专利名称：选择性去细胞猪皮作为人体皮肤代替物的应用及其制备方法
技术领域：
本发明涉及猪皮的用途，尤其涉及作为人体皮肤代替物的应用。本发明还涉及猪皮作为人体皮肤代替物的制备方法。
背景技术：
目前，对皮肤烧伤伤员的治疗，尤其是对大面积深度烧伤伤员的治疗，早期切削痂，及时封闭烧伤创面，是提高烧伤伤员成活率最关键、最有效的措施之一。其中最好的创面覆盖物是伤员的自体皮肤。但是，伤员自体皮肤移植不仅会产生供皮区的新创面，而且由于真皮损伤还会引起供皮区瘢痕形成和色素沉着，更重要的是大面积烧伤伤员自身可用皮肤匮乏。因此，寻求理想的永久性人体皮肤代替物成为烧伤整形外科的重要课题。
目前，可供应用的人体皮肤代替物主要包括暂时性皮肤代替物和永久性皮肤代替物两种。
暂时性人体皮肤代替物主要包括异体人皮和戊二醛猪皮等，其最终会被排斥掉。其中以异体人皮覆盖创面的效果最佳。但异体人皮来源有限，且有传播疾病的危险；戊二醛猪皮创面粘附性较差，且有占位现象，不利于创面愈合。
永久性人体皮肤代替物主要包括去细胞真皮基质(ADM)、Integra人工皮等。去细胞真皮基质(商品名Alloderm)是Wainwright1995年研制成功并应用于临床。该材料是对人异体皮经胰蛋白酶、去污剂等处理，去除了表皮及真皮内可诱发免疫排斥反应的细胞成分，具有可调节诱导宿主细胞长入、吸收率较低、可与自体皮肤复合移植等特点。缺点一是应用于创面后需用其它敷料覆盖保护，二是价格昂贵；Integra人工皮是1996年由Burke发明应用于临床并获得美国FDA批准。它是一种无细胞人工聚合材料，由戊二醛交联的I型牛胶原与6-硫酸软骨素构成真皮支架。支架为多孔隙，可容纳自体成纤维细胞长入。它具有烧伤后可立即应用，移植后真皮成分可自行降解，并可诱导宿主表皮细胞生长，材料可塑性好，形状、大小和厚度易于改变；可透过硅膜观察真皮的变化等特点。缺点是移植后易感染；角朊细胞膜片不易粘附；费用昂贵。
发明内容
本发明的任务之一在于提供选择性去细胞猪皮的新用途，即作为人体皮肤代替物的应用。
本发明的另一任务是提供选择性去细胞猪皮作为人体皮肤代替物的制备方法。
本发明选择性去细胞猪皮作为人体皮肤代替物的制备方法，取50Kg左右无皮肤疾病的健康白色家猪活杀，剃毛洗净皮肤，取下大张全厚皮，将其反削为皮片，戊二醛交联后用磷酸平衡盐水洗净，放于含胰蛋白酶的IM生理盐水内浸泡，经Triton-100持续震荡后再用磷酸平衡盐水洗涤，4℃冰箱保存备用。
本发明选择性去细胞猪皮作为人体皮肤代替物的制备方法，其中所说的大张全厚猪皮反削为皮片的厚度为0.3-0.4mm，用0.5％戊二醛交联10分钟后磷酸平衡盐水洗5遍，然后将其放在含0.25％胰蛋白酶的IM生理盐水内37℃浸泡2小时，再放入含0.5％Triton-100的37℃蒸馏水中100次/分钟持续震荡36小时再用磷酸平衡盐水洗5遍。
为了更好地理解本发明选择性去细胞猪皮作为人体皮肤代替物的应用及其皮肤移植的效果，下面通过动物实验结果加以证明。
1.选择性去细胞猪皮作为暂时性创面覆盖物的动物实验1.1动物模型取健康SD大鼠96只，雌雄不限，体重205-250克，3％戊巴比妥钠50mg/Kg行腹腔麻醉。背部剃毛后，100℃开水12秒钟致背部约4cm×3cmIII度烫伤，生理盐水100ml/Kg皮下注射，切除全层皮肤至肌膜，创面上均匀涂抹自体微粒皮。然后随机分成4组，每组24只，分别用选择性去细胞猪皮、异体鼠皮、戊二醛猪皮和凡士林油纱覆盖皮肤缺损，再用凡士林纱布及无菌敷料覆盖，包扎固定。实验鼠术后单笼饲养。
