专利名称：具有抗癌活性的Her－2/neuDNA疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有抗癌活性的人Her-2/neu表达质粒构建体以及包括该构建体的用于预防和治疗癌症的DNA疫苗。
背景技术：
Her-2/neu或erbB-2基因编码跨膜蛋白质，其是生长因子受体I型家族的成员(Akiyama，T.等，Science 2321644-1646，1986)。该基因的放大导致编码的185kDa受体酪氨酸激酶的超表达。
在多种人腺癌的类型中已经发现Her-2/neu蛋白质的扩大和超表达，尤其是在乳房和卵巢肿瘤中。超表达与乳腺癌患者的复发时间短和存活率低相关联(Slamon，D.J.等，Science 235177-182，1987)，提示了Her-2/neu超表达很可能在人癌症的发展中起了关键作用。多种证据也支持了Her-2/neu在Her-2/neu-表达肿瘤的致病和临床侵略性中的直接作用(Kobayashi.H.等，Cancer Res.605228-5236，2000)。例如，Herceptin，用于治疗Her-2/neu-表达肿瘤的人化抗Her-2/neu单克隆抗体，已经证明在发展的乳腺癌患者中带来了临床益处(Ewer，M.S.等，Semin.Oncol.2696，1999)。此外，在乳腺和卵巢癌患者中检测到了Her-2/neu-特异性抗体和T细胞。因此，对于Her-2/neu超表达人癌症特异性治疗疫苗的发展，Her-2/neu致癌基因是极好的目标物。
由于人Her-2/neu基因在胞内结构域具有酪氨酸激酶活性且其超表达自身刺激了正常细胞的分裂，因此存在多种试验来消除Her-2/neu可能的致癌基因性，通过将突变引入细胞质激酶结构域来抑制酪氨酸激酶活性或通过构建平端缺失胞内或胞外结构域的Her-2/neu质粒(Wei，W.I.等，Int.J.Cancer 81748-754，1999)。
对于编码癌症相关抗原的癌症疫苗的发展，裸露的质粒是有吸引力的候选载体。它们相对生产简单并对服用者的安全。因为它们不是蛋白质也没有相关的病毒外衣，裸露的核苷酸通常不遭受可以妨碍疫苗临床功效的中和抗体反应(Hellstrom，I.和Hellstrom，K.E.，J.Immunother.21119-126，1998)。在临床前肿瘤模型中，编码小鼠(Chen，Y.等，Cancer Res.581965-1971，1998)或人Her-2/neu(Pilon，S.A.等，J.Immunol.1673201-3206，2001)的DNA疫苗诱导了对抗Her-2/neu表达肿瘤细胞的预防功效。
尽管通过许多前期试验接种DNA获得了对抗Her-2/neu表达肿瘤成功的预防功效，但是没有只使用Her-2/neu表达质粒就有成功治疗功效的报道。困难在于由于Her-2/neu表达质粒的抗原表达之前的滞后时间，而乳腺肿瘤生长相对快，抗癌免疫性的获利就慢，因此，一些Her-2/neu治疗疫苗试验是基于DNA和细胞因子分泌肿瘤细胞(Chen，S.A.等，Clin.Cancer Res.64381-4388，2000)或树状细胞(Chen，Y.，GeneTher.8316-323，2001)的结合而进行的。
由于DNA疫苗具有许多优势包括大量生产力、安全性，以及方便性(Gurunathan，S.等，Annu，Rev.Immunol.18927-974，2001)，本发明者尽力发展具有高度抗癌活性的Her-2/neu表达质粒构建体，其可以有效地用作预防和治疗癌症的DNA疫苗。
发明概述因此，本发明的一个目的是提供具有高度抗癌活性的人Her-2/neu表达质粒构建体。
本发明的另一个目的是提供用于预防和/或治疗癌症的DNA疫苗组合物，包括所述质粒构建体和药物学上可接受的载体。
本发明的再一目的是提供用于预防和/或治疗癌症的方法，包括服用有效量的所述DNA疫苗的步骤。
附图概述当结合附图时从以下本发明的描述，本发明上述和其它目的以及特征将变得明白，附图各自显示了
图1a和1b各自的制备重组人pNeu质粒构建体流程示意图和预定的免疫接种程序表；ECD胞外结构域TM跨膜结构域ICD胞内结构域图2每组各自接种了pTV2(A)、pNeuTM(B)、pNeuECD(C)、pNeuTM-gDs(D)和pNeuECD-gDs(E)小鼠中的平均荧光强度的典型FACS柱状图；无色FACS柱状图对照抗体，有色FACS柱状图抗-Her-2/neu抗体图3各自用pTV2(A)、pNeuTM(B)和pNeuECD-gDs(C)免疫的小鼠血清中抗-Her-2/neu抗体的共焦显微分析；图451Cr-释放试验，用于比较各自接种了pTV2(A)、pNeuTM(B)、pNeuECD(C)、pNeuTM-gDs(D)和pNeuECD-gDs(E)诱导的细胞毒素T淋巴细胞(CTL)反应；图5通过接种pNeu构建体诱导的预防性抗癌免疫性；A皮下注射了Her2-CT26细胞动物模型中的肿瘤大小B静脉注射了Her2-CT26细胞动物模型中的存活率图6通过接种pNeuECD和pNeuECD-gDs诱导的预防性抗癌免疫性的比较；A皮下注射了Her2-CT26细胞动物模型中的肿瘤大小B静脉注射了Her2-CT26细胞动物模型中的存活率图7通过接种pNeuECD或pNeuECD-gDs诱导的治疗效能；A1×105个Her2-CT26细胞，B5×105个Her2-CT26细胞图8每组各自接种了PBS(A)、pNeuECD(B)、pNeuTM(C)、pCKECD(D)和pCKTM(E)小鼠中的平均荧光强度的典型FACS柱状图；图951Cr-释放试验，用于比较各自接种了PBS(A)、pNeuECD(B)、pNeuTM(C)、pCKECD(D)和pCKTM(E)诱导的CTL反应；图10通过接种pCKECD和pCKTM诱导的预防性抗癌免疫性；A皮下注射了Her2-CT26细胞动物模型中的肿瘤大小B静脉注射了Her2-CT26细胞动物模型中的存活率图11通过接种pCKECD和pCKTM诱导的治疗效能；图12a和12b各自为pCKTM和细胞因子质粒共注射的接种示意图以及用于比较因此诱导的CTL反应的51Cr-释放试验；图13a至13d通过共注射pCKTM和细胞因子质粒诱导的预防性抗癌效能，其中13a显示了接种进度表；13b，Her2-CT26细胞皮下注射模型中的肿瘤大小(括号意味着每个处理组中没有肿瘤生长小鼠的百分数)；13c和13d，Her2-CT26细胞静脉注射模型中的存活率(括号意味着每个处理组中活鼠的百分数)；图14a至14c通过共注射pCKTM和细胞因子质粒诱导的治疗效能，其中14a显示了接种进度表；14b和14c，接种pCKTM-细胞因子质粒的Her2-CT26细胞静脉注射模型中的存活率(括号意味着每个处理组中活鼠的百分数)；图15a至15dpCKTM-细胞因子质粒诱导的预防性抗癌效能，其中15a显示了构建双顺反子质粒的流程示意图；15b，接种进度表；15c，Her2-CT26细胞皮下注射模型中的肿瘤大小(括号意味着每个处理组中没有肿瘤生长小鼠的百分数)15d，Her2-CT26细胞静脉注射模型中的存活率(括号意味着每个处理组中活鼠的百分数)；图16通过诱导的治疗效能发明详述根据本发明的一个方面，提供了具有抗癌活性的Her-2/neu表达质粒构建体，其通过将平端人Her-2/neu基因插入pTV2或pCK载体而制得。
首先，本发明提供了编码缺失细胞质激酶结构域(胞内结构域)的平端Her-2/neu基因的Her-2/neu表达质粒构建体，选择平端基因是因为编码全长人Her-2/neu的质粒可以逆反地影响吸收质粒DNA细胞的生理。平端Her-2/neu基因具有包括Her-2/neu跨膜和胞外结构域的SEQID NO2的核苷酸序列，且将其插入pTV2载体中，其给予了外来基因的高表达量(Lee，S.W.等，J.Virol.728430-8436，1998)。
本发明还提供了编码SEQ ID NO3的平端人Her-2/neu基因的Her-2/neu表达质粒构建体，其缺失SEQ ID NO2的Her-2/neu基因的跨膜结构域，其导致了表达的蛋白质进入细胞外部的分泌。
进一步，本发明提供了Her-2/neu表达质粒构建体，其信号肽序列由I型单纯疱疹病毒糖蛋白D信号(gDs)序列替代，其促进了人I型免疫缺陷病毒gp160的有效表达和分泌是公知的(Berman，P.W.等，J.Virol.633489-3498，1989)。
在本发明的优选实施例中，产生了四个基于pTV2载体的Her-2/neu表达质粒构建体(pNeuTM、pNeuECD、pNeuTM-gDs和pNeuECD-gDs)，各自编码了Her-2/neu跨膜和胞外域(pNeuTM和pNeuTM-gDs)或只编码了Her-2/neu胞外结构域(pNeuECD和pNeuECD-gDs)(参见图1的A)。而pNeuTM或pNeuECD编码了原始Her-2/neu信号肽序列，pNeuTM-gDs或pNeuECD-gDs的信号肽序列由来自I型单纯疱疹病毒的糖蛋白D信号肽序列所替代。
