体内抑制病毒复制的方法

专利名称：体内抑制病毒复制的方法
技术领域：
本发明涉及抑制病毒复制的方法、治疗癌症的方法、治疗和/或抑制肿瘤转移的方法，以及同时抑制病毒复制和治疗癌症或治疗和/或抑制肿瘤转移的方法等。
背景技术：
病毒感染是导致死亡的主要原因之一，每年有数百万人的死亡可直接归因于几种病毒，包括肝炎和HIV。
肝炎是人类肝脏的一种疾病。它表现为肝脏的炎症，通常由病毒感染引起。已知有几种病毒可以引起病毒性肝炎，例如肝炎A、B、C、D、E和G型病毒。其中，HBV和HCV最为严重。
丙型肝炎病毒(HCV)在世界范围内广泛流行，有1亿7千万以上的人被感染。在病毒性疾病中，它比1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)分布广泛5倍，今年将有大约10000美国人死于由慢性HCV感染导致的肝硬化和肝细胞癌(HCC)(Sun CA，Wu DM，Lin CC，Lu SN，You SL，Wang LY，Wu MH，Chen CJ.2003.丙型肝炎病毒相关的肝细胞癌的发病率和协同因子台湾12008个男性的远景调查，Am J Epidemiol157674-682；Herrine SK.2002.走近慢性丙型肝炎病毒感染的病人，Ann Intern Med 136747-757；Hoofnagle JH.2002.丙型肝炎的过程和结果，Hepatology 36S21-S29；Lauer GM，Walker BD.2001.丙型肝炎病毒感染，N Engl J Med 34541-52；Liang TJ，Rehermann B，Seeff LB，Hoofnagle JH.2001.丙型肝炎的发病机理、自然史、治疗和预防，AnnIntern Med 132296-305)。此外，尽管有献血者筛选计划机构，在美国、西欧和亚洲HCV的流行持续增加。在大多数HCV感染的病人中出现向慢性病的发展。此外，HCV每年在1-4％的所有慢性感染个体中引起HCC。而且，即使是在那些没有肝硬化的人中HCC也可能发生(Shiratori Y，Shiina S，Teratani T，Imamura M，Obi S，Sato S，Koike Y，Yoshida H，Omata M.2003.在肿瘤切除后使用干扰素疗法在患有与丙型肝炎病毒相关的肝细胞癌的病人中改善了预后，Ann Int Med138299-306；Smith MW，Yue ZN，Geiss GK，Sadovnikova NY，Carter VS，Boix L，Lazaro CA，Rosenberg GB，Bumgarner RE，Fausto N，Bruix J，Katze MG.2003.在丙型肝炎病毒相关的肝细胞癌中鉴定新的肿瘤指标，Cancer Res 63859-864；Yoshizawa H.2002.日本的与丙型肝炎病毒相关的肝细胞癌在可预见的将来预测其它国家，Oncology 62(Suppl1)8-17；Colombo M.1999.与丙型肝炎病毒相关的肝细胞癌的自然史和发病机理，J Hepatology 31(Suppl 1)25-30)。鉴于现在HCV感染在30到50岁人群中的流行，据估计在美国HCC的发病率和死亡率在未来的10到20年中将会增加1倍(El-Serag HB.2002.美国的肝细胞癌和丙型肝炎。Hepatology 36S74-S83)。据估计在全世界有5亿人感染丙型肝炎。目前没有有效的免疫方法可以使用，丙型肝炎只能够通过其它的预防措施来控制，例如改善卫生和保健条件，阻断传播途径。
