专利名称：具有抗hiv活性的1'－乙酰氧基胡椒酚乙酸酯及其衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯及其衍生物作为Rev蛋白质传送的阻断剂，这种阻断剂能有效地抵抗人体免疫缺陷病毒(HIV)的感染。
背景技术：
1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯是一种天然化合物，被发现在高良姜及其他姜科植物中。在中国，良姜早已作为药用，在泰国及其他亚洲国家也已长期用作草药及食物。1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的结构式如下 从Alpinia galanga的新鲜及干燥根茎中发现的1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的含量约为1.5％-2.8％(De Pooter，H.L.et.al.1985)，叶子的含量较低(Jassen，A.M.and Scheffer，J.J.C.1985)。在高良姜中发现的天然1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的立体构型为S型。
1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯被发现抑制各种真菌的生长(Jassen，A.M.andScheffer，J.J.C.1985)，包括许多dermatophytic真菌如Trichophytonmentagrophytes，Trichophyton rubrum，Trichophyton concentricum和Epidermophyton floccosum，最小阻止浓度范围为50-250μg/ml。
1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯被发现具有抗结核病活性。它抑制M.tuberculosis和其他mycobacterium(Palittapongarnpim，P.et.al.2002)的生长。
1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯能抑制许多体内肿瘤及癌的发展，例如皮肤癌(Murakami，A.et.al.，1996)，口腔癌(Ohnishi，M.et.al.1996)，大肠癌(Tanaka，T.et.al.1997 and Tanaka，T.et.al.1997)，肝癌(Kobayashi，Y.et.al.1998)，胆囊癌(Miyauchi，M.et.al.2000)和食道癌(Kawabata，K.et.al.2000)。
在RAW264细胞中，通过抑制诱导一氧化氮合成酶的基因表达，1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯能够阻止脂多糖和干扰素-gamma诱导的一氧化氮的产生(Ohata，T.et.al.1998)。1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯能够阻断一氧化氮合成酶活性是通过抑制I.kappa.B-.alpha.蛋白质的破坏。I.kappa.B-.alpha.蛋白是NF-.kappa.B转录因子的阻断剂，因此阻止NF-.kappa.B的活化。1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯也阻止其它的转录因子如AP-1和Stat-1的活化。有认为1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯阻止一氧化氮的产生与调节几种转录因子的活化有关。这可能导致1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的抗癌作用。
1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯能够阻止肿瘤启动子诱导的Epstein-Barr病毒激活(Marukami，A.et.al.2000 and Kondo，A.et.al.1993)，能够阻止NADPH氧化酶及黄嘌呤氧化酶的活性(Murakami，A.et.al.2000 and Tanaka，T.et.al.1997)。这些酶和过氧化物的产生有关(Nakamura，Y.et.al.1998 andMurakami，A.et.al.1996)。
高良姜的许多成分已经被报道，例如α-pinene，β-pinene，limonene，1，8-cineole(Scheffer，J.J.C.et.al.1981)，1′-hydroxychavicol acetate，1′-acetoxyeugenol acetate(Jassen，A.M.and Scheffer，J.J.C.1985)，p-hydroxycinnamaldehyde，[di-(p-hydroxy-cis-styryl)]methane(Barik，B.R.et.al.1987)，galanal A，galanal B，galanolactone，(E)-8(17)，12-labddiene-15，16-dial and(E)-8，17-epoxylabd-12-ene-15，16-dial(Morita，H.and Itokawa，H.1988)。