1.2实验结果(1)大体观察术后3天，选择性去细胞猪皮和异体鼠皮组，移植的覆盖物完整，表面湿润柔软。揭开覆盖物，创面有较多的渗出液并可见较新鲜的肉芽组织。渗出液经细菌培养，除2例有阴沟杆菌生长外，余无细菌生长。微粒皮与创面结合紧密；戊二醛猪皮覆盖创面组除创面边缘部分有少许裸露外，移植的覆盖物完整，表面较干燥，创面有较少的渗出液并可见较新鲜的肉芽组织；凡士林油纱组与创面结合紧密，强行揭离油纱，可见较多的渗血，肉芽组织新鲜脆弱。
术后1周，选择性去细胞猪皮组的猪皮表面仍较完整柔软。揭开覆盖物，创面有较少的渗出液并可见大量肉芽组织，肉芽组织上可见上皮岛；异体鼠皮组的异体皮可见逐渐转红，创面仍有较多的渗出液并可见大量的肉芽组织，肉芽组织上可见上皮岛；戊二醛猪皮组的猪皮干燥，部分已剥离创面，其下暴露肉芽组织并变干燥。未剥离处其下可见肉芽组织及上皮岛。
术后2周，选择性去细胞猪皮组的猪皮质地较硬，部分已剥离创面，创面可见大量肉芽组织，肉芽组织上可见大量上皮岛；异体鼠皮组的异体皮逐渐干燥，其下仍有少许渗出液并可见大量肉芽组织，肉芽组织上可见大量上皮岛；戊二醛猪皮组的猪皮干燥，并基本剥离创面，仍有较多的残存创面；凡士林油纱组也仍有较多的残存创面。
术后4周，异体鼠皮组的异体皮大部分剥离创面，创面收缩，残留创面较少；选择性去细胞猪皮组的猪皮基本全部剥离，创面收缩，也残留部分创面，未愈合处仍可见肉芽组织；戊二醛猪皮组创面收缩明显，残留较多创面；凡士林油纱组创面收缩明显，残留创面较多，预后质量最差。各组皮片粘附天数和各组创面愈合率见表1、表2。
表1 各组皮片粘附天数比较(X±s)
*戊二醛猪皮组与异体鼠皮组比较，P＜0.05，统计学差异显著。
表2各组愈合率比较(％，X±S)
*选择性去细胞猪皮组、戊二醛猪皮组及凡士林油纱组与异体鼠皮组比较，P＜0.05，统计学差异显著。
#戊二醛猪皮组及凡士林油纱组与选择性去细胞猪皮组比较，P＜0.05，统计学差异显著。
(2)组织学检查术后3天，异体鼠皮组的异体皮内可见新生的小血管，与创面接触面有大量炎性细胞；选择性去细胞猪皮组可见大量的炎性细胞浸润，真皮层内可见成纤维细胞；戊二醛猪皮组也可见较多的炎性细胞浸润，但较选择性去细胞猪皮组少。
术后1周，选择性去细胞猪皮组仍可见大量的炎性细胞浸润，炎性细胞堆积成层且界限较为明显，而戊二醛猪皮组明显减少。
术后4周，选择性去细胞猪皮组和异体鼠皮组创面大部分上皮化；戊二醛猪皮组部分创面上皮化。
以上结果表明，选择性去细胞猪皮覆盖物的创面愈合效果略差于异体鼠皮覆盖物的创面愈合效果，但明显优于戊二醛猪皮及凡士林油纱覆盖创面的效果。
2.选择性去细胞猪皮作为永久性真皮代替物行两步法修复创面的动物实验2.1动物模型取健康SD大鼠12只，雌雄不限，体重205-250克，3％戊巴比妥钠50mg/Kg行腹腔麻醉。背部剃毛后，100℃开水12秒钟致背部约4cm×3cm III度烫伤，生理盐水100ml/Kg皮下注射，切除全层皮肤至肌膜，创面用选择性去细胞猪皮覆盖后再用凡士林纱布及无菌敷料覆盖，包扎固定。实验鼠术后单笼饲养。术后10天换药，揭去表皮，可见下层真皮转红，并与创基结合紧密。在实验鼠腹部剃毛后取3cm×3cm全厚皮肤，反削为0.2mm厚的皮片，移植于背部真皮上方，包扎固定，腹部创面缝合。
2.2实验结果(1)大体观察移植术后10天可见创面基本愈合，自体皮片转红，创面收缩不明显，弹性较好。移植术后30天自体皮片成活良好，红润，无毛发生长，有脱屑现象。