目前，除了外科切除之外对HCC还没有有效的治疗方法(Ryder SD.2003.成年人中肝细胞癌(HCC)的诊断和治疗指南，Gut 52(SupplIII)iii1-iii8；E1-Serag HB.2001.美国的肝细胞癌和丙型肝炎，Hepatology 36S74-S83；E1-Serag HB.2001.肝细胞癌的全球流行病学，Clin Liver Dis 587-107；DiMaio M，DeMaio E，Perrone F，Pegnata S，Daniele B.2002.肝细胞癌全身性治疗，J Clin Gastroenterol 35(Suppl.2)S109-S114；Curley SA，Izzo F，Ellis LM，Vauthey JN，Vallone P.2000.在110个患有肝硬化的病人中肝细胞癌的射频摘除，Ann Surg232381-391；Watkins KT，Curley Sa.2000.肝脏和胆管，临床肿瘤学(第二版)，MD Abeloff，JO Armitage，AS Lichter，JE Niederhuber主编，NewYorkChurchill Livingstone出版社，第1681-1748页)。但是只有不到5％的HCC病人符合外科手术要求，只有大约1％的病人实际上进行了切除。即使是在那些进行了切除的病人中，HCC的复发也是常见的，特别是在那些感染了HCV的人中。
氨基酸脱疗对于某些癌症的治疗是有效的方法。尽管正常的细胞不需要精氨酸，许多癌症细胞系对于这种氨基酸来说是营养缺陷的。因此，癌症，包括但不限于HCC，可以被精氨酸脱疗选择性杀死(EnsorCM，Holtsberg FW，Bomalaski JS，Clark MA.2002.PEG化的精氨酸脱亚胺酶(ADI-SS PEG20000)在体外和体内抑制了人的黑素瘤和肝细胞癌，Cancer Res 625443-5440；Takaku H，Misawa S，Hayashi H和Miyazaki K.(1993).来自精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)的抗肿瘤酶精氨酸脱亚胺酶的聚乙二醇化学修饰，Jpn.J.Cancer Res.841195-1200；Takaku H，Takase M，Abe S，Hayashi H和Miyazaki K.(1992).从精氨酸支原体纯化的精氨酸脱亚胺酶的体内抗肿瘤活性，Int.J.Cancer51244-249；Sugimura K，Ohno T，Kussyama T，Azuma I.1992.人类黑素瘤细胞系在体外对精氨酸支原体脱亚胺酶的生长抑制活性的高敏感性，Melanoma Res.2191-196)。这种疗法容易忍受，因为精氨酸在人体中不是一种必需氨基酸(Rose WC.1949.人类的氨基酸需求，FedProc 8546-552；Snyderman，S.，E.，Boyer，A.，和L.E.Holt 1959.婴儿的精氨酸需求，J.Dis.Child.97192，至于综述可以参见Rodgers QR.1994.精氨酸需求在物种中的变化，纪念Willard J.Visek研讨会会议录——从氨到癌症和基因表达，特别出版物86-1994年4月，Illinois大学农业试验站，211 Mumford Hall，Urbana，IL 61801，第9-21页)，它可以从瓜氨酸合成。ADI将细胞外的精氨酸转化为瓜氨酸，它可以被正常的细胞摄取并在细胞内转化为精氨酸，但是不能被癌细胞，特别是HCC细胞转化，因为它们缺乏限速酶精氨基琥珀酸合成酶(Ensor CM，Holtsberg FW，Bomalaski JS，Clark MA.2002.PEG化的精氨酸脱亚胺酶(ADI-SS PEG20000)在体外和体内抑制了人的黑素瘤和肝细胞癌，Cancer Res 625443-5440)。这种不能表达精氨基琥珀酸合成酶的性质最近被其他人所证实(Shen LJ，Lin WC，Beloussow K，Shen WC.2003.对细胞培养物中重组的精氨酸脱亚胺酶的抗增殖活性的抗性与内源的酶——精氨基琥珀酸合成酶相关，Cancer Lett 191165-170)。我们已经将这种对精氨基琥珀酸合成酶缺陷的研究扩展到其它肿瘤(Dillon BJ，Prieto VG，Curley SA，Ensor CM，Holtsberg FW，Bomalaski JS，Clark MA.2003.精氨基琥珀酸合成酶缺陷在人类癌症中的发生率和分布的方法一种鉴定对脱精氨酸敏感的癌症的方法，Cancer(待出版))。ADI-SS PEG20000的人类临床试验的初步结果表明这种疗法作为抗癌疗法既安全又有效。