鉴于编码原始信号肽序列的pNeuTM或pNeuECD的注射诱导了强烈的Her-2/neu特异性抗体反应，编码1型单纯疱疹病毒糖蛋白D信号序列的pNeuTM-gDs或pNeuECD-gDs诱导了微弱的Her-2/neu特异性抗体反应(参见图2和3)。然而，所有pNeu构建体诱导了相同强度的Her-2/neu特异性CTL反应(参见图4)。这些构建体可以用于评价小鼠中Her-2/neu特异性抗体量是否存在显著差异，该量可以影响对抗Her2-CT26的预防性或治疗性免疫性，Her2-CT26是同源的Her-2/neu-表达肿瘤。
本发明显示了pNeuTM、pNeuECD、pNeuTM-gDs或pNeuECD-gDs的肌内(i.m.)注射可以诱导对抗少量Her2-CT26细胞的完全预防(参见图5)。此外，甚至当皮下(s.c.)或静脉(i.v.)注射最大量的肿瘤细胞时，pNeuECD和pNeuECD-gDs的预防性抗癌效能也没有显著差异(参见图6)。这显示了在预防性模型中有强烈的Her-2/neuCTL反应而无抗体反应与强烈的CTL和抗体反应协作是一样有效的。然而，当在治疗模型中预注射大量的肿瘤细胞时，只有同时具有强烈CTL和抗体的小鼠群显示了显著提高的存活率(参见图7)。
本发明的Her-2/neu表达质粒构建体具有的优势是通过构建缺失Her-2/neu细胞质粒激酶结构域(胞内结构域)的平端Her-2/neu质粒来消除Her-2/neu可能的致癌性。因此其消除了胞内结构域酪氨酸激酶导致的向恶性肿瘤的正常细胞转化和非正常生长信号传导的机会的风险。此外，本发明的平端Her-2/neu可以避免对抗Her-2/neu胞内结构域的自体免疫的危险，其在EGFR(表皮生长因子受体)家族成员中高度保守。已经报道了编码平端Her-2/neu的质粒至少和编码总Her-2/neu的质粒一样有效(Chen，Y等，Cancer Res.581965-1971，1998)。还有，本发明的Her-2/neu表达质粒构建体同时诱导了Her-2/neu-特异性抗体反应和治疗性抗癌效能。
这些结果证明了通过在预防性模型中或治疗性模型中接种对抗Her-2/neu表达肿瘤的DNA的CTL和抗体的相对作用。尽管通过接种DNA的强烈的CTL活化作用而无抗体反应可以获得足够对抗Her-2/neu表达肿瘤激发的预防性效能，但是最大化免疫反应两个目的的DNA疫苗是在治疗模型中最有效。
为了提高本发明疫苗在临床使用中的效能，本发明进一步提供了使用更有效的载体pCK载体来替代pTV2制备的Her-2/neu表达质粒构建体来提高Her-2/neu的表达水平，。
pCK载体具有比pTV2更强的CMV启动子和更小的尺寸(约3kb)，且因此，在pCK质粒增加的浓度下目标抗体可以有效地表达。
为了制备pCK质粒构建体，将来自pNeuTM和pNeuECD的具有原始Her-2/neu信号肽和强烈抗癌活性的平端Her-2/neu片段各自插入pCK载体。
本发明的另一个优选实施例中，提供了两个基于pCK载体的Her-2/neu表达质粒(pCKTM和pCKECD)，其编码Her-2/neu跨膜和胞外结构域(pCKTM)或仅编码Her-2/neu胞外结构域(pCKECD)。
接种pCKTM和pCKECD同时诱导了强烈的抗体反应和CTL反应(参见图8和9)。通过接种pCKTM或pCKECD诱导的免疫性程度与观察到的pNeu构建体的相同或略高。pCKTM和pCKECD的肌内接种完全防止了预接种模型中皮下肿瘤的生长和转移以及在治疗模型中抑制了肿瘤的生长(参见图10和11)。
根据布达佩斯条约的用于专利程序目的的国际认证的微生物保藏，本发明的Her-2/neu表达质粒构建体，pNeuTM、pNeuECD、pCKTM和pCKECD已经于2002年6月26日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)(地址#361-221，Yurim B/D，Hongje-1-dong，Seodaemun-gu，Seoul120-091，韩国)各自的保藏号为KCCM-10393，KCCM-10394，KCCM-10395，KCCM-10396。
由于表达平端Her-2/neu的pCKTM更有效地同时诱导了体液免疫和细胞免疫，以及pCKTM的治疗性抗癌活性比pCKECD略好，优选进行结合细胞因子接种pCKTM。
因此，本发明揭露了细胞因子作为助剂的用途，其有助于克服肿瘤患者中对抗Her-2/neu的免疫耐受性。
进一步有意地，本发明选择了6个细胞因子；IL-12(Alfonso，L.C.等，Science 263235-237，1994)，IL-15(Min，W.等，Vaccine 201466-1474，2002)，IL-18(Hanlon，L.等，J.Virol.758424-8433，2001)，Eta-1，Flt3L(Mwangi，W.等，J.Immunol.1693837-3846，2002)，GM-CSF(Lee，A.H.等，Vaccine 17473-479，1999)。诱导抗原提呈细胞(APC)增殖和活化的GM-CSF和Flt3L期望来提高进入抗原提呈细胞如树状细胞的输送效率以及促进包括体液免疫和细胞免疫的免疫反应。IL-12、IL-15、IL-18和Eta-1是典型的TH1偏移细胞因子且期望用来诱导对癌症免疫性重要的细胞为介的免疫反应。
本发明提供了构建体pCK-IL12、pCK-IL15、pCK-IL18、pCK-Eta1、pCK-Flt3L和pCK-GMCSF，其通过将各自的细胞因子基因插入pCK载体而获得。结合细胞因子基因助剂的效果和观察到的pCKTM的就抗体产量和CTL反应而言是相似的(参见图12)，但是pCKTM和每个pCK-细胞因子结合，尤其是pCK-GMCSF，提高了预防和治疗模型中的抗癌效能(参见图13和14)。
为了在接种Her-2/neuDNA中提高细胞因子助剂的活性，本发明构建了双顺反子质粒，pCKTM-GMCSF、pCKTM-Flt3L、pCKTM-Eta1、pCKTM-IL12、pCKTM-IL15、pCKTM-IL18和pCKTM-IL23，其中Her-2/neu蛋白质和每个细胞因子各自独立地翻译。用本发明的双顺反子质粒接种还抑制了肿瘤生长和转移(参见图15和16)。双顺反子质粒的抗癌活性除了pCK-IL18和当结合两个分离的质粒时观察到的结果相似。pCKTM-IL18的抗癌活性比结合pCKTM和pCK-IL18要高得多。
上述结果显示了本发明的Her-2/neu表达质粒构建体提供了不仅是对抗癌症的预防性也是治疗性的疫苗。因此，Her-2/neuDNA疫苗具有作为在肿瘤手术后降低转移的治疗性疫苗或作为对于有遗传高风险人群的预防性疫苗的潜在用途。
根据本发明的另一方面，还提供了用于预防和治疗癌症的Her-2/neu疫苗组合物。
本发明的疫苗组合物包括本发明的人Her-2/neu表达质粒构建体和药物学上可接受的载体。这些疫苗组合物通过由本发明的人Her-2/neu表达质粒构建体诱导的抗原可以提供对抗传染病的保护性(用作预防药)。此外，本发明的疫苗组合物通过由本发明的人Her-2/neu表达质粒构建体诱导的抗原可以用于治疗(用作治疗剂)传染病。
含有本发明的人Her-2/neu表达质粒构建体作为有效成分的疫苗组合物的制备是本领域普通技术人员公知的。典型地，这样的疫苗制备为可注射的，如液体溶液或悬浮液；也可以制备成在注射之前适于溶解于或悬浮于液体的固体形式。制剂也可以是乳化的，或装入脂质体胶囊中的蛋白质。活性免疫成分通常和制药学上可接受的且与活性成分相适合的载体混合。术语“制药学上可接受的载体”涉及不会导致服用患者的过敏反应或其它副作用的载体。合适的制药学上可接受的载体包括，例如，一种或多种水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等及其组合。此外，如果期望，疫苗可以包括小量的辅助物质如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂，和/或可以提高疫苗效能的助剂。有效助剂的实例包括但不限制于氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(苏氨酸-MDP)，N-乙酰-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-异谷氨酰胺(CGP11637，涉及如去甲-MDP)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-丙三基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A，涉及如MTP-PE)，以及RIBI，其包括从细菌提取的三个成分，2％角鲨烯/吐温80乳浊液中的单磷酰基脂质A、海藻糖双霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。助剂的其它实例包括DDA(双甲基双十八烷基铵溴化物)，Freund’s完全和不完全助剂以及QuilA。此外，免疫调节物质如淋巴因子(例如，IFN-g，IL-2和IL-12)或合成的IFN-g诱导剂如聚I:C，可以和在此所述的助剂结合使用。