(2)组织学检查创面移植选择性去细胞猪皮后10天，真皮内可见较多的新生小血管，胶原纤维排列有序，成纤维细胞、小血管增生。
上述结果表明，选择性去细胞猪皮可作为真皮代替物行两步法修复创面，改善创面愈合质量。
本发明选择性去细胞猪皮作为暂时性创面覆盖物和作为永久性真皮代替物行两步法修复创面的以上动物实验结果表明，选择性去细胞猪皮具有同Integra人工真皮相似的结构功能特点，而且其去细胞真皮基质部分更加接近于人的真皮基质，具有Integra人工真皮与去细胞真皮基质(ADM)两种代替物的优点。既可作为暂时性的创面覆盖物保护创面，又可作为永久性的真皮代替物修复创面。
本发明的优点1.材料来源广泛、易得，价格低廉。
2.制备容易。只需对猪皮进行表皮细胞失活处理、真皮去细胞处理即可制得。
3.产品无抗原性，具有Integra人工皮和去细胞真皮基质(ADM)两种皮肤代替物的功能特点。选择性去细胞猪皮与Integra人工皮不仅结构功能相似，而且其真皮基质部分更加接近于人的真皮基质。因此，既可以作为暂时性的创面覆盖物保护创面，又可以作为永久性的真皮代替物修复创面。
具体实施例方式
本发明去细胞猪皮作为人体皮肤代替物的制备方法，取50Kg左右无皮肤疾病的健康白色家猪活杀，剃毛洗净皮肤，取下大张全厚皮，将其反削为0.3-0.4mm的皮片，用0.5％戊二醛交联10分钟后磷酸平衡盐水洗5遍，然后将其放在含0.25％胰蛋白酶的IM生理盐水内37℃浸泡2小时，再放入含0.5％Triton-100的37℃蒸馏水中100次/分钟持续震荡36小时再用磷酸平衡盐水洗5遍，放4℃冰箱保存备用。
权利要求
1.选择性去细胞猪皮作为人体皮肤代替物的应用。
2.一种选择性去细胞猪皮作为人体皮肤代替物的制备方法，其特征在于取50Kg左右无皮肤疾病的健康白色家猪活杀，剃毛洗净皮肤，取下大张全厚皮，将其反削为皮片，戊二醛交联后用磷酸平衡盐水洗净，放于含胰蛋白酶的IM生理盐水内浸泡，经Triton-100持续震荡后再用磷酸平衡盐水洗涤，4℃冰箱保存备用。
3.如权利要求2所述的一种选择性去细胞猪皮作为人体皮肤代替物的制备方法，其特征在于大张全厚猪皮反削为皮片的厚度为0.3-0.4mm，用0.5％戊二醛交联10分钟后磷酸平衡盐水洗5遍，然后将其放在含0.25％胰蛋白酶的IM生理盐水内37℃浸泡2小时，再放入含0.5％Triton-100的37℃蒸馏水中100次/分钟持续震荡36小时再用磷酸平衡盐水洗5遍。
全文摘要
本发明公开了猪皮的新用途，即作为人体皮肤代替物的应用。本发明还公开了猪皮作为人体皮肤代替物的制备方法，即取50Kg左右无皮肤疾病的健康白色家猪活杀，剃毛洗净皮肤，取下大张全厚皮，将其反削为皮片，戊二醛交联后用磷酸平衡盐水洗净，放在含胰蛋白酶的IM生理盐水内浸泡，经Triton－100震荡后再用磷酸平衡盐水洗涤，放4℃冰箱保存备用。本发明用作人体皮肤代替物，具有Integra人工皮和去细胞真皮基质(ADM)两种皮肤代替物的功能特点。既可以作为人体暂时性的创面覆盖物保护创面，又可以作为永久性的真皮代替物修复创面。其材料来源广泛、易得，价格低廉，制作容易。
文档编号A61L27/60GK1460527SQ0314829
公开日2003年12月10日 申请日期2003年7月3日 优先权日2003年7月3日
发明者柴家科, 杨红明, 刘强 申请人:中国人民解放军第三○四医院