乙型肝炎病毒感染可以导致多种类型的肝脏损伤。此外，慢性乙型肝炎病毒感染已经与随后的肝细胞癌(一种主要的死亡原因)的发展建立了联系。现在对HBV感染的预防是接种乙型肝炎病毒疫苗，它既安全又有效。但是，疫苗在治疗那些已经感染的人(即携带者和病人)时是无效的。
获得性免疫缺陷综合症(AIDS)是一种致命的疾病，报道的病例在过去的几年中急剧增加。AIDS病毒是在1983年首次鉴定的。它有几个名字和缩写。它是第三个知道的嗜T淋巴细胞病毒(HTLV-III)，具有在免疫系统细胞内复制的能力，引起严重的细胞毁坏。AIDS病毒为逆转录病毒，是一种在复制过程中使用逆转录酶的病毒。这种特殊的逆转录病毒也被称为淋巴腺病相关病毒(LAV)、AIDS相关病毒(ARV)，以及最近的人免疫缺陷病毒(HIV)。迄今为止已经描述了两种不同的HIV家族，即HIV-1和HIV-2。此处使用的缩写“HIV”在广义上是指人免疫缺陷病毒。
1型和2型单纯疱疹病毒(HSV)是持久性的病毒，通常感染人类；它们引起多种令人烦恼的人类疾病。1型HSV引起口腔“唇疱疹”(复发性唇疱疹)，2型HSV引起生殖器疱疹，它在世界许多地方已经变成了一种主要的性病。目前对生殖器疱疹没有完全令人满意的治疗方法。此外，尽管并不常见，HSV也可以引起脑炎(一种威胁生命的脑部感染)(Holvey主编的Merck手册，1972；Whitley，单纯性疱疹病毒，病毒学(第二版)，Raveb出版社(1990))。由HSV引起的最严重的紊乱是树枝状角膜炎，这是一种眼部感染，在角膜上产生分支状病变，可以导致永久性的瘢痕和失明。HSV的眼部感染是失明的主要原因。HSV也是一种难以治愈的病毒，如果不是不能治愈的话。
抗病毒疗法目前的抗病毒疗法面临几个难题。首先，有效的抗病毒药物相对较少。许多现有的抗病毒药物引起不利的或不希望的副反应。大多数有效的疗法(例如接种疫苗)只对单一的病毒株是高度特异的。病毒经常经历突变，以至于它变得对药物或疫苗具有抗性。
许多现有的治疗病毒感染的方法以α-干扰素(IFN-α)为中心。据信α-干扰素与细胞受体结合，启动了一个包括参与蛋白合成的酶的细胞内反应。这最终导致了抗病毒活性/反应。但是，来自各种临床试验的数据显示，大约40％用α-干扰素治疗的病人最初对疗法有反应，但是他们中有70％在治疗结束后复发(Damen，M.，和Bresters，D.，在H.W.主编的Curr.Stud.Hematol.Blood Transf.，Darger出版社，1998，Basel)。总的来说，只在10-30％的病人中观察到了长期的疗效和反应(Houghton，M.，Fields，B.N.等，野外病毒学，Raven出版社1996，Philadelphia)。此外还观察到了许多副反应，例如严重的流行感冒、疲劳、肌肉和头痛，甚至抑郁症、体重减轻和腹泻(Damen，M.，和Bresters，D.，在H.W.主编的Curr.Stud.Hematol.Blood Transf.，Darger出版社1998，Basel)。
HCV疗法目前HCV感染的标准疗法是PEG化的α-干扰素和利巴韦林(ribavirin)。尽管这种疗法可以产生持续的抗病毒反应，但有大量的病人对这种疗法没有反应或被排除在这种疗法之外(Falck-Ytter Y，Kale H，Mullen KD，Sarbah SA，Sorescu L，McCullough AJ.2002.在丙型肝炎患者中抗病毒治疗方法的效果惊人地小，Ann Intern Med 136288-292；Fried MW.2002.丙型肝炎疗法的副反应及其管理，Hepatology36S237-S244；Fried MW，Shiffman ML，Reddy KR，Smith C，Marinos G，Goncales FL Jr，Haussinger K，Diago M，Carosi G，Dhumeaux K，Craxi A，Lin A，Hoffman J，Yu J.2002.