者作为扩大体内CTL数量的工具，从而提高其根除扩散肿瘤的效力(治疗已经被确立的疾病)。另外，本发明的方法可以在患者中激发免疫应答，其在被传递回肿瘤携带者之前在离体情况下被增强(即过继免疫治疗)。
同样根据本方法的任何上述实施方案，所述的方法还可以包括在给予重组体病毒以后，收集宿主的血清。所收集的血清应该含有针对所述重组体病毒编码的抗原的抗体。任选地，所述的方法还包括在给予重组体病毒以后，从宿主分离针对所述病原体的一种抗体或多种抗体。可以将所收获的血清或者被分离的抗体存储一段时期以另外应用。例如，可以将一个健康的志愿者作为宿主，在预期病原体感染后或处于病原体感染过程中，将从他/她那里收集的血清或抗体作为通过激发针对病原体的被动免疫而作为预防或治疗剂给回他/她自身或者给予另一个不同的人。任选地，所述的宿主可以是非人动物，而且从被重组体病毒免疫的动物那里所收获的血清或者所分离的抗体可以被用作预防或治疗剂来治疗预期病原体感染或处于病原体感染如爆发生物战的人或非人动物。
应该注意到，任何上述包含在重组体病毒中的抗原和免疫刺激因子的DNA序列都可以被改变和修饰而仍然保持所述突变体的相同功能。例如，可以用要被免疫的宿主例如人所优选的密码子来代替上述抗原的野生型密码子。所得到的突变体也应属于本发明的范围。
附图简述

图1A-1C图解了如何构建本发明遗传疫苗的实例。
图1A图解了穿梭载体pLAd的实例。携带多个抗原基因如抗原1和抗原2的抗原可以在SD和SA位点，经由剪接供体-受体机制从CMVie启动子双顺反子地表达。
图1B图解了穿梭载体pRAd的实例。携带多个细胞因子基因如IL-2，INF，和IL-基因的细胞因子可以经由内部核糖体进入位点IRES和在SD和SA位点的剪接供体-受体机制，从CMVie启动子双顺反子地表达。
图1C图解了通过连接腺病毒骨架和衍生于穿梭载体pLAd的片段而构建的遗传疫苗实例。抗原包含多个抗原基因和衍生于穿梭载体pRAd的一段片段。细胞因子包含多个细胞因子基因。
图2图解了野生型GP基因，其编码两种形式的糖蛋白(sGP和GP)，包含产生未编辑的和编辑的mRNA的RNA编辑信号。sGP合成自未编辑的mRNA，GP合成自编辑的mRNA(在7个尿苷中的一个具有插入)。图2还描述了对RNA进行的修饰作用，其用来防止sGP合成。RNA编辑位点被从UUU UUU U修饰成了UUC UUC UU。这一修饰作用移除了编辑信号并产生只编码GP的mRNA。
图3图解了对位于GP2中的免疫抑制肽(IS)的修饰作用。图3A显示了野生型GP。图3B显示了IS肽被删除了10个氨基酸的GP。图3C显示了被分开的、翻转的和重复的IS肽。缩写词FP，融合肽；IS，免疫抑制肽；TM，跨膜结构域。
图4A和4B图解了用来产生作为针对埃博拉病毒的遗传疫苗的重组体腺病毒载体的过程。
图4A图解了携带作为抗原的埃博拉病毒GP基因的穿梭载体pLAd/EBO-GP，和携带IL-2和IL-4基因的穿梭载体pRAdIL2，4。
图4B图解了通过连接腺病毒骨架和衍生于穿梭载体pLAd/EBO-GP的一段片段的重组体腺病毒载体的构建，其包含GP基因和衍生于穿梭载体pRAdIL2，4并包含IL-2和IL-4基因的片段。
图5图解了作为本发明遗传疫苗的一个实例的复合腺病毒载体。埃博拉病毒GP基因由E1区域的CMVie启动子表达。GP基因后面的INF-γ和GM-CSF由两个IRES序列表达。这种构型允许从一个单独的mRNA表达三种蛋白。IL-2和IL-4的表达受控于作为双顺反子盒的第二CMVie启动子，其后的第二双顺反子盒由SV40早期启动子表达出E4区域中IL-12的两个亚基。
图6显示了在一组小鼠中针对HIV抗原的抗体的相对滴度。
图7显示了在另一组小鼠中针对HIV抗原的抗体的相对滴度。
图8A-C显示了作为对靶细胞刺激的响应，由活化的脾细胞分泌的INF-γ，所述的脾细胞收获自用腺病毒载体接种的小鼠。
图9显示了作为对靶细胞刺激的响应，由活化的脾细胞分泌的粒酶A，所述的脾细胞收获自用腺病毒载体接种的小鼠。
图10A显示了在一组小鼠中针对HBV表面抗原的抗体的相对滴度。
图10B显示了在另一组小鼠中针对HBV表面抗原的抗体的相对滴度。
图11A显示了在一组小鼠中针对HBV核心抗原的抗体的相对滴度。
图11B显示了在另一组小鼠中针对HBV核心抗原的抗体的相对滴度。
图12A显示了在小鼠中用Ad-3C/EmΔCΔT300-G免疫10周后针对HIVGag的抗体相对滴度。
图12B显示了在小鼠中用Ad-3C/EmΔCΔT300-G免疫14周后/加强免疫3周后针对HIVGag的抗体相对滴度。
图13A显示了在小鼠中用Ad-3C/EmΔCΔT99-G免疫10周后指向HIVGag的抗体相对滴度。
图13B显示了在小鼠中用Ad-3C/EmΔCΔT99-G免疫14周后/加强免疫3周后针对HIVGag的抗体相对滴度。
图14A显示了对系列1小鼠的粒酶A的测定结果，测定时间为Ad.3C.env.gag接种后4，6，8周和二次接种后12/1，13/2，14/3(初次免疫/加强免疫)周。
图14B显示了对系列2小鼠的粒酶A的测定结果，测定时间为Ad.3C.env.gag接种后2，4，6，8周。
图15A显示了系列1中4只小鼠的ELISPOT结果，测定时间为Ad.3C.env.gag接种后13/2(初次免疫/加强免疫)周。
图15B显示了系列1中4只小鼠的ELISPOT结果，测定时间为Ad.3C.env.rev.gag接种后13/2(初次免疫/加强免疫)周。
图16A图解了穿梭载体pLAd-E.T.R。
图16B图解了穿梭载体pRAd-ORF6-IL2。
图17A图解了穿梭载体pRAd-ORF6-cmv-EmΔCΔT300-G。
图17B图解了穿梭载体pLAd-3C。
图18图解了穿梭载体pRAd-EmΔCΔT99.T.R-G。
图19A图解了穿梭载体pLAd-EmΔV1，2ΔCΔT.T.R-IL2。
图19B图解了穿梭载体pRAd-ORF6-G.IL2。
图20图解了穿梭载体pLAd-EmΔC.T.R.N。
图21图解了穿梭载体pLAd-EmΔC.N。
图22图解了穿梭载体pLAd-EmΔCΔT300.T。
图23A图解了穿梭载体pLAd-EmΔC。
图23B图解了穿梭载体pRAd-ORF6-EmΔC。
图24图解了用PCR构建多进化枝插入物的过程。
图25图解了穿梭载体pLAd-Em.V3。
图26图解了穿梭载体pLAd-Em.2xV3。
图27A图解了穿梭载体pRAd-ORF6-p17/p24。
图27B图解了穿梭载体pRAd-ORF6-p17/p24sec。
图27C图解了穿梭载体pRAd-ORF6-p17/p24MB。
图28A图解了穿梭载体pRAd-ORF6-p17。
图28B图解了穿梭载体pRAd-ORF6-p17sec。
图28C图解了穿梭载体pRAd-ORF6-p17MB。
图29A图解了穿梭载体pRAd-ORF6-p24。
图29B图解了穿梭载体pRAd-ORF6-p24sec。
图29C图解了穿梭载体pRAd-ORF6-p24MB。
图30A-B图解了Ad-Em.2xV3m/p17/24MB的构建过程。
图31A-B图解了Ad-Em.2xV3m/p17MB的构建过程。
图32A-B图解了Ad-Em.2xV3m/p24MB的构建过程。
图33图解了穿梭载体pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T。
图34图解了穿梭载体pLAd-EmΔCΔT99.2xV3m.T.R。
图35图解了穿梭载体pRAd-ORF6-G.PI。
图36图解了穿梭载体pRAd-ORF6-G-PI。
图37图解了克隆载体SD/SA1.2.3。
图38显示了编码来自HIV-1毒株BH10的Env/Tat/Rev的DNA序列。
图39显示了编码突变的IL-2(IL-2ΔX)的DNA序列。
图40显示了编码被修饰的Env(EmΔCΔT(BH10)的DNA序列。
图41A显示了编码全长HIV Gag的DNA序列。
图41B显示了全长HIV Gag的氨基酸序列。
图42显示了编码Env，以及全长Tat和Rev的DNA序列。
图43显示了编码EmΔV1，2ΔCΔT.T.R的DNA序列。
图44显示了编码EmΔC.T.R.N的DNA序列。
图45显示了编码EmΔC.N的DNA序列。
图46显示了编码EmΔCΔT300T的DNA序列。
图47显示了编码Em/Em的DNA序列。
图48显示了B，A，C，D，E，F，和G进化枝的V3环的DNA序列。
图49A显示了这样的DNA序列，其编码包含多进化枝V3环的被修饰的Env。
图49B显示了这样的氨基酸序列，其编码包含多进化枝V3环的被修饰的Env。
图50A显示了分别编码天然形式、分泌形式和膜结合形式p17/p24的DNA序列。
图50B分别显示了天然形式、分泌形式和膜结合形式p17/p24的氨基酸序列。
图51A显示了分别编码天然形式、分泌形式和膜结合形式p17的DNA序列。
图51B分别显示了天然形式、分泌形式和膜结合形式p17的氨基酸序列。
图52A显示了分别编码天然形式、分泌形式和膜结合形式p24的DNA序列。
图52B分别显示了天然形式、分泌形式和膜结合形式p24的氨基酸序列。
图53A显示了这样的DNA序列，其编码包含多进化枝V3环的被修饰的Env，和Tat。
图53B显示了包括多进化枝V3环的被修饰的Env，和Tat的氨基酸序列。
图54A显示了这样的DNA序列，其编码包含多进化枝V3环的被修饰的Env，Tat和Rev。
图54B显示了包括多进化枝V3环的被修饰的Env，Tat和Rev的氨基酸序列。
图55A显示了编码HIV蛋白酶PI的DNA序列。
图55B显示了HIV蛋白酶PI的氨基酸序列。
图56A显示了编码HIV Gag-PI的DNA序列。
图56B显示了HIV Gag-PI的氨基酸序列。
图57显示了用来从多HIV进化枝克隆V3环的PCR引物。
图58图解了穿梭载体pRAd-ORF6-Gag/PI-RT。
图59图解了穿梭载体pRAd-ORF6-Gag-PI-RT。
图60图解了穿梭载体pRAd-ORF6-Gag/Pol。
图61图解了穿梭载体pRAd-ORF6-Gag-Pol。
图62图解了右穿梭载体pR-Ad.5/35-6m。
图63显示了嵌合载体的各种实施方案，所述的嵌合载体的Ad5纤维区个体结构域被Ad35纤维区的相应结构域所取代。
发明详述本发明提供了遗传疫苗，包含所述疫苗的药物组合物，和使宿主获得针对广谱致病病毒、细菌和寄生虫感染的免疫方法。所述的遗传疫苗是复制缺陷的重组体良性病毒而且不能在要被免疫的宿主体内引起恶性肿瘤。使用本发明遗传疫苗所进行接种模拟了天然病毒感染，这是因为被所述遗传疫苗感染的细胞所表达的抗原以其天然构型被提呈给宿主免疫系统，这样，与传统的、使用变性蛋白或病毒作为疫苗的“外-内”方法相比，本发明所使用的是“内-外”机制。所述的重组体病毒能够表达复合致病抗原，从而模拟了天然病原体感染。特别是，可以用重组体病毒表达野生型或突变型的复合致病抗原如HIV包膜蛋白Env和结构蛋白Gag的组合，这样不但可以激发体液免疫应答(即，从B细胞，辅助性T细胞和抑制性T细胞来产生抗体)而且可以通过产生特异针对这些抗原的细胞毒T淋巴细胞(CTL)来产生细胞应答。另外，可以对被天然表达为细胞内蛋白的致病抗原进行修饰而使其成为可分泌形式抗原从而使其结合到细胞表面，这样就能更好地将抗原呈递给机体的免疫系统。此外，被所述遗传疫苗感染的细胞还可以释放出高水平的细胞因子，从而进一步模拟细胞在病毒感染的压力下所呈现的天然反应而不会引起对细胞的致病效应。由于接受到这个“致病病毒感染”的错误信息，宿主的免疫系统就会对被感染细胞呈递的抗原发动强烈的免疫防御。因此，在某种意义上，本发明的遗传疫苗的作用就好像“披着狼皮的羊”，其呈递病毒抗原以诱导强烈的免疫应答却不引起病原体本应对宿主引起的有害作用。本发明的这些重组体病毒不但可以用作疫苗来预防病原体感染，而且可以用作治疗制剂来治疗与病原体感染相关的疾病。
在一个实施方案中，提供了一种用来在被病毒感染的宿主体内激发免疫应答的重组体病毒。该重组体病毒包含异源于所述重组体病毒的、编码来自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，当宿主被该重组体病毒感染的时候，该病毒抗原在宿主中的表达激发针对所述病毒抗原和表达所述病毒抗原的细胞的免疫应答；和，编码免疫刺激因子的、异源于所述重组体病毒的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表达能提高所述病毒抗原的免疫原性。该重组体病毒是不能复制的而且不会在宿主中引起与致病病毒天然相关的恶性肿瘤。
在另一个实施方案中，提供了一种用来在被病毒感染的宿主体内激发针对多个抗原的免疫应答的作为病毒疫苗的重组体病毒。该重组体病毒包含异源于该良性病毒的多个抗原序列，每个序列编码来自一个或多个致病病毒的不同病毒抗原，当宿主被该重组体病毒感染的时候，所述多个抗原序列的表达能够在宿主中激发针对所述病毒抗原和表达所述病毒抗原的细胞的免疫应答。该重组体病毒可以优选为不能复制的而且不会在宿主中引起与致病病毒天然相关的恶性肿瘤。
本发明的疫苗可以用于免疫宿主抗广谱和不同毒株致病病毒或致病细菌，所述病毒如HIV-1，HIV-2，1型单纯疱疹病毒，2型单纯疱疹病毒，埃博拉病毒，埃博拉病毒，以及肝炎A，B，C，D，和E病毒；所述致病细菌如bacillus tumerculoses和炭疽杆菌。
本发明的重组体疫苗是这样的重组体病毒，其含有编码病毒基因组中一个或多个病毒抗原的核酸序列。当宿主被该重组体疫苗免疫的时候，即被该重组体病毒感染的时候，病毒在宿主细胞中的感染引起该病毒抗原表达在被感染细胞的表面。由于病毒抗原的表达受强启动子的驱动，所以表达可以维持在高水平。当宿主的免疫系统识别到细胞表面出现大量病毒抗原的时候，它就会对病毒抗原发动强烈的免疫防御，从而获得针对衍生病毒抗原的致病病毒的持久免疫力。
与分离的那些由细菌、酵母或者昆虫细胞表达的蛋白并将其作为疫苗进行免疫相比，本发明重组体病毒表达的病毒抗原能够更好地在其结构和功能上模拟天然病毒抗原。分离的蛋白疫苗不能采用天然病毒抗原的天然构型而且在细菌、酵母或昆虫细胞中无法被正确地糖基化。当将这样的分离的蛋白疫苗注射到宿主中时，抗原是从宿主细胞的外面被呈递的。这种传统的“外-内”方法通常不会产生强烈的、持续时间长的免疫应答，这可能是由于疫苗的抗原性被改变并且蛋白疫苗被免疫清除细胞很快清除的结果。
相反，本发明的遗传疫苗，即重组体病毒，通过“内-外”机制呈递病毒抗原。病毒抗原的表达是在宿主细胞被重组体病毒感染之后。这更好地模拟了由致病病毒进行的病毒抗原的天然产生和提呈。
通过使用不能复制的病毒，该病毒除了最先被感染的细胞之外不能将感染扩散开来，本发明显著降低了由使用可复制的活病毒可能产生的副作用的危险。例如，基于活痘苗病毒的疫苗就能够在宿主细胞中复制，这样就会给宿主细胞造成高水平的压力并最终导致细胞死亡。
另外，与将衰减或者失活的病毒作为疫苗的方法相比，本发明遗传疫苗的制造过程要安全得多。给大量的人群或者动物群体进行接种需要大量的疫苗。对于剧毒病毒如埃博拉病毒和HIV，从活病毒来大规模生产衰减或失活的病毒往往会对环境和操作活病毒的人员造成很大危险。
本发明的重组体病毒可以被用来从相同的病毒载体同时表达多个抗原序列。这样，所述的重组体病毒可以编码来自致病病毒相同毒株的多个抗原，来自相同致病病毒不同毒株的多个抗原，或者编码来自不同种类病毒、细菌或寄生虫的不同抗原。这样可以使本发明的疫苗用于免疫广谱病毒和其它感染剂。由于在重组体病毒基因组中，这些复合抗原序列被重排，所以实际上消除了这些病毒序列潜在的重新组合而产生致病病毒的危险。
本发明的遗传疫苗还优选表达大量的免疫刺激因子如细胞因子。在病毒感染的天然过程中，病毒感染的细胞将病毒抗原呈递在它们表面上MHC-I受体的附近，而呈现MHC-II受体相关抗原的专职抗原提呈细胞将病毒颗粒消化。作为对病毒感染的应答，产生大量细胞因子和干扰素，引起强烈的、针对病毒抗原的体液和细胞应答。同时，大量记忆细胞被保留以击退任何新的感染。在使用分离的蛋白疫苗接种情况下，蛋白会被免疫清除细胞很快清除。在此过程中，只发生MHC-II抗原呈递，没有细胞因子释放应答或者该应答被大大降低。结果，只产生很少的细胞应答和很少的“记忆”细胞。
相反，通过将抗原呈递在被感染的表面并产生大量免疫调节细胞因子，来自本发明的重组体病毒的病毒抗原和细胞因子的共表达有效地模拟了宿主细胞对病毒感染的天然应答。由于高水平的、表达自被遗传疫苗感染的宿主细胞的细胞因，被“哄骗”的宿主免疫系统对疫苗发动了强烈的应答，从而产生持续时间更长的免疫力。
另外，尽管使用所述遗传疫苗的接种模拟了致病病毒的天然病毒感染，但是疫苗本身是不具有致病病毒有害效应的良性病毒。例如，致病病毒如HIV、流感病毒和埃博拉病毒的感染对宿主具有很强的免疫抑制作用，这可能是由于病毒糖蛋白的免疫抑制功能所致。依照本发明，由遗传疫苗所携带的病毒抗原序列优选被删除了其致病区或免疫抑制区。在这种意义上，本发明的遗传疫苗就象是“披着狼皮的羊”，其呈递病毒抗原以诱导强烈的免疫应答而不会对宿主引起有害影响。
1.本发明的遗传疫苗本发明涉及疫苗，其模拟天然致病病毒的特征但并不激发免疫抑制和致病性，因此引起宿主发动有效的防御却不会带来任何实际的感染危险。这些遗传疫苗是不能复制或者复制缺陷的病毒，编码一个或者多个病毒抗原的一个或者多个DNA序列被插入到此病毒基因组中对其传染力非必需的区域中。该重组体病毒表达病毒抗原并在体内激发细胞介导的、针对所述抗原和表达所述抗原的细胞的免疫应答。
在一个实施方案中，提供了用来在被所述病毒感染的宿主体内激发免疫应答的重组体病毒。所述的重组体病毒包括异源于所述重组体病毒的、编码来自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，当宿主被该重组体病毒感染的时候，该病毒抗原在宿主中的表达激发针对所述致病病毒和表达所述病毒抗原的细胞的免疫应答；和，编码免疫刺激因子的、异源于所述重组体病毒的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表达能提高所述病毒抗原的免疫原性。该重组体病毒是不能复制的而且不会在宿主中引起与致病病毒天然相关的恶性肿瘤。
任何病毒都可以用来构建所述的重组体病毒，只要使其原始祖先成为无法复制的病毒。例如，通过将病毒抗原插入到对重组体病毒传染力非必需的区域，不能复制的腺病毒、腺相关病毒、SV40病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒和痘苗病毒可以被用来产生所述的重组体病毒。因此，优选的重组体病毒不具有所述良性病毒天然祖先的致病区域但却保留了其对宿主的传染力。
在一个优选实施方案中，所述的重组体病毒是不能复制度腺病毒。
本发明的重组体腺病毒可以指导高水平的抗原表达，这样就提供了对免疫系统的强大的刺激作用。被腺病毒感染的细胞所表达的抗原，在被感染的细胞中以模拟病原体感染细胞的方式被加工并呈递。据信这一阶段对于诱导对被感染细胞的细胞免疫方面非常重要，而使用传统接种方法的时候这一阶段却完全没有。另外，所述的重组体腺病毒可以感染树突细胞，其是非常有效的抗原提呈细胞。此外，所述的重组体腺病毒还能携带编码增强免疫的细胞因子的基因以进一步增强免疫力。而且，所述的重组体腺病毒可以天然感染人的气道和内脏上皮细胞，因此该疫苗可以通过鼻喷和口咽方式给予。另外，由于本发明的重组体腺病毒是不能复制的，所以它应该是安全的。
可以将所述的异源抗原序列放置在腺病毒的E1，E3，或者E4区域。可以将所述的免疫刺激因子序列放置在腺病毒的E1，E3，或者E4区域。
在所述优选实施方案的一个变体中，所述的异源抗原序列和免疫刺激因子序列被放置在腺病毒的E1，E3或者E4区域中，在此区域中，所述的异源抗原序列和免疫刺激因子序列通过内部核糖体进入位点或者通过剪接供体-受体机制从启动子处被双顺反子地表达。
所述病毒抗原或者免疫刺激因子的表达可以由与所述重组体病毒的天然祖先同源的启动子调控。或者，所述病毒抗原的表达可以由与所述重组体病毒的天然祖先异源的启动子调控。例如，所述的与重组体病毒的天然祖先异源的启动子可以是真核启动子如胰岛素启动子，人巨细胞病毒(CMV)启动子及其早期启动子，猿猴病毒SV40启动子，劳斯肉瘤病毒LTR启动子/增强子，鸡胞质β-肌动蛋白启动子，和可诱导的启动子如可四环素诱导的启动子。
所述的致病病毒可以是任何在宿主如人、家畜或其它哺乳动物中引起致病效果或者疾病的致病病毒。因此，所述的重组体病毒可以被用作使宿主免于致病病毒感染的疫苗。
在一个变体中，所述的致病病毒可以是人免疫缺陷病毒(HIV)的各种毒株，如HIV-1和HIV-2。所述的病毒抗原可以是HIV糖蛋白(或者表面抗原)如HIV GP120和GP41，衣壳蛋白(或者结构蛋白)如HIV P24蛋白或者其它HIV调控蛋白如Tat、Vif和Ref蛋白。
在另一个变体中，所述的致病病毒可以是流感病毒。病毒抗原可以是流感病毒糖蛋白如流感病毒HA1，HA2和NA。
在另一个变体中，所述的致病病毒可以是埃博拉病毒。病毒抗原可以是埃博拉糖蛋白或者表面抗原如埃博拉病毒的GP1和GP2蛋白。
在另一个变体中，所述的致病病毒可以是肝炎病毒如肝炎A，B，C，D或者E病毒。病毒抗原可以是肝炎A，B，C，D或者E病毒的表面抗原或者核心蛋白。例如，所述的病毒抗原可以是乙肝病毒的表面抗原或者核心蛋白例如小乙肝病毒表面抗原(SHBsAg)(也称澳大利亚抗原)，中乙肝病毒表面抗原(MHBsAg)和大乙肝病毒表面抗原(LHBsAg)。所述的病毒抗原也可以是丙肝病毒的表面抗原或者核心蛋白例如NS3，NS4和NS5抗原。
在另一个变体中，所述的致病病毒可以是呼吸道合胞病毒(RSV)。例如，该RSV病毒抗原可以是RSV的糖蛋白(G-蛋白)或者融合蛋白(F-蛋白)，其序列可以在基因库中得到。
在另一个变体中，所述的致病病毒可以是单纯疱疹病毒(HSV)如HSV-1和HSV-2。例如，所述的HSV病毒抗原可以是来自HSV-2的糖蛋白D。
在另一个变体中，所述的病毒抗原可以是肿瘤抗原或病毒癌基因如人乳头瘤病毒的E6和E7，或者细胞癌基因如突变的ras或者p53。
应该注意的是，其它的病毒相关蛋白或者抗原对于本领域的技术人员是很容易获得的。对致病病毒和病毒抗原的选择并不是本发明的限制因素。
所述的病毒抗原可以是全长的抗原病毒蛋白，或者是含有主要抗原、中和抗原或者致病病毒表位的所述抗原病毒蛋白的一部分。或者，所述的病毒抗原含有至少两个相同致病病毒毒株间的保守的糖蛋白区域。
在一个变体中，所述的病毒抗原可以是突变自所述致病病毒糖蛋白的被修饰的抗原，所述突变使得所述的病毒抗原成了无功能的病毒组分但却保留了其抗原性。所述对病毒抗原的修饰作用包括删除了所述糖蛋白的蛋白水解切割位点，以及对所述糖蛋白免疫抑制肽区域的复制和重排。
所述的重组体病毒还表达免疫刺激因子，以模拟当病毒感染宿主细胞时的释放细胞因子反应，并进一步扩大对共表达自重组体病毒的病毒抗原的免疫应答。所述的免疫刺激因子可以优选为细胞因子。细胞因子的实例包括但不限于白细胞介素-2，白细胞介素-4，白细胞介素-12，β-干扰素，λ-干扰素，γ-干扰素，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在另一个实施方案中，提供了用来在被所述病毒感染的宿主中激发免疫应答的重组体病毒。所述的重组体病毒包括异源于所述重组体病毒并编码来自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，当宿主被该重组体病毒感染的时候，该病毒抗原在宿主中的表达激发针对所述病毒抗原和表达所述病毒抗原的细胞的免疫应答。
根据此实施方案，所述的重组体病毒优选为不能复制的腺相关病毒、SV40病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒或者痘苗病毒。所述的良性病毒优选删除了良性病毒天然祖先的致病区域，但却保留了其对宿主的感染力。
任选地，所述的重组体病毒包含异源于该重组体病毒的免疫刺激因子序列，该序列编码的免疫刺激因子在宿主中的表达能够增强病毒抗原的免疫原性。
本发明还提供了激发针对致病细菌的强烈且持久的免疫应答的遗传疫苗。在一个实施方案中，提供了一种被用作遗传细菌疫苗的重组体病毒以在被此重组体病毒感染的宿主中激发免疫应答。所述的重组体病毒的病毒基因组包括异源于该重组体病毒的多个抗原序列，每个序列编码来自致病细菌的细菌抗原，当宿主被该重组体病毒感染的时候，所述多个细菌抗原序列的表达在宿主中激发针对所述细菌抗原和表达所述细菌抗原的细胞的免疫应答。所述的重组体病毒可优选为不能复制的而且不能在宿主中引起与致病细菌天然相关的恶性肿瘤。
所述的致病细菌可以是任何在宿主中引起致病效果或者疾病的致病细菌，例如bacillus tuberculoses，炭疽杆菌，和在动物中引起莱姆病的螺旋体布氏疏螺旋菌。所述的多个抗原序列可以编码致病细菌的致死因子，保护性抗原，水肿因子，或其组合。
本发明还提供了激发针对致病性寄生虫的强烈且持久的免疫应答的寄生虫疫苗。在一个实施方案中，提供了一种被用作寄生虫疫苗的重组体病毒以在被此良性病毒感染的宿主中激发免疫应答。所述的重组体病毒包括异源于该重组体病毒的多个抗原序列，每个序列编码来自致病寄生虫的寄生虫抗原，当宿主被该重组体病毒感染的时候，所述多个寄生虫抗原序列的表达能够在宿主中激发针对所述寄生虫抗原和表达所述寄生虫抗原的细胞的免疫应答。所述的重组体病毒可优选为不能复制的，而且不能在宿主中引起与致病寄生虫天然相关的恶性肿瘤。
所述的致病寄生虫可以是任何在宿主中引起致病效果或者疾病的致病寄生虫，如疟疾和原生动物例如隐孢子虫属、艾美球虫属、组织滴虫属、白细胞虫属、疟原虫属、弓形虫属、毛滴虫属、利什曼虫属、锥虫属、贾第鞭毛虫属、巴贝虫属和泰累尔梨浆虫属。所述的多个抗原序列可以编码致病寄生虫的外壳蛋白、附着蛋白、或其组合。
本发明还提供了将多种抗原提呈给宿主的病毒疫苗，以进一步模拟天然致病病毒的天然感染并且在宿主中诱导针对各种毒株或类型致病病毒的强烈且持久的免疫应答。
在一个实施方案中，提供了一种重组体病毒，其被作为病毒疫苗来在被该病毒感染的细胞内激发免疫应答。该重组体病毒包含异源于该重组体病毒的多个抗原序列，每个序列编码来自致病病毒的病毒抗原，当宿主被该重组体病毒感染的时候，所述多个抗原序列的表达在宿主中激发针对所述病毒抗原和表达所述病毒抗原的细胞的免疫应答。所述的重组体病毒可以优选为不能复制的而且不能在宿主中引起与致病病毒天然相关的恶性肿瘤。
根据此实施方案，重组体病毒可以是任何病毒，优选为不能复制的腺病毒、腺相关病毒、SV40病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒或者痘苗病毒。重组体病毒也可以优选为具有删除了良性病毒天然祖先的致病区但却保留了其对宿主的传染性。
同样根据此实施方案，所述的多个抗原序列可以是相同抗原序列的多个拷贝或者是相互不同的多个抗原序列。
在所述实施方案的一个变体中，所述的多个抗原序列中至少有两个是经由内部核糖体进入位点或者经由剪接供体-受体机制从一个启动子双顺反子地表达的。
或者，所述的多个抗原序列中至少有两个从一个启动子表达而产生融合蛋白。
同样根据此实施方案，所述的重组体病毒还包含至少一个异源于所述重组体病毒天然祖先的启动子，其控制所述多个抗原序列中至少两个序列的表达。异源于重组体病毒天然祖先的启动子包括但不限于，胰岛素启动子，CMV启动子及其早期启动子，SV40启动子，劳斯肉瘤病毒LTR启动子/增强子，鸡胞质β-肌动蛋白启动子，和可诱导的启动子如可四环素诱导的启动子。
同样根据此实施方案，所述的多个抗原序列可以是来自至少两个致病病毒毒株的抗原组合。
任选地，所述的多个抗原序列可以是来自至少两个不同致病病毒的抗原组合。例如，所述的多个抗原序列可以是来自HIV-1，HIV-2，1型单纯疱疹病毒，2型单纯疱疹病毒，流感病毒，马尔堡病毒，埃博拉病毒，虫媒病毒(一组由蚊子携带的病毒，可引起脑炎、黄热病和登革热)以及肝炎A，B，C，D，和E病毒。
在所述实施方案的一个变体中，所述重组体病毒的病毒基因组还可以含有一个或者多个免疫刺激因子序列，这些序列异源于重组体病毒且编码免疫刺激因子，该刺激因子在宿主中的表达可提高所述病毒抗原的免疫原性。例如，所述的免疫刺激因子可以是细胞因子。细胞因子的实例包括但不限于白细胞介素-2，白细胞介素-4，白细胞介素-12、β-干扰素，λ-干扰素，γ-干扰素，G-CSF，和GM-CSF。
根据此变体，所述的一个或者多个免疫刺激因子序列可以是相同免疫刺激因子序列的多个拷贝，或者是相互不同的多个免疫刺激因子序列。
任选地，所述的多个免疫刺激因子序列中至少有两个可以是经由内部核糖体进入位点或者经由剪接供体-受体机制从一个启动子双顺反子地表达的。或者，所述的免疫刺激因子序列中至少有两个可以从一个启动子表达而产生融合蛋白。
编码病毒抗原的DNA序列被插入到复制缺陷病毒的任何非必需区域中。例如，当使用腺病毒时，优选将所述的核酸序列插入到腺病毒的E1，E3，和/或E4区域，最优选插入到E4区域。由于E1，E3和E4区域均可被用作插入位点，所以本发明还考虑将多于一个的编码序列分别插入。
在本发明的重组体病毒载体疫苗中，所选择的病毒抗原的核苷酸序列被可操作连接到调控元件上，此调控元件指导其在受试者体内的转录或者表达。可以使用同源或者异源的病毒调控序列。有效的异源调控序列通常包括那些衍生于编码宿主(hostian)或者病毒基因的序列。其实例包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV即早启动子区(CMVie)，SV40早期启动子，小鼠乳腺瘤病毒LTR启动子，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)，单纯疱疹病毒启动子，和逆转录病毒LTR启动子。优选地，可以将任何强的组成型启动子与病毒抗原或者细胞因子可操作连接。更优选地，病毒启动子是CMV即早启动子(CMVie)。
图1A-1C描述了用来将重组体腺病毒构建成本发明遗传疫苗的方法。通过使用携带多个抗原基因和多个细胞因子基因的穿梭质粒或载体来构建本发明的重组体腺病毒载体。
图1A图解了含有两个抗原基因抗原1和抗原2的穿梭质粒(pLAd.抗原)。穿梭质粒pLAd.抗原含有包含左侧长末端重复L-TR的腺病毒基因组左侧末端，和腺病毒包装信号(ψ)。腺病毒的E1区被多基因表达盒和CMVie启动子所取代。
编码抗原1和抗原2的基因通过在SD和SA位点的剪接机制被置于CMVie启动子的转录调控之下。质粒pLAd.抗原还含有SV40多聚腺苷酸位点，以及用于DNA在细菌中传播的原核复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
图1B图解了另一个含有多个细胞因子基因如IL-2，INF和IL-8的穿梭质粒(pRAd.细胞因子)。穿梭质粒pRAd.细胞因子含有包括右侧长末端重复R-TR的腺病毒基因组右侧末端。E4区域的大部分区域(除了orf6)被细胞因子基因所取代。细胞因子的表达经由内部核糖体进入位点(IRES)和在SD与SA位点的剪接机制被置于CMVie启动子的转录调控之下。质粒pLAd.细胞因子还包含牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸位点，以及用于DNA在细菌中传播的原核复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
所述的重组体腺病毒基因组由两个穿梭质粒pLAd.抗原和pRAd.细胞因子组装而成，其分别携带腺病毒基因组的左和右末端。分别用限制性酶如XbaI和EcoRI来消化穿梭质粒pLAd.抗原和pRAd.细胞因子。
如图1C所示，来自这两个穿梭质粒pLAd.抗原和pRAd.细胞因子的、相应于腺病毒左和右末端的片段，被分离并连接到腺病毒基因组(腺病毒骨架)的中间部分。
随后用此被连接的载体基因组DNA转染表达腺病毒E1蛋白的293HK细胞。在E1蛋白存在的情况下，已被删除了E1的载体基因组可以被复制并被包装到病毒颗粒中，即产生可被用作本发明遗传疫苗的重组体腺病毒载体。在天然腺病毒基因组被保留但是在重组体病毒基因组中被删除的E1区，是天然于重组体病毒天然祖先(野生型腺病毒)致病区的实例。
图5图解了通过使用上述方法构建的遗传疫苗的实例。所述的复制缺陷的腺病毒5型是载体的骨架，病毒抗原和细胞因子插入在其E1区。用CMVie启动子来表达病毒抗原。病毒抗原基因的后面是编码INF-γ和GM-CSF的基因，其利用2个IRES序列来实现由单个mRNA来表达三种蛋白。IL2和IL4由作为双顺反盒的第二CMVie启动子控制，其后面是在E4区域表达IL-12的两个亚单位的第二双顺反盒。本领域的技术人员将会理解，本发明并不限于上面讨论的结构，还可以使用备选的其它细胞因子或者结合使用这些或者其它的细胞因子。有关这些细胞因子的详细信息描述在下面的部分中。
2.与病毒抗原共表达的细胞因子本发明的重组体病毒还可以表达免疫刺激因子以模拟宿主在受到病毒感染的时候作出的释放细胞因子反应，并进一步扩大针对共表达自重组体病毒的病毒抗原的免疫应答。所述的免疫刺激因子可以是免疫增强细胞因子以进一步刺激免疫系统。所述的重组体病毒可以编码一种或者以任何方式组合的多个细胞因子。或者，可以由多于一个重组体病毒来表达多个细胞因子，或者通过使用其它技术如经由裸DNA质粒递送或者注射细胞因子蛋白来而递送到宿主。
细胞因子的实例包括但不限于白细胞介素-2，白细胞介素-4，白细胞介素-8，白细胞介素-12，β-干扰素，λ-干扰素，γ-干扰素，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
细胞因子是在本发明疫苗中特别有用的免疫调节分子，由于它们是调节并形成免疫应答质量和强度的多效(pleitropic)调节剂。细胞因子有时是自分泌或者内分泌的，但是多数情况下是由淋巴细胞和单核细胞天然产生的旁分泌激素。
这里使用的术语“细胞因子”指的是由免疫系统的细胞产生的并调节或者控制免疫应答的蛋白或多肽类的成员。这种控制可以发生在体液或者细胞介导的免疫应答中，这种调节可以发生在体液或细胞介导的免疫应答中，并且包括对T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、抗原提呈细胞或者其它免疫系统细胞的效应器功能的调节。
典型的细胞因子是分子量小于大约30kDa的小蛋白或者糖蛋白。这里使用的术语细胞因子包括那些由淋巴细胞和其它细胞类型分泌的细胞因子(常表示为淋巴因子)，以及由单核细胞和巨噬细胞及其它细胞类型分泌的细胞因子(通常称为单核因子)。这里使用的术语细胞因子包括那些由淋巴细胞和其它类型细胞分泌的细胞因子，以及由单核细胞和巨噬细胞及其它细胞类型分泌的细胞因子。术语细胞因子包括白细胞介素和人促炎细胞因子，白细胞介素如IL-2，IL-4，IL-5，IL-8，IL-10，IL-11，IL-12，IL-15，和IL-18，它们是由主要影响造血和免疫系统细胞的生长和分化的白细胞所分泌的分子；人促炎细胞因子如IL-1a，TNF-a和TNF-b。术语细胞因子还包括造血生长因子，特别是集落刺激因子如集落刺激因子-1，粒细胞集落刺激因子和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
这些细胞因子可以具有天然发生细胞因子的序列，或者与天然发生细胞因子的序列具有实质的氨基酸序列相似性，如60-95％的氨基酸序列类似，优选70-98％的氨基酸序列，最优选75-95％的氨基酸序列相似性。
因此，应该理解，可以对天然存在的序列进行有限的修饰作用而不会破坏该细胞因子的生物功能。例如，对γ-干扰素进行的、不破坏其功能的少量修饰作用仍属于γ-干扰素的定义范围内。这些修饰可以是故意进行的，如通过位点专一诱变，或者可以是偶然发生的如通过突变。优选的细胞因子是IL-2，IL-8，IL-12，或γ-干扰素，β-干扰素，λ-干扰素，GM-CSF，或者G-CSF，或其组合。
白细胞介素-2是由辅助性T细胞产生的淋巴因子并且在调控免疫应答的量度和类型中有活性。Smith，K.A.，Ann.Rev.Immunol.2，319-333(1984)。其它也归属于IL-2的功能包括激活NK细胞(Minato，N.等.，J.Exp.Med.154，750(1983))和在大粒状淋巴细胞和B细胞中刺激细胞分裂。Tsudo，M.等..J.Exp.Med.160，612-616(1984)。对小鼠和人进行的研究证明，IL-2在体内和体外都可以增强不足的免疫应答。例如，外源IL-2可以在环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠(Merluzzi，V.J.等.Cancer Res.41，850-853(1981))和无胸腺(裸)小鼠中恢复免疫应答。Wagner，H.等.Nature 284，278-80(1982)。另外，IL-2可以在患有免疫缺陷疾病如麻风和癌的患者中恢复淋巴细胞的应答。Vose，B.M.等.Cancer Immuno.13，105-111(1984)。这些用于鼠科的(Yokota，T.等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，68-72(1985))和人类的(Taniguchi，T.等.Nature，302，305-307(1983))IL-2基因已经被克隆并被测序。
白细胞介素-4是衍生于T细胞的因子，其充当静止B细胞的诱导因子、B细胞分化因子和B细胞生长因子。Sevenusar，E.Eur.J.Immunol.17，67-72(1987)。人类的IL-4基因已经被分离并测序。Lee，F.等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，2061-2065(1986)。
IL-12是近来才被表征的异源二聚体细胞因子，其分子量为75kDa而且由二硫键连接的40kDa和35kDa的亚单位组成。其由抗原提呈细胞如巨噬细胞产生，并结合到活化的T，B和NK细胞受体上。(Desai，B.B.，等.，J.Immunol.，1483125-3132(1992)；Vogel，L.A.，等.，Int.Immunol.，81955-1962(1996))。其具有的多种作用包括1)增强T细胞和NK细胞的增殖，2)增加T细胞，NK细胞和巨噬细胞的细胞溶解活性，3)诱导IFN-的产生，并在较小的程度上诱导TNF-α和GM-CSF的产生，和4)活化TH1细胞。(Trinchieri，G.，等.，Blood，844008-4027(1994)。已经表明，IL-12在Th1克隆的增殖上是重要的共刺激因子(Kennedy等.，Eur.J.Immunol.242271-2278(1994))而且引起血清中IgG2a抗体的产生增加(Morris，S.C.，等.，J.Immunol.1521047-1056(1994)；Germann，T.M.，等.，Eur.J.Immunol.，25823-829(1995)；Sher，A.，等.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，795202-207(1996)；Buchanan，J.M.，等.，Int.Immunol.，71519-1528(1995)；Metzger，D.W.等.，Eur.J.Imunol.，271958-1965(1997))。给予IL-12还可以暂时地降低IgG1抗体的产生(Morris，S.C.，等.，J.Immunol.1521047-1056(1994)；Mcknight，A.J.，J.Immunol.1522172-2179(1994)；Buchanan，J.M.，等.，Int.Immunol.，71519-1528(1995))，这表明了对Th2应答的抑制作用。对IL-12的纯化和克隆公开在WO92/05256和WO90/05147，以及EP322,827(确定为“CLMF”)中。上述的所有效应均是在成年动物中观察到的。
干扰素(IFNs)是相对较小的、种类特异的单链多肽，其由应答于暴露在多种诱导剂如病毒、多肽、有丝分裂原等的宿主细胞产生。它们表现出抗病毒、抗增殖和免疫调节特性，并且因此非常有前景被用作控制癌症和各种其它抗病毒疾病的治疗制剂(J.Desmyter等.，Lancet 11，645-647(1976)；R.Derynck等.，Nature 287，193(1980))。基于它们的细胞来源和抗原性，人干扰素被分成三类α-干扰素(白细胞)，β-干扰素(成纤维细胞)和γ-干扰素(B细胞)。每一类中的重组体类型已经被研制出来并且可以商购。