本发明的疫苗组合物可以非肠道给药，通过注射，例如，皮下或肌内。适用于其它给药形式的其它剂型包括栓剂，以及在一些情况中，口服剂型或适于分配的剂型如气雾剂。在口服剂型的情况中，在各种剂型中使用了助剂、抗原包装，或其它的单独细胞因子的T-细胞子集的操纵可以产生最佳免疫反应的改良口服疫苗。对于栓剂，可以包括常规的粘合剂和载体，例如，聚亚烷基二醇或甘油三酯；这样的栓剂可以由含有0.5至10％活性成分的混合物形成，优选1至2％。口服剂型包括常规使用的赋形剂如，药物级的甘露醇、乳糖、硬脂酸镁淀粉、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、药丸、胶囊、持续释放的剂型或粉末的形式，且包含10％至95％有效成分，优选25至70％。
本发明的Her-2/neu表达质粒构建体可以以中性或盐的形式配制入疫苗组合物中。药物学上可接受的盐包括酸性盐(由肽的自由氨基形成)以及由无机酸形成的，如盐酸或磷酸，或有机酸如醋酸、草酸、酒石酸、顺丁烯二酸等等。和自由羟基形成的盐可以源自无机碱，如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等。
疫苗组合物以与剂量配制相适应的方式给药，以这样的量可以是预防性的和/或治疗性的效能。给药量依赖于治疗的患者，包括，例如患者免疫系统合成抗体的能力，以及所期望的预防或治疗的程度。合适的剂量范围为每次接种数百个微克有效成分，约0.01至10mg/kg/天，优选约0.1至1mg/kg/天。最初使用和加强接种的适合群体也是变化的，但是通过最初给药随后的接种或其它给药得到表征。需要给药的有效成分的精确量依赖于从业者的判断，且对每个患者是特别的。对本领域普通技术人员显而易见的是本发明的Her-2/neu表达质粒构建体的治疗有效量尤其依赖于给药进度表、服用抗原的单次剂量、Her-2/neu表达质粒构建体是否结合其它治疗剂给药的、接受者的免疫状况和健康，以及特别的Her-2/neu表达质粒构建体的治疗活性。
可以以单个剂量进度表给予组合物，或优选多个剂量进度表。多个剂量进度表是可以包括1至10个分离剂量的接种起始过程，接着在随后需要保持和或加强免疫反应的时间间隔给予其它剂量，例如，在1至4个月给于第二个剂量，以及如果需要，数月后给予随后的剂量。间隔1至5年间歇接种，通常为3年，期望来保持所期望的预防性免疫性的水平。
免疫协议使用助剂来刺激反应已经很多年，以及如本领域普通技术人员公知的助剂。一些助剂作用于抗原存在的途径。例如，当蛋白质抗原用明矾沉淀时免疫反应增强。抗原的乳化也延长了抗原呈现的持续时间。
一方面，通过使用试剂如磷酸缓冲盐中约0.05至约0.1％溶液中的明矾来获得辅助效果。或者，抗原与用作约0.25％溶液的合成糖聚合物(Carbopol.RTM)制成混合物。也可以各自通过在约70℃至101℃温度下30秒至2分钟时间的热处理使疫苗中抗原凝聚来获得辅助效果。也可以通过用胃蛋白酶处理(Fab)抗体再活化来凝集成清蛋白，和细菌细胞如小棒杆菌或内毒素或脂革兰氏阴性细菌的多糖成分混合，在药物学上可接受的油性载体中乳化，如二缩甘露醇单油酸盐(Aracel A)或与用作块替代物的20％全氟化碳(Fluosol-DA.RTM)溶液乳化。
可以使用各种脂多糖助剂。例如，已经描述了在小鼠抗体反应上的各种肺炎球菌多糖助剂。可以如所述的使用产生最佳反应或换句话说不产生抑制的剂量。尤其优选脂多糖的聚胺变形，如几丁质和壳聚糖，包括脱乙酰几丁质。
打算用于本发明的另一个助剂是BCG。BCG(卡介菌，分枝杆菌的削弱菌株)和BCG细胞壁骨架(CWS)在本发明中也可用作助剂。由于它的免疫激发特性，BCG是重要的临床工具。BCG用来刺激网状内皮组织系统、活化自然杀伤细胞和增强造血干细胞的增殖。已经证实BCG细胞壁的提取物具有极好的免疫助剂活性。在本发明典型的实例中，牛分枝杆菌BCG的细胞是已知的且通过本领域公知的方法来收集。除了牛分枝杆菌BCG以外，非致病细菌例如，沙门氏菌sp.，假单胞菌属sp.，埃希氏菌sp.等等的疫苗，可以用于本发明。
本发明在以下的实施例中进一步详细说明。可以理解的是这些实施例仅仅通过图解方式而给予，而且显示的是本发明优选实施例。从上述的讨论和这些实施例，本领域的普通技术人员可以确定本发明的本质特征，以及不背离其精神和范围可以作出本发明的各种改变和修改来使其适于各种用途和条件。
参考实施例1细胞系和动物Her-2/neu表达人乳腺癌SK-BR3细胞系(ATCC HTB-30)和鼠结肠腺癌细胞系CT26(ATCC CRL-2639)从美国典型培养物保藏中心获得(Manassas，VA，USA)。人乳腺癌细胞系SK-BR3细胞保持在用10％热钝化牛胎儿血清(FBS，GIBCO，Gaithersburg，MD)和1％青霉素-链霉素(GIBCO)悬浮的RPMI1640(Bio Whittaker，Walkersvile，MD)中。Her-2/neu表达转染瘤Her2-CT26细胞是通过编码人Her-2/neu的cDNA(NCBI:M1730)转导CT26细胞而制得。Her2/CT26和CT26细胞在含有10％热钝化FBS和1％青霉素-链霉素的IMDM(Bio Whittaker)中培养。
从Charles River(Osaka，Japan)购得5周大的雌性BALB/c小鼠，且保持于22℃，55％的相对湿度，以及12小时照明/12小时黑暗的每日光照循环，自由摄取食物和水。小鼠安置在汉城国际大学的试验动物中心直至使用，且在整个试验过程中保持于无菌隔离器中(Techniplast，Buguggiate，Italy)。
参考实施例2用于肌内注射的DNA质粒的分离用每个质粒pNeuTM、pNeuECD、pNeuTM-gDs、pNeuECD-gDs、pCKTM和pCKECD，对照载体pTV2和pCK转化的大肠杆菌DH5α菌株在LB肉汤(Difco，Detroit，MI)中生长。根据制造商的介绍使用Endofree QiagenPlasmid-Giga试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)通过碱性溶菌方法来进行质粒DNA的大规模制备。然后将DNA沉淀，以2mg/ml的浓度悬浮于无菌PBS(Bio Whittaker)中，并以等分量保存于-20℃以用于随后的免疫原始记录。
参考实施例3流式细胞术(FACS)为了检测血清是否可以特异性地作用于Her-2/neu表面蛋白，用细胞刮刀(Nunc，Naperville，IL)从培养瓶剥离SK-BR3、Her2-CT26和CT26细胞。回收的细胞在用2％FBS和0.1％叠氮化钠悬浮的RPMI1640组成的FACS缓冲剂中洗涤。每个分析约2×105个细胞用一系列稀释的血清或对照抗体在4℃培养30分钟。用一系列稀释的相同FACS缓冲液洗涤细胞3次，然后用结合对小鼠IgG特异性的山羊单克隆抗体的FITC(Sigma)在4℃染色30分钟。将染色的细胞洗涤两次并重悬浮于相同的FACS缓冲液中。为了从数据中排除死亡细胞，将1μg/ml碘化丙啶(Sigma)加入细胞悬浮液并在分析前培养30秒。只有通过碘化丙啶染色为负的细胞是需要的且用于结合肿瘤细胞进一步分析。流式细胞术使用PAS IIIi流式细胞计(Partec GmbH，Münster，Germany)来进行。
参考实施例4用于抗Her-2/neu抗体的共焦显微术大约1×104个SK-BR3细胞在覆盖了1mg/ml聚-L-赖氨酸的Lab-Tek分室盖玻片(Nunc，Naperville，IL)上生长3天。细胞和含有4％多聚甲醛的PBS在室温下混合10分钟，用DMEM洗涤三次，用含有1％山羊γ-球蛋白的DMEM在4℃结块1小时，用1∶50稀释的小鼠血清在结块溶液中4℃培养8小时，洗涤，并用结合山羊抗小鼠免疫球蛋白第二抗体的R-藻红蛋白(Southern Biotech，Birmingham，AL)在室温下培养30分钟。然后将载波片安置在Gel/Mount介质(Fisher)上并使用共焦显微镜(Leica TCS-SP激光扫描显微镜)来检查。
参考实施例5DNA免疫方法简要地，每个小鼠在前胫骨肌肉内接受肌内注射溶解于100μl无菌PBS中的100μg质粒DNA。接种点用丁呱卡因-盐酸(ASTRA，Westborough，MA)预处理。由于治疗接种的每日免疫，丁呱卡因-盐酸只在第一次免疫之前仅仅预处理了一次。通过向后轨道淋巴管在选择的时间点回收血清，且监控抗Her-2/neu抗体的存在。
参考实施例6铬释放试验通过从免疫小鼠提取脾来制备的脾细胞用丝裂霉素-C处理的Her2-CT26细胞培养6天，在4小时51Cr-释放试验中进行CT26或Her2-CT26靶细胞溶解的试验。
