10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针及其应用，与现存荧光素二乙酰脂荧光探针相比较，10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针具有更长的激发和发射波长，因此可以避免活细胞自身荧光干扰。在活细胞中脂酶水解10-去氧碳代荧光素二乙酰脂产生具有强烈的红色荧光的10-去氧碳代荧光素而被识别，死细胞或受损细胞则因其脂酶活性损失而不发出红色荧光。本发明进一步公开了10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针在检测细胞活性、细胞毒性中的应用。
【专利说明】10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测【技术领域】，具体涉及一种检测细胞活性的荧光探针及其应 用。
【背景技术】
[0002] 药物、环境污染、温度、离子应激、放射污染或其他生物调节和潜在的不利因素都 会对细胞或机体组织产生损害。细胞活性、细胞毒性测定在评价细胞或组织因上述原因导 致的细胞改变时非常重要，细胞膜的完整性被广泛的用于细胞活性测定，保护细胞的细胞 膜的丢失导致细胞结构、胞浆物质、细胞离子梯度和膜电位等的丧失，细胞膜完整性的丢失 将不可避免的导致细胞死亡。
[0003] 在细胞膜完整性和细胞活性之间没有等价的量化关系，一般情况下把拥有完整细 胞膜的细胞归为"活细胞"，而把因有毒的细胞试剂导致的细胞膜不可逆损伤的细胞归为 "死细胞"。当然有些细胞在死去的过程中还拥有细胞膜，这些是"将死细胞"，"将死细胞"实 际上不是活细胞，它们不能继续被培养和传代，但是按照通常依赖于观测细胞膜的方法经 常把"将死细胞"计为活细胞。
[0004] 细胞膜失去完整性的一个共同特征是其允许极性小分子(分子量小于2000道尔 顿)进出细胞质。细胞膜通透性的改变是很多细胞活性、细胞毒性评价方法的基础。最常用 的用于检测细胞活性/细胞毒性的方法是放射性的铬 51 (51Cr)释放和非荧光的台盼蓝有色 染料排出。荧光染料比普通有色染料有更高的检测灵敏度，也不需要如放射性元素那样要 求有复杂的材料处理过程。可是，现存的荧光素二乙酰脂荧光探针激发和发射波长都很短， 容易受到细胞背景荧光干扰。例如，由于GFP (绿色荧光蛋白）的发射光谱与荧光素的发射 光谱完全重叠，现存的荧光素二乙酰脂荧光探针不可能被用于测定GFP细胞的活性。然而， 由于它们长波长发射本发明的10-去氧碳代荧光素二乙酰脂荧光探针则可被用于检测GFP 细胞的活性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种简便快速检测细胞活性的荧光探 针。10-去氧碳代荧光素二乙酰脂（I)在中性pH水溶液中有非常好的可溶性和稳定性。 10-去氧碳代荧光素二乙酰脂相对无色、没有荧光和具有很小的消光系数，然而，活细胞中 脂酶可使10-去氧碳代荧光素二乙酰脂的双脂键断裂释放出10-去氧碳代荧光素（II)使 溶液荧光和消光系数急速变强，可达10000倍以上。
[0006] 为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容： 一种具有如下结构式的荧光探针：
【权利要求】
1. 一种具有如下结构式的荧光探针：
R1 和 R2 分别是 H、COOH 或 COOCH2OAct5
2. 根据权利要求1所述的一种检测细胞活性的化合物，R1是H，R2是C00H。
3. 根据权利要求1所述的一种检测细胞活性的化合物，R1是C00H，R2是H。
4. 根据权利要求1所述的一种检测细胞活性的化合物，R1是C00CH20Ac，R2是H。
5. 根据权利要求1所述的一种检测细胞活性的化合物，R1是H，R2是C00CH20Ac。
6. 权利要求1所述荧光探针的合成方法，其特征在于按如下的步骤进行： (1) 合成带有保护基的蒽酮衍生物；
(2) 蒽酮衍生物与溴代苯衍生物缩合给出10-去氧碳代荧光素；
其中的R1和R2分别是H、COOH或COOCH2OAc ; (3) 10-去氧碳代荧光素乙酰化给出10-去氧碳代荧光素二乙酰脂；
其中的R1和R2分别是H或COOH ; (4) 10-去氧碳代荧光素二乙酰脂进一步脂化给出10-去氧碳代荧光素二乙酰脂羧酸 脂；
其中的R1和R2分别是H或COOCH2OAct5
7.权利要求1所述荧光探针在制备作为检测细胞活性、细胞毒性荧光探针中的应用。
【文档编号】C09K11/06GK104327844SQ201410564906
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】彭若谷, 伍谊波, 第五振军, 徐晗, 马里杰 申请人:天津百萤生物科技有限公司