γ-干扰素还是衍生于T细胞的分子，对免疫应答有深远的影响。该分子通过IL-2刺激的活化的B细胞来促进免疫球蛋白的产生。γ-干扰素还增加组织相容性抗原在与病毒抗原相关的细胞上的表达，以刺激细胞毒性T细胞。人γ-干扰素的基因已经被分离并被测序。Gray，P.W.等.，Nature 295，503-508(1982)。
人α干扰素(也称为白细胞干扰素)包含大约30个蛋白质种类的家族，由至少14个不同的基因和大约16个等位基因编码。已经表明，这些α干扰素蛋白种类中有一些具有抗病毒、抗生长和免疫调节活性。参见例如Pestka等.，Ann.Rev.Biochem.，56727(1987)。人α干扰素对人癌症和病毒疾病的治疗功效已经得到证明。例如，目前重组体干扰素(IFNα-2a，IFNα-2b，IFNα-2c)，衍生于细胞系的干扰素(IFNα-n1)，和衍生于白细胞的干扰素(IFNα-n3)被用于治疗尖锐湿疣(Condylomaacuminata)，肝炎(Weck等.，Am.J.Med.，85(Suppl 2A)159(1988)；Korenman等.，Annal.Intern.Med.，114.629(1991)；Friedman-Kien等.，JAMA，259533(1988))，用于某些恶性肿瘤的退变(Baron等.，JAMA，2661375(1991))，和用于治疗AIDS相关的卡波济肉瘤(Physicians DeskReference，第47版.，eds.Medical Economics Data，Montvale，N.J.，2194和2006页(1993))，目前正在考虑将其单独或者与其它抗病毒制剂结合以用于治疗人获得性免疫缺陷综合症(AIDS)(Hirsch，Am.J.Med.，85(Suppl2A)182(1988))。
通过化学测定β-干扰素的碳水化合物含量，结果显示其是糖蛋白。其具有一个N-糖苷基粘附位点(E.Knight，Jr.，Proc.Natl.Acad.Sci.，73，520(1976)；E.Knight，Jr.，和D.Fahey，J.Interferon Res.，2(3)，421(1982))。虽然还不太清楚究竟是那种类型的糖组成了β-干扰素的碳水化合物部分，但是已经表明碳水化合物部分对其抗原性、生物活性或疏水性并非必需(T.Taniguchi等.，supra；E.Knight，Jr.，supra；和E.Knight，Jr.和D.Fahey，supra)。在成纤维细胞中，β-干扰素可由病毒激发诱导，其包含大约165个氨基酸。β-干扰素的序列是已知的。Fiers等.Philos.Tmas.R.Soc.Lond.，B，Biol.Sci.29929-38(1982)。
GM-CSF是一种对树突细胞的成熟和功能十分重要的细胞因子。其与树突细胞上的受体结合并刺激这些细胞成熟、提呈抗原并准备原始T细胞。树突细胞形成一个高效的抗原呈递细胞系统。在捕获周边的抗原后，树突细胞迁移到淋巴器官并将抗原呈递给T细胞。这些有效的抗原呈递细胞在其与活化的原始T细胞相互作用的能力方面是独一无二的。树突细胞的这种有效的抗原呈递能力可能部分是由于其独特的生命周期和高水平表达的主要组织相容性复合物I和II类分子以及共刺激分子所致。人GM-CSF序列是已知的。Wong等.，Science 228810-815(1985)。
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种造血生长因子，也称作集落刺激因子，其刺激定型祖细胞分化并形成分化的血细胞集落。G-CSF优先刺激嗜中性粒细胞的生长和发育，并且对治疗中性白细胞减少症有用。Welte等.，PNAS-USA 821526-1530(1985)；Souza等.，Science 23261-65(1986)和Gabrilove，J.Seminars in Hematology 26(2)1-14(1989)。G-CSF增加循环粒细胞的数量并且已经报道能够改善脓毒病模型中的感染。给予G-CSF还抑制肿瘤坏死因子(TNF)的释放，TNF是一种在脓毒病和排斥反应过程中对组织损伤非常重要的细胞因子。参见例如Wendel等.，J.Immunol.，149918-924(1992)。人(Nagata等.，Nature319；415，1986)和小鼠(Tsuchiya等.，PNAS83，7633，1986)G-CSF的cDNA已经被分离，这可以使我们进一步表征G-CSF的结构和生物学特性。
内源性G-CSF在人的血浆中是可以探测到的。Jones等.，Bailliere′sClinical Hematology 2(1)83-111(1989)。G-CSF是由成纤维细胞，巨噬细胞，滋养层T细胞，内皮细胞和上皮细胞产生的，并且是位于17号染色体、包含4个外显子和5个内含子的单拷贝基因的表达产物。此基因座的转录产生一种mRNA类型，其被差别加工，产生两种类型G-CSF mRNA，一种编码一个177个氨基酸的蛋白质，另一个编码一个174个氨基酸的蛋白质。Nagata等.，EMBO J 5575-581(1986)。包含174个氨基酸的那种类型已经被发现具有最特异的体内生物学活性。G-CSF在种间会交叉反应，因此当将人G-CSF给予另一个宿主如小鼠、犬或者猴子的时候，会激发持续的嗜中性粒细胞白细胞增多。Moore等.PNAS-USA847134-7138(1987)。
本发明提供了用来增强针对重组体病毒的特异外来抗原多肽的免疫应答的有效方法。尽管任何外来抗原多肽均可以被用于本发明的疫苗，但是本发明的疫苗在针对HIV病毒和埃博拉病毒的疫苗中特别有用，这是因为这些病毒对宿主的免疫系统具有负面影响。本发明的疫苗对免疫肝炎B和C病毒也非常有用。
3.针对HIV感染的遗传疫苗本发明的遗传疫苗还致力于解决针对HIV病毒的有效疫苗的需求。依照本发明，所述的遗传疫苗可以是其病毒基因组携带一个或者多个来自HIV的抗原如HIV糖蛋白(如GP120和GP41)或者衣壳蛋白(如p24)的重组体良性病毒。这些HIV抗原的序列可以是被修饰的如删除了HIV糖蛋白的免疫抑制区域。
HIV病毒引起的疾病称为获得性免疫缺陷综合症(AIDS)。自从AIDS首先在1981年被报道以后，它就被描述为现代瘟疫，据称仅在美国就有超过60,000的患者，已有32,000例死亡。该疾病被表征为在长时间的无症状期后，免疫系统和中枢神经系统退变。在症状出现前，该病毒可以潜伏在被感染个体的体内长达5或者更多年，因此在此期间该疾病的真正影响不会表现出来。许多美国人可能在不知道的情况下被HIV感染，并且还能够传染其它可能与其体液进行接触的人。因此，如果不加以抑制，AIDS对个人、社会和经济的影响都将是巨大的。
HIV病毒是逆转录病毒。因此，其遗传物质是编码病毒复制信息的RNA。当宿主细胞被感染的时候，RNA充当转录成DNA的模板，此过程由被称为逆转录酶的酶所催化。如此产生的DNA进入到细胞核中，在这里，该DNA作为前病毒被整合到宿主DNA中。当被适当激活的时候，此衍生于逆转录病毒的DNA被转录并被翻译，产生含有RNA病毒粒子，该病毒粒子随后经由出芽过程从细胞释放出来。
当个体被HIV感染的时候，病毒优先黏附并进入到被称作T4淋巴细胞的一种特殊种类的白细胞中，该细胞的特征在于在细胞表面呈现被定义为CD4的标记。这些白细胞在免疫系统中起着必要的作用，其作为体液和细胞免疫应答的重要组分发挥功能。HIV的许多有害作用都可以归于对T4淋巴细胞的功能性抑制或者破坏作用。
完整的HIV病毒粒子是粗糙的球形，其直径大约为110nm。该病毒粒子具有被由糖蛋白gp160/120构成的钉状构件所布满的外层膜。另外，该病毒粒子还存在被定义为gp41的跨膜蛋白。病毒粒子里面是两个结构蛋白由磷蛋白p17构成的外壳，和由磷蛋白p24组成的内核或者中心核。病毒RNA与两个拷贝的逆转录酶p66/51出现在核的内部，该逆转录酶对于病毒DNA从RNA模板的合成是必要的。HIV的RNA基因组编码三个主要结构基因gag，pol和env，这些基因的两端都接有长末端重复(LTR)序列。Gag基因编码组特异的核蛋白p55，p39，p24，p17和p15。Pol基因编码逆转录酶p66/p51和蛋白酶p31。Env基因编码外层包膜糖蛋白gp120、其前体gp160、以及跨膜糖蛋白gp41。这些基因中有一些基因趋向于高度可变，特别是env基因。另外，HIV还有5个其它逆转录病毒所不具有的基因，这些基因或者参与转录或者翻译调控，或者编码其它结构蛋白。HIV的整个基因组目前已经被测序。参见Ratner等.Nature 313277(1985)，该文献在此加入作为参考。
HIV包膜蛋白已经被广泛地描述，编码许多HIV毒株的HIV包膜的氨基酸和RNA序列都是已知的。参见Myers，G.等.，Human Retrovirusesand AIDSA compilation and analysis of nucleic acid and amino acidsequences，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，N.M.(1992)。预计各种毒株HIV的env基因编码850-880个氨基酸的蛋白。在合成过程中，对Env的前体多聚蛋白的广泛糖基化作用产生了gp160(大约160千道尔顿)，其也是在被感染的细胞中检测到的env基因产物的主要类型。Gp160形成同源三聚体并在高尔基体中经历了糖基化作用。
Gp160的功能性结构域包括从N端开始，信号肽，包含CD4结合位点(如Thr257、Trp427、Asp368/Glu370和Asp457)的可变区域1-5，蛋白水解加工位点(也称为gp120和gp41之间的切割位点)，融合结构域，亮氨酸拉链基序，跨膜结构域和慢病毒属裂解肽(LLP)1和2。尽管gp120的核苷酸和氨基酸序列以及从各种HIV的分离物和毒株的编号方式可能会不同，但是编码功能性结构域的区域却可以很容易通过下列书籍中的教导鉴别开来Luciw(1996)″Fundamental Virology″，第3版，编辑.，Fields等.，Lippincott-Raven发行人，Philadelphia，27章，845-916页。
Env前体gp160的N末端的信号肽将核糖体所翻译的新生蛋白引导到内质网；在Env糖蛋白的生物发生过程中，细胞内蛋白酶将此信号肽移除。Env前体gp160在加工位点被细胞蛋白酶切割以生成gp120(称为SU亚单位)和gp41(称为TM亚单位)。Gp120包含多数外部的、表面暴露的、包膜糖蛋白复合物的结构域。Gp41含有跨膜结构域并保留着三聚体的构型，而且它以非共价的方式与gp120相互作用。Gp41的亚单位包括融合肽，亮氨酸拉链样区域，跨膜结构域(TM)，LLP1和LLP2。
Gp120亚单位含有5个可变区和6个保守区。根据Modrow等(1987)″Computer-assisted analysis of envelope protein sequences of seven humanimmunodeficiency virus isolatespredictions of antigenic epitopes inconserved and variable regions″，J.Virol.61570-578的命名法，Gp120的可变(V)结构域和保守(C)结构域是特定的。Modrow等。
Gp120分子由60,000道尔顿的多肽核构成，其被N联糖基化作用广泛地修饰，以增加该分子表观分子量到120,000道尔顿。在所有gp120序列中，Gp120一级序列中的18个半胱氨酸残基的位置和gp120序列中的大约24个N联糖基化作用位点的13个都是共有的。超可变结构域含有大量氨基酸取代、插入和缺失。在这些结构域中的序列变化导致了来自多种病毒分离物的gp120分子间的高达30％的总序列可变性。尽管存在可变性，但是所有的gp120序列保留了病毒与病毒受体CD4结合的能力和病毒与gp41相互作用的能力，以诱导病毒与宿主细胞膜融合。
HIV病毒通过包膜糖蛋白与细胞表面受体的相互作用黏附到宿主细胞上。似乎当HIV与T4细胞接触时，gp120就与CD4受体相互作用。近来，通过络合蛋白质与人CD的片段和来自阻断结合趋化因子受体的病毒中和抗体的抗原结合片段，已经解开了HIV-1 gp120(毒株HXB-2，进化枝B病毒)的核心结构域的晶体结构。Kwong等.(1998)″Structure of anHIVgp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and aneutralizing human antibody″，Nature 393648-659。这些研究揭示了gp120核心具有独特的分子结构，其包含两个结构域-“内部结构域”(面对gp41)和“外部结构域”(主要暴露在寡聚包膜糖蛋白复合物的表面)。这两个gp120结构域被一个不属于任何结构域部分的“桥板(bridging sheet)”分隔开。与CD4的结合会引起gp120的构象改变，其将所述桥板暴露出来并可能相对彼此移动内部和外部结构域。同样发现，多数被加在gp120上的碳水化合物分子被加到了外部结构域。这与病毒使用碳水化合物分子来掩盖gp120上的外部抗原表位这一想法相吻合。
Gp120不仅结合到CD4受体上，而且还结合到HIV共受体如细胞趋化因子受体(如CCR5)。当与受体和/或共受体结合的时候，病毒包膜随后与细胞膜融合，病毒的内部核心进入到被感染的细胞内，在被感染的细胞内，RNA经由逆转录酶的催化转录成为DNA前病毒。细胞中的前病毒以潜伏形式保留几个月或者几年，在此期间，被感染的个体是无症状的。但是，一旦病毒后来被激活，就会引起病毒复制和免疫抑制，被感染个体就很容易受到与AIDS相关的机会性感染。
在一个本发明HIV疫苗的实施方案中，提供了一种用来激发针对HIV感染的强烈免疫应答的重组体病毒。该重组体病毒包含异源于所述重组体病毒的、编码来自人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原的抗原序列，当宿主被该重组体病毒感染的时候，该HIV抗原在宿主中的表达激发针对HIV抗原和表达HIV抗原的细胞的免疫应答；和，编码免疫刺激因子的、异源于所述重组体病毒的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表达能提高HIV抗原的免疫原性。在一个优选的实施方案中，该重组体病毒是不能复制的而且不会在宿主中引起与HIV天然相关的恶性肿瘤。将所述的重组体病毒作为遗传疫苗给予宿主，以诱导或者激发针对HIV感染的强烈且持久的免疫力。
与其它使用变性的或减毒HIV病毒体开发HIV疫苗的方法相比，可能通过与感染宿主的野生型HIV重组，本发明的方法在激发强烈免疫应答但不产生HIV再活化危险方面将是更安全和更有效的。
依照本发明，由遗传疫苗表达的HIV抗原可以是任何衍生自HIV病毒的抗原，如HIV表面蛋白，核心/衣壳蛋白，调节蛋白，酶蛋白和辅助蛋白。HIV表面蛋白的实例包括但不限于env基因的产物如gp120和gp41。HIV衣壳蛋白的实例包括但不限于gag基因的产物如Pr55gag被病毒编码的蛋白酶PR所切割的产物成熟衣壳蛋白MA(p17)，CA(p24)，p2，NC(p7)，p1和p6。Herderson等.(1992)J.Virol.661856-1865。病毒调控蛋白的实例包括但不限于tat和rev基因产物Tat和Rev。病毒酶蛋白的实例包括但不限于pol基因的产物p11(蛋白酶或者PR)，p51(逆转录酶或者RT)和p32(整合酶或者IN)。病毒辅助蛋白的实例包括但不限于vif，vpr，vpx，vpu和nef基因的产物Vif，Vpr，Vpx，Vpu和Nef。
在一个实施方案中，HIVNef蛋白可以充当由本发明重组体病毒表达的HIV抗原。例如，可以将编码Nef的序列(例如，HIVBH10毒株8152-8523位置的nef序列和HIV pNL4-3毒株8787-9407位置的nef序列)插入到所述的载体中。
在另一个实施方案中，HIV Rev蛋白可以充当由本发明重组体病毒表达的HIV抗原。例如，可以将编码Rev的序列(例如，HIV pNL4-3毒株5969-6044位置的rev1序列和8369-8643位置的rev2序列)插入到所述的载体中。
在另一个实施方案中，全长HIV Gag蛋白可以充当由本发明重组体病毒表达的HIV抗原。例如，可以将编码Gag的序列(例如，HIVBH10毒株112-1650位置的gag序列和HIV pNL4-3毒株790-2292位置的gag序列)插入到所述的载体中。
或者，来自HIV Gag蛋白的衣壳蛋白(如p24 CA)可以充当由本发明重组体病毒表达的HIV抗原。例如，可以将编码p24CA的序列(例如，HIV BH10毒株1186-1878位置的序列和HIV pNL4-3毒株508-1200位置的序列)插入到所述的载体中。
在另一个实施方案中，由重组体病毒表达的HIV抗原衍生于env基因产物。例如，抗原衍生于Env蛋白。
根据此实施方案，可以用修饰或者诱变方法来缺失或者突变Env的一某区域来使其失去功能但是依然保留了其天然抗原性的中和表位。例如，可以缺失或者突变Env的蛋白水解加工位点以使其抵抗细胞蛋白酶切割以产生gp120和gp41片段。缺失或突变也可以在gp41的跨膜和胞质结构域如TM、LLP-1和LLP2结构域中进行。与野生型Env相比，突变的Env蛋白被整合到感染宿主的野生型HIV中的危险性和被HIV利用来实现其促进目的-破坏宿主的免疫系统的危险性应该被降低了。
例如，可以用下列途径来修饰野生型HIV Env。可以用限制性内切酶EcoRI和XhoI来消化来自HIV BH10毒株并且包含Env、Tat和Rev编码序列的野生型gp120序列，以产生始于核苷酸5101、止于核苷酸8252的片段。可以通过缺失来自HIV BH10毒株7848-8150位置和pNL4-3毒株8610-8785位置的编码序列的核苷酸来去除Env的胞质结构域。可以通过缺失HIV BH10毒株7101-7112位置和pNL4-3毒株7736-7747位置的编码氨基酸序列REKR的12个核苷酸来去除Env的切割位点。
同样根据本实施方案，修饰的Env蛋白可以在不含有中和表位的区域包含缺失。例如，可以缺失gp120的V1和V5结构域而不需要丧失gp120的天然抗原性。同样可以缺失不含有中和表位的gp120的V2和V3结构域部分。虽然已经在V3结构域中发现了主要中和结构域(PND)，但是也发现gp120的V2和C4结构域也含有中和表位。在各种HIV的毒株和进化枝中，中和表位的氨基酸序列是可变的。但是已经发现变化的数量是高度受限制的。因此，应该很容易确定不含有中和表位的序列。
例如，可以在HIV BH10毒株的5961-6032位置和pNL4-3毒株的6602-6673位置缺失编码Env V1区域的序列。可以在HIV BH10毒株的6060-6161位置和pNL4-3毒株的6700-6796位置缺失编码Env V2区域的序列。任选地，可以在HIV BH10毒株的5961-6161位置和pNL4-3毒株的6602-6796位置同时缺失编码Env V1和V2区域的序列。
或者，所述重组体病毒表达的HIV抗原可以是包含一个或者多个选择的可变(V)和/或保守(C)结构域的gp120的亚单位。例如，HIV抗原可以是包含V2，V3和C4结构域，或者V3和C4结构域的gp120亚单位。V3结构域中中和表位的位置为人所熟知。已经发现V2和C4结构域的中和表位分别位于163和200残基之间，和大约420和440之间。另外，用于抗体结合的残基还包括V2结构域中的残基171，174，177，181，183，187，188，以及C4结构域中的残基429和432。Berman等.(1999)Virology2651-9；和Berman(1998)AIDS Res.Human Retroviruses 15115-132。
在另一个实施方案中，本发明的重组体病毒所表达的HIV抗原可以是在糖基化位点具有缺失和/或突变的修饰的Env蛋白。HIV-1的gp120含有用于N-联糖基化作用(Asn-X-Ser/Thr)的24个潜在位点；这24个糖基化基序中大约有13个在不同的病毒分离物中是保守的。对HIV-1 Env gp蛋白的分析已经证明，24个潜在的糖基化位点中有17个是被糖类侧链修饰的。Mizuochi等.(1990)J.Biol.Chem.2658519-8524；和Leonard等.(1990)J.Biol.Chem.26510373-10382。由于Env gp蛋白的广泛糖基化作用，gp120肽骨架中只有很少的区域从糖类部分中突出。已经在非中和表位中发现了一些糖基化位点，这些非中和表位弱化了针对真正中和表位的免疫力或者作为假表位。因此，缺失或者突变这些糖基化位点可能会通过暴露真正的中和表位而提高抗原的免疫力。
在另一个实施方案中，可以通过本发明的相同重组体病毒来表达不同的HIV抗原。例如，可以从相同的启动子如CMV即早启动子、经由逆转录病毒剪接供体-受体机制同时表达Env、Tat和Rev蛋白。任选地，全长、截短或者修饰形式的HIV Gag蛋白(如衣壳蛋白p24)还可以与其它HIV抗原如Env、Tat和Rev一起表达。另外，还可以将这些HIV抗原与单独或者多拷贝的免疫刺激因子(例如IL-2，IL-12，INF-γ，和GM-CSF)、通过相同的重组体病毒载体一起表达。
例如，可以将编码HIV抗原的序列插入到腺病毒载体的E1区域并经由逆转录病毒剪接供体-受体机制或IRES机制从CMV即早启动子表达。可以将编码免疫刺激因子的序列插入到相同腺病毒的E4区域并经由逆转录病毒剪接供体-受体机制或IRES机制从另一个CMV即早启动子表达。
在另一个实施方案中，本发明重组体病毒中编码HIV抗原的序列是包含来自不同HIV病毒毒株、分离物和/或进化枝序列的嵌合体抗原。HIV毒株是分离自个体(分离物)、被表征并被给予了毒株名称的HIV(例如，MN，LAI)。由于HIV的异质性，没有两个分离物是完全相同的。一组相关的HIV分离物是根据其遗传类似度如其包膜蛋白来分类的。目前存在两组HIV分离物M和O。M组由至少9个进化枝(也称为亚型)组成A-I。O组可能由类似数目的进化枝组成。进化枝在遗传上不同，但是都有传染性。据信通过在本发明遗传疫苗的设计中使用嵌合体HIV抗原，所产生的疫苗应该更能刺激产生针对更广谱“野生型”HIV毒株的抗HIV抗体和HIV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。
在一个实施方案中，重组体病毒中的嵌合体HIV抗原所包含的抗原来自多个HIV进化枝，包括进化枝A(登记号HIV-1 92UG037WHO.0108HED)，B(登记号pNL4-3)，C(登记号HIV-1 92BR025WHO.109HED)，D(登记号HIV-1 92UG024.2)，E(登记号HIV-1 93TH976.17)，F(登记号HIV-1 93BR020.17)，和G(登记号HIV-1 92RU131.9)。任选地，可以将来自不同进化枝的HIV抗原的限制性片段(如AvaI片段)的多个重复，头尾相接地连接起来以产生更复杂的嵌合体HIV抗原。
例如，腺病毒载体可以作为嵌合体HIV抗原被构建到多个进化枝的V3环。任选地，来自多个进化枝的、gp41缺失的HIV抗原可以作为嵌合体HIV抗原。或者，来自多个进化枝的、V1和V2环从进化枝B(pNL4-3)缺失的HIV抗原可以作为嵌合体HIV抗原。
还任选地，可以将编码氨基酸序列SWLLLLLLSLSLLQATDFMSL[SEQ ID NO9]的人基因Thy-1 GPA锚定序列添加到所述的重组体病毒构建体中。
在另一个实施方案中，所述的嵌合体HIV抗原包含Env蛋白，该蛋白含有衍生于不同HIV病毒毒株、分离物和/或进化枝的gp120的可变和恒定结构域。例如，可以将来自M组进化枝B的V2结构域与来自O组进化枝C的V3和C4结构域混合，以产生嵌合体HIV抗原。用这样的嵌合体抗原来接种个体，可以用交叉进化枝活性来刺激CTLs。换句话说，这些CTLs可以识别并杀死被不同进化枝HIV感染的靶细胞。
或者，重组体病毒可以表达多个HIV抗原，每个抗原分别来自HIV的不同毒株、分离物或者进化枝。例如，可以将来自不同HIV进化枝的env基因克隆到重组体病毒中并串联表达以在宿主细胞中产生来自这些进化枝的各种Env蛋白。据信，在宿主细胞中表达来自不同HIV毒株、分离物或者进化枝的不同Env蛋白，将增强本发明遗传疫苗刺激产生针对更广谱“野生型”HIV毒株的抗HIV抗体和HIV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的能力。用这种疫苗接种的宿主能够获得针对各种HIV毒株感染的免疫力。
通过使用本发明的遗传疫苗，没有被HIV感染的个体可以获得针对HIV的免疫。对于已被HIV感染的个体，所述疫苗也可以增强他们的免疫应答并协助对抗此致命病毒。由于该遗传疫苗可以同时表达高水平的抗原和/或多种HIV糖蛋白和衣壳蛋白，被接种的个体应该能够获得针对各种HIV毒株如HIV-1和HIV-2的免疫力。另外，由于遗传疫苗能够表达高水平的细胞因子以模仿机体对天然病毒感染的应答，所以机体对这种针对HIV的遗传疫苗的免疫应答应该是强烈且持久的，从而实现针对此致命病毒的终生免疫。
4.针对肝炎病毒的遗传疫苗本发明的遗传疫苗还致力于解决针对肝炎病毒如肝炎A，B，C，D，和E型病毒的有效疫苗的需求。依照本发明，所述的遗传疫苗可以是其病毒基因组携带一个或者多个来自肝炎病毒抗原如肝炎病毒糖蛋白和核心蛋白的重组体良性病毒。这些HIV抗原的序列可以是被修饰的，如缺失了肝炎糖蛋白或者核心蛋白致病区域。
特别是，本发明的重组体病毒可以被用作使个体获得针对乙肝病毒感染的免疫力的疫苗。病毒性乙型肝炎是由肝炎B型病毒(HBV)引起的。据估计HBV已经在全世界感染了4亿人，这使HBV成为最常见的人类病原体之一。人类最常见的癌症之一-肝癌(HCC)主要就是由慢性HBV感染所致。
HBV在嗜肝DNA病毒科中是主要为双链的DNA病毒。虽然其病毒粒子主要包含DNA，但是由于其紧凑的形式、使用重叠的读码框和依靠逆转录酶步骤，HBV基因组在所有病毒中是独特的。HBV基因组具有4个基因pol，env，前核和X，其分别编码病毒DNA聚合酶，包膜蛋白，前核蛋白(被加工成病毒衣壳)和蛋白X。蛋白X的功能尚不清楚，但是它可能参与宿主细胞基因的活化和癌症的形成。
HBV感染的诊断通常基于血清学。事实上，所有被HBV感染的个体都有可检测得到的血清肝炎表面抗原(HBsAg)。尽管针对HBV感染的疫苗已经获得了显著的成功，但是它仍然是正在进行的任务。在Eddleston中可以发现现代肝炎疫苗的综述，包括许多主要参考文献。The Lancet，1142页，1990年5月12日.也参见Viral Hepatitis and Liver Disease，Vyas，B.N.，Dienstag，J.L.，和Hoofnagle，J.H.，编辑.，Gruneand Stratton，Inc.(1984)和Viral Hepatitis and Liver Disease，Proceedings of the 1990International Symposium，编辑F.B.Hollinger，S.M.Lemon和H.Margolis，由Williams和Wilkins发表。根据本发明，所述的病毒抗原可以是乙肝病毒的表面抗原或核心蛋白如小乙型肝炎表面抗原(SHBsAg)(也称澳大利亚抗原)、中乙型肝炎表面抗原(MHBsAg)和大乙型肝炎表面抗原(LHBsAg)。
可以用所述的重组体病毒表达不同HBV类型的抗原如亚洲C型和美洲A型，以激发针对这些HBV类型的免疫应答。可以通过本发明重组体病毒来分别地或者组合(HBsAg+HBcAg)地表达HBV表面抗原(HBsAg)或者核心抗原(HBcAg)。
例如，可以将编码多个HBV抗原的序列插入到腺病毒载体的E1或者E4区，并且经由逆转录病毒剪接供体-受体机制或者IRES机制从CMV即早启动子表达。另外，可以将这些HBV抗原与一种或者多种单独或者多拷贝的免疫刺激因子如IL-2，IFN-γ和GM-CSF组合在一起表达。可以将编码这些细胞因子的序列插入到没有被抗原序列占据的E1或者E4区域，并经由逆转录病毒剪接供体-受体机制或IRES机制从另一个CMV即早启动子表达。
具体的插入组合包括但不限于HBsAg+HBcAg；HBsAg+HBcAg+IL-2；HBsAg+HBcAg+IFN-γ+GMCSF；和HBsAg+IFN-γ+IFN-γ+GMCSF。
可以将编码免疫刺激因子的序列插入到相同腺病毒载体的E4区域，并经由逆转录病毒剪接供体-受体机制或IRES机制从另一个CMV即早启动子表达。
同样根据本发明，病毒抗原可以是丙肝病毒的表面抗原或者核心蛋白如NS3，NS4和NS5抗原。
例如，可以将编码一个或多个HCV抗原的序列插入到腺病毒载体的E1或者E4区，并且单独或者与一种或者多种单独或者多拷贝的免疫刺激因子如IL-2，IL-12，IFN-γ和GM-CSF组合在一起表达。
具体的组合包括但不限于(1)HCV野生型E2+野生型E1；(2)HCV核心；(3)HCV E2+E1+核心；(4)HCV E2+E1+核心+IL-2；(5)HCV E2+E1+核心+IL-2+IFN-γ+GM-CSF；和(6)HCVE2+E1+核心+IL-2+IFN-γ+IL-12。
在另一个实施方案中，可以将多个拷贝的HIV E1和E2的超可变区(HVR)例如5个拷贝的HVR(5×HVR)作为重组体病毒的病毒抗原，并且可以将他们单独地表达或者与一个或者多个单独或多拷贝的免疫刺激因子如IL-2，IL-12，IFN-γ和GM-CSF组合在一起表达。
具体的组合包括但不限于(1)E2-5×HVR+E1；(2)E2-5×HVR+E1+IL-2；(3)E2-5×HVR+E1+核心+IL-2；(4)E2-5×HVR+E1+核心+IL-2+IFN-γ+GM-CSF；和(5)E2-5×HVR+E1+核心+IL-2+IL-12。
通过使用本发明的遗传疫苗，没有被肝炎病毒感染的个体可以获得针对肝炎病毒的免疫。对于已被肝炎病毒感染的个体，所述疫苗也可以用于增强他们的免疫应答并协助对抗肝炎病毒。由于该遗传疫苗可以同时表达高水平的抗原和/或多种肝炎糖蛋白和核心蛋白，被接种的个体应该能够获得针对各种毒株和/或类型肝炎病毒如肝炎病毒A，B，C，D，和E型的免疫力。另外，由于遗传疫苗能够表达高水平的细胞因子以模仿机体对天然病毒感染的应答，所以机体对这种针对肝炎病毒的遗传疫苗的免疫应答应该强烈且持久，从而实现针对肝炎病毒的终生免疫。
5.针对埃博拉病毒的遗传疫苗本发明的遗传疫苗还致力于解决针对埃博拉致命病毒的有效疫苗的需求。依照本发明，所述的遗传疫苗可以是其病毒基因组携带一个或者多个来自埃博拉病毒的抗原如埃博拉病毒糖蛋白(如GP1和GP2)的重组体良性病毒。这些埃博拉抗原的序列可以是被修饰的，如缺失了埃博拉病毒的免疫抑制区域和/或其它致病区。
埃博拉病毒是已知的对人类最致命病毒中的一种，致死率高达90％。Johnson，K.M.，Ann Intern Med 91(1)117-9(1979)。埃博拉病毒感染的受害者会经历可怕的出血性疾病，往往在几天内死亡。该病毒的天然贮主还不清楚，感染的具体发病机制也不清楚。该病毒对肝细胞和网状内皮系统的细胞如巨噬细胞具有特殊的向性。该疾病的一个标记特征是肝脏受到大规模破坏。
尽管埃博拉病毒感染很少见，但是公共卫生官员很关注，因为该疾病可能会成为国际流行病，因为埃博拉病毒很容易通过人体接触而传染并且传染性特别强。由于现代旅游的广泛和快速，近来在非洲爆发的那些疾病也可能在发达国家发生。近来在非洲发现的埃博拉病毒感染个例发出了强烈预警应该为预防这种极度危险感染性疾病做好准备。另外，如果被恐怖国家或者恐怖组织用作生物武器，埃博拉病毒将是一种极大的潜在威胁。在病毒感染的多数病例中，对埃博拉病毒爆发的最好处理途径是接种疫苗。但是，目前尚没有针对埃博拉病毒感染的有效疫苗或者可用的方法。
埃博拉病毒是包膜的、负链RNA病毒，其属于丝状病毒科。有三种丝状病毒毒株埃博拉、马尔堡和Reston。埃博拉病毒可以以多种不同的方式进入体内，例如由于该病毒可以由通过空气传播的颗粒携带，所以它可以通过空气进入的开口进入体内；其还可以通过其它皮肤中的开口如伤口进入体内。
埃博拉病毒具有编码所有病毒结构蛋白(核蛋白、基质蛋白VP24和VP40)、非结构蛋白(VP30，VP35)和病毒聚合酶的非分段的RNA基因组。Peters，C.J.，West JMed164(1)36-8(1996)。在这些病毒蛋白中，包膜糖蛋白(GP)以两种形式存在由转录编辑产生的分泌形式糖蛋白(50-70kDa)和跨膜糖蛋白(130-170kDa)。Sanchez，A.等.，Proc Natl Acad Sci U.S.A.，93(8)3602-7(1996)。尽管这两种类型的GP共有295个氨基酸的同源性，它们却具有不同的结合特性，这表明它们在病毒感染的过程中起着不同的作用。分泌的糖蛋白(sGP)是由被感染的细胞所合成并分泌的主要类型。它可能在抑制宿主免疫系统中起作用(Yang，Z.，等.，Science 279(5353)1034-7(1998))并且可以作为假目标来使病毒颗粒避开中和抗体，原因在于两种类型的GPs部分具有它们的抗原性。对来自扎伊尔的埃博拉病毒幸存者中所获得的单克隆抗体进行分析，结果表明它们的极大多数特异于sGP，只有很少与GP弱结合。Maruyama，T.，等.，J Infect Dis，.179Suppl 1S235-9(1999)，Maruyama，T.，等.，J Virol，73(7)6024-30(1999)。尽管对sGP可抑制免疫系统的确切机制尚不清楚，但是在感染早期合成的大量sGP很可能是抑制被感染位点嗜中性粒细胞浸润的原因(Yang，Z.，等.，Science 279(5353)1034-7(1998))和被埃博拉病毒感染的患者缺乏体液免疫应答的原因。Baize，S.，等.，Nat Med，5(4)423-6(1999)。这种蛋白还可以超活化那些能够引起大规模血管内凋亡-主要是使免疫系统关闭的许多类型的免疫细胞。Baize，S.，等.，Nat Med，5(4)423-6(1999)。sGP对埃博拉病毒生命周期的重要性也由它出现在迄今为止调查过的所有埃博拉病毒毒株中而得到提示。Feldmann，H.，等.，Arch Virol Suppl，15159-69(1999)。
膜糖蛋白负责使病毒颗粒黏附并穿透靶细胞，这一过程通过与受体结合和病毒-细胞膜融合来实现。Wool-Lewis，等.，J.Virol，72(4)3155-60(1998)，Ito H.，等.，J.Virol，73(10)8907-12(1999)。它们被合成为单肽前体并被细胞酶(弗林蛋白酶或者组织蛋白酶B)切割成两个成熟类型GP1和GP2。这两种GPs通过一个二硫键键合保持联系并且通过一个跨膜(TM)结构域保持锚定到病毒膜中。Ito H.，等.，J.Virol，73(10)8907-12(1999)；Malashkevich，V.N.，等.，Proc Natl Acad Sci U.S.A.，96(6)2662-7(1999)。蛋白水解切割位点由4-5个碱性氨基酸残基组成，这些残基类似于那些发现于逆转录病毒、流感病毒和副粘病毒GPs中的残基。Garten，W.，等.，Biochimie，76(3-4)217-25(1994)。切割事件对于病毒传染性是必需的，而且其可能是通过与切割逆转录病毒或者流感病毒GPs相同的酶来执行的。Garten，W.，等.，Biochimie，76(3-4)217-25(1994)；Volchkov，V.E.，等.，Virology，245(1)110-9(1994)。另外，埃博拉病毒GP可以与逆转录病毒和流感病毒糖蛋白介导的病毒感染具有共同的机制。Weissenhorn，W.，等.，Mol Membr Biol，16(1)3-9(1999)。由于膜结合的GPs在发动病毒感染中起着关键作用，而且其还是暴露于病毒颗粒表面的主要蛋白，因此它们是中和针对病毒的抗体的主要靶目标。
埃博拉病毒能够抑制宿主的免疫系统，这一特性使得它们对宿主来说是致命的。对死于埃博拉病毒感染的患者的血清学分析揭示没有体液或者细胞免疫应答迹象。Baize，S.，等.，Nat Med，5(4)423-6(1999)。与此相反，在一些少数存活者中查到了针对病毒蛋白抗体和病毒特异性T细胞活性。Baize，S.，等.，Nat Med，5(4)423-6(1999)。尽管现在还不清楚免疫抑制的机理，但是高水平的sGP和GP中的免疫抑制肽很可能是导致埃博拉病毒感染患者体内缺乏体液和细胞免疫应答的原因。
负责埃博拉病毒初始感染的蛋白是病毒糖蛋白。因此，它们是中和抗体的靶目标。但是，埃博拉病毒已经演化出了防止或者延缓宿主免疫应答的“策略”，直到感染已经无法恢复。生产针对埃博拉病毒的疫苗的传统方法通常没有效果，这可能是由于下列原因(1)在细菌、酵母或者昆虫细胞中产生的病毒糖蛋白没有被正确地糖基化，因此不具有病毒蛋白的真正抗原性；(2)埃博拉病毒太危险，无法大批量生产灭活的病毒疫苗；和(3)灭活病毒的操作过程往往破坏了蛋白的构象，因此改变了它们的抗原性。
在本发明的一个优选实施方案中，重组体病毒疫苗具有编码一个或多个埃博拉病毒抗原的核酸序列。埃博拉病毒(包括扎伊尔毒株)的限制性图谱和全长序列信息可以在基因库中得到。
所述的遗传疫苗是重组体良性病毒，其是复制缺陷或者不能复制的，因此不会传播到最初被感染细胞之外。例如，即使埃博拉病毒蛋白与重组体病毒功能不具有相关性，本发明的重组体腺病毒疫苗也能介导埃博拉病毒抗原高水平表达两周或更多周的时间。
在本发明的另一个实施方案中，重组体病毒表达一种或者多种修饰的埃博拉病毒抗原。被修饰的埃博拉病毒抗原优选为埃博拉病毒包膜糖蛋白和/或其免疫活性部分。优选地，所述的糖蛋白是修饰的GP和sGP糖蛋白。埃博拉病毒的GP和sGP糖蛋白被修饰以破坏其致病功能和免疫抑制功能，但却保留了其大部分天然抗原性，这是由于它们被表达、折叠、糖基化并被靶向可以被埃博拉病毒大量感染的细胞内的细胞的膜。所述的修饰是使用标准的分子遗传操作技术如限制性消化和聚合酶链式反应进行的。
对埃博拉病毒包膜糖蛋白的优选修饰作用破坏了埃博拉病毒GP的感染功能。可以使用任何破坏埃博拉病毒感染功能的修饰作用，但是优选的修饰作用是在GP的切割位点缺失5个氨基酸。见实施例1。该切割位点由5个碱性氨基酸组成，从读码框开始的位置501RRTRR。可以用PCR扩增来将所述的缺失引入埃博拉病毒GP的cDNA，该技术在本领域为人所熟知。
另一个对埃博拉病毒基因组的优选修饰作用防止了sGP的合成。可以使用任何防止这种合成的修饰作用。优选地，这种修饰作用将RNA编辑位点从UUUUUUU变成UUCUUCUU。见实施例1。
另一个对本疫苗中使用的埃博拉病毒抗原的优选修饰作用是修饰位于GP2的免疫抑制(IS)肽。所述的IS肽基序位于氨基酸585-609。氨基酸590-600之间的10个氨基酸缺失会使其失去功能。第二，翻转并复制IS肽基序的每一半。见图2。这进一步确保了其功能被破坏并且也增加了其抗原性。
此外，对于本领域的技术人员来说，很容易生产出编码本发明埃博拉病毒抗原的核苷酸序列的变体或者衍生物，这些变体或衍生物改变了所述编码蛋白的氨基酸序列。虽然被改变的表达抗原可以具有改变的氨基酸序列，但是其仍然激发与埃博拉病毒抗原反应的免疫应答，并且被认为是功能等价物。另外，也可以构建编码部分全长蛋白的全长基因片段。这些片段可以编码激发与埃博拉病毒反应的抗体的蛋白或者肽，并且被认为是功能等价物。
用本发明疫苗对个体进行接种导致腺病毒颗粒进入到了细胞内，并且表达埃博拉病毒抗原如包膜糖蛋白以及免疫刺激因子。埃博拉病毒抗原在细胞中的表达会诱导强烈且持续的免疫应答，就好像感染已经发生一样。所述的遗传疫苗具有天然感染的所有免疫原性，包括天然病毒蛋白的表达和持久的抗原刺激，但是不具有真正病毒感染的致病性。在本发明的疫苗中，埃博拉病毒的免疫抑制机制的丧失，抗原以其天然形式存在并且与细胞膜相关联，免疫刺激作用持续数周。这种新型疫苗的作用是持久的并且提供了针对埃博拉病毒感染的高保护率。