通过在200μl盐水中用200μCiNa51CrO4(NEN Research Products，Boston，MA)培养2×106个细胞37℃90分钟来用51Cr标记Her2-CT26或CT26肿瘤靶细胞。通过用RPMI1640洗涤四次来回收未结合的51Cr。分级数量的效应细胞与加了10％FBS的200μl RPMI中的10000个标记的靶细胞在圆底微量滴定平板的小孔中混合。平板在37℃培养4小时。培养后，将平板离心，且从每个小孔中除去100μl等分用于γ-闪光计数器(Packard，Minaxi Auto Gamma 5000系列)计数。通过式1计算溶解百分比<式1>
溶解百分比(％)＝100×[(cpm试验-cpm自发)/(cpm最大-cpm自发)]通过将10μl的5％曲通-X(Sigma)加入含有51Cr标记靶细胞的池中来测定cpm最大值。重复每个组。通过只加入等体积培养基而没添加脾细胞或曲通-X来测定cpm自发值。
参考实施例7肿瘤激发通过肋腹上皮下注射或静脉注射悬浮于无菌PBS中的Her2-CT26细胞激发小鼠。用测径器测量每个肿瘤的三维尺寸，且通过式2来计算体积<式2>
肿瘤体积(mm3)＝(宽度×长度×深度)mm3×π/6为了可触诊肿瘤的发展一周监测两次动物。处死显示任何急性疾病症状、呼吸困难或很少移动的小鼠实施例1Her-2/neu表达质粒的构建pTV2和pTV2-gDs(Lee，S.W.等，J.Virol.728430-8436，1998)以及pCK(Lee Y.，等,Biochem Biophys Res Commun.272230-235，2000；保藏号KCCM-10179)用作表达载体。pTV2-gDs是克隆来含有表达载体pTV2中1型单纯疱疹病毒糖蛋白D信号序列的表达载体。将编码全部人Her-2/neu基因的cDNA(SEQ ID NO1)插入pRC/CMV骨架(Invitrogen，San Diego，CA)中来生产全长Her-2/neu质粒(9.6Kb)。
编码Her-2/neu胞外结构域而无Her-2/neu胞内和跨膜结构域的质粒pNeuECD，从全长Her-2/neu质粒的PCR产品而制得，使用NF6(SEQ IDNO4)和NSR1(SEQ ID NO5)作为引物对，并克隆进pTV2的KpnI和XbaI位点。同样地，编码Her-2/neu胞外和跨膜结构域的质粒pNeuTM，从全长Her-2/neu质粒的PCR产品制得，使用NF5(SEQ ID NO6)和NRM2(SEQ ID NO7)作为引物对，并克隆进pTV2的KpnI和XbaI位点(图1)。
编码Her-2/neu胞外结构域而无Her-2/neu胞内和跨膜结构域的质粒pNeuECD-gDs，从全长Her-2/neu质粒的PCR产品制得，使用NSF2(SEQID NO8)和NSR1(SEQ ID NO5)作为引物对，并克隆进pTV2-gDs的AscI和XbaI位点。同样地，编码Her-2/neu胞外和跨膜结构域的质粒pNeuTM-gDs，从全长Her-2/neu质粒的PCR产品制得，使用NF3(SEQ IDNO9)和NRM2(SEQ ID NO7)作为引物对，并克隆进pTV2-gDs的AscI和XbaI位点。通过将各自从pNeuECD和pNeuTM获得的平端Her-2/neu基因片段插入pCK载体的KpnI-XbaI位点来制得pCKECD和pCKTM质粒。PCR在94℃进行2分钟；94℃15秒，55℃30秒和68℃3.5分钟；以及72℃7分钟。
然后产生四个Her-2/neu表达质粒(pNeuTM、pNeuECD、pNeuTM-gDs，和pNeuECD-gDs)，每个同时编码Her-2/neu跨膜和胞外结构域(pNeuTM和pNeuTM-gDs)或只编码Her-2/neu胞外结构域(pNeuECD和pNeuECD-gDs)(图1a)。当pNeuTM或pNeuECD编码原始Her-2/neu信号肽序列时，pNeuTM-gDs或pNeuECD-gDs的信号肽序列由来自I型单纯疱疹病毒的糖蛋白D的信号肽序列替代。
实施例2通过接种pNeu构建体的抗Her-2/neu抗体的诱导如下进行试验来测定各种pNeu质粒构建体是否可以诱导抗Her-2/neu抗体。
参考实施例1中获得的每个小鼠根据预定的免疫进度表接受3次肌内注射参考实施例2中制得的100μg质粒DNA(图1b)。处死每个组中的一些小鼠，检测Her-2/neu特异性CTL的溶菌功能。其它小鼠接受Her-2/neu表达肿瘤的激发来评价抗癌免疫性。在第一次注射之前和第三次接种后一周从BALB/c小鼠获得血清，使用流式细胞术测量血清中的抗Her-2/neu抗体滴定度，基于其和乳腺癌细胞系SK-BR3的结合。测量并显示所有接种pNeuTM、pNeuECD、pNeuTM-gDs，或pNeuECD-gDs小鼠的Her-2/neu特异性血清IgG滴定度，基于血清最大程度的稀释，为了看到相对于无关对照抗体的SK-BR3细胞结合亲和性的平均荧光强度的偏移。
<表1>
如表1所示，观察到的IgG滴定度的排列顺序为pNeuECD＞pNeuTM＞pNeuTM-gDs＞pNeuECD-gDs＝pTV2。正如所料，在注射质粒DNA之前从动物收集的血清没有一个具有可检测的抗Her-2/neu结合活性。此外，注射pTV2的动物以1∶50稀释没有一个获得可检测的抗Her-2/neu抗体。然而，接种pNeuTM或pNeuECD导致高Her-2/neu特异性IgG滴定度(图2，A)且1∶800稀释的血清样本的平均荧光强度产生宽的偏移(图2，B和C)。相反，接种pNeuTM-gDs或pNeuECD-gDs导致低的或不可测的IgG滴定度且1∶50稀释的血清样本显示出少的或几乎不能检测的平均荧光强度的偏移(图2，D和E)。
通过共焦显微分析还证实了用pNeuTM或pNeuECD-gDs免疫小鼠血清中Her-2/neu特异性抗体的存在。用pNeuTM免疫的小鼠血清(图3，B)证明了抗Her-2/neu抗体在SK-BR3细胞表面上的清楚定位，而用pTV2(图3，A)或pNeuECD-gDs(图3，C)免疫的小鼠血清中没有显示，其和图2显示的抗Her-2/neu抗体滴定度相一致。
实施例3通过接种pNeu构建体的Her-2/neu特异性CTL的诱导已经证明接种pNeu构建体在接种小鼠中促进了从高至非常低的Her-2/neu特异性抗体反应(图2)，如下评价在相同小鼠中诱导的Her-2/neu特异性CTL反应。
在第三次接种2周后从相同小鼠中制备脾细胞用于测试Her-2/neu特异性血清IgG滴定度。用丝裂霉素C处理的人Her-2/neu表达的同源小鼠转染瘤Her2-CT26细胞来培养脾细胞6天，通过4小时51Cr释放试验来进行CT26或Her2-CT26靶细胞的溶解试验。
结果，从接种pNeuTM(图4，B)、pNeuECD(图4，C)、pNeuTM-gDs(图4，D)，或pNeuECD-gDs(图4，E)小鼠的脾细胞显示了CTL依赖性的Her2-CT26溶解，而在对照接种pTV2小鼠的脾细胞中未显示(图4，A)，Her-2/neu特异性CTL反应相对强度的次序为pNeuTM＞pNeuECD＞pNeuTM-gDs＞pNeuECD-gDs＞pTV2。来自用任一个pNeu构建体免疫小鼠的脾细胞的Her-2/neu特异性溶菌百分比可以和其它的pNeu构建体相比，且E∶T比例为50∶1时为80～90％以及E∶T比例为10∶1时为60～70％(图3，B至E)。然而，来自任一组小鼠的脾细胞都没有诱导CT26细胞的CTL依赖性溶解。
简单说来，所有Her-2/neu表达质粒诱导了强烈的Her-2/neu特异性CTL反应，和它们的信号肽序列无关。然而，根据它们的信号肽序列，它们诱导了随后不同的Her-2/neu特异性抗体反应。只有带有原始信号序列的pNeuTM和pNeuECD显示了高的Her-2/neu特异性IgG滴定度(图2)。当它们的信号序列由病毒的信号序列替代时，pNeuTM-gDs产生了低含量的抗Her-2/neu抗体，而pNeuECD-gDs产生了非常低含量的抗Her-2/neu抗体。
实施例4通过接种pNeu构建体的肿瘤生长的预防如下评价小鼠中对抗人Her-2/neu表达的同源小鼠肿瘤细胞系Her2-CT26的抗癌免疫性。
最初，进行滴定研究来测定皮下或静脉注射进小鼠来产生皮下肿瘤结构或肺转移瘤的肿瘤细胞的最佳数量，结果显示当皮下或静脉注射5×104个或更多细胞时，Her2-CT26细胞诱导了BALB/c小鼠中皮下或肺转移肿瘤。由于长的存活时间有助于判别Her-2/neuDNA质粒的抗癌效能，因此选择了5×104个细胞作为静脉或皮下肿瘤激发的最初细胞数量。每个小鼠根据预定的免疫进度表接受3次肌内注射100μg质粒DNA(图1b)，第三次注射质粒DNA一周半后，每个小鼠静脉或皮下用5×104个Her2-CT26细胞激发。
在上述皮下肿瘤模型研究中，所有注射了pTV2的动物产生了可触诊的肿瘤(图5，A)。另一方面，在每个注射了pNeuTM、pNeuECD、pNeuTM-gDs，或pNeuECD-gDs60天后皮下注射肿瘤的所有组中的小鼠肿瘤受到了完全抑制。在转移模型中，注射pNeuTM、pNeuECD、pNeuTM-gDs，或pNeuECD-gDs的所有组的小鼠在静脉肿瘤激发中存活(图5，B)。然而，注射pTV2小鼠的七分之四(57％)和所有只注射了PBS的小鼠在肺转移瘤中没有存活。