用于慢性丙型肝炎病毒感染的PEG化α-2a干扰素加利巴韦林，N Engl J Med 347975-982；Herrine SK.2002.走近慢性丙型肝炎病毒感染的病人，Ann Intern Med 136747-757；LauerGM，Walker BD.2001.丙型肝炎病毒感染，N Engl J Med 34541-52；Liang TJ，Rehermann B，Seeff LB，Hoofnagle JH.2001.丙型肝炎的发病机理、自然史、治疗和预防，Ann Intern Med 132296-305；Manns MP，McHuntchinson JG，Gordon SC，Rustgi VK，Shiffman M，Reindollar R，Goodman ZD，Koury K，Ling M-H，Albrecht JK.2001.PEG化α-2b干扰素加利巴韦林与α-2b干扰素加利巴韦林在慢性丙型肝炎最初治疗中的比较随机化试验，Lancet 358958-965)。例如，最近对PEG-IFNα-2a(PegasysTN)加利巴韦林和PEG-IFNα-2b(PegintronTN)加利巴韦林的研究证明大约56％被研究的病人具有持续的病毒反应(Dantzler TD，Lawitz EJ.2003.在对以前的疗法无反应的人中治疗慢性丙型肝炎，Curr Gastroenterol Rep 578-85；Masci P，Bukowski RM，Patten PA，Osborn BL，Borden EC.2003.新的和修饰的α-干扰素临床前和临床数据，Curr Oncol Rep 5108-113；Chandler G，Sulkowski MS，Jenckes MW，Torbenson MS，Herlong HF，Bass EB，Gebo KA.2002.慢性丙型肝炎的治疗系统的综述，Hepatology 36S135-S144；DiBisceglie AM，Hoofnagle JH.2002.丙型肝炎的最适疗法，Hepatology 36S121-127；Fried MW.2002.丙型肝炎疗法的副反应及其管理，Hepatology36S237-S244；Lindsay KL.2002.丙型肝炎疗法介绍，Hepatology36S114-S120；Lopez-Guerrero JA，Carrasco L.1998.一氧化氮对两种人类细胞系的脊髓灰质炎病毒感染的影响，J.Virol 722538-2540；Wedemeyer H，Wiegand J，Cornberg M，Manns MP.；聚乙二醇-干扰素在丙型肝炎病毒疗法中的现状，J Gastroenterol Hepatol.2002年12月，17 Suppl 3S344-S350；Manns MP，McHuntchinson JG，Gordon SC，Rustgi VK，Shiffman M，Reindollar R，Goodman ZD，Koury K，Ling M-H，Albrecht JK.2001.PEG化α-2b干扰素加利巴韦林与α-2b干扰素加利巴韦林在慢性丙型肝炎最初治疗中的比较随机化试验，Lancet358958-965)。但是，对于HCV 1a和1b这些在美国和西欧最常见的基因型来说，反应只有大约46％。HCV 2和3基因型反应较好(76％-82％)。此外，在临床试验中对被研究的病人来说反应率只有大约50％；这并不代表整个病人人群，因此存在偏差(Dantzler TD，Lawitz EJ.2003.在对以前的疗法没有反应的病人中治疗慢性丙型肝炎，CurrGastroenterol Rep 578-85；Masci P，Bukowski RM，Patten PA，Osborn BL，Borden EC.2003.