本发明还涉及对人进行免疫以使其免受埃博拉病毒感染的方法。该方法包括给药上述的疫苗。将这些疫苗给予人体的方法在健康领域为人所熟知。
通过使用本发明的遗传疫苗，个体可以获得针对埃博拉病毒的免疫。由于所述的遗传疫苗可以同时高水平地表达抗原和/或多种糖蛋白，被接种的个体应该可以获得针对各种毒株埃博拉病毒的免疫。另外，由于所述的遗传疫苗可以表达高水平的细胞因子以模仿指向天然病毒感染的机体应答，机体对这种指向埃博拉病毒的遗传疫苗的免疫应答应该强烈且持久，从而获得针对埃博拉病毒的终生免疫力。
6.制剂和给药途径本发明还涉及包含上述疫苗的药物组合物，以及药用稀释剂、载体或者赋形剂载体。另外，所述疫苗还可以含有水性介质或者含水混悬液，其通常与其它组分混合以增强其活性和/或贮藏期。这些组分可以是盐、pH缓冲剂、稳定剂(例如脱脂乳或者酪蛋白水解物)、乳化剂和防腐剂。
可以在所述的药物组合物中加入佐剂以增强指向表达自所述重组体病毒的病毒抗原的免疫应答。佐剂的实例包括但不限于胞壁酰二肽、氢氧化铝、皂苷、聚阴离子、两亲物质(anamphipatic substance)、卡介菌(BCG)、内毒素脂多糖、钥孔血蓝蛋白(GKLH)、白细胞介素-2(IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GS-CSF)和环磷酰胺，环磷酰胺是一种据信能够在低剂量给予的时候降低肿瘤诱导的抑制的化学治疗剂。
本发明还提供了用来增强宿主对病原体免疫力的试剂盒。这些试剂盒可以包括依照本发明的任何一种或者多种疫苗，并结合了用来将疫苗传送给宿主的组合物，和/或将疫苗传送给宿主的装置如注射器。
可以以传统的主动免疫方案来给予依照本发明的疫苗以与剂量制剂相容的方式单独或者重复地给予；所给予的剂量应在疾病预防中有效，即免疫抗原或者重组体微生物的剂量能够表达可以在人体中诱导出针对致病病毒或细菌激发的免疫力的抗原，所述的病毒如致病性强的埃博拉病毒，HIV，肝炎A、B、C、D和E型病毒和bacillus tuberculous。所述的免疫力被定义为与未被接种的人体相比，在接种以后诱导显著水平的保护。
可以经由任何药用途径将本发明的疫苗即重组体病毒给予宿主、优选人受试者。给药途径包括但不限于肌肉内、气管内、皮下、鼻内、皮内、直肠、粘膜内、口和肠胃外途径给予。如果需要，可以结合使用给药途径，或者根据免疫所针对的致病病毒的类型或者想要保护的身体部位调整给药途径。
在影响所诱导免疫力的性质以及保护程度方面，给药途径可能是特别重要的。例如，尽管肠胃外给药可能只激活系统免疫应答，但是经口给予还能另外提供粘膜免疫应答。本发明重组体病毒激发粘膜免疫的这种能力使其在粘膜和性传播感染中有重要用途。
重组体病毒的剂量或者有效量可能依赖于下列因素，如疾病、所选择的病毒或者细菌抗原、宿主的年龄、体重和健康程度；而且在不同宿主之间是可以变化的。通常，本领域的技术人员应该理解，所要给予的病毒粒子数量依赖于例如疫苗给予的次数和所需应答的水平。
给予个体的本发明重组体病毒的合适滴度应该是这样的滴度，其能够调节针对病毒或者细菌抗原的免疫应答并激发针对衍生抗原的致病病毒或者细菌的抗体。可以使用下面的测试方法确定有效的滴度利用在将疫苗给予个体后确定免疫效应细胞的活性的检测；或者通过在体内使用为人熟知的诊断分析来监测治疗的效果。例如，本发明重组体腺病毒在预防学上的有效量或者剂量，可以是含有浓度大约1×104-1×108蚀斑形成单位(pfu)病毒/ml的、范围在约100μl-约10ml之间的盐水溶液。当使用其它质粒DNA载体的时候，优选的剂量范围是每次给予1-1000μg。初次免疫和加强免疫的剂量可以是相同的，或者与初次给予的剂量相比，改变在加强免疫阶段给予的重组体病毒量的理想的。本发明重组体病毒接种物的剂量取决于或者依赖于具体重组体病毒的特有性质和所要实现的特定免疫效应，如技术人员所充分鉴别的。
7.增强宿主对病原体免疫力的方法本发明还提供了用上述的重组体病毒来提高宿主对病原体免疫力的方法。
在一个实施方案中，提供了增强宿主对致病病毒的免疫力的方法。该方法包括将重组体病毒以有效剂量给予宿主以诱导免疫应答。该重组体病毒包含异源于所述良性病毒的、编码来自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，当宿主被该重组体病毒感染的时候，该病毒抗原在宿主中的表达能激发针对所述病毒抗原和表达所述病毒抗原的细胞的免疫应答；和，编码免疫刺激因子的、异源于所述良性病毒的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表达能提高所述病毒抗原的免疫原性。该重组体病毒是优选不能复制的而且不会在宿主中引起与致病病毒天然相关的恶性肿瘤。
可以经由任何药用给药途径将所述的重组体病毒给予宿主。可以经由肌肉内、气管内、皮下、鼻内、皮内、粘膜内、直肠、口和肠胃外途径对宿主给予重组体病毒。
在另一个实施方案中，提供了这样的一种方法，该方法用多个抗原免疫宿主来抗致病病毒，所述抗原激发针对这多个抗原的强烈且持久的免疫应答，从而使宿主获得针对致病病毒的免疫力。该方法包括将重组体病毒以有效剂量给予宿主以诱导免疫应答。该重组体病毒包含异源于该重组体病毒的多个抗原序列，每个序列编码来自一个或多个致病病毒的不同病毒抗原，当宿主被该重组体病毒感染的时候，所述多个抗原序列的表达能够在宿主中激发针对所述病毒抗原和表达所述病毒抗原的细胞的免疫应答。该重组体病毒可以优选为不能复制的而且不会在宿主中引起与致病病毒天然相关的恶性肿瘤。
任选地，所述的重组体病毒还可以包含一个或者多个异源于所述重组体病毒的编码免疫刺激因子的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表达能够增强病毒抗原的免疫原性。
在另一个实施方案中，提供了一种用多个遗传疫苗或者病毒免疫使宿主抗致病病毒的方法。在多个重组体病毒中，每一个重组体病毒可以携带不同的抗原。可以同时或者分步地将所述的多个重组体病毒给予宿主。
所述的方法包括以有效剂量给予宿主第一和第二重组体病毒以诱导产生抗体的免疫应答。第一重组体良性病毒包括异源于第一重组体病毒的、编码来自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，当宿主被该重组体病毒感染的时候，该病毒抗原在宿主中的表达能激发针对所述病毒抗原和表达所述病毒抗原的细胞的免疫应答。第二重组体病毒包含编码免疫刺激因子的、异源于所述第二重组体病毒的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表达能提高所述病毒抗原的免疫原性。所述的第一和第二重组体病毒可优选是不能复制的而且不会在宿主中引起与致病病毒天然相关的恶性肿瘤。
根据此实施方案，所述的第一和第二重组体病毒可以是任何良性病毒，例如不能复制的腺病毒、腺相关病毒、SV40病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、Alpha病毒、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒和痘苗病毒。任选地，第一和第二重组体病毒均可以是不能复制的腺病毒。同样任选地，第一和第二重组体病毒中的一个可以是重组体腺病毒，另一个可以是重组体痘苗病毒。
在另一个实施方案中，提供了一种用来增强宿主对病原体免疫力的方法。该方法包括给予宿主重组体病毒和一个或多个免疫刺激因子。所述的重组体病毒可以是任何上述的重组体病毒。特别地，所述的重组体病毒含有一个或者多个异源于所述重组体病毒的、编码来自该病原体的一个或多个抗原的抗原序列。当宿主被所述重组体病毒感染的时候，所述抗原在宿主中的表达能够激发针对所述抗原和表达所述抗原的细胞的免疫应答。所述的重组体病毒优选为不能复制的而且不会在宿主中引起与所述病原体天然相关的恶性肿瘤。所述的病原体可以是致病病毒如HIV、肝炎病毒和埃博拉病毒，致病细菌或寄生虫。
根据此实施方案，所述的免疫刺激因子可以是任何这样的分子，其能够增强被所述重组体病毒感染的细胞所表达的抗原的免疫原性。优选地，所述的免疫刺激因子是细胞因子，其包括但不限于白细胞介素-2，白细胞介素-8，白细胞介素-12，β-干扰素，λ-干扰素，γ-干扰素，粒细胞集落刺激因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子及其组合。
所述细胞因子可以以纯化蛋白的方式被给予宿主，或者，可以将所述细胞因子以表达载体的方式给予宿主，该表达载体在转染或者转导宿主细胞时能够表达所述细胞因子的编码序列。
根据所述方法的任何上述实施方案，所述方法还可以包括再次给予宿主所述的重组体病毒以增进免疫应答。优选在首次接种的几周到几个月后，再次使用重组体病毒进行这种加强接种。为了保证对感染持续高水平的保护作用或者保证对病原体感染引发疾病的有效治疗作用，定期如每几年进行一次再次给予宿主加强免疫是有益的。在加强免疫中所给予的重组体病毒可以与在初次免疫中所给予的重组体病毒相同，也可以不同。
同样根据所述方法的任何上述实施方案，所述方法还可以包括给予宿主这样的质粒载体，该载体所编码的抗原与所述重组体病毒所编码抗原相同或者不同。该质粒载体优选为能够在转染宿主细胞时表达抗原的真核质粒表达载体。
同样根据所述方法的任何上述实施方案，所述方法还可以包括给予所述宿主第二重组体病毒以增进免疫应答和/或使宿主免疫系统对重组体病毒的中和作用减到最低。
任选地，所述的第二重组体病毒包含来自第二病原体的第二抗原序列，其不同于在初次免疫中给予的第一重组体病毒所包含的第一抗原序列。优选地，由所述的第二抗原序列编码的抗原与由第一抗原序列编码的抗原类型相同，但来自相同病原体的不同毒株、血清型、或者亚型/进化枝。或者，与第一抗原相比，所述的第二抗原可以是不同类型的抗原，例如，第一抗原是表面蛋白，而第二抗原是相同或者不同病原体的核心蛋白。
同样根据所述方法的任何上述实施方案，所述方法还可以包括在给予宿主任何上述实施方案中的重组体病毒的之前、同时或之后，将病毒载体给予所述宿主，从而将宿主的免疫系统对所述重组体病毒的中和作用降到最低。优选地，病毒载体的给予后于重组体病毒的给予。
所述的病毒载体可以是所述重组体病毒的天然后代。例如，病毒载体可以是野生型5型腺病毒(Ad5)，而重组体病毒是遗传修饰的Ad5。
任选地，病毒载体可以不同血清型重组体病毒的野生型或者遗传修饰的病毒。例如，重组体病毒可以是遗传修饰的Ad5，而病毒载体是血清型不同于Ad5例如血清型1-4或者6-51的遗传修饰的腺病毒载体。应该注意，其它以后发现和/或分类的血清型也在本发明的范围内。
例如，重组体病毒是编码一种或者多种异源抗原和/或免疫刺激因子的重组体Ad5，而病毒载体也可以是编码相同或者不同抗原和/或免疫刺激因子但是血清型不同(例如Ad2，Ad4，Ad9，Ad12，Ad35和Ad40)的重组体腺病毒。据信这种血清型转换提高了转基因的表达并且增加了疫苗的免疫原性。为了验证这种想法，可以首先将野生型非Ad5载体给予小鼠，注射三周后用ELISA测定抗腺病毒抗体的水平。随后在首次注射后4-5周将编码异源抗原(例如HBV核心蛋白)的重组体Ad5给予小鼠。在第二次注射后的4-5周，测定针对异源抗原(如HBV核心蛋白)的抗体的水平。
同样任选地，病毒载体可以是与所述重组体病毒不同的病毒。例如，所述的重组体病毒可以是遗传修饰的Ad5，而病毒载体是遗传修饰的AAV、SV40病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、Alpha病毒、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒或痘苗病毒。该病毒载体可以含有也可以不含有异源抗原序列。优选地，该病毒载体可以含有与所述重组体病毒携带的抗原序列相同或者不同的另一段抗原序列。
同样任选地，病毒载体可以是基于重组体病毒的天然祖先进行了修饰的嵌合载体。例如，如果重组体病毒的天然祖先是5型腺病毒，那么病毒载体可以是嵌合5型腺病毒，其骨架的某些区域从5型变成了其它腺病毒血清型的相应区域。据信该方法是有利的，这是因为当仅骨架的一部分具有另一血清型的相应部分时，克隆操作是容易进行的。这可以通过构建穿梭载体实现，其方法是通过将Ad5纤维DNA包括进来并部分地或者全部地将Ad5纤维DNA与来自另一种血清型腺病毒的相应部分进行交换。如图62所示，构建右穿梭载体pR-Ad.5/35-6m以用Ad35的纤维区取代Ad5的纤维区。此右穿梭载体可以与左穿梭载体以及Ad5骨架相结合以产生嵌合Ad5载体。
迄今为止，已经鉴定出51种血清型的人腺病毒并将其分成6个亚组A-F。腺病毒进入细胞是分两步进行的，其包括病毒经由Ad纤维结黏附到膜；随后是当五邻体基底RGD基序与细胞表面的ανβ3和ανβ5整联蛋白结合时的内化。De Long等.(1999)J.Clin.Microbiol.373940；Sallusto等.(1994)J.Exp.Med.1791109；Huang等.(1995)J.Virol.692257-2263；和Mathias等.(1994)J.Virol.686811-6814。腺病毒纤维被认为是高效结合靶细胞的重要介质。亚组C，Ad5纤维利用柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)来介导高亲和力结合。Nemerow(1999)Mol.Biol.Rev.63725-734。在CAR-缺陷的细胞中，通过备选途径发生的Ad5黏附效率要差得多，所述途径涉及纤维与I类MHC重链α2结构域之间的相互作用；或者五邻体与细胞整联蛋白之间的相互作用。Bergelson等.(1997)Science2751320-1323。
腺病毒纤维可以被分为三个结构域。保守的N末端尾部含有与五邻体基底相关联的序列。De Long等.(1999)J.Clin.Microbiol.373940。柱样的纤维干含有6-23个形成β片层的重复。Davison等.(1999)J.Virol.734513。C末端包含球状的结结构域，纤维干和结都参与原发受体的相互作用。Huang等.(1996)J.Virol.704502。
根据本发明，例如，可以用腺病毒血清型1-4，和6-51骨架的相应区域替代5型腺病毒骨架中的纤维结(即头部)、干、和/或五邻体基底(即尾部)。图63显示了具有被Ad35纤维区相应结构域取代了Ad5纤维区个体结构域的嵌合载体的各种实施方案。优选地，由于结结构域被认为能够决定受体-配体的相互作用，所以用来自另一血清型腺病毒的相应结构域交换Ad5的纤维区的结结构域。
例如，所述的重组体病毒是编码一个或多个异源抗原和/或免疫刺激因子的重组体Ad5，而嵌合病毒载体也可以是编码相同或者不同抗原和/或免疫刺激因子、但是具有来自不同血清型腺病毒(例如Ad2，Ad4，Ad9，Ad12，Ad35和Ad40)纤维区的重组体Ad5。据信这种血清型转换提高了转基因的表达并且增加了疫苗的免疫原性。为了验证这种想法，可以首先将携带GFP的Ad5载体给予小鼠，注射后4周用ELISA测定抗GFP抗体的水平。随后在首次注射后4-5周将另一个也携带GFP但是具有来自不同血清型腺病毒(例如Ad9，Ad11或者Ad35)的纤维区的重组体Ad5给予小鼠。在第二次注射后的4-5周，测定针对GFP的抗体的水平。
上述的方法也可以用来预防或者治疗疾病。在治疗方法中，给予本发明的重组体病毒可以用于“预防”或者“治疗”目的。当用来预防的时候，可将所述的重组体病毒在任何症状呈现之前提供给患者。预防性给予所述的重组体病毒可用来预防或者改善任何后来的感染或疾病。当用来治疗的时候，可以在感染或者疾病症状呈现之时(或者之后)提供该重组体病毒。因此，可以在下列情况下提供本发明在预计到将要被暴露于引发疾病制剂以前，或者在感染或疾病开始和/或进展之后。
应该注意的是，本发明的创新方法也可被用于癌症疫苗的构建。例如，可以用编码肿瘤特异性抗原的序列替代任何上述重组体病毒实施方案及其使用方法中编码病毒抗原的抗原序列。在宿主中表达肿瘤特异性抗原应该能激发特异的免疫应答，以防止患者癌症发展增加的风险(即预防性免疫)或者联合其它治疗来增进癌症治疗、预防首次手术后的疾病复发(抗转移接种)、或者作为扩大体内CTL数量的工具，从而提高其根除扩散肿瘤的效力(治疗已经被确立的疾病)。另外，本发明的方法可以在患者中激发免疫应答，其在被传递回肿瘤携带者之前在离体情况下已经得到了提高(即过继免疫治疗)。
同样根据本方法的任何上述实施方案，所述的方法还可以包括在给予重组体病毒以后，收集宿主的血清。所收集的血清应该含有针对所述重组体病毒编码的抗原的抗体。任选地，所述的方法还包括在给予重组体病毒以后，从宿主分离针对病原体的一种抗体或多种抗体。可以将所收获的血清或者被分离的抗体存储一段时期以另外应用。例如，可以将一个健康的志愿者作为宿主，在预期病原体感染后或处于病原体感染过程中，将从他/她那里收集的血清或抗体作为通过激发针对病原体的被动免疫而作为预防或治疗剂给回他/她自身或者给予另一个不同的人。任选地，所述的宿主可以是非人动物，而且从被重组体病毒免疫的动物那里所收获的血清或者所分离的抗体可以被用作预防或治疗剂来治疗预期病原体感染或处于病原体感染如爆发生物战的人或非人动物。
应该注意到，任何上述包含在重组体病毒中的抗原和免疫刺激因子的DNA序列，都可以被改变和修饰而仍然保持所述突变体的相同功能。例如，可以用要被免疫的宿主例如人所优选的密码子来代替上述抗原的野生型密码子。可以制备合成的多核苷酸而使其包括“人源化”抗原的优选密码子。这种人源化的过程是有利的，这是因为由于通过使用了优选的密码子，所以重组体病毒所表达的抗原的翻译效率得以显著提高，其反过来在宿主中引起更高水平的体液和/或细胞免疫应答。所有上述的突变体应该属于本发明的范围。
核酸内切酶消化、连接和电泳的标准步骤依照生产商或者供应商的说明书进行。标准技术在这里不再详述而且为本领域的技术人员所熟知。除非另外说明，本发明的实际操作使用本领域中的常规病毒学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有详述。参见例如Sambrook，等.Molecular CloningA laboratory Manual；DNA CloningAPractical Approach，卷I & II(D.Glover编辑)；Oligonucleotide Synthesis(N.Giat，编辑)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames & S.Higgins，编辑，现行版)；Transcription and Translation(B.Hames & S.Higgins，编辑.，现行版)；Fundamental Virology，第二版，卷.I & II(B.N.Fields和D.M.Knipe，编辑)。
以下提供了实施例以描述本发明的内容，但是并不能认为本发明只限于这些实施例。
实施例对下面步骤的描述阐明了如何制备本发明的针对各种致病病毒的遗传疫苗。所述的遗传疫苗基于腺病毒载体，具有衍生于致病病毒(例如埃博拉病毒、乙肝病毒和HIV)的修饰的抗原，其被插入到腺病毒骨架中。另外，所述的重组体腺病毒还携带编码各种细胞因子的多个基因。所述的重组体腺病毒是不能复制的，但是依然保留了腺病毒的传染性。
应该注意的是，本领域的普通技术人员还可以遵照以下详细描述的类似程序来构建针对其它致病病毒、细菌和寄生虫的遗传疫苗。
1.针对埃博拉病毒的遗传疫苗以下详细描述了针对埃博拉病毒的遗传疫苗，以及构建它们的方法的实施方案。
1)埃博拉病毒膜糖蛋白的遗传修饰使用标准的分子遗传操作技术如限制性内切酶消化和聚合酶链式反应(PCR)来执行所述的修饰作用。
对埃博拉病毒的糖蛋白进行修饰以产生适用于埃博拉病毒疫苗的最适抗原。构建两种修饰类型的GP蛋白，使其具有灭活的免疫抑制和传染机制但是保留了野生型糖蛋白的天然抗原性。(1)、缺失mRNA编辑信号以防止产生免疫抑制的分泌形式糖蛋白(sGP)；和(2)、缺失糖蛋白前体的蛋白水解切割位点以防止功能性糖蛋白(GP1和GP2)的形成。Sanchez，A.，等.，Proc Natl Acad Sci U.S.A.93(8)3602-7(1996)。在一种类型中，缺失了免疫抑制肽区域以防止其功能；在另一种类型中，免疫抑制肽基序被分开以破坏其功能但保留了其免疫原性。这些步骤产生了用于所述疫苗的有效且安全的抗原。
埃博拉病毒的包膜糖蛋白(GP)被合成为一个单独的前体蛋白并在转运过程中被细胞酶(弗林蛋白酶)切割成两个亚单位(GP1和GP2)。Volchkov，V.E.，等.，Proc Natl Acad Sci U.S.A.，95(10)5762-7(1998)。这种蛋白水解切割对于成熟糖蛋白的形成和位于切割位点C末端的融合肽的释放是必需的。成熟的糖蛋白作为三聚体被整合到病毒粒子中(每个单体是通过二硫键连接的GP1和GP2的异源二聚体)Sanchez，A.，等.，J.Virol72(8)6442-7(1998)。埃博拉病毒的糖蛋白是暴露于病毒膜表面的主要蛋白，而且负责引发病毒进入宿主细胞。因此，它们是中和抗体的主要目标。
糖蛋白切割位点由从读码框起始位点开始的501位置的5个碱性氨基酸残基组成(RRTRR[SEQ ID NO10])。埃博拉病毒的糖蛋白切割位点与发现在其它病毒糖蛋白如RSV或者MuLV的包膜糖蛋白中的保守序列类似。我们以前已经显示，缺失或者点突变这些碱性氨基酸残基可以阻断切割并使糖蛋白在RSV中失去功能。Dong，J.Y，等.，J.Virol 66(2)865-74(1992)。
为了破坏埃博拉病毒糖蛋白的传染能力，这5个在切割位点的碱性氨基酸被缺失。通过使用PCR扩增来将这一缺失引入埃博拉病毒GP cDNA。或者，可以改变切割位点如通过位点特异的突变来消除切割。
埃博拉病毒的另一个重要特征在于两种类型的糖蛋白是从一个基因合成的一种为分泌形式(sGP)，另一种为膜结合形式(GP)。这两种类型的产生是由于在7个尿嘧啶(位于从起始位点开始的1020-1028位置)序列发生的选择性RNA编辑事件所致，该序列在所有4种埃博拉病毒亚型中高度保守。Sanchez，A.，等.，Proc Natl Acad Sci U.S.A.93(8)3602-7(1996)。sGP合成自未编辑的mRNA并且很可能具有免疫抑制功能。GP合成自编辑的mRNA而且很可能具有免疫抑制功能。GP合成自编辑的mRNA，其中在所述的7个尿嘧啶中的一个中具有插入。该RNA编辑引起移码并且导致编码完整的跨膜糖蛋白(GP2)的第二读码框被翻译。
为了防止sGP的合成，将RNA编辑位点从UUUUUUU[SEQ ID NO2]修饰成UUCUUCUU[SEQ ID NO3]。在cDNA中，等效序列分别是AAAAAAA[SEQ ID NO4]和AAGAAGAA[SEQ ID NO5]。这一修饰作用完成了两件事(1)所有的mRNAs只编码GP(等效于-1移码的编辑型)，和(2)虽然UUUUUU[SEQ ID NO6]与UUCUUC[SEQ ID NO7]编码相同的氨基酸残基，但是其防止了聚合酶进一步滑过这六个尿嘧啶序列的可能性。额外的编辑作用会导致缺失更多的一个尿嘧啶并且会进一步(-2)移码。这种修饰作用机制图解在图2中。
可以将第三种修饰引入到埃博拉病毒的糖蛋白中，该修饰涉及缺失位于GP2的免疫抑制(IS)肽。此IS肽基序(从起始位点开始，氨基酸585-609)在线状病毒中是高度保守的并且与已经显示出具有免疫抑制作用的致瘤逆转录病毒糖蛋白中的一个基序具有高度同源性。Volchkov，V.E.，等.，FEBS Lett 305(3)181-4(1992)；Will，C.，等.，J.Virol 67(3)1203-10(1993)；Mitani，M.，等.，Proc Natl Acad Sci U.S.A.84(1)237-40(1987)；Gatot，J.S.，等.，J.Biol Chem 273(21)12870-80(1998)；Denner，J.，等，JAcquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 12(5)442-50(1996)。首先，在该基序的核心区域(氨基酸590-600间)引入10个氨基酸缺失以去除其功能。其次，将此基序的每一半翻转并复制以破坏其功能并增加抗原性。据信针对IS肽的抗体可以在感染过程中抑制埃博拉病毒的免疫抑制功能。此修饰作用的基本策略图解在图3A-3C中。
如3A-3C所示，在GP2基因上对免疫抑制肽(IS)进行修饰。图3A图解了野生型GP。图3B图解了其IS肽被缺失了10个氨基酸的GP。图3C图解了被分开、翻转并被复制的IS肽。
经过这些修饰作用，所产生的埃博拉病毒糖蛋白是没有功能的、没有免疫抑制作用、但是它们仍然保存了GP的天然抗原性。这些被修饰的GP序列被用来产生针对埃博拉病毒的本发明疫苗的抗原。
用序列分析证实所得到的被改变的GP基因的DNA序列。随后将被修饰的GP序列克隆到质粒载体(intoplasmid vector)中，所述的质粒载体包含有对在宿主细胞中有效表达这些GPs所必需的DNA元件。表达和正确定位到细胞膜取决于HeLa或293细胞的瞬时转染，用蛋白印迹杂交和FACS进行分析，使用分别用辣根过氧化酶(HRP)或者荧光标记来标记的来自超免疫马血清的多克隆抗体和抗马第二抗体。
2)一系列介导修饰的埃博拉病毒GPs高水平表达的复制缺陷腺病毒疫苗的构建本发明的疫苗利用重组体良性病毒来携带修饰的埃博拉病毒抗原以欺骗宿主发动针对埃博拉病毒的强大的免疫防御。优选的良性病毒是不能复制的腺病毒。这些载体是疫苗表达的最佳选择，这是由于下列几个原因。首先，腺病毒载体指导抗原高水平地表达，提供了对免疫系统的强烈刺激作用。第二，这些载体表达的抗原在被转导细胞中的加工和表达模拟了病原体感染的细胞。据信这一阶段对于诱导针对被感染细胞的细胞免疫十分重要，而且在传统免疫接种方法中完全没有这一阶段。第三，腺病毒载体感染非常有效的提呈抗原细胞-树突细胞。Diao，J.等.，Gene Ther 6(5)845-53(1999)；Zhong，L.，等.，Eur J Immunol 29(3)964-72(1999)；Wan，Y.，等.，Int J Oncol 14(4)771-6(1999)；Wan，Y.，等.，Hum Gene Ther 8(11)1355-63(1997)。第四，可以对这些载体进行设计以使其携带增强免疫的细胞因子基因以进一步增强免疫力。第五，腺病毒天然感染人体的通气道和肠上皮细胞，因此可以通过经鼻喷洒或者经口摄服进行递送。最后，由于本发明的腺病毒载体是复制缺陷的而且已经被以高剂量(109-1012腹膜内/剂量)用于基因治疗研究的临床试验，因此它们是安全的。Gahery-Segard，H.，等.，J.Clin Invest 100(9)2218-26(1997)；Bellon，G.，等.，Hum Gene Ther 8(1)15-25(1997)；Boucher，R.C.，等.，Hum GeneTher 5(5)615-39(1994)。实际上，甚至活病毒也已经被安全的用于军队中的新兵以预防普通感冒。
该载体构建系统也被用于建立表达多个基因或者调控机制的复合载体。例如，所述的载体构建体被用于在单个复合载体中表达埃博拉GP抗原和多个细胞因子，以进一步增强免疫诱导。或者，可以把抗原和细胞因子置于分开的载体中。这样可以使通过用两个或者三个载体共转导(感染)从而操纵细胞因子与抗原的不同组合成为可能。
在图4中图解了腺病毒载体的构建。使用穿梭载体pLAd(图4A左侧)，将编码被修饰GP的cDNA克隆到腺病毒基因组的左末端(E1区域)，产生穿梭载体pLAd/EBO-GP。pLAd/EBO-GP载体含有包括左侧长末端重复L-TR和腺病毒包装信号ψ的腺病毒基因组左末端。使用穿梭载体pRAd(图4A，右侧)，将编码细胞因子如IL-2和IL-4的基因插入到腺病毒载体的E4区域，产生穿梭载体pRAdIL2，4。pRAdIL2，4包含包括右侧长末端重复R-TR的腺病毒基因组右末端。
为了构建只携带GP基因的腺病毒载体，用适当的限制性内切酶如XbaI消化穿梭载体pLAd/EBO-GP。将含有GP基因的片段连接到腺病毒骨架和pRAd载体。
为了构建同时在E1区域携带GP基因和在E4区域携带细胞因子基因的腺病毒载体，pLAd/EBO-GP和pRAdIL2，4被线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)。
为了产生重组体腺病毒载体，用被连接的载体基因组转染293细胞，在该细胞中，只有带有两个腺病毒末端重复的、被正确连接的基因组才能复制并产生传染性病毒颗粒。人293细胞(Graham等.，J.Gen.Virol.，3659-72(1977)，可从ATCC获得，登记号No.CRL1573)具有稳定整合到其基因组中的腺病毒E1a和E1b基因。293细胞补充了已经从载体骨架中缺失的腺病毒的必需的E1基因。最终的载体缺失了E1、E3和部分E4，其只能在293细胞中复制而不能在靶细胞中复制。腺病毒载体在293中扩增并通过在氯化铯梯度中超速离心来进行纯化。载体的滴度由系列稀释和在感染293细胞后计算感染颗粒(ip)来确定。
3)确定针对遗传疫苗的免疫应答用体外分析来对应答于疫苗而形成的中和抗体数量进行定量。该分析基于逆转录病毒载体系统，而这一系统基于莫洛尼鼠类白血病毒系统。表达GAG和POL蛋白的载体和包装细胞已经被广泛地表征并且可以商购。使用携带作为报道基因的β-半乳糖苷酶基因的包装载体构建体。将表达膜形式的埃博拉病毒GP的新的载体构建体与β-Gat报道基因载体共转染，得到GAG-POL包装细胞系，该细胞系产生埃博拉病毒GP取代了其原始包膜蛋白的逆转录病毒载体颗粒。
4)确定哪种修饰的GP抗原在动物模型中能够更好地产生中和抗体对携带两个GP变体的腺病毒疫苗载体进行测试，测试其在CD-1小鼠(Charles River实验室；来自洛克菲勒研究所(Rockefeller Institute)的远交种Swiss小鼠)中诱导针对埃博拉病毒GP的免疫应答的能力。特别是，比较了由带有和不带有IS基序的GP变体所诱导的中和抗体的滴度和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对埃博拉病毒GP抗原的活性。用105ip的、分别表达GP变体1(缺失IS肽)、GP变体2(IS肽被分开并翻转)和β-半乳糖苷酶(对照载体)的腺病毒载体皮下注入三组(每组有30只8周龄的小鼠)小鼠。在接种后的1、2、4、8和16周，处死(用二氧化碳窒息和颈脱位)每组中的6只小鼠，收集它们的血液和脾脏。另外，用盐水模拟接种6只小鼠并在两天后处死小鼠以提供免疫前对照。
对于用对照β-Gal载体注射的小鼠，其载体注射位点的组织切片被取出、固定并用X-gal溶液染色，以确定在感染后的不同时间点的载体转导细胞的数量和类型。另外，进行溶血素染色以确定在载体传递位点的各种免疫细胞(嗜中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞等等)的浸润度。
如已经描述的，使用标准的96孔板ELISA规程来测试来自被接种动物的血清的总GP结合抗体。Van Ginkel，F.W.，等.，Hum Gene Ther 6(7)895-903(1995)；Van Ginkel，F.W.，等.，J Immunol 159(2)685-93(1997)。通过在将载体与不同浓度的血清温育之后，监测埃博拉病毒GP-假型逆转录病毒载体(Wool-Lewis，等.，J.Virol，72(4)3155-60(1998))对Hela细胞的感染活性来分析血清的中和活性。将β-半乳糖苷酶在被感染细胞裂解物中的表达作为血清的中和活性的指示物(β-半乳糖苷酶活性越低，EBO-β-Gal载体已经被中和的越多)并且使用一种非常灵敏的荧光底物(Galacto-Light试剂盒J)和荧光板读数器来进行测量。将抗-GP血清中和的感染率与不存在血清并且存在非-GP活化的血清情况下的感染率作比较。
如前所述，从小鼠的脾脏中提取细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。VanGinkel，F.W.，等.，Hum Gene Ther 1995；6(7)895-903；Dong，J.Y.，等.，Hum Gene Ther 1996；7(3)319-31。将它们与恒定数量的分离的LnCaP细胞(上皮来源的前列腺癌细胞)混合在一起，所述的LnCaP细胞被携带未修饰的埃博拉病毒GP蛋白的腺病毒载体所转导。使用10∶1、3∶1和1∶1的效应物∶靶细胞比率。将细胞种入96孔板，24小时后，移除所有未黏附的细胞(包括所有的效应物CTLs和死亡或濒死的LnCaP细胞)，用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-20-基)2，5-联苯基四唑溴化物)切割分析来定量剩下的存活(黏附的)细胞。这种分析已经被用来测定淋巴细胞的细胞毒活性(Ni，J.，等.，J Clin Lab Anal 1996；10(1)42-52)，而且与放射性分析方法比较，其在灵敏度、可信度和速度上更有优势。
5)复合细胞因子的免疫增强功能及其对遗传疫苗效力的影响为了扩大疫苗的效果，导入载体介导的基因以表达免疫增强细胞因子如使用IL-2，IL-4，IL-12，INF-γ和GM-CSF。起先，分别克隆每种细胞因子，或者以各种组合将细胞因子克隆到与编码病毒抗原的载体分开的腺病毒载体中。通过共转染编码细胞因子的载体和携带抗原的载体，研究个体细胞因子或其组合的免疫增强效应。比较血清抗体的滴度，比较在动物体中达到有效滴度所需的时间，所述的动物体被接种了结合了各种表达细胞因子的载体的疫苗。这些实验可以确定是否免疫增强细胞因子能够诱导更高水平的抗体、缩短诱导时间、和延长针对埃博拉病毒的免疫力。
在确定了表现最佳的被修饰的GP变体后，通过向免疫位点共传递携带分析的各种细胞因子的载体增强其所激发的免疫应答的程度。已经证实白细胞介素-2自身或者其与IL-4或IL-12的组合大大增强细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞和B细胞的活化和增殖。Michael，B.N.等.，CellImmunol 1994；158(1)；105-15；Bruserud，O.，等.，Eur J.Haematol 1992；48(4)；221-7；Jacobsen，S.E.，等.，Res Immunol 1995；146(7-8)506-14；Wolf，S.F.，等.，Res Immunol 1995；146(7-8)；486-9；Tepper，R.I.，Res Immunol1993；144(8)633-7；O′Garra A.，等.，Res Immunol 1993；144(8)620-5；Ohe，Y.，等.，Int J Cancer 1993；53(3)432-7；Delespesse，G.，等.，Res Immunol1995；146(7-8)461-6.[36-43]。IFN-γ刺激体液免疫应答并在其分泌部位增加血管壁的渗透性(Chensue，S.W.等.，J Immunol 154(11)5969-76(1995)；Szente，B.E.，等.，Biochem Biophys Res Commun 203(3)1645-54(1994)；Adams R.B.等.，J Immunol 150(6)2356-63(1993))，而Gm-CSF激活并吸引巨噬细胞和其它专职APCs到达感染位点。Bober，L.A.，等.，Immunopharmacology 29(2)111-9(1995)；Dale，D.C.，等.，Am J.Hematol57(1)7-15(1998)；Zhao，Y.，等.，Chung Hua I Hsueh Tsa Chih 77(10)32-6(1997)。
用5×104ip的选择的GP变体载体和5×104ip的下述载体Ad-β-Gal、Ad-IL2、Ad-IL2/IL4、Ad-IL2/IL12、Ad-IFN-γ和Ad-GM-CSF之一的混合物皮下注射6组30只8周龄小鼠。
处死每组的六只小鼠所述在第1，2，4，8和16周分析。使用ELISA分析总IgG，作为干扰EBO-GP假型逆转录病毒载体感染HeLa细胞的能力分析中和活性，并通过混合脾提取的CTL和用如实施例4所述的Ad-EBO-GP构建体转导的靶LnCaP细胞进行抗GP CTL分析。血清中各种细胞因子的水平也通过利用可商购检验的ELISA定量。在一些情况下，这些检测可在相同细胞因子的人和鼠版间区分，提供使用腺病毒载体递送的细胞因子的表达水平和它们如何与免疫应答的发展相关的直接信息。
在分析完个体细胞因子后，组合检测那些效果最好的。用5×104i.p.选择的GP变体载体和5×104i.p.高达3种选择的表达细胞因子的载体(如果使用少于3种细胞因子载体，则用Ad-β-Gal载体补足i.p.数)的混合物皮下注射四组30只8周龄的小鼠。在1，2，4，8和16周处死每组6只小鼠，并如上所述分析。
为了证明不同物种中对GP载体和多个细胞因子的免疫应答的强烈和可再现的性质，在兔中再次进行如上所述的实验。如上所述，用下述载体组合之一注射5组六只白新西兰兔股肌肉Ad-β-Gal载体(106ip)，选择的GP载体(2.5×105每种细胞因子载体)和GP载体(2.5×105ip)。在接种前2天将动物放血(免疫前放血)，然后按照上述程序进行。每段时间取5-10ml血。以类似于小鼠的方式进行分析(参见上述内容)。
由于编码人细胞因子的基因被应用于小鼠和兔模型，所以它们的免疫系统对那些蛋白有可能具有不相同(对人而言)的应答。但是，人和鼠的细胞因子及其受体之间存在高度的同源性，已经发表的文献报道，在小鼠实验中使用人和其它宿主的细胞因子，结果显示了高水平的同等性。如果需要，可以获得这些细胞因子的物种特异性版本并将其克隆到本发明的腺病毒载体中以用于物种靶向的细胞因子活性研究。
6)最优化给予疫苗的效率和速度，在非灵长类动物和灵长类动物模型中进行安全性和病原激发研究在确定了细胞因子和抗原的最佳组合以后，构建最终版本的疫苗载体。这些复合重组体腺病毒载体使用单个载体将细胞因子与抗原的组合传递到靶细胞中。在小鼠和兔中进行剂量-滴度分析以鉴定产生最大水平免疫应答所需的最低剂量。比较疫苗给予的不同路径，例如肌肉内和静脉内注射，经口摄服以及经鼻喷洒。对于安全研究，在小鼠和兔中进行剂量扩大实验，直到观察到毒性或者直到达到了有效剂量10倍的水平。最后，在灵长类动物中进行附加的安全性和病原激发实验。
2.针对HIV的遗传疫苗以下详细描述了针对HIV的遗传疫苗及其构建方法的具体实施方案。A.针对HIV的复制缺陷腺病毒疫苗的构建1)Ad-E.T.R/IL2构建腺病毒载体Ad-E.T.R/IL2以使其在相同的载体中同时携带编码多个HIV抗原包括Env、Tat和Rev蛋白和白细胞介素-2(IL-2)的序列。HIV抗原和IL-2的表达由位于腺病毒载体不同区域的启动子分别控制。据信这一设计可以确保同时高水平表达病毒抗原和免疫刺激因子IL-2，并能够增强腺病毒疫苗的免疫原性。如下一部分中的实验数据所示，该腺病毒载体能够在动物中激发针对HIV抗原的强烈的体液免疫应答。
使用类似于如上详细描述构建针对埃博拉病毒的腺病毒疫苗那样的策略来构建腺病毒载体Ad-E.T.R/IL2。简而言之，使用穿梭载体，将编码野生型包膜糖蛋白gp160(全长gp120和gp41)、全长野生型Tat和全长野生型Rev的来自HIV-1毒株BH10的EcoRI/XhoI酶切片段(HIV-1或者HTLV-IIIB，进化枝B，登记号NoM15654)插入到腺病毒基因组的左末端(E1区域)，产生穿梭载体pLAd-E.T.R(图16A)。在图38中显示了该EcoRI/XhoI限制酶切片段的DNA序列[SEQ ID NO14]。
使用穿梭载体，将编码IL-2的序列(在氨基酸位置79将CTA沉寂突变成CTT以缺失XbaI位点)插入到腺病毒载体的E4区域，产生穿梭载体pRAd-ORF6-IL2(图16B)。在图39中显示了编码此突变IL-2(IL-2ΔX)的DNA序列[SEQ ID NO15]。
使用适当的限制性酶如XbaI和EcoRI将pLAd-E.T.R和pRAd-OFR6-IL2线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体Ad-E.T.R/IL2。