人体免疫缺陷病毒(HIV)感染引起获得性免疫缺陷综合症(一般称艾滋病)。过去15年里有关治疗方法的大量研究集中在有限的药物靶点上，即HIV的逆转录酶，HIV蛋白酶，HIV整合酶。
许多已知的抗HIV化合物都有其它严重的副反应。例如，逆转录酶阻止剂如AZT和ddI有相当的毒性，用这些化合物治疗患者具有严重的副反应。
据此，虽然用上面的抗HIV化合物控制HIV感染和治疗艾滋病已取得一定的成功，但克服目前用药的缺点开发其它的治疗方法是必要的。
HIV-1病毒的增殖需要其基因的有效表达，HIV-1病毒基因的有效表达有赖于病毒的一种调节蛋白质，Rev蛋白质。因为Rev蛋白质是HIV-1病毒增殖的一关键因素，所以阻止Rev蛋白质的功能近年已成为具有吸引力的一种治疗战略方法。
发明内容
获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)是一种由HIV-1病毒引起的威胁生命的疾病。HIV-1病毒的增殖需要其基因的有效表达，HIV-1病毒基因的有效表达有赖于病毒的一种调节蛋白质，Rev蛋白质。Rev蛋白质增加病毒mRNAs在细胞浆内的积聚，后者经从细胞核到细胞浆的传送而编码病毒的结构蛋白质。由于Rev蛋白质对于病毒增殖至关重要，阻止Rev蛋白质的功能是一种具有吸引力的治疗战略。
因为Rev蛋白质是病毒的一种蛋白质没有细胞的对应体，所以阻止Rev蛋白质作用的几种不同的战略被用于阻止HIV-1增殖。在慢性感染细胞中反义寡核苷酸对抗Rev蛋白质的作用已被用于抑制HIV-1(Matsukura，M.et.al.1989)。HIV-1 Rev的显性转移变异(Bevec，D.et.al.1992)，细胞的Rev协同子eIF-5A的显性阴转变异(Bevec，D.et.al.1996)，一种抗Rev蛋白质单链抗体结构的细胞内表达(Duan，L.et.al.1994)，以及RRE-诱媒(Lee，L.et.al.1992)都显示阻止HIV-1的细胞内感染。在用低分子物质这一更为经典的方法中，新霉素被发现阻断Rev-RRE的结合而对抗Rev蛋白质的作用(Zapp，M.L.et.al.1993)。
Rev蛋白质从细胞核外传到细胞质对该蛋白质的作用是很重要的，这一输出依赖Rev蛋白质的活化结构域，该结构域起细胞核输出信号作用。Rev蛋白质的传送通过受体蛋白质，即染色体区域维持物(CRM1)直接和Rev蛋白质的核外输出信号相结合。小蘖霉素B被证明阻止Rev蛋白质的核外输出信号和受体蛋白质CRM1相结合而对HIV-1病毒的增殖显示出强大的抑制效果(Wolff，B.et.al.1997)。尽管小蘖霉素B在体外具有显著的生物学活性，但因为毒性特别大不适合发展为药物。
从东京大学获得一种分裂酵母Schizosaccharomyces pombe，这种酵母表达一由谷胱甘肽S-转移酶(GST)，SV40 T抗原的核定位信号(NLS)，绿色萤光蛋白质(GFP)及Rev蛋白质的核外输出信号(NES)融合成的蛋白质。这种酵母模型被用来筛选新的Rev蛋白质细胞核外输送的抑制剂。
1.从良姜中制备1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的提取和纯化方法为把高良姜的根茎切碎，碎片干燥后用甲醇提取。提取物干燥后通过硅胶层析柱用正己烷∶醋酸乙酯(5∶1)作为溶媒进行分离得到纯1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯。其收获率为1公斤高良姜可提取150mg 1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯。
2.用于检测1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯对Rev蛋白质输送抑制作用的分裂酵母Schizosaccharomyces pombe的制备Schizosaccharomyces pombe(JY266)酵母株被用于本研究。含有野生型nmt1启动子(该启动子在没有维生素B1的培养液中能够有力地引导转录)的pREP1质粒被用于S.pombe酵母的转化。为了能在S.pombe酵母中看见细胞核质间的传送，编码谷胱甘肽S-转移酶(GST)，SV40 T抗原的核定位信号(NLS)，绿色萤光蛋白质(GFP)及Rev蛋白质的核外输出信号(NES)的融合蛋白质的基因被导入到JY266酵母株中。
3.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯对阻止Rev蛋白质传送作用的测定在引入融合蛋白质后，S.pombe酵母菌在不添加维生素B1的培养液中30℃培养24小时，然后酵母细胞及含1％二甲亚砜的培养液的1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯被种在96孔的平板中继续在30℃下培养3小时。通过萤光显微镜对GST-NLS-GFP-RevNES融合蛋白的分布进行检测，在1μg/ml的浓度下1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯完全阻止了S.pombe酵母的融合蛋白从细胞核向细胞质进行传送。