新的和修饰的α-干扰素临床前和临床数据，CurrOncol Rep 5108-113；Chandler G，Sulkowski MS，Jenckes MW，Torbenson MS，Herlong HF，Bass EB，Gebo KA.2002.慢性丙型肝炎的治疗系统的综述，Hepatology 36S135-S144；DiBisceglie AM，Hoofnagle JH.2002.丙型肝炎的最适疗法，Hepatology 36S121-127；Fried MW.2002.丙型肝炎疗法的副反应及其管理，Hepatology36S237-S244；Fried MW，Shiffman ML，Reddy KR，Smith C，Marinos G，Goncales FL Jr，Haussinger K，Diago M，Carosi G，Dhumeaux K，Craxi A，Lin A，Hoffman J，Yu J.2002.用于慢性丙型肝炎病毒感染的PEG化α-2a干扰素加利巴韦林，N Engl J Med 347975-982；Lindsay KL.2002.丙型肝炎疗法介绍，Hepatology 36S114-S120；López-Guerrero JA，Carrasco L.1998.一氧化氮对两种人类细胞系的脊髓灰质炎病毒感染的影响，J.Virol 722538-2540；Wedemeyer 2002，Manns MP，McHuntchinson JG，Gordon SC，Rustgi VK，Shiffman M，Reindollar R，Goodman ZD，Koury K，Ling M-H，Albrecht JK.2001.PEG化α-2b干扰素加利巴韦林与α-2b干扰素加利巴韦林在慢性丙型肝炎最初治疗中的比较随机化试验，Lancet 358958-965)。例如在美国的一项大型研究中，根据选择的判据从1337个潜在的病人中排除了404个(或大约30％)(McHutchinson JG，Gordon SC，Schiff ER，Shiffman ML，Lee WM，Rustgi VK，等，1998，α-2b干扰素单独或与利巴韦林结合作为慢性丙型肝炎的最初治疗方法，Hepatitis Interventional Therapy Group，N EnglJ Med 3391485-1492)。其它的大型研究经常不能描述它们的筛选判据或登记病人的百分数。一项最近在美国由一家大的教学医院进行的研究注意到所有HCV患者中的72％没有用IFN治疗，其原因例如医学或精神病学上的禁忌征候、正在进行的物质或酒精滥用、没有坚持到评估步骤、正常的肝脏酶、或者甚至是病人宁愿放弃治疗(Falck-Ytter Y，Kale H，Mullen KD，Sarbah SA，Sorescu L，McCullough AJ.2002.在丙型肝炎患者中抗病毒治疗方法的效果惊人地小，Ann Intern Med136288-292)。同样的结果已经被其它人所证实(Diamond C，Lee JH.2002.在患有丙型肝炎的病人中使用抗病毒疗法，Annals Intern Med1371012)。因此，在HCV感染人群中很大的一部分由于各种医学或精神病学上的禁忌征候而没有接受现有的“最好的护理标准”的治疗。即使是在美国和西欧使用了“最好的”病人的研究中，也只有大约50％能够获得持续的病毒反应。
α-干扰素也有严重的副作用，在PEG化和非PEG化的制剂中发生的频率大致相同(Masci P，Bukowski RM，Patten PA，Osborn BL，Borden EC.2003.新的和修饰的α-干扰素临床前和临床数据，CurrOncol Rep 5108-113；Fried MW.2002.丙型肝炎疗法的副反应及其管理，Hepatology 36S237-S244；Wedemeyer 2002，Herrine SK.2002.走近慢性丙型肝炎病毒感染的病人，Ann Intern Med 136747-757；LauerGM，Walker BD.2001.