2)Ad-3C/EmΔCΔT300-G构建另一个腺病毒载体Ad-3C/EmΔCΔT300-G以使其在相同的载体中携带编码多个HIV抗原的序列和3个不同的细胞因子(在氨基酸位置79将CTA沉寂突变成CTT以缺失XbaI位点的IL-2、INF-γ和GM-CSF)，所述的HIV抗原包括缺失了gp120和gp41之间的切割位点和胞质结构域的修饰的Env(gp160)和Gag蛋白。HIV抗原和所述细胞因子的表达由位于腺病毒载体不同区域的启动子分别控制。据信这一设计可以确保同时高水平表达病毒抗原和免疫刺激因子和增强腺病毒疫苗的免疫原性。如下一部分中的实验数据所示，该腺病毒载体能够在动物中激发针对HIV抗原的强烈的体液免疫应答。
使用类似于如上详细描述构建针对埃博拉病毒的腺病毒疫苗那样的策略来构建腺病毒载体Ad-3C/EmΔCΔT300-G。简而言之，对来自HIV-1毒株BH10的、编码Env/gp160(核苷酸位置5580-7850)的序列进行修饰以缺失编码切割位点(REKR[SEQ ID NO11]由位置7101-7112的核苷酸编码)和100个氨基酸长度的胞质结构域(由在位置7850-8150的核苷酸编码)的序列，而后，使用穿梭载体，将其与编码全长Gag的序列一起插入到腺病毒基因组的右末端(E4区域)。图40和41A分别显示了此被修饰Env(EmΔCΔT(BH10)的DNA序列[SEQ ID NO16]和全长Gag的DNA序列[SEQ ID NO17](其氨基酸序列为SEQ ID NO18，图41B)。
这两个HIV抗原分别从一个CMV启动子、在两个剪接受体位点SA1和SA2经由剪接供体(SD)和受体(SA)机制表达。为了促进对各种基因片段的有效克隆，构建克隆载体SD/SA1.2.3以使其包括逆转录病毒SD位点和多个逆转录病毒SA位点SA1，SA2，SA3和SA4。在此实施例中，SD和SA位点衍生于莫洛尼鼠类白血病毒(MMLV)，它们的序列如下所示SD位点(MMLV nt204-210)AGGTAAG[SEQ ID NO72]；和SA1-4位点(MMLV nt560-568)CTGCTGCAG[SEQ ID NO73]。使用标准的PCR诱变，将每一个SD位点以及具有相同序列的SA1，SA2，SA3和SA4(SA1-4)位点插入到克隆载体pSP73的多克隆位点。如图37所示，SA1被插入到紧接着SD位点下游，其后是SA2，SA3和SA4。为了测试经由SD/SA机制的多个基因的表达水平，将GFP(绿色荧光蛋白)基因插入到SD/SA1与SA2，SA2与SA3，SA3与SA4之间，以及SA4之后。在这四个位点中表达水平的比例是10∶1∶5∶4。
将编码EmΔCΔT300和Gag的DNA序列分别在SD/SA1以及SA2之后插入到克隆载体SD/SA1.2.3。用EcoR V和Xho I消化所得到的载体，将包含EmΔCΔT和Gag的片段插入到腺病毒穿梭载体中，得到pRAd-ORF6-cmv-EmΔCΔT300-G(图17A)。使用相同的策略构建能够经由逆转录病毒SD/SA机制表达其它蛋白的穿梭载体(如下所示)。
使用穿梭载体，将编码多个免疫刺激因子的序列插入到腺病毒基因组的E1区域，所述的免疫刺激因子包括IL-2(带有由Xba I位点缺失导致的沉寂突变)、INF-γ和GM-CSF。这三种免疫刺激因子经由逆转录病毒剪接供体(SD)和受体(SA)机制，在三个剪接受体位点SA1、SA2和SA3从另一个CMV启动子分别地表达。所得到的穿梭载体被命名为pLAd-3C(图17B)。
使用适当的限制性酶如XbaI和EcoRI将pRAd-ORF6-cmv-EmΔCΔT300-G和pLAd-3C线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体Ad-3C/EmΔCΔT300-G。
3)Ad-3C/EmΔCΔT99.T.R-G构建另一个腺病毒载体Ad-3C/EmΔCΔT99.T.R-G以使其在一个相同的载体中携带编码多个来自毒株pNL4-3的HIV抗原的序列(登记号NoM19921)和3个不同的细胞因子(在氨基酸位置79将CTA沉寂突变成CTT以缺失XbaI位点的IL-2、INF-γ和GM-CSF)，所述的HIV抗原包括修饰的Env(缺失了33个氨基酸长度的切割位点和胞质结构域的gp160)，全长Rev和Gag蛋白。HIV抗原和所述细胞因子的表达由位于腺病毒载体不同区域的启动子分别控制。据信这一设计可以确保同时高水平表达病毒抗原和免疫刺激因子，并能够增强腺病毒疫苗的免疫原性。如下一部分中的实验数据所示，该腺病毒载体能够在动物中激发针对HIV抗原的强烈的体液免疫应答。
使用类似于如上详细描述构建针对埃博拉病毒的腺病毒疫苗那样的策略来构建腺病毒载体Ad-3C/EmΔCΔT99.T.R-G。简而言之，对来自HIV-1毒株pNL4-3的、编码Env/gp160(核苷酸位置6221-8686)的序列进行修饰以缺失在长度上编码切割位点(由位置7736-7747的核苷酸编码)和胞质结构域(由在位置8687-8785的核苷酸编码)的序列，而后，使用穿梭载体，将其与编码全长Tat、Rev和Gag(来自HIV毒株BH10)的序列一起插入到腺病毒基因组的右末端(E4区域)。
这三种HIV抗原经由逆转录病毒剪接供体(SD)和受体(SA)机制，在三个剪接受体位点SA1、SA2和SA3从CMV启动子分别地表达。所得到的穿梭载体被命名为pRAd-EmΔCΔT99.T.R-G(图18)。在图42中显示了编码被修饰的Env以及全长Tat和Rev的DNA序列[SEQ ID NO19]。在图41A和41B中分别显示了来自HIV毒株BH10的全长Gag的DNA[SEQ ID NO17]和氨基酸序列。
使用适当的限制性酶如XbaI和EcoRI将穿梭载体pRAd-EmΔCΔT99.T.R-G和pLAd-3C(图17B)线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体Ad-3C/EmΔCΔT99.T.R-G。
4)Ad-EmΔV1，2ΔCΔT99.T.R-IL2/G.IL2构建另一个腺病毒载体Ad-EmΔV1，2ΔCΔT99.T.R-IL2/G.IL2以使其携带编码多个来自HIV-1毒株pNL4-3的HIV抗原的序列。对来自HIV-1毒株pNL4-3的、编码Env/gp160的序列(核苷酸位置6221-8686)进行修饰，以缺失编码V1和V2环的位于6602-6796nt的序列并且插入编码氨基酸序列GAG[SEQ ID NO13]的核苷酸序列GGA GCT GGT[SEQ ID NO12]。同样对此HIV Env/gp160进行修饰以缺失由位于7736-7747(ΔC)的核苷酸编码的切割位点以及由位于8687-8785(ΔT99)的核苷酸编码的33个氨基酸的胞质结构域。使用穿梭载体，将此修饰的env与编码全长Rev(R)和Tat(T)的序列一起插入到腺病毒基因组的左末端(E1区域)。在图43中显示了编码插入物(EmΔV1，2ΔCΔT.T.R)的DNA序列[SEQ ID NO20]。
另外，将IL-2(带有由XbaI位点缺失导致的沉寂突变，DNA SEQ IDNO15)插入到被修饰的env的下游。将修饰的Env和IL-2经由逆转录病毒剪接供体(SD)和受体(SA)机制，在两个剪接受体位点SA1和SA2/SA3从CMV启动子分别地表达。所得到的穿梭载体被命名为pLAd-EmΔV1，2ΔCΔT.T.R-IL2(图19A)。
使用穿梭载体，将编码IL-2的序列(带有由Xba I位点缺失导致的沉寂突变，DNA SEQ ID NO15)和编码来自HIV-1毒株BH10的Gag的序列(nt 112-1650，DNA SEQ ID NO17)插入到腺病毒基因组的E4区域。将这两个蛋白经由逆转录病毒剪接供体(SD)和受体(SA)机制，在两个剪接受体位点SA1和SA2从CMV启动子分别地表达。所得到的穿梭载体被命名为pRAd-ORF6-G.IL2(图19B)。
使用适当的限制性酶将pLAd-cmv-EmΔV1，2ΔCΔT.T.R-G和pRAd-ORF6-G.IL2线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体Ad-EmΔV1，2ΔCΔT.T.R-G/G.IL2。
5)Ad-EmΔC.T.R.N/G.IL2构建另一个腺病毒载体Ad-EmΔC.T.R.N/G.IL2以使其携带编码多个来自HIV-1毒株BH10的HIV抗原的序列。通过缺失Env的编码切割位点的序列和插入SpeI限制性内切位点对来自HIV-1毒株BH10的、编码全长Env/gp160(核苷酸位置5580-8150)，Tat，Rev和Nef的序列进行修饰。在图44中显示了该插入物的DNA序列[SEQ ID NO21]，使用穿梭载体，将该序列插入到腺病毒基因组的左末端(E1区域)，得到穿梭载体pLAd-EmΔC.T.R.N(图20)。
使用适当的限制性酶将pLAd-EmΔC.T.R.N和pRAd-ORF6-G.IL2(图19B)线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体Ad-EmΔC.T.R.N/G.IL2。
6)Ad-EmΔC.N/G.IL2构建另一个腺病毒载体Ad-EmΔC.N/G.IL2以使其携带编码多个来自HIV-1毒株BH10的HIV抗原的序列。通过缺失编码Env、Tat和Rev切割位点的序列和插入SpeI限制性内切位点对来自HIV-1毒株BH10的、编码全长Env/gp160(核苷酸位置5580-8150，具有前述的Kozak序列)，Tat，Rev和Nef的序列进行修饰。在图45中显示了该插入物的DNA序列[SEQ ID NO22]，使用穿梭载体，将该序列插入到腺病毒基因组的左末端(E1区域)，得到穿梭载体pLAd-EmΔC.N(图21)。
使用适当的限制性酶将pLAd-EmΔC.N和pRAd-ORF6-G.IL2(图19B)线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体Ad-EmΔC.N/G.IL2。
7)Ad-EmΔCΔT300.T/G.IL2构建另一个腺病毒载体Ad-EmΔCΔT300.T/G.IL2以使其携带编码多个来自HIV-1毒株BH10的HIV抗原的序列。通过缺失编码切割位点的序列和编码胞质结构域的300nt序列，但是仍然包含全长的Tat(T)序列，对来自HIV-1毒株BH10的、编码全长Env/gp160(核苷酸位置5580-8150)的序列进行修饰。在图46中显示了该插入物的DNA序列[SEQ ID NO23]，使用穿梭载体，将该序列插入到腺病毒基因组的左末端(E1区域)，得到穿梭载体pLAd-EmΔCΔT300.T(图22)。
使用适当的限制性酶将pLAd-EmΔCΔT300.T和pRAd-ORF6-G.IL2(图19B)线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体Ad-EmΔCΔT300.T/G.IL2。
8)Ad-EmΔC/EmΔC构建另一个腺病毒载体Ad-EmΔC/EmΔC以使其携带编码两个拷贝的修饰的来自HIV-1毒株BH10的Env的序列。通过缺失编码切割位点的序列，对来自HIV-1毒株BH10的、编码全长Env/gp160(核苷酸位置5580-8150)的序列进行修饰。在图47中显示了修饰的Env的DNA序列[SEQ ID NO24]，使用穿梭载体，将该序列插入到腺病毒基因组的左末端(E1区域)，得到穿梭载体pLAd-EmΔC(图23A)。
使用穿梭载体，将编码修饰的Env(EmΔC)的DNA序列[SEQ IDNO24]同样插入到腺病毒基因组的E1区，得到穿梭载体pRAd-ORF6-EmΔC(图23B)。
使用适当的限制性酶将pLAd-EmΔC和pRAd-ORF6-EmΔC线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体Ad-EmΔC/EmΔC。
9)Ad-Em.V3m/G.IL-2构建另一个腺病毒载体Ad-Em.V3m/G.IL-2以使其携带编码具有多进化枝V3环的修饰的HIV-1 Env和Gag和IL-2的序列。在图48中显示了编码来自HIV-1 M组中的进化枝B，A，C，D，E，F和G的V3环的序列。如图48所示，对于进化枝B(HIV-1毒株BH10)选择编码V3环，nt885-992的DNA序列[SEQ ID NO25]。在该具体实施方案中，对于进化枝A(HIV-1毒株192UG037WHO.01083hED)选择编码V3环，nt888-992的DNA序列[SEQ ID NO26]。对于进化枝C(HIV-1毒株192BR025WHO.01093hED)选择编码V3环，nt876-980的DNA序列[SEQID NO27]。对于进化枝D(HIV-1毒株192UG024.2)选择编码V3环，nt888-989的DNA序列[SEQ ID NO28]。对于进化枝E(HIV-1毒株193TH976.17)选择编码V3环，nt894-998的DNA序列[SEQ ID NO29]。对于进化枝F(HIV-1毒株193BR020.17)选择编码V3环，nt888-992的DNA序列[SEQ ID NO30]。对于进化枝G(HIV-1毒株192RU131.9)选择编码V3环，nt885-989的DNA序列[SEQ ID NO31]。
通过PCR连接编码来自HIV进化枝A，C，D，E，F和G的V3环的DNA序列，以形成含多进化枝V3环的单一片段。克隆这些来自它们的同源HIV进化枝的V3环的引物列于图57。由于HIV进化枝B的V3环已经包含在HIV-1gp120骨架中，所以将克隆的来自进化枝A，C，D，E，F和G的V3环插入到进化枝B的V3环之后。
图24描述了这样一个过程用PCR产生连接的多进化枝V3环并随后将其克隆到编码修饰的进化枝B的gp120的构建体中。如图24所示，使用列在图57中的一组正向和反向引物，用PCR分别地扩增编码来自进化枝A，C，D，E，F和G的包膜V3环区域的每个基因片段。PCR循环的参数如下，变性94℃1分钟；退火50-60℃30秒钟；和延伸72℃1分钟；共20个循环。
用PCR将编码一个进化枝V3环的PCR产物与另一个相连接。例如，将编码进化枝A和C V3环的PCR产物混合在一起、连接、并使用图24中所示的引物1和4进行PCR扩增，产生A/C片段。类似地，使用引物5和8来产生编码连接的进化枝D和E的V3环的PCR产物，产生D/E片段；使用引物9和12(图24)的进化枝F和G，产生F/G片段。
仍然参照图24，使用引物1和8，用PCR连接A/C和D/E片段，并在EcoRI和BamHI位点将其克隆进载体。用BamHI和Xbal限制性消化F/G片段，并将其与序列A/C/D/E融合以产生多进化枝序列ACDEFG(V3m)。
为了产生两个重复的多进化枝ACDEFG序列，用AvaI(在引物1和12)限制性消化编码多进化枝ACDEFG序列的PCR终产物并头尾重新连接，产生两个重复的多进化枝序列2×V3m。随后在编码gp120的构建体中，将编码V3m或者2×V3m的DNA序列插入到编码进化枝B V3环序列的后面，所述的构建体被修饰如下。
编码HIV毒株BH10(进化枝B)的Env(nt5580-8150)的DNA序列被如下修饰a)缺失编码切割位点(nt7101-7112)的序列；b)缺失V1和V2环(nt5961-6161)并插入编码氨基酸序列GAG[SEQ ID NO13]的核苷酸序列GGA GCT GGT[SEQ ID NO12]；c)在位置nt6572插入多进化枝V3环(V3m)序列；和d)用编码乙二醇磷脂酰肌醇(glycophosphatidylinositol)的GPI锚定序列SWLLLLLLSLSLLQATDFMSL[SEQ ID NO9]来替代gp41跨膜结构域序列。在图49A中显示了编码此被修饰的Env的DNA序列[SEQ ID NO32](其氨基酸序列是SEQ ID NO33，图49B)，使用穿梭载体，将该序列插入到腺病毒基因组的左末端(E1区域)，产生穿梭载体pLAd-Em.V3m(图25)。
使用适当的限制性酶将pLAd-Em.V3m和pRAd-ORF6-G.IL2(图19B)线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体Ad-Em.V3m./G.IL2。
10)穿梭载体pLAd-Em.2xV3m为了增加多进化枝V3环的表达水平，将编码两个重复的V3m序列(2xV3m，如上构建)的序列插入到上述部分9)中所述编码修饰的Env的序列中。将得到的穿梭载体表示为pLAd-Em.2xV3m，并显示在图26中。
11)编码p17和/或p24的穿梭载体天然状态下，Pr55 Gag蛋白可被加工成4种不同的蛋白，p17MA，p24CA，p7NC和p6。p17MA蛋白保持与脂包膜的内部相关，并且在将包膜锚定到病毒颗粒中发挥重要作用。所有逆转录病毒的p24CA蛋白包含有效的病毒复制和颗粒产生所需的主要同源区(MHR)。获得的elispot数据暗示p17MA(或p17)和p24CA(或p24)可能有意义地负责在作肽图实验Pr55 gag蛋白中特异CTL应答。依照本发明，这些HIV结构蛋白由重组体病毒表达，以激发针对HIV感染的特异CTL应答。此外，这些结构蛋白可被修饰以包括信号肽序列(如由SEQ ID NO74atgagagtgaaggagaaatatcagcacttgtggagatgggggtggagatggggcaccatgctccttgggatgttgatgatctgtagtgct所编码的HIV gp120信号肽)，以促进这些胞内蛋白由被感染的细胞所分泌。而且，通过向分泌形式的HIV蛋白加入膜锚定结构域(如由SEQ ID NO75ttattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctgtagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaatcccgagggga所编码的HIV gp41跨膜结构域)，使得这种修饰的HIV结构蛋白被赋予了膜结合特性，其更好地将HIV抗原提呈给机体的免疫系统。这些修饰可以赋予突变体抗原比胞内捕获的天然抗原更强烈的免疫原性。
构建腺病毒穿梭载体以编码加工的Gag蛋白，p17，p24和p17/p24，每个以3种不同形式存在天然形式，分泌形式和膜结合形式。
3种形式的p17/p24的DNA序列[SEQ ID NO34-36]示于图50A中(相应的氨基酸序列[SEQ ID NO37-39]，图50B)，并且使用穿梭载体每个插入到腺病毒基因组的E4区，分别产生穿梭载体pRAd-ORF6-p17/24(天然形式，图27A)，pRAd-ORF6-p17/24sec(分泌形式，图27B)和pRAd-ORF6-p17/24MB(膜结合形式，图27C)。
在图51A中显示了三种形式p17的DNA序列[SEQ ID NOs40-42](对应的氨基酸序列为[SEQ ID NOs43-45，图51B])，并且使用穿梭载体将每个插入到腺病毒基因组的E4区域，分别得到穿梭载体pRAd-ORF6-p17(天然形式，图28A)，pRAd-ORF6-p17sec(分泌形式，图28B)和pRAd-ORF6-p17MB(膜结合形式，图28C)。
在图52A中显示了三种形式p24的DNA序列[SEQ ID NOs46-48](对应的氨基酸序列为[SEQ ID NOs49-51，图52B])，使用穿梭载体将每个插入到腺病毒基因组的E4区域，分别得到穿梭载体pRAd-ORF6-p24(天然形式，图29A)，pRAd-ORF6-p24sec(分泌形式，图29B)和pRAd-ORF6-p24MB(膜结合形式，图29C)。
可以以组合的方式将以上构建的pLAd-和pRAd-穿梭载体组合起来以产生更多样的重组体腺病毒载体。以下仅是这样的重组体腺病毒载体的几个实例。
12)Ad-Em.2xV3m/p17/24MB图30A-B描述了这样的重组体腺病毒载体的构建，其编码被修饰的、含有两个拷贝多进化枝V3环和膜结合形式p17/p24的Env。如图30A-B中所示，使用限制性酶EcoRI和XbaI将pLAd-Em.2xV3m(载体的详细资料见图26)和pRAd-ORF6-p17/24MB(载体的详细资料见图27C)线性化并连接到腺病毒的骨架，得到重组体腺病毒载体Ad-Em.2xV3m/p17/24MB。
13)Ad-Em.2xV3m/p17MB图31A-B描述了这样的重组体腺病毒载体的构建，其编码被修饰的、含有两个拷贝多进化枝V3环和膜结合形式p17的Env。如图31A-B中所示，使用限制性酶EcoRI和XbaI将pLAd-Em.2xV3m(载体的详细资料见图26)和pRAd-ORF6-p17MB(载体的详细资料见图28C)线性化并连接到腺病毒的骨架，得到重组体腺病毒载体Ad-Em.2xV3m/p17MB。
14)Ad-Em.2xV3m/p24MB图32A-B描述了这样的重组体腺病毒载体的构建，其编码被修饰的、含有两个拷贝多进化枝V3环和膜结合形式p24的Env。如图32A-B中所示，使用限制性酶EcoRI和XbaI将pLAd-Em.2xV3m(载体的详细资料见图26)和pRAd-ORF6-p24MB(载体的详细资料见图29C)线性化并连接到腺病毒的骨架，得到重组体腺病毒载体Ad-Em.2xV3m/p24MB。
15)Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T./p17/24sec编码来自HIV毒株BH10的Env的DNA序列(包含Tat1(nt5189-5403)和Tat2(7734-7779))被修饰如下a)缺失编码切割位点(nt7101-7112)的序列；b)缺失V1和V2环(nt5961-6161)并插入编码氨基酸序列GAG[SEQ ID NO13]的核苷酸序列GGA GCT GGT[SEQ ID NO12]；c)在位置nt6572插入两个拷贝的多进化枝V3环(2×V3m)序列；和d)缺失100个氨基酸长度的胞质结构域(由位置7850-8150的核苷酸编码)。在图53A中显示了编码此被修饰的Env的DNA序列[SEQ ID NO52](其氨基酸序列是SEQ ID NO53，图53B)，使用穿梭载体，将该序列插入到腺病毒基因组的左末端(E1区域)，产生穿梭载体pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T(图33)。
使用适当的限制性酶将pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T和pRAd-ORF6-p17/24sec(图27B)线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T./p17/24sec。
16)Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T./p17/24MB使用适当的限制性酶将pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T(图33)和pRAd-ORF6-p17/24MB(图27C)线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T./p17/24MB。
17)Ad-EmΔCΔT99.2xV3m.T.R/p17/24sec编码来自HIV毒株BH10的Env的DNA序列(包含Tat1(nt5189-5403)，Rev1(nt5328-5403)，Tat2(7734-7779)和Rev2(7734-8008))被修饰如下a)缺失编码切割位点(nt7101-7112)的序列；b)缺失V1和V2环(nt5961-6161)并插入编码氨基酸序列GAG[SEQ ID NO13]的核苷酸序列GGA GCT GGT[SEQ ID NO12]；c)在位置nt6572插入两个拷贝的多进化枝V3环(2×V3m)序列；和d)缺失33个氨基酸长度(nt8687-8785)的胞质结构域。在图54A中显示了编码此被修饰的Env的DNA序列[SEQ ID NO54](其氨基酸序列是SEQ ID NO55，图54B)，使用穿梭载体，将该序列插入到腺病毒基因组的左末端(E1区域)，产生穿梭载体pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T.R(图34)。
使用适当的限制性酶将pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T.R和pRAd-ORF6-p17/24sec(图27B)线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体Ad-EmΔCΔT99.2xV3m.T.R/p17/24sec。
18)Ad-EmΔCΔT99.2xV3m.T.R/p17/24MB使用适当的限制性酶将pLAd-EmΔCΔT99.2xV3m.T.R(图34)和pRAd-ORF6-p17/24MB(图27C)线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体Ad-EmΔCΔT99.2xV3m.T.R/p17/24MB。
19)Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T/G.PI作肽图和Elispot数据显示，Gag蛋白的特定区域可能在激发被本发明腺病毒载体所免疫的动物中的CTL应答方面起重要的作用。为了促进腺病毒载体有效表达p17MA和p24CA，在穿梭载体pRAd-ORF6-G.PI中，将编码来自HIV毒株BH10的pol区的蛋白酶的DNA序列(PI，DNA SEQID NO56，图55A；氨基酸SEQ ID NO57，图55B)插入到Gag编码序列的下游区(图35)。如图35所示，Gag和PI经由逆转录病毒剪接供体(SD)和受体(SA)机制，在两个剪接受体位点SA1和SA2/SA3从CMV启动子分别表达。
使用适当的限制性酶将pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T(图33)和pRAd-ORF6/G.PI(图35)线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T/G.PI。
20)Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T/G-PI或者，通过在位置nt1410插入一个C残基以使pol处于与gag相同的读码框之内，HIV蛋白酶PI可以与Gag一起被表达为融合蛋白。在图56A和56B中，分别显示了Gag-PI融合蛋白的DNA[SEQ ID NO58]和氨基酸[SEQ ID NO59]序列。如图36所示，在相同读码框内Gag和PI从相同的CMV启动子表达。所得到的穿梭载体被命名为pRAd-ORF6/G-PI。
使用适当的限制性酶将pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T(图33)和pRAd-ORF6/G-PI(图36)线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T/G-PI。
21)pRAd-ORF6-Gag/PI-RT在穿梭载体pRAd-ORF6-Gag/PI-RT中中，将编码来自HIV毒株BH10pol区域的蛋白酶(PI)和逆转录酶(RT)的DNA序列插入到Gag编码序列的下游区(图58)。如图58所示，Gag和PI-RT经由逆转录病毒剪接供体(SD)和受体(SA)机制，在两个剪接受体位点SA1和SA2/SA3从CMV启动子分别表达。
可以将右穿梭载体pRAd-ORF6-Gag/PI-RT与上述任何左穿梭载体(pLAd)结合以产生重组体腺病毒载体。
22)pRAd-ORF6-Gag-PI-RT或者，通过在位置nt1410插入一个C残基以使pol处于与gag相同的读码框之内，PI-RT可以与Gag一起被表达为融合蛋白。如图59所示，在相同读码框内Gag和PI-RT从相同的CMV启动子表达。所得到的穿梭载体被命名为pRAd-ORF6-Gag-PI-RT。
可以将右穿梭载体pRAd-ORF6-Gag-PI-RT与上述任何左穿梭载体(pLAd)结合以产生重组体腺病毒载体。
23)pRAd-ORF6-Gag/Pol在穿梭载体pRAd-ORF6-Gag/Pol中，将编码来自HIV毒株BH10 pol区域的HIV酶PI、RT和IN的DNA序列插入到Gag编码序列的下游区(图60)。如图60所示，Gag和Pol经由逆转录病毒剪接供体(SD)和受体(SA)机制，在两个剪接受体位点SA1和SA2/SA3从CMV启动子分别表达。
可以将右穿梭载体pRAd-ORF6-Gag/Pol与上述任何左穿梭载体(pLAd)结合以产生重组体腺病毒载体。
24)pRAd-ORF6-Gag-Pol或者，通过在位置nt1410插入一个C残基以使pol处于与gag相同的读码框之内，Pol可以与Gag一起被表达为融合蛋白。如图61所示，在相同读码框内Gag和Pol从相同的CMV启动子表达。所得到的穿梭载体被命名为pRAd-ORF6-Gag-Pol。
可以将右穿梭载体pRAd-ORF6-Gag/Pol与上述任何左穿梭载体(pLAd)结合以产生重组体腺病毒载体。
B.动物对针对HIV抗原的腺病毒疫苗的免疫应答用以上构建的腺病毒疫苗Ad.tat.env.IL2(如上述A部分1小部分所述，也称为″Ad-E.T.R/IL2″))来免疫接种实验小鼠，以激发针对由此载体表达的HIV抗原的免疫应答。通过测量针对HIV tat和env的抗体的滴度来确定腺病毒载体的免疫原性。
图6和7分别显示了两组小鼠中针对HIV Env蛋白的Ad.tat.env.IL2的免疫原性。在如图中所示的不同日期，向这些组的C57BL/6小鼠(由Charles River实验室提供。威尔明顿，马萨诸塞州)肌肉内注射107pfu的Ad.tat.env.IL2。在免疫接种后每两周从4只动物中收集血液(每只动物大约150-500μl)并制备血清。接种后77天，用额外107pfu的Ad.tat.env.IL2重新激发这些小鼠。第二次激发后每天从3只动物中收集血液。通过对被Ad.tat.env.IL2感染的HeLa细胞的裂解物进行ELISA来确定被激发针对HIV tat和env的抗体的滴度。
简而言之，被Ad.tat.env.IL2感染的HeLa细胞的裂解物如下制备。以20感染复数(MOI)用Ad.tat.env.IL2感染HeLa细胞。感染后48小时，收集HeLa细胞并将其重悬于含有1％TritonX-100的缓冲液中。以15,000×g离心裂解物5分钟，获得核后(post-nuclear)上清液。将裂解物稀释至10μg/ml用于涂布ELISA孔板。执行标准的ELISA分析以测定血清的OD450，并且通过将其与小鼠免疫前血清的OD450平均值相对标准化来计算针对HIV tat和env蛋白的抗体的相对滴度。
如图6所示，该组中的三只小鼠具有针对由腺病毒载体Ad.tat.env.IL2表达的HIV抗原的强烈的免疫应答，抗体对HIV抗原的滴度在接种后的大约42天达到最高。使用Ad.tat.env.IL2进行的二次接种再次增强了免疫应答而且滴度在二次接种后的大约5天内达到很高的水平。
如图7所示，该组中的三只小鼠也具有针对由腺病毒载体Ad.tat.env.IL2表达的HIV抗原的强烈的免疫应答，抗体对HIV抗原的滴度在接种后的大约70天达到最高。使用Ad.tat.env.IL2进行的二次接种再次增强了免疫应答而且滴度在二次接种后的大约5天内达到很高的水平。
图12A-B显示了在小鼠中由重组体腺病毒载体Ad.3C.env.gag(如上述A部分2小部分所述，也称为“Ad-3C/EmΔCΔT300-G”)激发的抗体产生。用107pfu的Ad.3C.env.gag肌肉内注射C57BL/6小鼠。在接种后77天，用另外的107pfu Ad.3C.env.gag再次激发这些小鼠。在免疫(或初次免疫)后10周(图12A)和初次免疫后14周/加强免疫后3周(图12B)，用针对纯化重组体Gag(获自NHI AIDS Research and Reference ReagentProgram；贝塞斯达，马里兰州)的ELISA来测定这些小鼠的相对抗体滴度。如图12A和12B所示，用Ad.3C.env.gag接种的小鼠具有针对HIV抗原Gag的强烈的免疫应答。
图13A-B显示了在小鼠中由重组体腺病毒载体Ad.3C.env.rev.gag(如上述A部分3小部分所述，也称为“Ad-3C/EmΔCΔT99.T.R-G”)激发的抗体产生。用107pfu的Ad.3C.env.rev.gag肌肉内注射C57BL/6小鼠。在接种后77天，用另外的107pfu Ad.3C.env.rev.gag再次激发这些小鼠。在免疫(或初次免疫)后10周(图13A)和初次免疫后14周/加强免疫后3周(图13B)，用针对纯化重组体Gag的ELISA来测定这些小鼠的相对抗体滴度。如图13A和13B所示，用Ad.3C.env.rev.gag接种的小鼠具有针对HIV抗原Gag的强烈的免疫应答。
C.通过用针对HIV抗原的腺病毒疫苗免疫活化细胞毒性T淋巴细胞(CTL)通过用两种独立的测试方法来测定被针对HIV抗原的腺病毒疫苗免疫活化的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)IFNγ分析和粒酶A分析。对IFNγ和粒酶分析进行设计以检测T细胞的抗原-特异性活化作用。IFNγ是由活化的CTL和在特异性在细胞免疫途径中发挥作用的TH1辅助T细胞所分泌的。粒酶A也由活化的CTL分泌。基本方法是将脾细胞与表达目的抗原的靶细胞一起温育，观察分泌到培养基中的IFNγ或粒酶A。
1)IFNγ分析除了在将靶细胞和脾细胞一起温育以前不对靶细胞进行放射性标记之外，IFNγ分析是标准51Cr-释放胞溶分析(Current Protocols inImmunology，Coligan等.，编辑)的变体。该分析的详细步骤描述在DiFabio等.(1994)″Quantitation of human influenza virus-specific cytotoxic Tlymphocytescorrelation of cytotoxicity and increased numbers ofIFN-gamma-(or IFNγ-)producing CD8+T cells″Int.Immunol.611-9中。简而言之，将约1×105的脾细胞与1×105的靶细胞(例如，用携带靶抗原的适当病毒感染)在100μl的总体积内温育。将细胞在37℃温育4小时。通过ELISA从25μl培养基中测量IFNγ。
通过利用如上所述IFNγ分析，确定用针对HIV抗原的腺病毒疫苗接种的小鼠中CTL的活化。简而言之，用107pfu Ad.tat.env.IL2肌肉内注射12只C57BL/6小鼠。在图8A-C中所示的时间点，从4只接种的小鼠中收获脾。通过与已被Ad.tat.env.IL2感染的B16-F1细胞(C57BL/6的黑素瘤细胞系，ATCC号CRL-6323)温育来活化脾细胞。在刺激7天后，将活化的脾细胞与用指定的病毒感染的B16-F1细胞混合。通过ELISA(R&D系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州)确定IFNγ分泌到培养基中。
图8A-C显示在接种后4-8周的时间内分泌到培养基中IFNγ的量增加的百分比。如图8A所示，在用Ad.tat.env.IL2接种后4周收获的4只小鼠的脾细胞中IFNγ的分泌显著增加。相反，当脾细胞与用腺病毒载体感染的B16 F-1细胞或未感染的B16 F-1细胞温育时，发生IFNγ分泌的少量增加，所述腺病毒载体表达非特异的蛋白β-Gal(Ad.lacZ)。
如图8B所示，在接种后6周收获的小鼠脾细胞中IFNγ的分泌增加更多。值得注意的是，在小鼠5脾细胞中IFNγ的分泌增加近100％(图8B)。
如图8C所示，接种后8周收获的小鼠脾细胞中IFNγ的分泌非常显著的增加。在小鼠11的脾细胞中IFNγ的分泌增加多于300％(图8C)。这些结果证实针对HIV的强烈体液免疫应答，如高滴度抗体的诱导和特异靶向HIV抗原的CTL活化已经通过用腺病毒疫苗接种动物得以实现，所述腺病毒疫苗同时表达HIV病毒抗原和免疫刺激因子如IL-2。免疫应答类似于在病毒感染疾病的恢复过程中的那些免疫应答。这些结果倾向于表明本发明的遗传疫苗模拟天然病毒感染，其极有前景被用作人类对抗HIV的有效疫苗。
2)粒酶A分析使用更改自描述在Deitz等.(2000)″MHC I-dependent antigenpresentation is inhibited by poliovirus protein 3A″Proc.Natl.Acad.Sci.9713790-13795中的方案来进行粒酶A分析。描述在Deitz等中的粒酶A分析是描述在Kane等.(1989)″Cytolytic T-lymphocyte response to isolatedclass I H-2 proteins and influenza peptides″Nature(London)340157-159中的方案的一个变体。
粒酶A分析的步骤与IFNγ分析的操作步骤类似，只是存在以下的不同之处。通过酶分析来确定分泌到培养基中的粒酶A。通过计算反应线性阶段过程中的活性斜率来确定粒酶A的单位。一个单位的粒酶A被定义为在一小时内将底物转化成1OD405所需的酶量。
简而言之，象INFγ分析那样，将大约1×105的活化的脾细胞与大约1×105的靶细胞一起温育。通过在96孔板中混合20μl培养基和180μl反应混合物(0.2mM BLT(N-α-苄氧基羰基-L-赖氨酸硫代苄基酯，Sigma，St.Louis，MO)，0.22mM DTNB(5，5′-二硫-二(2-硝基苯甲酸，Sigma，St.Louis，MO))并在室温下温育确定粒酶A的活性。在数小时监测在405nm处的吸光度。在反应的线性阶段确定酶活性的斜率并将其转换成酶单位。
图9显示了由接种8周后收集的小鼠脾细胞分泌到培养基中的粒酶A的量的增加。如图9所示，用Ad.tat.env.IL2接种8周后所收集的4只小鼠的脾细胞中，粒酶A的分泌显著增加。相反，当脾细胞与被表达非特异蛋白β-Gal(Ad.lacZ)的腺病毒载体、同时表达乙肝表面抗原和IL-2的腺病毒载体感染的B16-F1细胞或未感染的B16 F-1细胞温育时，发生非常少的粒酶A分泌。类似地，在没有与靶细胞一起培育地这些脾细胞中，只有很少的自发粒酶A分泌。
图14A显示了在所示的不同时间点，对系列1小鼠进行粒酶A分析的结果，所述的时间点包括在用Ad.3C.env.gag进行免疫后的4、6、8周和二次接种后的12/1、13/2、14/3周(初次免疫/加强免疫)。
图14B显示了在所示的不同时间点，对系列2小鼠进行粒酶A分析的结果，所述的时间点包括在用Ad.3C.env.gag进行免疫后的2、4、6、8周。
通过使用独立于IFNγ分析的粒酶A分析获得的这些结果又一次证明了用同时表达HIV病毒抗原和免疫刺激因子如IL-2的腺病毒疫苗接种小鼠，诱导出了强烈的特异靶向HIV抗原的CTL活性。这些结果同时也支持这一观念本发明提供的遗传疫苗极有前景被用作人类对抗HIV的有效疫苗。
3)ELISPOT分析进行ELISPOT分析以确定被重组体腺病毒载体Ad.3C.env.gag和Ad.3C.env.gag.rev接种的小鼠的CTL活化。用107pfu的Ad.3C.env.gag或者Ad.3C.env.gag.rev接种C57BL/6小鼠。以两周的间隔处死小鼠并制备脾细胞(参见Current Protocols in Immunology，Coligan等编辑)。在11周，以第二剂量107pfu的Ad.3C.env.gag或Ad.3C.env.gag.rev接种小鼠。将2×105的脾细胞与4×104的MC57G细胞(ATCC #CRL-2295)在96孔、小鼠INFγ、ELISPOT板(R&D系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州)中温育30小时，所述的MC57G细胞被表达Env、Gag或Rev的痘苗病毒所感染。随后加入4μg/ml的PHA(Sigma，St.Louis，密苏里州)而不是表达抗原的细胞来检测非特异性活化。根据试剂盒的说明书来显影IFNγ斑点并计数。野生型和重组体痘苗病毒来自NHI AIDS Research andReference Reagent Program，贝塞斯达，马里兰州。