实施例5pNeuECD和pNeuECD-gDs的抗癌免疫性的比较实施例2至4证明了用不同pNeu质粒免疫的小鼠中Her-2/neu特异性抗体滴定的对比性差异，除了可比较的CTL反应。此外，每个用pNeuTM、pNeuECD、pNeuTM-gDs，或pNeuECD-gDs免疫的所有组的小鼠抑制了5×104个皮下肿瘤的激发。由于皮下或静脉注射入小鼠的肿瘤细胞的数量太小以至于不能在免疫小鼠中诱导肿瘤，因此通过不同的pNeu构建体诱导的不同免疫反应来判别抗癌活性非常困难。因此，注射的肿瘤细胞数量相对于第一个肿瘤试验中的肿瘤细胞数量增加100倍(5×106)用于皮下肿瘤激发和40倍(2×106)用于静脉肿瘤激发，来评价Her-2/neu特异性抗体和CTL对Her2-CT26抑制的相对重要性。因为静脉注射过量肿瘤细胞导致的血管堵塞的危险，用于静脉肿瘤激发的细胞数量不可能大于2×106个。为比较的目的选择了一系列的pNeuECD和pNeuECD-gDs，在四个不同Her-2/neu表达质粒中产生Her-2/neu特异性抗体滴定度的最大差异。每个小鼠根据相同的免疫进度表接受三次肌内注射100μg质粒DNA(图1，B)，第三次注射质粒DNA后的10天，每个小鼠接受皮下5×106个或静脉2×106个Her2-CT26的激发。
在皮下的模型中，所有8个注射pTV2的动物发展了肿瘤，在皮下肿瘤激发后19天前平均的肿瘤体积超过了2000mm3(图6，A)。在第23天8只注射pNeuECD小鼠的平均肿瘤体积是82.2mm3，而8只注射pNeuECD-gDs小鼠的平均肿瘤体积是67.9mm3。而在注射pNeuECD(p＝2.9900e-8，Student’st检验)或pNeuECD-gDs(p＝2.8400e-8，Student’st检验)小鼠中肿瘤生长受到了显著抑制，两个免疫组中平均肿瘤体积的差异没有统计显著性(P＝0.8684，Student’st测试)。在转移模型中，在8只注射了pNeuECD小鼠中的8只(100％)和8只注射了pNeuECD-gDs小鼠中的7只(88％)至40天抑制了肺转移瘤(图6，B)。所有注射了pTV2的小鼠没有在肺转移瘤中存活。再一次，尽管通过用pNeuECD(p＜0.0001，Mantel-Haenszel测试)或pNeuECD-gDs(p＝0.0002，Mantel-Haenszel测试)处理的相对于pTV2存活显著延长，但是在pNeuECD和pNeuECD-gDs之间没有显著差异(p＝0.3173，Mantel-Haenszel测试)。
实施例6治疗模型中接种pNeu构建体的效能通过用肿瘤细胞激发免疫小鼠进行了预防性模型肿瘤试验。为了比较在治疗模型中pNeuECD和pNeuECD-gDs的抗癌效能，首先用肿瘤细胞激发小鼠，然后接受DNA质粒的肌内注射。6周大的首次用于试验的小鼠用1×105个或5×105个Her2-CT26细胞静脉激发，然后分成4组。肿瘤注射后的开始1小时，每个小鼠接受第一次肌内注射100μg的pNeuECD或pNeuECD-gDs，接着每天用相同的DNA质粒肌内注射多于四次。
图5和图6的结果显示了注射1×105个肿瘤细胞时的情况，用pNeuECD或pNeuECD-gDs处理的所有小鼠在接下来的40天从肺转移瘤中存活(图7，A)。然而，注射pTV2的8只小鼠中的5只(63％)和只注射PBS的所有小鼠(100％)没有从肺转移瘤中存活。尽管和pTV2相比较pNeuECD和pNeuECD-gDs显著提高了存活率(p＝0.0085，Mantel-Haenszel测试，但是在pNeuECD和pNeuECD-gDs之间没有显著差异。
另一方面，当肿瘤细胞的数量增加至5倍(5×105)时，只有注射pNeuECD的小鼠显示了和注射pTV2小鼠相比较具有统计学差异的提高的存活率(p＝0.0237，Mantel-Haenszel测试)(图7，B)。然而，和注射了pTV2小鼠相比较注射pNeuECD-gDs的小鼠没有显示显著提高的存活(p＝0.4628，Mantel-Haenszel测试)。尽管如此，和预防性模型一致，pNeuECD和pNeuECD-gDs之间的抗癌免疫性没有显著差异(p＝0.4263，Mantel-Haenszel测试)。
总之，通过改变预注射肿瘤细胞的数量来评价Her-2/neuDNA疫苗的治疗效能。当用小量转移肿瘤细胞处理小鼠时，pNeuECD和pNeuECD-gDs都显著地延长了存活时间，且它们之间的抗癌免疫性没有显著差异。然而，当使用大剂量的肿瘤细胞时，只有pNeuECD提高了存活率。
实施例7pNeu构建体和pCK构建体诱导的免疫反应的比较分析为了提高疫苗的临床效能，Her-2/neuDNA质粒载体是用比pTV2具有更强的启动子活性的pCK载体构建的。将从pNeuECD和pNeuTM获得的平端Her-2/neu基因的KpnI-XbaI片段各自插入pCK载体的KpnI-XbaI位点。因此，制得了表达Her-2/neu胞外和跨膜结构域的pCKTM和表达胞外结构域的pCKECD。
为了评价pCKTM和pCKECD的免疫原性，BALB/c小鼠接种pCKTM、pCKECD、pNeuECD和pNeuTM，用每个DNA质粒第三次肌内接种10天后从免疫小鼠获得血清和脾。用400倍稀释的血清培养SK-BR3细胞，接着与结合了山羊抗鼠IgG的FITC结合。通过使用流式细胞计进行终点滴定来评价Her-2/neu特异性抗体反应。图8的结果显示了接种pCKTM和pCKECD小鼠诱导的Her-2/neu特异性IgG抗体反应和接种pNeu构建体的相似，其中未着色的和着色的柱状图各自代表了对照抗体和稀释的血清。
此外，在标准的51Cr释放试验中测试了对抗Her2-CT26的Her-2/neu特异性CTL活性。接种pCKTM和pCKECD的小鼠也诱导了强烈的CTL反应(图9)。通过接种pCK构建体诱导的CTL反应比当接种pNeu构建体时的略高。
实施例8pCKTM和pCKECD的抗癌活性为了测定Her-2/neu的pCK构建体的抗癌效能，雌性BALB/c小鼠以两周间隔各自肌内接种三次100μg的PBS、pCK、pCKECD或pCKTM。最后接种2周后小鼠接受皮下或静脉1×106个Her2-CT26的激发。用测径器测量了由皮下注射Her2-CT26诱导生长的固体肿瘤的三维尺寸。每天计数活小鼠的数量，以每个处理组活小鼠的百分比显示结果。
在接种pCKTM或pCKECD的小鼠中完全抑制了由皮下注射Her2-CT26诱导的固体肿瘤的生长(图10，A)。在肺转移瘤模型中，pCKTM和pCKECD延长了存活时间，证明了肺转移瘤的强烈抑制(图10，B)。总之，通过接种pCKTM或pCKECD也可以获得对抗Her2-CT26激发的预防性免疫性。
为了测试pCKTM和pCKECD的治疗效能，在2×105个Her2-CT26静脉激发1小时后，小鼠肌内接种100μg的PBS、pCK、pCKECD或pCKTM。每天计数活小鼠的数量，以每个处理组活小鼠的百分比显示结果。接种pCKTM或pCKECD后对于对抗转移性克隆生长的预防是有效的且明显地抑制了肺转移瘤引起的死亡(图11)。因此，在pCKTM或pCKECD中保留着pNeu构建体的预防性抗癌效能。因此，在治疗模型中来评价对抗预注射肿瘤细胞的预防性免疫性，pCKTM或pCKECD显著地延长了存活率。由于pCKTM的治疗抗癌活性略高于pCKECD，因此选择pCKTM与细胞因子基因结合作为用于Her-2/neuDNA疫苗的模型。
实施例9通过共注射pCKTM与各种细胞因子质粒诱导的免疫反应和抗癌活性在Her-2/neuDNA接种中使用细胞因子基因作为分子助剂，如下制得六种含有细胞因子基因的pCK载体，pCK-GMCSF、pCK-IL12、pCK-IL15、pCK-IL18、pCK-Eta1和pCK-Flt3L。GM-CSF和Flt3L，促进了抗原提呈细胞的增殖和活性，期望来提高转移进消化性抗原提呈细胞如树状细胞的传递效率并提高免疫反应。IL-12、IL-15、IL-18和Eta-1是典型的TH1偏移细胞因子，期望来诱导对癌症免疫性重要的细胞为介的免疫反应。
从BALB/c小鼠脾分离的mRNA和特异性的引物(Eta-1，用SEQ IDNO14的EF1和SEQ ID NO15的ER1；IL-18，用SEQ ID NO16的18F1和SEQ ID NO17的18R1；IL-15，用SEQ ID NO18的15F1和SEQ IDNO19的15R1；以及Flt3L，用SEQ ID NO20的FF1和SEQ ID NO21的FR1)根据制造商的介绍通过RT-PCR(SUPERSCRIPTTMII RT，GIBCO BRL)扩增Eta-1(SEQ ID NO10)、IL-18(SEQ ID NO11)、IL-5(SEQ ID NO12)和Flt3L(SEQ ID NO13)基因。将克隆的细胞因子基因插入pCK来产生pCK-Eta1、pCK-IL18、pCK-IL15和pCK-Flt3L。通过将pTV2-GMCSF(Cho，J.H.等，Vaccine171136-1144，1999)和pTV2-IL12(Ha，S.J.等，Nat.Biotechnol.20381-386，2002)的EcoRI-XbaI和XhoI片段各自插入pCK载体来构建pCK-GMCSF和pCK-IL12。