丙型肝炎病毒感染，N Engl J Med 34541-52；Liang TJ，Rehermann B，Seeff LB，Hoofnagle JH.2001.丙型肝炎的发病机理、自然史、治疗和预防，Ann Intern Med 132296-305)。这些副作用包括类似流感的疾病，在多达82％被研究的病人中伴随着发烧、寒战、肌肉疼痛和身体不适，在大约20％的病人中伴随着神经精神病学的并发症，例如抑郁症、易怒和焦虑。在大约5％中发生骨髓萎缩，伴随着粒性白细胞减少症、贫血或血小板减少症，脱发症的发生率也相当。这些副作用通常非常严重，以至于使用α-干扰素的继续治疗被中止，从而进一步限制了IFN疗法的使用。因此，需要新的治疗HCV的方法。
HIV的治疗方法已经批准了几种治疗HIV的药物，包括azidovudine(AZT)、去羟肌苷(didanosine)(双脱氧肌苷，ddI)、d4T、扎西他滨(zalcitabine)(双脱氧胞苷，ddC)、内维拉平(Nevirapine)、拉米夫定(lamivudine)(epivir，3TC)、沙奎那维(Saquinavir)(Invirase)、利托那韦(ritonavir)(Norvir)、茚地那韦(indinavir)(Crixivan)以及地拉韦定(delavirdine)(Rescriptor)。参见M.I.Johnston和D.F.Hoth，Science，260(5112)，1286-1293(1993)和D.D.Richman，Science，272(5270)，1886-1888(1996)。对于HCV的可选择的疗法是利巴韦林。利巴韦林是一种抗病毒药物，其靶病毒活性范围广。利巴韦林是一种带有修饰碱基(1-β-D-核糖呋喃基-1，2，4-三唑-3-羧酰胺)的鸟苷类似物，已被建议抑制细胞中的酶——肌苷单磷酸脱氢酶，导致三磷酸鸟苷的减少(Damen，M.，和Bresters，D.，在H.W.主编的Curr.Stud.Hematol.Blood Transf.，Darger出版社1998，Basel)。但是，利巴韦林将引起副作用(Christie，J.M.和Chapman，R.W.，HospMed.60，357(1999))。特别是利巴韦林在患者红细胞中积累，可引起溶血性贫血。
AIDS疫苗(Salk氏疫苗)已经被试验，几种蛋白已经被发现可以作为HIV的抑制剂，它们是来自CD8的趋化因子。除了上面的合成的核苷类似物、蛋白和抗体之外，几种植物和来自植物的物质已经被发现具有体外的抗HIV活性。但是，HIV病毒不容易被毁灭，也没有好的机制可以阻止宿主细胞复制病毒。
脱精氨酸的体外使用在过去的30年中，许多研究已经表明细胞外的精氨酸为病毒在体外复制所必需。历史上，这已经通过制作缺陷精氨酸的组织培养基以及将血清透析用做补充培养基(complement)以获得无精氨酸的培养基而完成。使用这种方法达成了脱精氨酸，导致抑制了大量不同的病毒家族的复制，包括腺病毒(Rouse HC，Bonifas VH，Schlesinger RW.1963.腺病毒复制对精氨酸的依赖和通过胸膜肺炎类生物抑制噬菌斑的形成，Virology 20357-365)、疱疹病毒(Tankersley RW Jr.1964.单纯疱疹病毒在人类细胞中的氨基酸需求，J Bacteriol 87608-613)、SV40(Goldblum N，Ravid Z，Becker Y.1968.精氨酸和其它氨基酸的停药对肿瘤和SV40病毒的病毒抗原合成的影响，J Gen Virol 3143-146)、细胞肥大病毒(Minamishima Y，Benyesh-Melnick M.1969.细胞肥大病毒感染中的精氨酸依赖事件，Bacteriol Proc 170334-339)、呼吸道合胞病毒(Levine S，Buthala D，Hamilton RD.1971.呼吸道合胞病毒复制的晚期同步化，Virology 45390-400)、多形瘤病毒(Winters AL，ConsigliRA，Rogers OR 1972.