图15A显示了对4只系列1中的小鼠用Ad.3C.env.gag进行初次免疫/加强免疫后13/2周所获得的ELISPOT结果。图15B显示了对4只系列1中的小鼠用Ad.3C.env.rev.gag进行初次免疫/加强免疫后13/2周所获得的ELISPOT结果。这些结果显示用本发明的遗传疫苗免疫小鼠可以诱导出强烈的针对HIV Gag的CTL活化。
3.针对乙型肝炎病毒的遗传疫苗以下详细描述了针对乙型肝炎病毒的遗传疫苗及其构建方法的具体实施方案。
1)构建针对乙型肝炎病毒的复制缺陷的腺病毒疫苗构建两种腺病毒载体Ad.HBsAg.IL2和Ad.HBcAg.IL2以使其分别携带编码乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和HBV核心抗原(HBcAg)的序列。在相同的载体中，还包括编码白细胞介素-2(IL-2)的DNA序列，其由与表达病毒抗原不同的启动子来表达。据信这一设计可以确保同时高水平表达病毒抗原和免疫刺激因子IL-2，并能够增强腺病毒疫苗的免疫原性。如下一部分中的实验数据所示，这两种腺病毒载体都能够在动物中激发针对乙型肝炎抗原的强烈且持久的免疫应答。
使用类似于如上详述的构建针对埃博拉病毒的腺病毒疫苗那样的策略来构建这两种腺病毒载体Ad.HBsAg.IL2和Ad.HBcAg.IL2。
a)Ad.HBsAg.IL2简而言之，使用穿梭载体pLAd(图4A，左侧)，将全长HBsAg(带有由XbaI位点缺失所致的沉寂突变)插入到腺病毒基因组的左末端(E1区域)，产生穿梭载体pLAd-CMV-HBsAg。
使用穿梭载体pRAd(图4A，右侧)，将编码IL-2的序列(带有由XbaI位点缺失所致的沉寂突变)插入到腺病毒基因组的E4区域，产生穿梭载体pRAd-CMV-IL2。
使用适当的限制性酶如XbaI和EcoRI将pLAd-CMV-HBsAg和pRAd-CMV-IL2线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体被命名为Ad.HBsAg.IL2a)Ad.HBcAg.IL2简而言之，使用穿梭载体pLAd(图4A，左侧)，将编码全长HBsAg(带有由XbaI位点缺失所致的沉寂突变)和全长HBcAg的序列插入到腺病毒基因组的左末端(E1区域)。通过逆转录病毒剪接供体(SD)受体(SA)机制，在剪接受体位点SA1和SA2从另一个CMV启动子分别表达HBsAg和HBcAg。产生的穿梭载体被命名为pLAd-CMV-SD/SA1-HBsAg-SA2-HbcAg。
使用穿梭载体pRAd(图4A，右侧)，将编码包括IL-2(带有由XbaI位点缺失所致的沉寂突变)、INF-γ和GM-CSF在内的多个免疫刺激因子的序列插入到腺病毒基因组的E4区域。这三种免疫刺激因子经由逆转录病毒供体(SD)和受体(SA)机制，在三个剪接受体位点SA1、SA2和SA3从另一个CMV启动子分别地表达。所得到的穿梭载体被命名为pRAd-CMV-SD/SA1-IL2-SA2-INFγ-SA3-GMCSF。
使用适当的限制性酶如XbaI和EcoRI将pLAd-CMV-SD/SA1-HBsAg-SA2-HbcAg和pRAd-CMV-SD/SA1-IL2-SA2-INFγ-SA3-GMCSF线性化并连接到腺病毒的骨架(图4B)，得到重组体腺病毒载体被命名为Ad.HBcAg.IL2。
2)动物对针对HBV抗原的腺病毒疫苗的免疫应答用上面构建的腺病毒疫苗Ad.HBsAg.IL2和Ad.HBcAg.IL2接种实验小鼠，以分别激发针对由此二载体表达的乙肝病毒表面抗原和核心抗原的免疫应答。通过测量针对HBsAg和HbcAg的抗体的滴度来分别确定这些腺病毒载体的免疫原性。
a)HBV表面抗原(HBsAg)抗体滴度用几种不同浓度的Ad.HBsAg.IL2100、1×106、1×107、1×108、5×105、5×106和5×107pfu病毒经肌肉内注射给予CD-1小鼠(CharlesRiver实验室，威尔明顿，马萨诸塞州)。图10A显示了相对抗-HBsAg抗体的滴度，这是通过测定收集自被接种了1×105和5×105pfu的小鼠的血清而得到的。每次测量中的血清被稀释1∶500。图10B显示了相对抗-HbsAg抗体的滴度，这是通过测定收集自被接种了1×107和1×108pfu的小鼠的血清而得到的。每次测量中的血清被稀释1∶1500。
为了测定由Ad.HBsAg.IL2所激发的抗-HbsAg抗体的相对滴度，每两周从被免疫的小鼠中收集每只动物的血液(大约150-500μl)并制备血清。将血液在室温下温育2-3小时以使其凝结。随后将血液在4℃下过夜冷却以使血凝块缩小。将未凝结的液体转移到干净的管中并以2000×g的速度离心5分钟。将上清液转移到另一个干净管中。加入叠氮化钠(NaN3)至0.05％作为防腐剂。将其分为小等份，保存在4℃短期贮存，保存在-80℃长期贮存。
对纯化自酵母(来自Aldevron，LLC，Fargo，ND)的重组体HBsAg进行ELISA，以确定相对抗-HBsAg滴度。如图10A所示，在接种8周内，组1中的小鼠对由腺病毒载体Ad.HBsAg.IL2表达的HBsAg具有增加的强烈的免疫应答。该载体的低达5×105pfu的滴度足以诱导特异针对HBsAg的高水平抗体。
图10B显示了更高滴度Ad.HBsAg.IL2的免疫原性。如图10B所示，当腺病毒载体的滴度从1×107pfu增加到1×108pfu的时候，Ad.HBsAg.IL2的免疫原性显著增加。
这些结果证明同时表达乙型肝炎表面抗原和IL-2的腺病毒载体能够在接种了该载体的小鼠体内诱导强烈的、特异靶向所述病毒抗原的免疫应答。这些结果同样支持这样的观念本发明提供的遗传疫苗极有前景被用作人类对抗乙型肝炎病毒的有效疫苗。
b)HBV核心抗原(HBcAg)抗体滴度在不同日期，用1×107pfu的Ad.HBcAg.IL2经肌肉内注射给予C57BL/6小鼠组(Charles River实验室，威尔明顿，马萨诸塞州)。在接种后每两周从4只动物收集血液，并制备血清。在接种后91天(组3，图11A)或者84天(组4，图11B)，额外用1×107pfu的病毒再次激发这些小鼠。在第二次激发后，每天从3只动物中收集血液。对纯化自大肠杆菌(来自Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)的重组体HBcAg进行ELISA以确定抗体滴度。
如图11A所示，组3中的小鼠对由腺病毒载体Ad.HBcAg.IL2所表达的肝炎核心抗原HBcAg具有强烈的免疫应答，抗体对HBcAg的滴度在接种后大约28天达到最高。用Ad.HBcAg.IL2进行的二次接种又一次增强了免疫应答，在二次接种后的大约3天内获得了非常高的滴度。
如图11B所示，组4中的小鼠对由腺病毒载体Ad.HBcAg.IL2所表达的肝炎核心抗原HBcAg也具有强烈的免疫应答，抗体对HBcAg的滴度在接种后大约34天达到最高。用Ad.HBcAg.IL2进行的二次接种又一次增强了免疫应答，在二次接种后的大约3天内获得了非常高的滴度。
这些结果证明同时表达乙型肝炎核心抗原和IL-2的腺病毒载体能够在接种了该载体的小鼠体内诱导强烈的、特异靶向所述病毒抗原的免疫应答。这些结果又一次支持了这样的观念本发明提供的遗传疫苗极有前景被用作人类对抗乙型肝炎病毒的有效疫苗。
序列表<110>健方公司<120>针对人免疫缺陷病毒的遗传疫苗<130>US056PC04086<140>PCT/US02/65112<141>2002-11-01<150>US09/585,599<151>2000-06-02<150>PCT/US01/18238<151>2001-06-04<150>US10/003,035<151>2001-11-01<160>75<210>1<211>7<212>DNA<213>埃博拉病毒<400>1ttttttt 7<210>2<211>7<212>RNA<213>埃博拉病毒<400>2uuuuuuu 7<210>3<211>8<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>修饰的RNA编辑信号<400>3uucuucuu 8<210>4<211>7<212>DNA<213>埃博拉病毒<400>4aaaaaaa 7<210>5<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>修饰的RNA编辑信号的DNA<400>5aagaagaa 8<210>6<211>6<212>RNA
<213>埃博拉病毒<400>6uuuuuu 6<210>7<211>6<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>修饰的RNA编辑信号<400>7uucuuc 6<210>8<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>修饰的RNA编辑信号的DNA<400>8ttcttc 6<210>9<211>21<212>PRT<213>人<400>9Ser Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ala5 10 15Thr Asp Phe Met Ser Leu20<210>10<211>5<212>PRT<213>埃博拉病毒<400>10Arg Arg Thr Arg Arg5<210>11<211>4<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<400>11Arg Glu Lys Arg<210>12<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GAG位点的DNA<400>12ggagctggt 9<210>13<211>3
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GAG位点<400>13Gly Ala Gly<210>14<211>3157<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Env/Tat/Rev<400>14gaattctgca acaactgctg tttatccatt ttcagaattg ggtgtcgaca 50tagcagaata ggcgttactc gacagaggag agcaagaaat ggagccagta 100gatcctagac tagagccctg gaagcatcca ggaagtcagc ctaaaactgc 150ttgtaccaat tgctattgta aaaagtgttg ctttcattgc caagtttgtt 200tcataacaaa agccttaggc atctcctatg gcaggaagaa gcggagacag 250cgacgaagac ctcctcaagg cagtcagact catcaagttt ctctatcaaa 300gcagtaagta gtacatgtaa tgcaacctat acaaatagca atagtagcat 350tagtagtagc aataataata gcaatagttg tgtggtccat agtaatcata 400gaatatagga aaatattaag acaaagaaaa atagacaggt taattgatag 450actaatagaa agagcagaag acagtggcaa tgagagtgaa ggagaaatat 500cagcacttgt ggagatgggg gtggagatgg ggcaccatgc tccttgggat 550gttgatgatc tgtagtgcta cagaaaaatt gtgggtcaca gtctattatg 600gggtacctgt gtggaaggaa gcaaccacca ctctattttg tgcatcagat 650gctaaagcat atgatacaga ggtacataat gtttgggcca cacatgcctg 700tgtacccaca gaccccaacc cacaagaagt agtattggta aatgtgacag 750aaaattttaa catgtggaaa aatgacatgg tagaacagat gcatgaggat 800ataatcagtt tatgggatca aagcctaaag ccatgtgtaa aattaacccc 850actctgtgtt agtttaaagt gcactgattt gaagaatgat actaatacca 900atagtagtag cgggagaatg ataatggaga aaggagagat aaaaaactgc 950tctttcaata tcagcacaag cataagaggt aaggtgcaga aagaatatgc 1000atttttttat aaacttgata taataccaat agataatgat actaccagct 1050atacgttgac aagttgtaac acctcagtca ttacacaggc ctgtccaaag 1100gtatcctttg agccaattcc catacattat tgtgccccgg ctggttttgc 1150gattctaaaa tgtaataata agacgttcaa tggaacagga ccatgtacaa 1200atgtcagcac agtacaatgt acacatggaa ttaggccagt agtatcaact 1250caactgctgt taaatggcag tctggcagaa gaagaggtag taattagatc 1300tgccaatttc acagacaatg ctaaaaccat aatagtacag ctgaaccaat 1350ctgtagaaat taattgtaca agacccaaca acaatacaag aaaaagtatc 1400cgtatccaga gaggaccagg gagagcattt gttacaatag gaaaaatagg 1450aaatatgaga caagcacatt gtaacattag tagagcaaaa tggaataaca 1500ctttaaaaca gatagatagc aaattaagag aacaatttgg aaataataaa 1550acaataatct ttaagcagtc ctcaggaggg gacccagaaa ttgtaacgca 1600cagttttaat tgtggagggg aatttttcta ctgtaattca acacaactgt 1650ttaatagtac ttggtttaat agtacttgga gtactaaagg gtcaaataac 1700actgaaggaa gtgacacaat caccctccca tgcagaataa aacaaattat 1750aaacatgtgg caggaagtag gaaaagcaat gtatgcccct cccatcagtg 1800gacaaattag atgttcatca aatattacag ggctgctatt aacaagagat 1850ggtggtaata gcaacaatga gtccgagatc ttcagacctg gaggaggaga 1900tatgagggac aattggagaa gtgaattata taaatataaa gtagtaaaaa 1950ttgaaccatt aggagtagca cccaccaagg caaagagaag agtggtgcag 2000agagaaaaaa gagcagtggg aataggagct ttgttccttg ggttcttggg 2050agcagcagga agcactatgg gcgcagcgtc aatgacgctg acggtacagg 2100ccagacaatt attgtctggt atagtgcagc agcagaacaa tttgctgagg 2150gctattgagg cgcaacagca tctgttgcaa ctcacagtct ggggcatcaa 2200gcagctccag gcaagaatcc tggctgtgga aagataccta aaggatcaac 2250agctcctggg gatttggggt tgctctggaa aactcatttg caccactgct 2300gtgccttgga atgctagttg gagtaataaa tctctggaac agatttggaa 2350taacatgacc tggatggagt gggacagaga aattaacaat tacacaagct 2400taatacactc cttaattgaa gaatcgcaaa accagcaaga aaagaatgaa 2450caagaattat tggaattaga taaatgggca agtttgtgga attggtttaa 2500cataacaaat tggctgtggt atataaaatt attcataatg atagtaggag 2550gcttggtagg tttaagaata gtttttgctg tactttctgt agtgaataga 2600gttaggcagg gatattcacc attatcgttt cagacccacc tcccaatccc 2650gaggggaccc gacaggcccg aaggaataga agaagaaggt ggagagagag 2700acagagacag atccattcga ttagtgaacg gatccttagc acttatctgg 2750gacgatctgc ggagcctgtg cctcttcagc taccaccgct tgagagactt 2800
actcttgatt gtaacgagga ttgtggaact tctgggacgc agggggtggg 2850aagccctcaa atattggtgg aatctcctac agtattggag tcaggagcta 2900aagaatagtg ctgttagctt gctcaatgcc acagctatag cagtagctga 2950ggggacagat agggttatag aagtagtaca aggagcttat agagctattc 3000gccacatacc tagaagaata agacagggct tggaaaggat tttgctataa 3050gatgggtggc aagtggtcaa aaagtagtgt ggttggatgg cctgctgtaa 3100gggaaagaat gagacgagct gagccagcag cagatggggt gggagcagca 3150tctcgag3157<210>15<211>508<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>修饰的IL-2<400>15tcactctctt taatcactac tcacagtaac ctcaactcct gccacaatgt 50acaggatgca actcctgtct tgcattgcac taagtcttgc acttgtcaca 100aacagtgcac ctacttcaag ttctacaaag aaaacacagc tacaactgga 150gcatttactg ctggatttac agatgatttt gaatggaatt aataattaca 200agaatcccaa actcaccagg atgctcacat ttaagtttta catgcccaag 250aaggccacag aactgaaaca tcttcagtgt cttgaagaag aactcaaacc 300tctggaggaa gtgctaaatt tagctcaaag caaaaacttt cacttaagac 350ccagggactt aatcagcaat atcaacgtaa tagttctgga actaaaggga 400tctgaaacaa cattcatgtg tgaatatgct gatgagacag caaccattgt 450agaatttctg aacagatgga ttaccttttg tcaaagcatc atctcaacac 500taacttga 508<210>16<211>2280<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>修饰的Env<400>16gaattcgcca ccatgggagt gaaggagaaa tatcagcact tgtggagatg 50ggggtggaga tggggcacca tgctccttgg gatgttgatg atctgtagtg 100ctacagaaaa attgtgggtc acagtctatt atggggtacc tgtgtggaag 150gaagcaacca ccactctatt ttgtgcatca gatgctaaag catatgatac 200agaggtacat aatgtttggg ccacacatgc ctgtgtaccc acagacccca 250acccacaaga agtagtattg gtaaatgtga cagaaaattt taacatgtgg 300aaaaatgaca tggtagaaca gatgcatgag gatataatca gtttatggga 350tcaaagccta aagccatgtg taaaattaac cccactctgt gttagtttaa 400agtgcactga tttgaagaat gatactaata ccaatagtag tagcgggaga 450atgataatgg agaaaggaga gataaaaaac tgctctttca atatcagcac 500aagcataaga ggtaaggtgc agaaagaata tgcatttttt tataaacttg 550atataatacc aatagataat gatactacca gctatacgtt gacaagttgt 600aacacctcag tcattacaca ggcctgtcca aaggtatcct ttgagccaat 650tcccatacat tattgtgccc cggctggttt tgcgattcta aaatgtaata 700ataagacgtt caatggaaca ggaccatgta caaatgtcag cacagtacaa 750tgtacacatg gaattaggcc agtagtatca actcaactgc tgttaaatgg 800cagtctggca gaagaagagg tagtaattag atctgccaat ttcacagaca 850atgctaaaac cataatagta cagctgaacc aatctgtaga aattaattgt 900acaagaccca acaacaatac aagaaaaagt atccgtatcc agagaggacc 950agggagagca tttgttacaa taggaaaaat aggaaatatg agacaagcac 1000attgtaacat tagtagagca aaatggaata acactttaaa acagatagat 1050agcaaattaa gagaacaatt tggaaataat aaaacaataa tctttaagca 1100gtcctcagga ggggacccag aaattgtaac gcacagtttt aattgtggag 1150gggaattttt ctactgtaat tcaacacaac tgtttaatag tacttggttt 1200aatagtactt ggagtactaa agggtcaaat aacactgaag gaagtgacac 1250aatcaccctc ccatgcagaa taaaacaaat tataaacatg tggcaggaag 1300taggaaaagc aatgtatgcc cctcccatca gtggacaaat tagatgttca 1350tcaaatatta cagggctgct attaacaaga gatggtggta atagcaacaa 1400tgagtccgag atcttcagac ctggaggagg agatatgagg gacaattgga 1450gaagtgaatt atataaatat aaagtagtaa aaattgaacc attaggagta 1500gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg cagactagtg cagtgggaat 1550aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg 1600cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata 1650gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc aacagcatct 1700
gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg 1750ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc 1800tctggaaaac tcatttgcac cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag 1850taataaatct ctggaacaga tttggaataa catgacctgg atggagtggg 1900acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa 1950tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg aattagataa 2000atgggcaagt ttgtggaatt ggtttaacat aacaaattgg ctgtggtata 2050taaaattatt cataatgata gtaggaggct tggtaggttt aagaatagtt 2100tttgctgtac tttctgtagt gaatagagtt aggcagggat attcaccatt 2150atcgtttcag acccacctcc caatcccgag gggacccgac aggcccgaag 2200gaatagaaga agaaggtgga gagagagaca gagacagatc cattcgatta 2250gtgaacggat ccttagcact tatctggtaa 2280<210>17<211>1496<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>全长Gag<400>17ggctagaagg agagaggatg ggtgcgagag cgtcagtatt aagcggggga 50gaattagatc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa 100atataaatta aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgactac 150aaccatccct tcagacagga tcagaagaac ttagatcatt atataataca 200gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg atagagataa aagacaccaa 250ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt aagaaaaaag 300cacagcaagc agcagctgac acaggacaca gcagtcaggt cagccaaaat 350taccctatag tgcagaacat ccaggggcaa atggtacatc aggccatatc 400acctagaact ttaaatgcat gggtaaaagt agtagaagag aaggctttca 450gcccagaagt aatacccatg ttttcagcat tatcagaagg agccacccca 500caagatttaa acaccatgct aaacacagtg gggggacatc aagcagccat 550gcaaatgtta aaagagacca tcaatgagga agctgcagaa tgggatagag 600tacatccagt gcatgcaggg cctattgcac caggccagat gagagaacca 650aggggaagtg acatagcagg aactactagt acccttcagg aacaaatagg 700atggatgaca aataatccac ctatcccagt aggagaaatt tataaaagat 750ggataatcct gggattaaat aaaatagtaa gaatgtatag ccctaccagc 800attctggaca taagacaagg accaaaagaa ccttttagag actatgtaga 850ccggttctat aaaactctaa gagccgagca agcttcacag gaggtaaaaa 900attggatgac agaaaccttg ttggtccaaa atgcgaaccc agattgtaag 950actattttaa aagcattggg accagcggct acactagaag aaatgatgac 1000agcatgtcag ggagtaggag gacccggcca taaggcaaga gttttggctg 1050aagcaatgag ccaagtaaca aatacagcta ccataatgat gcagagaggc 1100aattttagga accaaagaaa gatggttaag tgtttcaatt gtggcaaaga 1150agggcacaca gccagaaatt gcagggcccc taggaaaaag ggctgttgga 1200aatgtggaaa ggaaggacac caaatgaaag attgtactga gagacaggct 1250aattttttag ggaagatctg gccttcctac aagggaaggc cagggaattt 1300tcttcagagc agaccagagc caacagcccc accatttctt cagagcagac 1350cagagccaac agccccacca gaagagagct tcaggtctgg ggtagagaca 1400acaactcccc ctcagaagca ggagccgata gacaaggaac tgtatccttt 1450aacttccctc agatcactct ttggcaacga cccctcgtca caataa 1496<210>18<211>492<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<400>18Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg5 10 15Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys20 25 30Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Leu Gln35 40 45Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn50 55 60Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys65 70 75Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys80 85 90Ser Lys Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser95 100 105
Ser Gln Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly110 115 120Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp125 130 135Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro140 145 150Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn155 160 165Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met170 175 180Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val185 190 195His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu200 205 210Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu215 220 225Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu230 235 240Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg245 250 255Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys260 265 270Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg275 280 285Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr290 295 300Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys305 310 315Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys320 325 330Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu335 340 345Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Thr Ala Thr Ile Met Met Gln Arg350 355 360Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Met Val Lys Cys Phe Asn Cys365 370 375Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys380 385 390Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp395 400 405Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser410 415 420Tyr Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro425 430 435Thr Ala Pro Pro Phe Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro440 445 450Pro Glu Glu Ser Phe Arg Ser Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Pro455 460 465Gln Lys Gln Glu Pro Ile Asp Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Thr Ser470 475 480Leu Arg Ser Leu Phe Gly Asn Asp Pro Ser Ser Gln485 490<210>19<211>2941<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>来自HIV毒株pNL4-3的修饰的Env<400>19gaattctgca acaactgctg tttatccatt tcagaattgg gtgtcgacat 50agcagaatag gcgttactcg acagaggaga gcaagaaatg gagccagtag 100atcctagact agagccctgg aagcatccag gaagtcagcc taaaactgct 150tgtaccaatt gctattgtaa aaagtgttgc tttcattgcc aagtttgttt 200catgacaaaa gccttaggca tctcctatgg caggaagaag cggagacagc 250gacgaagagc tcatcagaac agtcagactc atcaagcttc tctatcaaag 300cagtaagtag tacatgtaat gcaacctata atagtagcaa tagtagcatt 350agtagtagca ataataatag caatagttgt gtggtccata gtaatcatag 400aatataggaa aatattaaga caaagaaaaa tagacaggtt aattgataga 450ctaatagaaa gagcagaaga cagtggcaat gagagtgaag gagaagtatc 500agcacttgtg gagatggggg tggaaatggg gcaccatgct ccttgggata 550ttgatgatct gtagtgctac agaaaaattg tgggtcacag tctattatgg 600