4.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯抗病毒作用的测定MT-4细胞以5×105cells/mL的密度悬浮在含有10％小牛血清的RPMI1640培养液中，加入HIV-1 NL43株后在37℃下培养2小时，洗2次。这样制备的HIV-1感染的MT-4细胞的悬浮液(4×105cells/mL)100μL被添加到培养盘的各孔中，同时加入含适当浓度1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的稀释液各100μL。
在37℃下培养3天，然后，用商品HIV-抗原试剂盒(ZeptoMetrix)对培养上清液中HIV-p24抗原的产生量进行定量测定。结果在2μM的浓度下1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯对p24产生量的抑制率为81％。
5.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的毒性实验MT-4细胞悬浮在含有10％小牛血清及抗生素的RPMI1640培养液中，在37℃，5％二氧化碳，2个大气压下进行培养。取MT-4细胞加至96孔的培养盘中使其浓度为40000cells/0.1mL/孔。1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯被溶于二甲亚砜，用MT-4细胞的培养液稀释，然后加入每孔中。经过3天的培养后，MTT(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltetraz-olium bromide)溶液被加至各孔，继续培养3小时。然后除去各孔的溶液，加二甲亚砜溶解沉淀物。在570nm的波长处测吸收值且和空白比较。结果在2μM的浓度时1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯不显示任何细胞毒性。
权利要求
1.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯作为HIV处理剂的应用。
2.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物作为HIV处理剂的应用。
3.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯如要求1中所指单独作为HIV处理剂，或结合其它的药物作为HIV处理剂的应用。
4.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物如要求2中所指单独作为HIV处理剂，或结合其它的药物作为HIV处理剂的应用。
5.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯按要求3中所指作为HIV处理剂在人体中的应用。
6.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯按要求3中所指作为HIV处理剂在动物中的应用。
7.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物按要求4中所指作为HIV处理剂在人体中的应用。
8.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物按要求4中所指作为HIV处理剂在动物中的应用。
9.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯作为HIV感染疾病的发展阻止剂在人体中的应用。
10.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯作为HIV感染疾病的发展阻止剂在动物中的应用。
11.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物作为HIV感染疾病的发展阻止剂在人体中的应用。
12.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物作为HIV感染疾病的发展阻止剂在动物中的应用。
13.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯按要求9中所指单独或结合其它的药物作为HIV感染疾病的发展阻止剂在人体中的应用。
14.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物按要求11中所指单独或结合其它的药物作为HIV感染疾病的发展阻止剂在人体中的应用。
15.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯按要求10中所指单独或结合其它的药物作为HIV感染疾病的发展阻止剂在动物中的应用。
16.1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物按要求12中所指单独或结合其它的药物作为HIV感染疾病的发展阻止剂在动物中的应用。
全文摘要
本发明涉及具有抗人体免疫缺陷病毒HIV活性的1'－乙酰氧基胡椒酚乙酸酯及其衍生物。本发明指出了1'－乙酰氧基胡椒酚乙酸酯及其衍生物在一定浓度下对HIV－1感染的MT－4细胞具有高的抑制率，而对宿主MT－4细胞不显示细胞毒性。因此表明1'－乙酰氧基胡椒酚乙酸酯及其衍生物对处理HIV具有潜在的应用前景。
文档编号A61K31/05GK1457771SQ0313087
公开日2003年11月26日 申请日期2003年5月21日 优先权日2003年5月21日
发明者叶英 申请人:南昌弘益科技有限公司