在多形瘤感染的小鼠胚胎细胞中的非功能性精氨酸生物合成途径，Biochem Biophys Res Comm 471045-1051)、新城疫病毒(Illnuma M，Maemo K，Matsumoto T.1973.新城疫病毒装配的研究病毒复制中的精氨酸依赖性步骤，Virology 51205-215)、麻疹病毒(Romano N，Scarlata G.1973.麻疹病毒在HeLa细胞中的氨基酸需求，Arch Gesamte Virus Forschung 43359-366)、流感病毒(Lisok TP，Sominina AA.1977.流感病毒繁殖的改进方法.I.在细胞培养液中增强病毒的繁殖，Acta Virol 21234-240)、以及可能是更相关的痘苗病毒(Holterman OA.1969.在Earle氏L细胞中繁殖痘苗病毒的氨基酸需求，J Gen Virol 4585-591；Singer SH，Fitzgerald EA，Barile MF，Kirschstein RL.1970.支原体对痘苗病毒生长的影响精氨酸的需求，Proc Soc Exp Biol Med 1331439-1442；Obert G，Tripier F，Guir J.1971.痘苗病毒在KB细胞中晚期mRNA转录的精氨酸需求，Biochem BiophysRes Comm 44362-367；Archard LC，Williamson JD.1971.脱精氨酸对痘苗病毒复制的影响，J Gen Virol 12249-258)、以及兔痘病毒(Cooke BC，Williamson JD.1973.在兔痘病毒感染的小鼠肉瘤180细胞中瓜氨酸的利用增强，J Gen Virol 21339-348)。痘苗病毒是包括天花病毒的正痘病毒属的原型成员。病毒复制的抑制在体外被观察到，即使被感染的细胞的蛋白合成和复制不受影响。
降解精氨酸的酶已经知道，包括精氨酸脱亚胺酶(ADI)。但是，与使用这样的外源蛋白进行治疗相关的问题是它的抗原性。Takaku，H，Misawa，S，Hayashi H和Miyazaki K.(1993).来自精氨酸支原体的抗肿瘤酶精氨酸脱亚胺酶的聚乙二醇化学修饰，Jpn.J.Cancer Res.841195-1200)描述了利用聚乙二醇经由氰尿酰氯连接基团对来自精氨酰支原体的精氨酸脱亚胺酶进行化学修饰。但是修饰的蛋白在代谢时是有毒的，因为从氰尿酰氯连接基团中释放了氰化物。
对能够抑制病毒复制而没有与现有工艺相关的问题的方法有需求。本发明的针对于这些目的以及其它的重要目的。
发明简述本发明涉及了调节病毒复制的方法，包括给病人施用与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶。本发明还涉及了同时调节病毒复制和治疗癌症的方法，包括例如肉瘤、肝细胞瘤和黑素瘤。本发明还涉及确定个体对病毒感染可被精氨酸脱疗的方法、改善肝功的方法等。本发明的这些和其它的方面将在下面本发明的详细描述中阐述。
发明详述概述本发明是基于意外的发现，即用聚乙二醇修饰的ADI抑制病毒的复制。ADI可以通过或不通过连接基团与聚乙二醇共价键合，尽管在有些实施方案中使用了连接基团。例如PEG-20000表现出了有用的酶活性水平、抗原性、循环半衰期和效力，并且相对容易制造。
降低胞外精氨酸抑制病毒复制的机理尚不了解。食草类动物例如人和小鼠(与对精氨酸有绝对需求的肉食类动物不同)(综述可以参见Rodgers QR.1994.精氨酸需求在物种中的变化，纪念Willard J.Visek研讨会会议录——从氨到癌症和基因表达，特别出版物86-1994年4月，Illinois大学农业试验站，211 Mumford Hall，Urbana，IL 61801，第9-21页)以及大多数细胞的生长不需要精氨酸，因为它可以使用两种胞内酶(精氨基琥珀酸合成酶和精氨基琥珀酸裂解酶)从瓜氨酸合成。因此如果细胞可以得到瓜氨酸，消除细胞外的精氨酸不会影响细胞内的精氨酸水平。因为病毒的复制是细胞内过程，因此没有预料到细胞外精氨酸的减少能够抑制病毒的复制。