ggtacctgtg tggaaggaag caaccaccac tctattttgt gcatcagatg 650ctaaagcata tgatacagag gtacataatg tttgggccac acatgcctgt 700gtacccacag accccaaccc acaagaagta gtattggtaa atgtgacaga 750aaattttaac atgtggaaaa atgacatggt agaacagatg catgaggata 800taatcagttt atgggatcaa agcctaaagc catgtgtaaa attaacccca 850ctctgtgtta gtttaaagtg cactgatttg aagaatgata ctaataccaa 900tagtagtagc gggagaatga taatggagaa aggagagata aaaaactgct 950ctttcaatat cagcacaagc ataagagata aggtgcagaa agaatatgca 1000ttcttttata aacttgatat agtaccaata gataatacca gctataggtt 1050gataagttgt aacacctcag tcattacaca ggcctgtcca aaggtatcct 1100ttgagccaat tcccatacat tattgtgccc cggctggttt tgcgattcta 1150aaatgtaata ataagacgtt caatggaaca ggaccatgta caaatgtcag 1200cacagtacaa tgtacacatg gaatcaggcc agtagtatca actcaactgc 1250tgttaaatgg cagtctagca gaagaagatg tagtaattag atctgccaat 1300ttcacagaca atgctaaaac cataatagta cagctgaaca catctgtaga 1350aattaattgt acaagaccca acaacaatac aagaaaaagt atccgtatcc 1400agaggggacc agggagagca tttgttacaa taggaaaaat aggaaatatg 1450agacaagcac attgtaacat tagtagagca aaatggaatg ccactttaaa 1500acagatagct agcaaattaa gagaacaatt tggaaataat aaaacaataa 1550tctttaagca atcctcagga ggggacccag aaattgtaac gcacagtttt 1600aattgtggag gggaattttt ctactgtaat tcaacacaac tgtttaatag 1650tacttggttt aatagtactt ggagtactga agggtcaaat aacactgaag 1700gaagtgacac aatcacactc ccatgcagaa taaaacaatt tataaacatg 1750tggcaggaag taggaaaagc aatgtatgcc cctcccatca gtggacaaat 1800tagatgttca tcaaatatta ctgggctgct attaacaaga gatggtggta 1850ataacaacaa tgggtccgag atcttcagac ctggaggagg cgatatgagg 1900gacaattgga gaagtgaatt atataaatat aaagtagtaa aaattgaacc 1950attaggagta gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg cagactagtg 2000cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc 2050actatgggct gcacgtcaat gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt 2100gtctgatata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc 2150aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaaaca gctccaggca 2200agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat 2250ttggggttgc tctggaaaac tcatttgcac cactgctgtg ccttggaatg 2300ctagttggag taataaatct ctggaacaga tttggaataa catgacctgg 2350atggagtggg acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt 2400aattgaagaa tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg 2450aattagataa atgggcaagt ttgtggaatt ggtttaacat aacaaattgg 2500ctgtggtata taaaattatt cataatgata gtaggaggct tggtaggttt 2550aagaatagtt tttgctgtac tttctatagt gaatagagtt aggcagggat 2600attcaccatt atcgtttcag acccacctcc caatcccgag gggacccgac 2650aggcccgaag gaatagaaga agaaggtgga gagagagaca gagacagatc 2700cattcgatta gtgaacggat ccttagcact tatctgggac gatctgcgga 2750gcctgtgcct cttcagctac caccgcttga gagacttact cttgattgta 2800acgaggattg tggaacttct gggacgcagg gggtgggaag ccctcaaata 2850ttggtggaat ctcctacagt attggagtca ggaactaaag aatagtgctg 2900ttaacttgct caatgccaca gccatagcag tagctgagta a 2941<210>20<211>2746<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>来自pNL4-3的修饰的Env/Tat/Rev<400>20gaattctgca acaactgctg tttatccatt tcagaattgg gtgtcgacat 50agcagaatag gcgttactcg acagaggaga gcaagaaatg gagccagtag 100atcctagact agagccctgg aagcatccag gaagtcagcc taaaactgct 150tgtaccaatt gctattgtaa aaagtgttgc tttcattgcc aagtttgttt 200catgacaaaa gccttaggca tctcctatgg caggaagaag cggagacagc 250gacgaagagc tcatcagaac agtcagactc atcaagcttc tctatcaaag 300cagtaagtag tacatgtaat gcaacctata atagtagcaa tagtagcatt 350agtagtagca ataataatag caatagttgt gtggtccata gtaatcatag 400aatataggaa aatattaaga caaagaaaaa tagacaggtt aattgataga 450ctaatagaaa gagcagaaga cagtggcaat gagagtgaag gagaagtatc 500agcacttgtg gagatggggg tggaaatggg gcaccatgct ccttgggata 550ttgatgatct gtagtgctac agaaaaattg tgggtcacag tctattatgg 600ggtacctgtg tggaaggaag caaccaccac tctattttgt gcatcagatg 650ctaaagcata tgatacagag gtacataatg tttgggccac acatgcctgt 700gtacccacag accccaaccc acaagaagta gtattggtaa atgtgacaga 750aaattttaac atgtggaaaa atgacatggt agaacagatg catgaggata 800taatcagttt atgggatcaa agcctaaagc catgtgtaaa attaacccca 850
ctctgtgtta gttgtaacac ctcagtcatt acacaggcct gtccaaaggt 900atcctttgag ccaattccca tacattattg tgccccggct ggttttgcga 950ttctaaaatg taataataag acgttcaatg gaacaggacc atgtacaaat 1000gtcagcacag tacaatgtac acatggaatc aggccagtag tatcaactca 1050actgctgtta aatggcagtc tagcagaaga agatgtagta attagatctg 1100ccaatttcac agacaatgct aaaaccataa tagtacagct gaacacatct 1150gtagaaatta attgtacaag acccaacaac aatacaagaa aaagtatccg 1200tatccagagg ggaccaggga gagcatttgt tacaatagga aaaataggaa 1250atatgagaca agcacattgt aacattagta gagcaaaatg gaatgccact 1300ttaaaacaga tagctagcaa attaagagaa caatttggaa ataataaaac 1350aataatcttt aagcaatcct caggagggga cccagaaatt gtaacgcaca 1400gttttaattg tggaggggaa tttttctact gtaattcaac acaactgttt 1450aatagtactt ggtttaatag tacttggagt actgaagggt caaataacac 1500tgaaggaagt gacacaatca cactcccatg cagaataaaa caatttataa 1550acatgtggca ggaagtagga aaagcaatgt atgcccctcc catcagtgga 1600caaattagat gttcatcaaa tattactggg ctgctattaa caagagatgg 1650tggtaataac aacaatgggt ccgagatctt cagacctgga ggaggcgata 1700tgagggacaa ttggagaagt gaattatata aatataaagt agtaaaaatt 1750gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag tggtgcagac 1800tagtgcagtg ggaataggag ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag 1850gaagcactat gggctgcacg tcaatgacgc tgacggtaca ggccagacaa 1900ttattgtctg atatagtgca gcagcagaac aatttgctga gggctattga 1950ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aaacagctcc 2000aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg 2050gggatttggg gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg 2100gaatgctagt tggagtaata aatctctgga acagatttgg aataacatga 2150cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca attacacaag cttaatacac 2200tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg aacaagaatt 2250attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa 2300attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta 2350ggtttaagaa tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca 2400gggatattca ccattatcgt ttcagaccca cctcccaatc ccgaggggac 2450ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag gtggagagag agacagagac 2500agatccattc gattagtgaa cggatcctta gcacttatct gggacgatct 2550gcggagcctg tgcctcttca gctaccaccg cttgagagac ttactcttga 2600ttgtaacgag gattgtggaa cttctgggac gcagggggtg ggaagccctc 2650aaatattggt ggaatctcct acagtattgg agtcaggaac taaagaatag 2700tgctgttaac ttgctcaatg ccacagccat agcagtagct gagtaa 2746<210>21<211>3417<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>来自毒株BH10的修饰的Env/Tat/Rev<400>21gaattctgca acaactgctg tttatccatt ttcagaattg ggtgtcgaca 50tagcagaata ggcgttactc gacagaggag agcaagaaat ggagccagta 100gatcctagac tagagccctg gaagcatcca ggaagtcagc ctaaaactgc 150ttgtaccaat tgctattgta aaaagtgttg ctttcattgc caagtttgtt 200tcataacaaa agccttaggc atctcctatg gcaggaagaa gcggagacag 250cgacgaagac ctcctcaagg cagtcagact catcaagttt ctctatcaaa 300gcagtaagta gtacatgtaa tgcaacctat acaaatagca atagtagcat 350tagtagtagc aataataata gcaatagttg tgtggtccat agtaatcata 400gaatatagga aaatattaag acaaagaaaa atagacaggt taattgatag 450actaatagaa agagcagaag acagtggcaa tgagagtgaa ggagaaatat 500cagcacttgt ggagatgggg gtggagatgg ggcaccatgc tccttgggat 550gttgatgatc tgtagtgcta cagaaaaatt gtgggtcaca gtctattatg 600gggtacctgt gtggaaggaa gcaaccacca ctctattttg tgcatcagat 650gctaaagcat atgatacaga ggtacataat gtttgggcca cacatgcctg 700tgtacccaca gaccccaacc cacaagaagt agtattggta aatgtgacag 750aaaattttaa catgtggaaa aatgacatgg tagaacagat gcatgaggat 800ataatcagtt tatgggatca aagcctaaag ccatgtgtaa aattaacccc 850actctgtgtt agtttaaagt gcactgattt gaagaatgat actaatacca 900atagtagtag cgggagaatg ataatggaga aaggagagat aaaaaactgc 950tctttcaata tcagcacaag cataagaggt aaggtgcaga aagaatatgc 1000atttttttat aaacttgata taataccaat agataatgat actaccagct 1050atacgttgac aagttgtaac acctcagtca ttacacaggc ctgtccaaag 1100gtatcctttg agccaattcc catacattat tgtgccccgg ctggttttgc 1150gattctaaaa tgtaataata agacgttcaa tggaacagga ccatgtacaa 1200atgtcagcac agtacaatgt acacatggaa ttaggccagt agtatcaact 1250caactgctgt taaatggcag tctggcagaa gaagaggtag taattagatc 1300
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<223>来自毒株BH10的修饰的Env/Nef<400>22gaattcgcca ccatgggagt gaaggagaaa tatcagcact tgtggagatg 50ggggtggaga tggggcacca tgctccttgg gatgttgatg atctgtagtg 100ctacagaaaa attgtgggtc acagtctatt atggggtacc tgtgtggaag 150gaagcaacca ccactctatt ttgtgcatca gatgctaaag catatgatac 200agaggtacat aatgtttggg ccacacatgc ctgtgtaccc acagacccca 250acccacaaga agtagtattg gtaaatgtga cagaaaattt taacatgtgg 300aaaaatgaca tggtagaaca gatgcatgag gatataatca gtttatggga 350tcaaagccta aagccatgtg taaaattaac cccactctgt gttagtttaa 400agtgcactga tttgaagaat gatactaata ccaatagtag tagcgggaga 450atgataatgg agaaaggaga gataaaaaac tgctctttca atatcagcac 500aagcataaga ggtaaggtgc agaaagaata tgcatttttt tataaacttg 550atataatacc aatagataat gatactacca gctatacgtt gacaagttgt 600aacacctcag tcattacaca ggcctgtcca aaggtatcct ttgagccaat 650tcccatacat tattgtgccc cggctggttt tgcgattcta aaatgtaata 700ataagacgtt caatggaaca ggaccatgta caaatgtcag cacagtacaa 750tgtacacatg gaattaggcc agtagtatca actcaactgc tgttaaatgg 800cagtctggca gaagaagagg tagtaattag atctgccaat ttcacagaca 850atgctaaaac cataatagta cagctgaacc aatctgtaga aattaattgt 900acaagaccca acaacaatac aagaaaaagt atccgtatcc agagaggacc 950agggagagca tttgttacaa taggaaaaat aggaaatatg agacaagcac 1000attgtaacat tagtagagca aaatggaata acactttaaa acagatagat 1050
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<223>来自毒株BH10的修饰的Env/Tat<400>23gaattctgca acaactgctg tttatccatt ttcagaattg ggtgtcgaca 50tagcagaata ggcgttactc gacagaggag agcaagaaat ggagccagta 100gatcctagac tagagccctg gaagcatcca ggaagtcagc ctaaaactgc 150ttgtaccaat tgctattgta aaaagtgttg ctttcattgc caagtttgtt 200tcataacaaa agccttaggc atctcctatg gcaggaagaa gcggagacag 250cgacgaagac ctcctcaagg cagtcagact catcaagttt ctctatcaaa 300gcagtaagta gtacatgtaa tgcaacctat acaaatagca atagtagcat 350tagtagtagc aataataata gcaatagttg tgtggtccat agtaatcata 400gaatatagga aaatattaag acaaagaaaa atagacaggt taattgatag 450actaatagaa agagcagaag acagtggcaa tgagagtgaa ggagaaatat 500cagcacttgt ggagatgggg gtggagatgg ggcaccatgc tccttgggat 550gttgatgatc tgtagtgcta cagaaaaatt gtgggtcaca gtctattatg 600gggtacctgt gtggaaggaa gcaaccacca ctctattttg tgcatcagat 650gctaaagcat atgatacaga ggtacataat gtttgggcca cacatgcctg 700tgtacccaca gaccccaacc cacaagaagt agtattggta aatgtgacag 750aaaattttaa catgtggaaa aatgacatgg tagaacagat gcatgaggat 800ataatcagtt tatgggatca aagcctaaag ccatgtgtaa aattaacccc 850actctgtgtt agtttaaagt gcactgattt gaagaatgat actaatacca 900atagtagtag cgggagaatg ataatggaga aaggagagat aaaaaactgc 950tctttcaata tcagcacaag cataagaggt aaggtgcaga aagaatatgc 1000atttttttat aaacttgata taataccaat agataatgat actaccagct 1050atacgttgac aagttgtaac acctcagtca ttacacaggc ctgtccaaag 1100gtatcctttg agccaattcc catacattat tgtgccccgg ctggttttgc 1150gattctaaaa tgtaataata agacgttcaa tggaacagga ccatgtacaa 1200atgtcagcac agtacaatgt acacatggaa ttaggccagt agtatcaact 1250caactgctgt taaatggcag tctggcagaa gaagaggtag taattagatc 1300tgccaatttc acagacaatg ctaaaaccat aatagtacag ctgaaccaat 1350
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<223>修饰的Env<400>24gaattcgcca ccatgggagt gaaggagaaa tatcagcact tgtggagatg 50ggggtggaga tggggcacca tgctccttgg gatgttgatg atctgtagtg 100ctacagaaaa attgtgggtc acagtctatt atggggtacc tgtgtggaag 150gaagcaacca ccactctatt ttgtgcatca gatgctaaag catatgatac 200agaggtacat aatgtttggg ccacacatgc ctgtgtaccc acagacccca 250acccacaaga agtagtattg gtaaatgtga cagaaaattt taacatgtgg 300aaaaatgaca tggtagaaca gatgcatgag gatataatca gtttatggga 350tcaaagccta aagccatgtg taaaattaac cccactctgt gttagtttaa 400agtgcactga tttgaagaat gatactaata ccaatagtag tagcgggaga 450atgataatgg agaaaggaga gataaaaaac tgctctttca atatcagcac 500aagcataaga ggtaaggtgc agaaagaata tgcatttttt tataaacttg 550atataatacc aatagataat gatactacca gctatacgtt gacaagttgt 600aacacctcag tcattacaca ggcctgtcca aaggtatcct ttgagccaat 650tcccatacat tattgtgccc cggctggttt tgcgattcta aaatgtaata 700ataagacgtt caatggaaca ggaccatgta caaatgtcag cacagtacaa 750tgtacacatg gaattaggcc agtagtatca actcaactgc tgttaaatgg 800cagtctggca gaagaagagg tagtaattag atctgccaat ttcacagaca 850atgctaaaac cataatagta cagctgaacc aatctgtaga aattaattgt 900acaagaccca acaacaatac aagaaaaagt atccgtatcc agagaggacc 950agggagagca tttgttacaa taggaaaaat aggaaatatg agacaagcac 1000attgtaacat tagtagagca aaatggaata acactttaaa acagatagat 1050agcaaattaa gagaacaatt tggaaataat aaaacaataa tctttaagca 1100gtcctcagga ggggacccag aaattgtaac gcacagtttt aattgtggag 1150gggaattttt ctactgtaat tcaacacaac tgtttaatag tacttggttt 1200aatagtactt ggagtactaa agggtcaaat aacactgaag gaagtgacac 1250aatcaccctc ccatgcagaa taaaacaaat tataaacatg tggcaggaag 1300taggaaaagc aatgtatgcc cctcccatca gtggacaaat tagatgttca 1350tcaaatatta cagggctgct attaacaaga gatggtggta atagcaacaa 1400tgagtccgag atcttcagac ctggaggagg agatatgagg gacaattgga 1450gaagtgaatt atataaatat aaagtagtaa aaattgaacc attaggagta 1500gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg cagagagaaa aaagagcagt 1550gggaatagga gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca ggaagcacta 1600tgggcgcagc gtcaatgacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct 1650ggtatagtgc agcagcagaa caatttgctg agggctattg aggcgcaaca 1700gcatctgttg caactcacag tctggggcat caagcagctc caggcaagaa 1750tcctggctgt ggaaagatac ctaaaggatc aacagctcct ggggatttgg 1800ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact gctgtgcctt ggaatgctag 1850
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<400>30tgtacaagac ccaacaacaa tacaagaaaa agaatatctt taggaccagg 50acgagtattt tatacagcag gagaaataat aggagacatc agaaaggcac 100attgt 105<210>31<211>105<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒1型<400>31tgtaccagac ctaataacaa tacaagaaaa agtataactt ttgcaccagg 50acaagcgctc tatgcaacag gtgaaataat aggagatata agacaagcac 100attgt 105<210>32<211>2562<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>具有多进化枝v3环的Env<400>32atgagagtga aggagaaata tcagcacttg tggagatggg ggtggagatg 50gggcaccatg ctccttggga tgttgatgat ctgtagtgct acagaaaaat 100tgtgggtcac agtctattat ggggtacctg tgtggaagga agcaaccacc 150actctatttt gtgcatcaga tgctaaagca tatgatacag aggtacataa 200tgtttgggcc acacatgcct gtgtacccac agaccccaac ccacaagaag 250tagtattggt aaatgtgaca gaaaatttta acatgtggaa aaatgacatg 300gtagaacaga tgcatgagga tataatcagt ttatgggatc aaagcctaaa 350gccatgtgta aaattaaccc cactctgtgt tggagctggt agttgtaaca 400cctcagtcat tacacaggcc tgtccaaagg tatcctttga gccaattccc 450atacattatt gtgccccggc tggttttgcg attctaaaat gtaataataa 500gacgttcaat ggaacaggac catgtacaaa tgtcagcaca gtacaatgta 550cacatggaat taggccagta gtatcaactc aactgctgtt aaatggcagt 600ctggcagaag aagaggtagt aattagatct gccaatttca cagacaatgc 650taaaaccata atagtacagc tgaaccaatc tgtagaaatt aattgtacaa 700gacccaacaa caatacaaga aaaagtatcc gtatccagag aggaccaggg 750agagcatttg ttacaatagg aaaaatagga aatatgagac aagcacattg 800tctcgggtgt accagaccta acaacaatac aagaaaaagt gtacgtatag 850gaccaggaca aacattctat gcaacaggtg atataatagg ggatataaga 900caagcacatt gttgtacgag acccaacaat aatacaagaa aaagtataag 950gataggacca ggacaagcat tctatgcaac aggagaaata ataggagata 1000taagacaagc acattgttgc acaaggccct acaacaatat aagacaaagg 1050acccccatag gactagggca agcactctat acaacaagaa gaatagaaga 1100tataagaaga gcacattgtt gtaccagacc ctccaccaat acaagaacaa 1150gtatacgtat aggaccagga caagtattct atagaacagg agacataaca 1200ggagatataa gaaaagcata ttgtggatcc tgtacaagac ccaacaacaa 1250tacaagaaaa agaatatctt taggaccagg acgagtattt tatacagcag 1300gagaaataat aggagacatc agaaaggcac attgttgtac cagacctaat 1350aacaatacaa gaaaaagtat aacttttgca ccaggacaag cgctctatgc 1400aacaggtgaa ataataggag atataagaca agcacattgt ctcgggaaca 1450ttagtagagc aaaatggaat aacactttaa aacagataga tagcaaatta 1500agagaacaat ttggaaataa taaaacaata atctttaagc agtcctcagg 1550aggggaccca gaaattgtaa cgcacagttt taattgtgga ggggaatttt 1600tctactgtaa ttcaacacaa ctgtttaata gtacttggtt taatagtact 1650tggagtacta aagggtcaaa taacactgaa ggaagtgaca caatcaccct 1700cccatgcaga ataaaacaaa ttataaacat gtggcaggaa gtaggaaaag 1750caatgtatgc ccctcccatc agtggacaaa ttagatgttc atcaaatatt 1800acagggctgc tattaacaag agatggtggt aatagcaaca atgagtccga 1850gatcttcaga cctggaggag gagatatgag ggacaattgg agaagtgaat 1900tatataaata taaagtagta aaaattgaac cattaggagt agcacccacc 1950aaggcaaaga gaagagtggt gcagactagt gcagtgggaa taggagcttt 2000gttccttggg ttcttgggag cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa 2050tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat tgtctggtat agtgcagcag 2100cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc tgttgcaact 2150cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa 2200gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa 2250ctcatttgca ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc 2300tctggaacag atttggaata acatgacctg gatggagtgg gacagagaaa 2350ttaacaatta cacaagctta atacactcct taattgaaga atcgcaaaac 2400
cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata aatgggcaag 2450tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaatcgt 2500ggctgctgct gctcctgctc tccctctccc tcctccaggc cacggatttc 2550atgtccctgt ga 2562<210>33<211>853<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有多进化枝v3环的修饰的Env<400>33Met Arg Val Lys Glu Lys Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp Gly Trp5 10 15Arg Trp Gly Thr Met Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala20 25 30Thr Glu Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp35 40 45Lys Glu Ala Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala50 55 60Tyr Asp Thr Glu Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val65 70 75Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Val Val Leu Val Asn Val Thr80 85 90Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys Asn Asp Met Val Glu Gln Met His95 100 105Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val110 115 120Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Gly Ala Gly Ser Cys Asn Thr Ser125 130 135Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro140 145 150Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Asn155 160 165Asn Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr170 175 180Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser Thr Gln Leu185 190 195Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile Arg Ser200 205 210Ala Asn Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu Asn215 220 225Gln Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg230 235 240Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr245 250 255Ile Gly Lys Ile Gly Asn Met Arg Gln Ala His Cys Leu Gly Cys260 265 270Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Val Arg Ile Gly Pro275 280 285Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg290 295 300Gln Ala His Cys Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser305 310 315Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Glu Ile320 325 330Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cys Cys Thr Arg Pro Tyr Asn335 340 345Asn Ile Arg Gln Arg Thr Pro Ile Gly Leu Gly Gln Ala Leu Tyr350 355 360Thr Thr Arg Arg Ile Glu Asp Ile Arg Arg Ala His Cys Cys Thr365 370 375Arg Pro Ser Thr Asn Thr Arg Thr Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly380 385 390Gln Val Phe Tyr Arg Thr Gly Asp Ile Thr Gly Asp Ile Arg Lys395 400 405Ala Tyr Cys Gly Ser Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys410 415 420Arg Ile Ser Leu Gly Pro Gly Arg Val Phe Tyr Thr Ala Gly Glu425 430 435Ile Ile Gly Asp Ile Arg Lys Ala His Cys Cys Thr Arg Pro Asn440 445 450