为了分析抗体产生和CTL反应中细胞因子基因助剂的效果，小鼠肌内注射了pCKTM和各个pCK-细胞因子(图12a)。最后一次接种3周后，通过流式细胞计进行抗体滴定来测定Her-2/neu特异性抗体产物和51Cr释放试验来测量CTL反应。
<表2>
如表2所示，通过接种pCKTM和或不和细胞因子充分产生了Her-2/neu特异性抗体，但没有发现结合细胞因子基因质粒的组有显著差异(图12b)。
<表3>
表3显示了图12b中观察到的CTL反应的总结。如表3所示，目标物溶解的百分比通过接种pCKTM和pCK-Eta1或pCK-Flt3L略有增加，而通过接种pCKTM和pCK-IL18或pCK-GMCSF略有减少。在所有小鼠中没有发现使用CT26细胞作为靶细胞的非特异性溶解。
实施例10通过共注射pCKTM和细胞因子质粒诱导的抗癌活性为了测定通过共注射pCKTM和细胞因子质粒诱导的抗癌活性，使用BALB/c小鼠进行预防性和治疗性试验。如图13a和14a所示，在接种pCKTM和各个细胞因子质粒之前或之后用Her2-CT26激发BALB/c小鼠。给BALB/c小鼠肌内共注射100μg的pCKTM和100μg各个pCK-细胞因子质粒。在第二次接种后3周用1×106个Her2-CT26静脉或皮下激发小鼠。用测径器一周两次测量每个小鼠的肿瘤生长并计算体积。
通过共接种pCKTM和细胞因子质粒抑制了皮下肿瘤的生长，尤其是pCK-GMCSF、pCK-Eta1和pCK-IL15(图13b)。通过接种pCKTM和pCK-GMCSF抑制了Her2-CT26静脉激发的转移(图13c和13d)。
在2×105个Her2-CT26静脉激发后小鼠肌内接种100μg的pCKTM和各个pCK-细胞因子质粒。每天计数活小鼠的数量，以每个处理组活小鼠的百分比显示结果。共接种pCKTM和pCK-细胞因子提高了比当只用pCKTM接种时高的存活率，除了pCK-Eta1(图14b和14c)。
因此，在肿瘤生长模型和转移模型中通过共注射特别的细胞因子质粒如pCK-GMCSF提高了pCKTM的预防性抗癌活性。
实施例11表达Her-2/neu和细胞因子的双顺反子质粒的构建为了提高Her-2/neuDNA接种的抗癌活性，构建了双顺反子质粒，pCKTM-GMCSF、pCKTM-Flt3L、pCKTM-Eta1、pCKTM-IL12、pCKTM-IL15、pCKTM-IL18，和pCKTM-IL23，其中Her-2/neu蛋白质和每个细胞因子已经独立地翻译。在Her-2/neu基因和细胞因子基因之间的脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES)使Her-2/neu蛋白质和细胞因子同时表达(图15a)。
为了生产共表达Her-2/neu和细胞因子蛋白的双顺反子质粒，使用如实施例9所述的特异性引物通过PCR来扩增GM-CSF、Flt3L、IL-15、IL-18和Eta-1基因，将其插入pCKTM-IRES的EMCV的IRES的下游。具有SEQ ID NO22核苷酸序列的EMCV的IRES源自pCK-IL12。为了IL-12和IL-23(Belladonna，M.L，等，J.Immunol.1685448-5454，2002)，使用pCK-IL12作为模板以及SEQ ID NO23的IRES-F1和SEQ IDNO24的IRES-R1作为引物对通过PCR来扩增IRES，将扩增的产物插入pCKTM的NotI-XhoI位点来获得pCKTM-IRES。
实施例12表达Her-2/neu和细胞因子的双顺反子质粒诱导的抗癌效能为了评价pCKTM-细胞因子质粒的预防性抗癌活性，根据图15b所示的接种进度表给小鼠各自接种七个pCKTM-细胞因子质粒(pCKTM-GMCSF、pCKTM-Flt3L、pCKTM-Eta1、pCKTM-IL12、pCKTM-IL15、pCKTM-IL18和pCKTM-IL23)。
用pCKTM-细胞因子构建体肌内接种比当只注射pCK时更充分地抑制了皮下植入肿瘤的生长(图15c)。尤其是，pCKTM-IL18、pCKTM-GMCSF、pCKTM-IL12和pCKTM-Flt3L在肿瘤生长的抑制作用中显示了突出的效果。在肿瘤转移模型中，pCKTM-IL18完全预防了小鼠肺转移瘤(图15d)。其它双顺反子构建体的抗转移效能和pCKTM的情况相似。根据图14a所示的进度表在治疗模型中试验对抗预注射Her2-CT26转移的预防。接种pCKTM-GMCSF和pCKTM-IL18延长了存活率(图16，A和B)。总起来说，在预防性和治疗性模型中pCKTM-GMCSF和pCKTM-IL18看来显著地增加了肿瘤抑制效果。
已经描述和用图说明了本发明的实施例，在不脱离本发明的精神下各种改变和修饰是显而易见的，其只受限于所附权利要求的范围。
序列表<110>凡基因里门<120>具有抗癌活性的Her-2/neu DNA疫苗<130>PCA30540/PAN/PCT<150>KR2002-41764<151>2002-07-16<150>KR2003-38012<151>2003-06-12<160>24<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>4530<212>DNA<213>人Her-2/neu基因cDNA<400>1aattctcgag ctcgtcgacc ggtcgacgag ctcgagggtc gacgagctcg gggcgcgcg 60cccggccccc acccctcgca gcaccccgcg ccccgcgccc tcccagccgg gtccagccgg120agccatgggg ccggagccgc agtgagcacc atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg180ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac240atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag acccacctgg acatgctccg ccacctctac300cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg gaactcacct acctgcccac caatgccagc360ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa420gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac480aactatgccc tggccgtgct agacaatgga gacccgctga acaataccac ccctgtcaca540ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa600ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag660
gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg720gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag ggctcccgct gctggggaga gagttctgag780gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca840ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt gctgccggct gcacgggccc caagcactct900gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc960ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag tccatgccca atcccgaggg ccggtataca1020ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc1080tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg1140tgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga gtgtgctatg gtctgggcat