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ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtacatccagtgcatgca gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaagtgacatagc aggaactact agtacccttc aggaacaaat aggatggatgacaaataatc cacctatccc agtaggagaa atttataaaa gatggataatcctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc agcattctggacataagaca aggaccaaaa gaacctttta gagactatgt agaccggttctataaaactc taagagccga gcaagcttca caggaggtaa aaaattggatgacagaaacc ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattttaaaagcatt gggaccagcg gctacactag aagaaatgat gacagcatgtcagggagtag gaggacccgg ccataaggca agagttttgt aa 1092<210>35<211>1179<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒1型<400>35atgagagtga aggagaaata tcagcacttg tggagatggg ggtggagatg 50gggcaccatg ctccttggga tgttgatgat ctgtagtgct ggtgcgagag 100cgtcagtatt aagcggggga gaattagatc gatgggaaaa aattcggtta 150aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta aaacatatag tatgggcaag 200cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta gaaacatcag 250aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 300tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt 350gcatcaaagg atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag 400aggaagagca aaacaaaagt aagaaaaaag cacagcaagc agcagctgac 450acaggacaca gcagtcaggt cagccaaaat taccctatag tgcagaacat 500ccaggggcaa atggtacatc aggccatatc acctagaact ttaaatgcat 550gggtaaaagt agtagaagag aaggctttca gcccagaagt aatacccatg 600ttttcagcat tatcagaagg agccacccca caagatttaa acaccatgct 650aaacacagtg gggggacatc aagcagccat gcaaatgtta aaagagacca 700tcaatgagga agctgcagaa tgggatagag tacatccagt gcatgcaggg 750cctattgcac caggccagat gagagaacca aggggaagtg acatagcagg 800aactactagt acccttcagg aacaaatagg atggatgaca aataatccac 850ctatcccagt aggagaaatt tataaaagat ggataatcct gggattaaat 900aaaatagtaa gaatgtatag ccctaccagc attctggaca taagacaagg 950accaaaagaa ccttttagag actatgtaga ccggttctat aaaactctaa 1000gagccgagca agcttcacag gaggtaaaaa attggatgac agaaaccttg 1050ttggtccaaa atgcgaaccc agattgtaag actattttaa aagcattggg 1100accagcggct acactagaag aaatgatgac agcatgtcag ggagtaggag 1150gacccggcca taaggcaaga gttttgtaa1179<210>36<211>1308<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒l型<400>36atgagagtga aggagaaata tcagcacttg tggagatggg ggtggagatg 50gggcaccatg ctccttggga tgttgatgat ctgtagtgct ggtgcgagag 100cgtcagtatt aagcggggga gaattagatc gatgggaaaa aattcggtta 150aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta aaacatatag tatgggcaag 200cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta gaaacatcag 250aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 300tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt 350gcatcaaagg atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag 400aggaagagca aaacaaaagt aagaaaaaag cacagcaagc agcagctgac 450acaggacaca gcagtcaggt cagccaaaat taccctatag tgcagaacat 500ccaggggcaa atggtacatc aggccatatc acctagaact ttaaatgcat 550gggtaaaagt agtagaagag aaggctttca gcccagaagt aatacccatg 600ttttcagcat tatcagaagg agccacccca caagatttaa acaccatgct 650aaacacagtg gggggacatc aagcagccat gcaaatgtta aaagagacca 700tcaatgagga agctgcagaa tgggatagag tacatccagt gcatgcaggg 750cctattgcac caggccagat gagagaacca aggggaagtg acatagcagg 800aactactagt acccttcagg aacaaatagg atggatgaca aataatccac 850ctatcccagt aggagaaatt tataaaagat ggataatcct gggattaaat 900aaaatagtaa gaatgtatag ccctaccagc attctggaca taagacaagg 950accaaaagaa ccttttagag actatgtaga ccggttctat aaaactctaa 1000gagccgagca agcttcacag gaggtaaaaa attggatgac agaaaccttg 1050ttggtccaaa atgcgaaccc agattgtaag actattttaa aagcattggg 1100accagcggct acactagaag aaatgatgac agcatgtcag ggagtaggag 1150gacccggcca taaggcaaga gttttgttat tcataatgat agtaggaggc 1200ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctgtag tgaatagagt 1250taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaatcccga 1300
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<223>修饰的Env/Tat<400>52gaattctgca acaactgctg tttatccatt ttcagaattg ggtgtcgaca 50tagcagaata ggcgttactc gacagaggag agcaagaaat ggagccagta 100gatcctagac tagagccctg gaagcatcca ggaagtcagc ctaaaactgc 150ttgtaccaat tgctattgta aaaagtgttg ctttcattgc caagtttgtt 200tcataacaaa agccttaggc atctcctatg gcaggaagaa gcggagacag 250cgacgaagac ctcctcaagg cagtcagact catcaagttt ctctatcaaa 300gcagtaagta gtacatgtaa tgcaacctat acaaatagca atagtagcat 350tagtagtagc aataataata gcaatagttg tgtggtccat agtaatcata 400gaatatagga aaatattaag acaaagaaaa atagacaggt taattgatag 450actaatagaa agagcagaag acagtggcaa tgagagtgaa ggagaaatat 500cagcacttgt ggagatgggg gtggagatgg ggcaccatgc tccttgggat 550gttgatgatc tgtagtgcta cagaaaaatt gtgggtcaca gtctattatg 600gggtacctgt gtggaaggaa gcaaccacca ctctattttg tgcatcagat 650gctaaagcat atgatacaga ggtacataat gtttgggcca cacatgcctg 700tgtacccaca gaccccaacc cacaagaagt agtattggta aatgtgacag 750aaaattttaa catgtggaaa aatgacatgg tagaacagat gcatgaggat 800ataatcagtt tatgggatca aagcctaaag ccatgtgtaa aattaacccc 850actctgtgtt ggagctggta gttgtaacac ctcagtcatt acacaggcct 900gtccaaaggt atcctttgag ccaattccca tacattattg tgccccggct 950ggttttgcga ttctaaaatg taataataag acgttcaatg gaacaggacc 1000atgtacaaat gtcagcacag tacaatgtac acatggaatt aggccagtag 1050tatcaactca actgctgtta aatggcagtc tggcagaaga agaggtagta 1100attagatctg ccaatttcac agacaatgct aaaaccataa tagtacagct 1150gaaccaatct gtagaaatta attgtacaag acccaacaac aatacaagaa 1200aaagtatccg tatccagaga ggaccaggga gagcatttgt tacaatagga 1250aaaataggaa atatgagaca agcacattgt ctcgggtgta ccagacctaa 1300caacaataca agaaaaagtg tacgtatagg accaggacaa acattctatg 1350caacaggtga tataataggg gatataagac aagcacattg ttgtacgaga 1400cccaacaata atacaagaaa aagtataagg ataggaccag gacaagcatt 1450ctatgcaaca ggagaaataa taggagatat aagacaagca cattgttgca 1500caaggcccta caacaatata agacaaagga cccccatagg actagggcaa 1550gcactctata caacaagaag aatagaagat ataagaagag cacattgttg 1600taccagaccc tccaccaata caagaacaag tatacgtata ggaccaggac 1650aagtattcta tagaacagga gacataacag gagatataag aaaagcatat 1700tgtggatcct gtacaagacc caacaacaat acaagaaaaa gaatatcttt 1750aggaccagga cgagtatttt atacagcagg agaaataata ggagacatca 1800gaaaggcaca ttgttgtacc agacctaata acaatacaag aaaaagtata 1850acttttgcac caggacaagc gctctatgca acaggtgaaa taataggaga 1900tataagacaa gcacattgtc tcgggtgtac cagacctaac aacaatacaa 1950gaaaaagtgt acgtatagga ccaggacaaa cattctatgc aacaggtgat 2000ataatagggg atataagaca agcacattgt tgtacgagac ccaacaataa 2050tacaagaaaa agtataagga taggaccagg acaagcattc tatgcaacag 2100gagaaataat aggagatata agacaagcac attgttgcac aaggccctac 2150aacaatataa gacaaaggac ccccatagga ctagggcaag cactctatac 2200aacaagaaga atagaagata taagaagagc acattgttgt accagaccct 2250
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<223>修饰的Env/Tat/Rev<400>55Met Arg Val Lys Glu Lys Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp Gly Trp5 10 15Arg Trp Gly Thr Met Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala20 25 30Thr Glu Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp35 40 45Lys Glu Ala Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala
50 55 60Tyr Asp Thr Glu Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val65 70 75Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Val Val Leu Val Asn Val Thr80 85 90Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys Asn Asp Met Val Glu Gln Met His95 100 105Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val110 115 120Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Gly Ala Gly Ser Cys Asn Thr Ser125 130 135Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro140 145 150Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Asn155 160 165Asn Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr170 175 180Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser Thr Gln Leu185 190 195Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile Arg Ser200 205 210Ala Asn Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu Asn215 220 225Gln Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg230 235 240Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr245 250 255Ile Gly Lys Ile Gly Asn Met Arg Gln Ala His Cys Leu Gly Cys260 265 270Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Val Arg Ile Gly Pro275 280 285Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg290 295 300Gln Ala His Cys Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser305 310 315Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Glu Ile320 325 330Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cys Cys Thr Arg Pro Tyr Asn335 340 345Asn Ile Arg Gln Arg Thr Pro Ile Gly Leu Gly Gln Ala Leu Tyr350 355 360Thr Thr Arg Arg Ile Glu Asp Ile Arg Arg Ala His Cys Cys Thr365 370 375Arg Pro Ser Thr Asn Thr Arg Thr Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly380 385 390Gln Val Phe Tyr Arg Thr Gly Asp Ile Thr Gly Asp Ile Arg Lys395 400 405Ala Tyr Cys Gly Ser Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys410 415 420Arg Ile Ser Leu Gly Pro Gly Arg Val Phe Tyr Thr Ala Gly Glu425 430 435Ile Ile Gly Asp Ile Arg Lys Ala His Cys Cys Thr Arg Pro Asn440 445 450Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Thr Phe Ala Pro Gly Gln Ala Leu455 460 465Tyr Ala Thr Gly Glu Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cys470 475 480Leu Gly Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Val Arg485 490 495Ile Gly Pro Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly500 505 510Asp Ile Arg Gln Ala His Cys Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr515 520 525Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr530 535 540Gly Glu Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cys Cys Thr Arg545 550 555Pro Tyr Asn Asn Ile Arg Gln Arg Thr Pro Ile Gly Leu Gly Gln560 565 570Ala Leu Tyr Thr Thr Arg Arg Ile Glu Asp Ile Arg Arg Ala His575 580 585Cys Cys Thr Arg Pro Ser Thr Asn Thr Arg Thr Ser Ile Arg Ile590 595 600Gly Pro Gly Gln Val Phe Tyr Arg Thr Gly Asp Ile Thr Gly Asp605 610 615
Ile Arg Lys Ala Tyr Cys Gly Ser Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn620 625 630Thr Arg Lys Arg Ile Ser Leu Gly Pro Gly Arg Val Phe Tyr Thr635 640 645Ala Gly Glu Ile Ile Gly Asp Ile Arg Lys Ala His Cys Cys Thr650 655 660Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Thr Phe Ala Pro Gly665 670 675Gln Ala Leu Tyr Ala Thr Gly Glu Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln680 685 690Ala His Cys Leu Gly Asn Ile Ser Arg Ala Lys Trp Asn Asn Thr695 700 705Leu Lys Gln Ile Asp Ser Lys Leu Arg Glu Gln Phe Gly Asn Asn710 715 720Lys Thr Ile Ile Phe Lys Gln Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile725 730 735Val Thr His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn740 745 750Ser Thr Gln Leu Phe Asn Ser Thr Trp Phe Asn Ser Thr Trp Ser755 760 765Thr Lys Gly Ser Asn Asn Thr Glu Gly Ser Asp Thr Ile Thr Leu770 775 780Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly785 790 795Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile Arg Cys Ser800 805 810Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Ser815 820 825Asn Asn Glu Ser Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg830 835 840Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile845 850 855Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val860 865 870Gln Thr Ser Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu875 880 885Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Cys Thr Ser Met Thr Leu Thr890 895 900Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Asp Ile Val Gln Gln Gln Asn905 910 915Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu920 925 930Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val935 940 945Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys950 955 960Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser965 970 975Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp980 985 990Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His99510001005Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln101010151020Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe102510301035Asn Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Leu Phe Ile Met Ile104010451050Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala Val Leu Ser105510601065Ile Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Tyr Ser Pro Leu Ser Phe Gln107010751080Thr His Leu Pro Ile Pro Arg Gly Pro Asp Arg Pro Glu Gly Ile108510901095Glu Glu Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg Ser Ile Arg Leu110011051110Val Asn Gly Ser Leu Ala Leu Ile Trp Asp Asp Leu Arg Ser Leu111511201125Cys Leu Phe Ser Tyr His Arg Leu Arg Asp Leu Leu Leu Ile Val113011351140Thr Arg Ile Val Glu Leu Leu Gly Arg Arg Gly Trp Glu Ala Leu114511501155Lys Tyr Trp Trp Asn Leu Leu Gln Tyr Trp Ser Gln Glu Leu Lys116011651170Asn Ser Ala Val Asn Leu Leu Asn Ala Thr Ala Ile Ala Val Ala
117511801185Glu<210>56<211>507<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒1型<400>56atgttcttta gggaagatct ggccttccta caagggaagg ccagggaatt 50ttcttcagag cagaccagag ccaacagccc caccatttct tcagagcaga 100ccagagccaa cagccccacc agaagagagc ttcaggtctg gggtagagac 150aacaactccc cctcagaagc aggagccgat agacaaggaa ctgtatcctt 200taacttccct cagatcactc tttggcaacg acccctcgtc acaataaaga 250taggggggca actaaaggaa gctctattag atacaggagc agatgataca 300gtattagaag aaatgagttt gccaggaaga tggaaaccaa aaatgatagg 350gggaattgga ggttttatca aagtaagaca gtatgatcag atactcatag 400aaatctgtgg acataaagct ataggtacag tattagtagg acctacacct 450gtcaacataa ttggaagaaa tctgttgact cagattggtt gcactttaaa 500tttttaa507<210>57<211>168<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<400>57Met Phe Phe Arg Glu Asp Leu Ala Phe Leu Gln Gly Lys Ala Arg5 10 15Glu Phe Ser Ser Glu Gln Thr Arg Ala Asn Ser Pro Thr Ile Ser20 25 30Ser Glu Gln Thr Arg Ala Asn Ser Pro Thr Arg Arg Glu Leu Gln35 40 45Val Trp Gly Arg Asp Asn Asn Ser Pro Ser Glu Ala Gly Ala Asp50 55 60Arg Gln Gly Thr Val Ser Phe Asn Phe Pro Gln Ile Thr Leu Trp65 70 75Gln Arg Pro Leu Val Thr Ile Lys Ile Gly Gly Gln Leu Lys Glu80 85 90Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val Leu Glu Glu Met95 100 105Ser Leu Pro Gly Arg Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly110 115 120Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp Gln Ile Leu Ile Glu Ile125 130 135Cys Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr Pro140 145 150Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu Thr Gln Ile Gly Cys Thr155 160 165Leu Asn Phe<210>58<211>1800<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Gag-PI<400>58atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgatggga 50aaaaattcgg ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa ttaaaacata 100tagtatgggc aagcagggag ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg 150ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata ctgggacagc tacaaccatc 200ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat acagtagcaa 250ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct 300ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aagcacagca 350agcagcagct gacacaggac acagcagtca ggtcagccaa aattacccta 400tagtgcagaa catccagggg caaatggtac atcaggccat atcacctaga 450actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa gagaaggctt tcagcccaga 500
agtaataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc ccacaagatt 550taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtacatcc 650agtgcatgca gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa 700gtgacatagc aggaactact agtacccttc aggaacaaat aggatggatg 750acaaataatc cacctatccc agtaggagaa atttataaaa gatggataat 800cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc agcattctgg 850acataagaca aggaccaaaa gaacctttta gagactatgt agaccggttc 900tataaaactc taagagccga gcaagcttca caggaggtaa aaaattggat 950gacagaaacc ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt 1000taaaagcatt gggaccagcg gctacactag aagaaatgat gacagcatgt 1050cagggagtag gaggacccgg ccataaggca agagttttgg ctgaagcaat 1100gagccaagta acaaatacag ctaccataat gatgcagaga ggcaatttta 1150ggaaccaaag aaagatggtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200acagccagaa attgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg 1250aaaggaagga caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaatttct 1300ttagggaaga tctggccttc ctacaaggga aggccaggga attttcttca 1350gagcagacca gagccaacag ccccaccatt tcttcagagc agaccagagc 1400caacagcccc accagaagag agcttcaggt ctggggtaga gacaacaact 1450ccccctcaga agcaggagcc gatagacaag gaactgtatc ctttaacttc 1500cctcagatca ctctttggca acgacccctc gtcacaataa agataggggg 1550gcaactaaag gaagctctat tagatacagg agcagatgat acagtattag 1600aagaaatgag tttgccagga agatggaaac caaaaatgat agggggaatt 1650ggaggtttta tcaaagtaag acagtatgat cagatactca tagaaatctg 1700tggacataaa gctataggta cagtattagt aggacctaca cctgtcaaca 1750taattggaag aaatctgttg actcagattg gttgcacttt aaatttttaa 1800<210>59<211>599<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Gag-PI<400>59Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg5 10 15Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys20 25 30Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala35 40 45Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile50 55 60Leu Gly Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu65 70 75Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln80 85 90Arg Ile Glu Ile Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu95 100 105Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala110 115 120Asp Thr Gly His Ser Ser Gln Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val125 130 135Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg140 145 150Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser155 160 165Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr170 175 180Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln185 190 195Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala200 205 210Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro215 220 225Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr230 235 240Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro245 250 255Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu260 265 270Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile275 280 285
Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe290 295 300Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn305 310 315Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys320 325 330Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu335 340 345Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala350 355 360Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Thr Ala Thr365 370 375Ile Met Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Met Val380 385 390Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys395 400 405Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly410 415 420His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Phe Arg425 430 435Glu Asp Leu Ala Phe Leu Gln Gly Lys Ala Arg Glu Phe Ser Ser440 445 450Glu Gln Thr Arg Ala Asn Ser Pro Thr Ile Ser Ser Glu Gln Thr455 460 465Arg Ala Asn Ser Pro Thr Arg Arg Glu Leu Gln Val Trp Gly Arg470 475 480Asp Asn Asn Ser Pro Ser Glu Ala Gly Ala Asp Arg Gln Gly Thr485 490 495Val Ser Phe Asn Phe Pro Gln Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu500 505 510Val Thr Ile Lys Ile Gly Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp515 520 525Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val Leu Glu Glu Met Ser Leu Pro Gly530 535 540Arg Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys545 550 555Val Arg Gln Tyr Asp Gln Ile Leu Ile Glu Ile Cys Gly His Lys560 565 570Ala Ile Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile Ile575 580 585Gly Arg Asn Leu Leu Thr Gln Ile Gly Cys Thr Leu Asn Phe590 595<210>60<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>60aaatcaaccg gaattgaatt ccctcgggtg taccagacct aacaacaata 50c 51<210>61<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>61attgttgggt ctcgtacaac aatgtgcttg tcttatatcc cc 42<210>62<211>41<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物<400>62ggggatataa gacaagcaca ttgtacgaga cccaacaata c 41<210>63<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>63gttgtagggc cttgtgcaac aatgtgcttg tcttatatc 39<210>64<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>64gatataagac aagcacattg ttgcacaagg ccctacaac 39<210>65<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>65ggtggagggt ctggtacaac aatgtgctct tcttat36<210>66<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>66ataagaagag cacattgttg taccagaccc tccgcc36<210>67<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>67gtattgttgt tgggtcttgt acaacaatat gcttttctta tatctcc47<210>68<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR物
<400>68ggagatataa gaaaagcata ttgttgtaca agacccaaca acaatac47<210>69<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>69gttattaggt ctggtacaac aatgtgcctt tctgatgtc 39<210>70<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>70gacatcagaa aggcacattg ttgtaccaga cctaataac 39<210>71<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>71aataaactag tctagacccc cgagtctaga acaatgtgct tgtcttatat 50ctcc 54<210>72<211>7<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MMLV SD位点<400>72aggtaag 7<210>73<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MMLV SA位点<400>73ctgctgcag 9<210>74<211>90<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码gp120信号肽的DNA<400>74atgagagtga aggagaaata tcagcacttg tggagatggg ggtggagatg 50
gggcaccatg ctccttggga tgttgatgat ctgtagtgct90<210>75<211>129<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>编码gp41跨膜结构域的DNA<400>75ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa tagtttttgc 50tgtactttct gtagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt 100ttcagaccCa cctcccaatc ccgagggga129
权利要求
1.一种重组体腺病毒，其包含编码HIV抗原的HIV序列，当宿主被所述的重组体腺病毒感染的时候，由所述重组体腺病毒表达的HIV抗原在宿主体内激发针对所述HIV抗原的免疫应答。
2.权利要求1的重组体腺病毒，其中所述的重组体腺病毒是不能复制的。
3.权利要求1的重组体腺病毒，其中所述的HIV抗原是HIV-1或HIV-2的抗原。
4.权利要求1的重组体腺病毒，其中所述的HIV抗原是HIV毒株BH10或者pNL4-3的抗原。
5.权利要求1的重组体腺病毒，其中所述的HIV抗原是HIV进化枝A，B，C，D，E，F，或者G的抗原。
6.权利要求1的重组体腺病毒，其中所述的HIV抗原是HIV糖蛋白或者表面抗原。
7.权利要求6的重组体腺病毒，其中所述的HIV糖蛋白是HIV包膜蛋白。
8.权利要求7的重组体腺病毒，其中所述的HIV包膜蛋白是野生型或者突变体gp160，gp120或者gp41。
9.权利要求7的重组体腺病毒，其中所述HIV包膜蛋白的切割位点被突变所钝化。
10.权利要求7的重组体腺病毒，其中所述HIV包膜蛋白的C末端胞质结构域被缺失。
11.权利要求7的重组体腺病毒，其中所述HIV包膜蛋白的切割位点和C末端胞质结构域都被缺失。
12.权利要求7的重组体腺病毒，其中所述的HIV包膜蛋白是由选自由SEQ ID NOs14，16，20，21，22，23，和24组成的组的多核苷酸所编码。
13.权利要求7的重组体腺病毒，其中所述的HIV序列还编码选自由RT，PR，Tat，Vif，Nef，和Rev组成的组的HIV蛋白。
14.权利要求7的重组体腺病毒，其中所述的HIV抗原是包含多进化枝可变环的修饰的HIV包膜蛋白。
15.权利要求14的重组体腺病毒，其中所述的多进化枝可变环是来自至少两个HIV进化枝的V3环。
16.权利要求15的重组体腺病毒，其中所述的至少两个HIV进化枝选自由M组HIV-1分离物的进化枝A，B，C，D，E，F，和G组成的组。
17.权利要求15的重组体腺病毒，其中所述的V3环由选自由SEQ ID NOs25，26，27，28，29，30，和31组成的组的多核苷酸所编码。
18.权利要求14的重组体腺病毒，其中所述包含多进化枝可变环的修饰的HIV包膜蛋白是由选自由SEQ ID NOs32，52，和54组成的组的多核苷酸编码。
19.权利要求1的重组体腺病毒，其还包含编码促进所述HIV抗原分泌的信号肽的多核苷酸，所述的HIV抗原是由被所述重组体腺病毒感染的细胞所分泌的。
20.权利要求19的重组体腺病毒，其中所述的信号肽是HIV gp120信号肽。
21.权利要求19的重组体腺病毒，其中所述的信号肽由SEQ ID NO74编码。
22.权利要求1的重组体腺病毒，其还包含编码膜锚定结构域的多核苷酸，所述的结构域使所述HIV抗原结合到被所述重组体腺病毒感染的细胞的表面。
23.权利要求22的重组体腺病毒，其中所述的膜锚定结构域是HIV gp41的跨膜结构域。
24.权利要求22的重组体腺病毒，其中所述的膜锚定结构域由SEQ ID NO75编码。
25.权利要求1的重组体腺病毒，其中所述的HIV抗原是HIV结构蛋白。
26.权利要求25的重组体腺病毒，其中所述的HIV结构蛋白是野生型HIV Gag。
27.权利要求25的重组体腺病毒，其中所述的HIV结构蛋白是HIV Gag的蛋白水解片段。
28.权利要求27的重组体腺病毒，其中所述HIV Gag的蛋白水解片段选自由p17/24，p17和p24组成的组。
29.权利要求27的重组体腺病毒，其中所述HIV Gag的蛋白水解片段是天然形式，分泌形式或者膜结合形式。
30.权利要求27的重组体腺病毒，其中所述Gag的蛋白水解片段是由选自由SEQ ID NOs34，35，36，40，41，42，46，47，和48组成的组的多核苷酸所编码。
31.权利要求1的重组体腺病毒，其还包含编码HIV蛋白酶或者HIV逆转录酶的多核苷酸。
32.权利要求31的重组体腺病毒，其中所述编码HIV蛋白酶的多核苷酸是SEQ ID NO56。
33.权利要求31的重组体腺病毒，其中所述的HIV抗原是HIV Gag。
34.权利要求33的重组体腺病毒，其中所述的蛋白酶与所述HIV Gag一起被表达为融合蛋白。
35.权利要求33的重组体腺病毒，其中所述的蛋白酶从一个启动子被分开地表达，所述启动子不同于用于所述HIV Gag的启动子。
36.权利要求33的重组体腺病毒，其中所述的蛋白酶经由IRES或者剪接供体/受体机制从与所述HIV Gag相同的启动子被表达为分开的蛋白质。
37.权利要求1的重组体腺病毒，其还包含编码HIV蛋白酶和HIV逆转录酶的融合蛋白质的多核苷酸。
38.权利要求37的重组体腺病毒，其中所述的HIV抗原是HIV Gag。
39.权利要求38的重组体腺病毒，其中所述的HIV蛋白酶和HIV逆转录酶的融合蛋白质与所述HIV Gag一起被表达为融合蛋白质。
40.权利要求38的重组体腺病毒，其中所述的HIV蛋白酶和HIV逆转录酶的融合蛋白质从一个启动子被分开地表达，所述启动子不同于用于所述HIV Gag的启动子。
41.权利要求38的重组体腺病毒，其中所述HIV蛋白酶和HIV逆转录酶的融合蛋白质经由IRES或者剪接供体/受体机制从与所述HIV Gag相同的启动子被表达为分开的蛋白质。
42.权利要求1的重组体腺病毒，其还包含编码HIV蛋白酶，HIV逆转录酶和HIV整合酶的融合蛋白质的多核苷酸。
43.权利要求42的重组体腺病毒，其中所述的HIV抗原是HIV Gag。
44.权利要求43的重组体腺病毒，其中所述的HIV蛋白酶，HIV逆转录酶和HIV整合酶的融合蛋白质与所述HIV Gag一起被表达为融合蛋白质。
45.权利要求43的重组体腺病毒，其中所述的HIV蛋白酶，HIV逆转录酶和HIV整合酶的融合蛋白质从一个启动子被分开地表达，所述启动子不同于用于所述HIV Gag的启动子。
46.权利要求43的重组体腺病毒，其中所述的HIV蛋白酶，HIV逆转录酶和HIV整合酶的融合蛋白质经由IRES或者剪接供体/受体机制从与所述HIV Gag相同的启动子被表达为分开的蛋白质。
47.权利要求1的重组体腺病毒，其还包含异源于腺病毒并且编码免疫刺激因子的免疫刺激因子序列，其在所述宿主中的表达提高了所述HIV抗原的免疫原性。
48.权利要求47的重组体腺病毒，其中所述的HIV序列被放置于所述腺病毒的E1区域而且所述的免疫刺激因子序列被放置于所述腺病毒的E4区域。
49.权利要求47的重组体腺病毒，其中所述的HIV序列和免疫刺激因子序列均被放置于所述腺病毒的E1或者E4区域，并且经由内部核糖体进入位点或者经由剪接供体-受体机制从相同的启动子被双顺反子地表达。
50.权利要求47的重组体腺病毒，其中所述HIV抗原或者免疫刺激因子的表达由腺病毒启动子控制。
51.权利要求47的重组体腺病毒，其中所述HIV抗原或者免疫刺激因子的表达由非腺病毒启动子控制。
52.权利要求51的重组体腺病毒，其中所述的非腺病毒启动子选自由CMV启动子，SV40启动子，逆转录病毒LTR启动子和鸡胞质β-肌动蛋白启动子组成的组。
53.权利要求47的重组体腺病毒，其中所述的免疫刺激因子是细胞因子。
54.权利要求53的腺病毒载体，其中所述的细胞因子选自由白细胞介素-2，白细胞介素-4，白细胞介素-12，β-干扰素，λ-干扰素，γ-干扰素，粒细胞集落刺激因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子组成的组。
55.权利要求47的重组体腺病毒，其中所述的免疫刺激因子是不同细胞因子的组合。
56.权利要求55的重组体腺病毒，其中所述的细胞因子组合经由IRES机制或者逆转录病毒剪接供体/受体机制表达自相同的启动子但是被表达为分开的蛋白质。
57.一种重组体腺病毒，其包含编码第一HIV抗原的第一HIV序列，其表达处于第一启动子的转录控制之下；和编码第二HIV抗原的第二HIV序列，其表达处于第二启动子的转录控制之下，所述第二启动子与第一启动子处在不同区域，当宿主被所述的重组体病毒感染的时候，第一和第二HIV序列的表达激发针对所述第一和第二HIV抗原的免疫应答。
58.权利要求57的重组体腺病毒，其中所述的重组体腺病毒是不能复制的。
59.权利要求57的重组体腺病毒，其中所述的第一和第二HIV抗原是相同的。
60.权利要求57的重组体腺病毒，其中所述的第一和第二HIV抗原是不同的。
61.权利要求57的重组体腺病毒，其中所述的第一或者第二HIV抗原是HIV包膜蛋白质。
62.权利要求61的重组体腺病毒，其中所述的HIV包膜蛋白是野生型或者突变体gp160，gp120或者gp41。
63.权利要求62的重组体腺病毒，其中所述HIV包膜蛋白的切割位点被突变所钝化。
64.权利要求62的重组体腺病毒，其中所述HIV包膜蛋白的C末端胞质结构域被缺失。
65.权利要求62的重组体腺病毒，其中所述HIV包膜蛋白的切割位点和C末端胞质结构域都被缺失。
66.权利要求61的重组体腺病毒，其中所述的第一或者第二HIV序列还编码选自由RT，PR，Tat，Vif，Nef，和Rev组成的组的HIV蛋白质。
67.权利要求57的重组体腺病毒，其中所述的第一或者第二HIV抗原是包含多进化枝可变环的修饰的HIV包膜蛋白质。
68.权利要求67的重组体腺病毒，其中所述的多进化枝可变环是来自至少两个HIV进化枝的V3环。
69.权利要求68的重组体腺病毒，其中所述的至少两个HIV进化枝选自由M组HIV-1分离物的进化枝A，B，C，D，E，F，和G组成的组。
70.权利要求68的重组体腺病毒，其中所述的V3环由选自由SEQ ID NOs25，26，27，28，29，30，和31组成的组的多核苷酸编码。
71.权利要求57的重组体腺病毒，其还包含编码促进所述第一或者第二HIV抗原分泌的信号肽的多核苷酸，所述的HIV抗原是由被所述重组体腺病毒感染的细胞所分泌的。
72.权利要求71的重组体腺病毒，其中所述的信号肽是HIV gp120信号肽。
73.权利要求71的重组体腺病毒，其中所述的信号肽由SEQ ID NO74编码。
74.权利要求57的重组体腺病毒，其还包含编码膜锚定结构域的多核苷酸，所述的锚定结构域使所述第一或者第二HIV抗原结合到被所述重组体腺病毒感染的细胞的表面。
75.权利要求74的重组体腺病毒，其中所述的膜锚定结构域是HIV gp41跨膜结构域。
76.权利要求74的重组体腺病毒，其中所述的膜锚定结构域由SEQ ID NO75编码。
77.权利要求57的重组体腺病毒，其中所述的第一和第二HIV抗原是HIV结构蛋白质。
78.权利要求77的重组体腺病毒，其中所述的HIV结构蛋白是野生型HIV Gag。
79.权利要求77的重组体腺病毒，其中所述的HIV结构蛋白是HIV Gag的蛋白水解片段。
80.权利要求77的重组体腺病毒，其中所述HIV Gag的蛋白水解片段选自由p17/24，p17和p24组成的组。
81.权利要求77的重组体腺病毒，其中所述HIV Gag的蛋白水解片段是天然形式，分泌形式或者膜结合形式。
82.权利要求77的重组体腺病毒，其中所述Gag的蛋白水解片段是由选自由SEQ ID NOs34，35，36，40，41，42，46，47，和48组成的组的多核苷酸所编码。
83.权利要求77的重组体腺病毒，其还包含编码HIV蛋白酶的多核苷酸。
84.权利要求83的重组体腺病毒，其中所述编码HIV蛋白酶的多核苷酸是SEQ ID NO56。
85.权利要求57的重组体腺病毒，其中所述的第一HIV抗原是野生型或者突变型HIV包膜蛋白，而且所述第二HIV抗原是野生型或者突变型的HIV结构蛋白。
86.权利要求85的重组体腺病毒，其中所述的野生型或者突变型的HIV结构蛋白是野生型Gag或者Gag的蛋白水解片段。
87.权利要求57的重组体腺病毒，其中所述的第一和第二HIV抗原都是野生型或者突变型HIV包膜蛋白。
88.权利要求57的重组体腺病毒，其中所述的第一和第二HIV抗原都是野生型或者突变型HIV结构蛋白。
89.权利要求57的重组体腺病毒，其还包括异源于腺病毒并且编码免疫刺激因子的免疫刺激因子序列，其在所述宿主中的表达提高了所述第一或者第二HIV抗原的免疫原性。
90.权利要求89的重组体腺病毒，其中所述的第一或第二HIV序列和免疫刺激因子序列经由内部核糖体进入位点或者经由剪接供体受体机制，从相同的启动子双顺反子地表达。
91.权利要求89的重组体腺病毒，其中所述的免疫刺激因子是细胞因子。
92.权利要求91的重组体腺病毒，其中所述的细胞因子选自由白细胞介素-2，白细胞介素-4，白细胞介素-12，β-干扰素，λ-干扰素，γ-干扰素，粒细胞集落刺激因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子组成的组。
93.权利要求57的重组体腺病毒，其中所述的第一或第二启动子是腺病毒启动子。
94.权利要求57的重组体腺病毒，其中所述的第一或第二启动子是非腺病毒启动子。
95.权利要求94的重组体腺病毒，其中所述的非腺病毒启动子选自由CMV启动子，SV40启动子，逆转录病毒LTR启动子和鸡胞质β-肌动蛋白启动子组成的组。
96.权利要求57的重组体腺病毒，其中所述的第一启动子位于所述腺病毒的E1区域并且所述第二启动子位于所述腺病毒的E4区域。
97.一种用于增强宿主对HIV感染免疫力的方法，其包含给予所述宿主第一重组体腺病毒，所述第一重组体腺病毒包含编码第一HIV抗原的第一HIV序列，当宿主被所述重组体腺病毒感染的时候，由所述第一重组体腺病毒所表达的第一HIV抗原在宿主体内激发针对所述第一HIV抗原的免疫应答。
98.权利要求97的方法，其中将重组体腺病毒给予宿主是通过肌肉内，气管内，皮下，鼻内，皮内，直肠，口和肠胃外进行的。
99.权利要求97的方法，其中所述的重组体腺病毒还包含一种或者多种异源于腺病毒并且编码免疫刺激因子的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表达提高了所述HIV抗原的免疫原性。
100.权利要求97的方法，其还包含给予所述宿主一种免疫刺激因子。
101.权利要求100的方法，其中所述的免疫刺激因子是细胞因子，所述细胞因子选自由白细胞介素-2，白细胞介素-4，白细胞介素-12，β-干扰素，λ-干扰素，γ-干扰素，粒细胞集落刺激因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子组成的组。
102.权利要求97的方法，其还包含给予所述宿主与所述第一重组体腺病毒不同血清型的第二重组体腺病毒，其包含编码第二HIV抗原的第二HIV序列，当所述宿主被所述重组体腺病毒感染的时候，由所述第二重组体腺病毒所表达的第二HIV抗原在宿主体内激发针对所述第二HIV抗原的免疫应答。
103.权利要求102的方法，其中所述第一重组体腺病毒的血清型是腺病毒血清型5，而且所述第二重组体腺病毒的血清型选自由腺病毒血清型1-4和6-51组成的组。
104.权利要求102的方法，其中所述的由第一重组体腺病毒编码的第一HIV抗原与由所述第二重组体腺病毒编码的第二HIV抗原相同。
105.权利要求102的方法，其中所述的由第一重组体腺病毒编码的第一HIV抗原与由所述第二重组体腺病毒编码的第二HIV抗原不同。
106.权利要求102的方法，其中所述的第二重组体腺病毒具有与所述第一个相同的腺病毒骨架，除了所述第二重组体腺病毒的纤维区与所述第一重组体腺病毒的纤维区血清型不同。
107.权利要求102的方法，其中所述的第二重组体腺病毒具有与所述第一个相同的腺病毒骨架，除了所述第二重组体腺病毒的纤维区的结，干和五邻体基底结构域与所述第一重组体腺病毒相应区域的血清型不同。
108.权利要求102的方法，其中在将所述第一重组体腺病毒给予所述宿主至少一周后，将所述第二重组体腺病毒给予宿主。
109.权利要求97的方法，其还包含在将所述第一重组体腺病毒给予所述宿主后收集血清。
110.权利要求109的方法，其中所述的宿主是人或者非人灵长类动物。
111.权利要求109的方法，其还包含将所述的血清存贮至少12个小时；和然后将所述血清给予所述宿主或者另一个宿主。
112.权利要求111的方法，其中所述的另一个宿主是人或者非人灵长类动物。
113.权利要求97的方法，其还包含在将所述第一重组体腺病毒给予所述宿主后，从宿主中分离针对所述第一HIV抗原的抗体；和然后将所述抗体给予所述宿主或者另一个宿主。
114.一种增强宿主对HIV感染的免疫力的方法，其包含给予所述宿主重组体腺病毒，所述重组体腺病毒包含编码第一HIV抗原的第一HIV序列，其表达处于第一启动子的转录控制下；和编码第二HIV抗原的第二HIV序列，其表达处于位于与所述第一启动子不同区域的第二启动子的转录控制下，当所述宿主被所述重组体腺病毒感染的时候，所述第一和第二HIV序列的表达激发针对所述第一和第二HIV抗原的免疫应答。
115.权利要求114的方法，其还包含在首次给予所述的重组体腺病毒之后，至少再一次将所述的重组体腺病毒给予所述宿主。
116.一种增强宿主对第一和第二致病病毒感染的免疫力的方法，其包含给予所述宿主第一重组体腺病毒，其包含异源于天然腺病毒并且编码来自第一致病病毒的第一病毒抗原的第一抗原序列，当宿主被所述第一重组体腺病毒感染的时候，由所述第一重组体腺病毒表达的第一病毒抗原在宿主体内激发针对所述第一病毒抗原的免疫应答；和给予所述宿主第二重组体腺病毒，其包含异源于天然腺病毒并且编码来自第二致病病毒的第二病毒抗原的第二抗原序列，当宿主被所述第一重组体腺病毒感染的时候，由所述第二重组体腺病毒表达的第二病毒抗原在宿主体内激发针对所述第二病毒抗原的免疫应答。
117.权利要求116的方法，其中将所述第一或者第二重组体腺病毒给予宿主是通过肌肉内，气管内，皮下，鼻内，皮内，直肠，口和肠胃外进行的。
118.权利要求116的方法，其中所述第一重组体腺病毒的血清型是腺病毒血清型5，而且所述第二重组体腺病毒的血清型选自由腺病毒血清型1-4和6-51组成的组。
119.权利要求116的方法，其中所述的由第一重组体腺病毒编码的第一病毒抗原与由所述第二重组体腺病毒编码的第二病毒抗原相同。
120.权利要求116的方法，其中所述的由第一重组体腺病毒编码的第一病毒抗原与由所述第二重组体腺病毒编码的第二病毒抗原不同。
121.权利要求116的方法，其中所述的第二重组体腺病毒具有与所述第一个相同的腺病毒骨架，除了所述第二重组体腺病毒的纤维区与所述第一重组体腺病毒的纤维区血清型不同。
122.权利要求116的方法，其中所述的第二重组体腺病毒具有与所述第一个相同的腺病毒骨架，除了所述第二重组体腺病毒纤维区的结，干或五邻体基底结构域与所述第一重组体腺病毒相应区域的血清型不同。
123.权利要求116的方法，其中所述的第二重组体腺病毒具有与所述第一个相同的腺病毒骨架，除了所述第二重组体腺病毒纤维区的结结构域与所述第一重组体腺病毒相应区域的血清型不同。
124.权利要求116的方法，其中在将所述第一重组体腺病毒给予宿主至少一周后，将所述第二重组体腺病毒给予宿主。
125.权利要求116的方法，其中所述的第一或者第二重组体腺病毒是不能复制的。
126.权利要求116的方法，其中的第一重组体病毒还包含第三抗原序列，该序列异源于天然腺病毒并编码来自所述第一或者第二致病病毒的第三病毒抗原。
127.权利要求126的方法，其中所述的第一和第三抗原序列被分别放置于所述第一重组体腺病毒天然祖先的E1和E3或E4区域。
128.权利要求126的方法，其中所述的第一和第三抗原序列被同一个启动子双顺反子地表达。
129.权利要求128的方法，其中所述的第一和第二抗原序列经由内部核糖体进入位点或者经由剪接供体-受体机制被双顺反子地表达。
130.权利要求116的方法，其中所述的第一重组体病毒还包含第三抗原序列，该序列异源于天然腺病毒并且编码来自所述第一或第二致病病毒的第三病毒抗原，和所述的第二重组体病毒还包含第四抗原序列，该序列异源于天然腺病毒并且编码来自所述第一或第二致病病毒的第四病毒抗原。
131.权利要求130的方法，其中所述的第一和第三抗原序列被分别置于所述第一重组体腺病毒天然祖先的E1和E3或E4区域；并且所述的第二和第四抗原序列被分别置于所述第二重组体腺病毒天然祖先的E1和E3或E4区域。
132.权利要求131的方法，其中所述的第一和第三抗原序列被相同的启动子双顺反子地表达，或者所述的第二和第四抗原序列被相同的启动子双顺反子地表达。
133.权利要求132的方法，其中所述的双顺反子表达是经由内部核糖体进入位点或者剪接供体-受体机制进行的。
134.权利要求116的方法，其中所述的第一和第二致病病毒是相同的。
135.权利要求116的方法，其中所述的第一和第二致病病毒的类型相同但是亚型或进化枝不同。
136.权利要求116的方法，其中所述的第一和第二致病病毒是相同病毒的不同类型。
137.权利要求116的方法，其中所述的第一和第二致病病毒是不同的病毒。
138.权利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是人免疫缺陷病毒。
139.权利要求138的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是HIV表面蛋白，核心/衣壳蛋白，调控蛋白，酶蛋白或者辅助蛋白。
140.权利要求138的方法，其中所述第一或第二病毒抗原选自由HIVgp120，gp41，Gag，p17，p24，p2，p7，p1，p6，Tat，Rev，PR，RT，IN，Vif，Vpr，Vpx，Vpu和Nef组成的组。
141.权利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是流感病毒。
142.权利要求141的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是所述流感病毒的糖蛋白。
143.权利要求142的方法，其中所述的第一或者第二病毒抗原是流感糖蛋白HA1，HA2或者NA。
144.权利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是埃博拉病毒。
145.权利要求144的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是埃博拉糖蛋白。
146.权利要求145的方法，其中所述的第一或者第二病毒抗原是埃博拉GP1或者GP2蛋白。
147.权利要求146的方法，其中所述的第一或者第二病毒抗原是埃博拉核壳蛋白。
148.权利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是马尔堡病毒。
149.权利要求148的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是马尔堡糖蛋白。
150.权利要求148的方法，其中所述的第一或者第二病毒抗原是马尔堡核壳蛋白。
151.权利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是虫媒病毒。
152.权利要求151的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是虫媒病毒糖蛋白。
153.权利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是肝炎病毒。
154.权利要求153的方法，其中所述的肝炎病毒是肝炎A、B、C、D或者E病毒。
155.权利要求153的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是乙肝病毒的表面抗原或者核心蛋白。
156.权利要求155的方法，其中所述的第一或者第二病毒抗原是乙肝病毒的SHBsAg，MHBsAg，或者LHBsAg。
157.权利要求153的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是丙型肝炎病毒的表面抗原或者核心蛋白。
158.权利要求157的方法，其中所述的第一或者第二病毒抗原是丙型肝炎病毒的NS3，NS4或者NS5抗原。
159.权利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是呼吸道合胞病毒。
160.权利要求159的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是呼吸道合胞病毒的糖蛋白或者融合蛋白。
161.权利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是单纯疱疹病毒。
162.权利要求161的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是单纯疱疹病毒类型1或者类型2。
163.权利要求161的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是来自单纯疱疹病毒类型2的糖蛋白D。
164.权利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是人乳头瘤病毒。
165.权利要求164的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是人乳头瘤病毒的E6或者E7。
166.权利要求116的方法，其中所述的第一或者第二病毒抗原是全长的抗原病毒蛋白或者该抗原病毒蛋白的一部分，所述的部分包含主要抗原，中和抗原或者所述第一或第二致病病毒的表位。
167.权利要求116的方法，其中所述的第一或者第二病毒抗原是被修饰的抗原，其突变自所述第一或者第二致病病毒的糖蛋白，使得所述的第一或者第二病毒抗原作为病毒组分没有功能但却保留了其抗原性。
168.权利要求167的方法，其中对第一或者第二病毒抗原的修饰作用包括缺失所述糖蛋白的蛋白水解切割位点，以及复制和重排所述糖蛋白的免疫抑制肽区域。
169.权利要求116的方法，其中所述的第一或第二重组体腺病毒还包含异源于天然腺病毒而且编码免疫刺激因子的免疫刺激因子序列。
170.权利要求169的方法，其中所述的免疫刺激因子是细胞因子。
171.权利要求170的方法，其中所述的细胞因子选自由白细胞介素-2，白细胞介素-4，白细胞介素-12，β-干扰素，λ-干扰素，γ-干扰素，粒细胞集落刺激因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子组成的组。
172.权利要求116的方法，其还包含在给予所述的第一和第二重组体腺病毒后从所述收集血清。
173.权利要求172的方法，其中所述的宿主是人或者非人灵长类动物。
174.权利要求172的方法，其还包含将所述的血清贮存至少12个小时；和然后将所述血清给予所述宿主或者另一个宿主。
175.权利要求174的方法，其中所述的另一个宿主是人或者非人灵长类动物。
176.权利要求116的方法，其还包含在给予所述第一和第二重组体腺病毒后，从所述宿主中分离针对所述第一或第二病毒抗原的抗体；和然后将所述抗体给予宿主或另一个宿主。
177.权利要求176的方法，其中所述的宿主或另一个宿主是人或者非人灵长类动物。
全文摘要
提供了用以激发宿主对人免疫缺陷病毒(HIV)作出免疫应答的重组体腺病毒以及将其给予宿主的方法。所述的重组体腺病毒能够表达多种野生型或者突变型HIV抗原，如没有切割位点或者胞质结构域的HIV包膜蛋白，天然、分泌或膜结合形式的结构蛋白如Gag及其蛋白水解片段，HIV酶如逆转录酶、蛋白酶和整合酶，以及调控蛋白如Tat、Rev和Nef。所述的重组体腺病毒还可以表达免疫刺激因子如细胞因子以进一步提高HIV抗原的免疫原性。
文档编号A61K39/02GK1636063SQ02826611
公开日2005年7月6日 申请日期2002年11月1日 优先权日2001年11月1日
发明者王丹鹤 申请人:健方公司