ggagcacttg1200cgagaggtga gggcagttac cagtgccaat atccaggagt ttgctggctg caagaagatc1260tttgggagcc tggcatttct gccggagagc tttgatgggg acccagcctc caacactgcc1320ccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt gagactctgg aagagatcac aggttaccta1380tacatctcag catggccgga cagcctgcct gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagta1440atccggggac gaattctgca caatggcgcc tactcgctga ccctgcaagg gctgggcatc1500agctggctgg ggctgcgctc actgagggaa ctgggcagtg gactggccct catccaccat1560aacacccacc tctgcttcgt gcacacggtg ccctgggacc agctctttcg gaacccgcac1620caagctctgc tccacactgc caaccggcca gaggacgagt gtgtgggcga gggcctggcc1680tgccaccagc tgtgcgcccg agggcactgc tggggtccag ggcccaccca gtgtgtcaac1740tgcagccagt tccttcgggg ccaggagtgc gtggaggaat gccgagtact gcaggggctc1800cccagggagt atgtgaatgc caggcactgt ttgccgtgcc accctgagtg tcagccccag1860aatggctcag tgacctgttt tggaccggag gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat1920aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac1980atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc2040
acccactcct gtgtggacct ggatgacaag ggctgccccg ccgagcagag agccagccct2100ctgacgtcca tcgtctctgc ggtggttggc attctgctgg tcgtggtctt gggggtggtc2160tttgggatcc tcatcaagcg acggcagcag aagatccgga agtacacgat gcggagactg2220ctgcaggaaa cggagctggt ggagccgctg acacctagcg gagcgatgcc caaccaggcg2280cagatgcgga tcctgaaaga gacggagctg aggaaggtga aggtgcttgg atctggcgct2340tttggcacag tctacaaggg catctggatc cctgatgggg agaatgtgaa aattccagtg2400gccatcaaag tgttgaggga aaacacatcc cccaaagcca acaaagaaat cttagacgaa2460gcatacgtga tggctggtgt gggctcccca tatgtctccc gccttctggg catctgcctg2520acatccacgg tgcagctggt gacacagctt atgccctatg gctgcctctt agaccatgtc2580cgggaaaacc gcggacgcct gggctcccag gacctgctga actggtgtat gcagattgcc2640aaggggatga gctacctgga ggatgtgcgg ctcgtacaca gggacttggc cgctcggaac2700gtgctggtca agagtcccaa ccatgtcaaa attacagact tcgggctggc tcggctgctg2760gacattgacg agacagagta ccatgcagat gggggcaagg tgcccatcaa gtggatggcg2820ctggagtcca ttctccgccg gcggttcacc caccagagtg atgtgtggag ttatggtgtg2880actgtgtggg agctgatgac ttttggggcc aaaccttacg atgggatccc agcccgggag2940atccctgacc tgctggaaaa gggggagcgg ctgccccagc cccccatctg caccattgat3000gtctacatga tcatggtcaa atgttggatg attgactctg aatgtcggcc aagattccgg3060gagttggtgt ctgaattctc ccgcatggcc agggaccccc agcgctttgt ggtcatccag3120aatgaggact tgggcccagc cagtcccttg gacagcacct tctaccgctc actgctggag3180gacgatgaca tgggggacct ggtggatgct gaggagtatc tggtacccca gcagggcttc3240ttctgtccag accctgcccc gggcgctggg ggcatggtcc accacaggca ccgcagctca3300tctaccagga gtggcggtgg ggacctgaca ctagggctgg agccctctga agaggaggcc3360cccaggtctc cactggcacc ctccgaaggg gctggctccg atgtatttga tggtgacctg3420
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atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc60gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag120acccacctgg acatgctccg ccacctctac cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg180gaactcacct acctgcccac caatgccagc ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg240cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg300attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac aactatgccc tggccgtgct agacaatgga360gacccgctga acaataccac ccctgtcaca ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg420cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag480ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct540ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag600ggctcccgct gctggggaga gagttctgag gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt660gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt720gctgccggct gcacgggccc caagcactct gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac780agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag840tccatgccca atcccgaggg ccggtataca ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc900tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa960gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg tgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga1020gtgtgctatg gtctgggcat ggagcacttg cgagaggtga gggcagttac cagtgccaat1080atccaggagt ttgctggctg caagaagatc tttgggagcc tggcatttct gccggagagc1140tttgatgggg acccagcctc caacactgcc ccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt1200gagactctgg aagagatcac aggttaccta tacatctcag catggccgga cagcctgcct1260gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagta atccggggac gaattctgca caatggcgcc1320tactcgctga ccctgcaagg gctgggcatc agctggctgg ggctgcgctc actgagggaa1380
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<223>NSR1引物<400>5gtctagatga ttcacgtcag agggctggct c 31<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NF5引物<400>6gcagtggtac ccaagcttag cac 23<210>7
<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NRM2引物<400>7ttctagagca gtctccgcat cgtctac 27<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NSF2引物<400>8ggcgcgcccc ggcacagaca tgaagctg 28<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NF3引物<400>9gccgcagcgg ccgccatgga gctg 24<210>10<211>1535<212>DNA<213>小鼠Eta-1基因<400>10gggggggggg gggggggggg ggggctttcc ttgctcctta tgagaggtgg agaggtagaa 60
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<223>18R1引物<400>17ttctagacta actttgatgt aag 23<210>18<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>15F1引物<400>18tgaattcatg aaaattttga aaccatat 28<210>19<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>15R1引物<400>19ttctagacta aaagctttgc aaaaactctg tgaag 35<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FF1引物
<400>20tgaattcatg acagtgctgg cgcc 24<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FR1引物<400>21ttctagacta ctgcctgggc cgag 24<210>22<211>600<212>DNA<213>来自pCK-mlL12的IRES<400>22ggatccgata agcttgatat cgaattccgc cccccccccc cctaacgtta ctggccgaag 60ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc 120ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg 180tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc 240tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc 300cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa 360ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct 420ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccaa aaggtacccc attgtatggg 480atctgatctg gggcctcggg gcacatgctt tacatgtgtt tagtccaggt taaaaaaacg 540tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat aataccatgg 600<210>23
<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IRES-F1引物<400>23gcggccgcga taagcttgat atcgaattcc g 31<210>24<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IRES-R1引物<400>24ctcgagtatt atcgtgtttt tcaaagg 2权利要求
1.具有抗癌活性的Her-2/neu质粒构建体，其通过将缺失胞内结构域的平端人Her-2/neu基因插入质粒pTV2或pCK而制备。
2.根据权利要求1所述的质粒构建体，其中人Her-2/neu基因具有SEQ ID NO2的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的质粒构建体，其是pNeuTM(KCCM-10393)或pCKTM(KCCM-10396)。
4.根据权利要求1所述的质粒构建体，其中平端人Her-2/neu基因进一步缺失跨膜结构域。
5.根据权利要求4所述的质粒构建体，其中人Her-2/neu基因具有SEQ ID NO3的核苷酸序列。
6，根据权利要求5所述的质粒构建体，其是pNeuECD(KCCM-10394)或pCKECD(KCCM-10395)。
7.根据权利要求1所述的质粒构建体，其中人Her-2/neu基因的信号肽被I型单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)的信号肽替代。
8.根据权利要求7所述的质粒构建体，其是pNeuECD-gDs。
9.根据权利要求4所述的质粒构建体，其中人Her-2/neu基因的信号肽被I型单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)的信号肽替代。
10.根据权利要求7所述的质粒构建体，其是pNeuECD-gDs。
11.根据权利要求1所述的质粒构建体，除了翻译人Her-2/neu基因之外进一步翻译细胞因子基因。
12.根据权利要求11所述的质粒构建体，其中细胞因子基因选自粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)、早期T淋巴细胞活化-1(Eta-1)、白细胞介素-12(IL-12)、IL-15或IL-18。
13.用于预防和/或治疗癌症的DNA疫苗，其包括作为有效成分的权利要求1的质粒构建体以及药物学上可接受的载体。
14.根据权利要求13所述的DNA疫苗，其进一步包括细胞因子基因表达质粒。
15.根据权利要求14所述的DNA疫苗，其中细胞因子基因选自GM-CSF、Flt3L、Eta-1、IL-12、IL-15和IL-18。
16.预防和/或治疗癌症的方法，其中包括服用有效量的根据权利要求13的DNA疫苗的步骤。
全文摘要
本发明涉及具有抗癌活性的人Her－2/neu表达质粒的构建体以及用于预防和/或治疗癌症的含有该构建体的DNA疫苗。本发明的Her－2/neuDNA疫苗可以有效地用作治疗疫苗在肿瘤外科手术后减少转移或作为遗传高风险人群的预防性疫苗。
文档编号A61K45/00GK1668750SQ03816988
公开日2005年9月14日 申请日期2003年7月15日 优先权日2002年7月16日
发明者李俊晔, 金东贤, 郑渊硕, 张仙荣, 李庆哲, 姜昌律 申请人:凡基因里门