尽管不希望被理论所束缚，降低细胞外的精氨酸可以抑制病毒复制的一种可能的机制是通过抑制一氧化氮的合成。一氧化氮从细胞外的精氨酸合成，因此消除精氨酸的这个库有效地抑制了这种重要代谢物的生产。尽管一氧化氮被认为对某些病毒感染具有保护性(Akaike T，Maeda H.2000.一氧化氮和病毒感染，Immunology 101300-308)，抑制一氧化氮的合成已经显示阻断了淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(Campbell IL，Samimi A，Chiang CS.1994.可诱导的一氧化氮合成酶的表达，小鼠中的神经病理学和临床特征与淋巴细胞脉络丛脑膜炎的关联，J Immunol 1533622-3629)和HIV(Blond D，Raoul H，LeGrand R，Dormont D.2000.在初级人巨噬细胞中一氧化氮的合成增强了人免疫缺陷病毒的复制，J Virol 748904-8912)的复制。一氧化氮合成的抑制也已经显示出保护动物免受流感(Akaike T，Noguchi Y，Ijiri S，SetoguchiK，Suga M，Zheng YM，Dietzschold B，Maeda H.1996.流感病毒诱导的肺炎的发病机理一氧化氮和氧自由基的参与，Proc Natl Acad Sci USA932448-2453；Karupiah G，Chen J-H，Mahalingam S，Nathan CF，MacMicking JD.1998.在一氧化氮合成酶2缺陷的小鼠中的γ-干扰素依赖型的流感A病毒的快速清除以及针对巩固性肺炎的保护，J ExpMed 1881541-1546)、脊髓灰质炎病毒(López-Guerrero JA，Carrasco L.1998.一氧化氮对脊髓灰质炎病毒感染两种人类细胞系的影响，J Virol722538-2540)、狂犬病毒(Ubol S，Sukwattanapan C，Maneerat Y.2001.可诱导的一氧化氮合成酶延迟了狂犬病毒感染的小鼠的死亡，J MedMicrobiol 50238-42)和黄热病病毒(Kreil TR，Eibl MM.1996.一氧化氮和病毒感染在体外针对黄热病病毒没有抗病毒活性，以及在体内感染实验中对发病机理贡献的证据，Virology 219304-306)的致命影响。但是，这些以前使用的一氧化氮合成抑制剂由于它们的毒性(肝功衰竭、抽搐和死亡)在动物和人类中受到限制。因此，尚不清楚从培养基中消除精氨酸(一种明显的消除一氧化氮产生的方法)导致对病毒复制的抑制是否是病毒复制抑制发生时的唯一机制。一氧化氮和病毒感染的这种刺激/抑制的二重性也在其它的病理事件中用一氧化氮观察到了(Colasanti M，Suzuki H.2000.一氧化氮的二重性，Trends Pharm Sci21249-252)。因此一氧化氮的抑制不应该被期望能够取消感染事件所有随之而来的事件(Bogdan C.2001.一氧化氮和免疫系统，NatureImmunology 2907-916)。但是，与过去使用的一氧化氮合成抑制剂不同，ADI-PEG 20在抑制一氧化氮的产生中表现得安全和有效，可以被用来帮助阐述这种生物介质在防止病毒感染中的作用。
定义在本公开中，可以使用下面的缩写PEG，聚乙二醇；ADI，精氨酸脱亚胺酶；SS，琥珀酰亚胺基琥珀酸酯；SSA，琥珀酰亚胺基琥珀酰胺；SPA，琥珀酰亚胺基丙酸酯；和NHS，N-羟基-琥珀酰亚胺。
用聚乙二醇共价修饰的ADI(带有或不带连接基团)在下文中可以被称为“ADI-PEG”或“PEG-ADI”。
“聚乙二醇”或“PEG”是指环氧乙烷和水的缩合聚合物的混合物，以支链和直链的形式，用通式H(OCH2CH2)nOH代表，其中n至少为4。“聚乙二醇”或“PEG”与数字下缀结合使用时是指它的大约平均分子量。例如PEG-5000(PEG5)是指具有平均分子量大约5000的聚乙二醇分子；PEG-12000(PEG12)是指具有平均分子量大约12000的聚乙二醇分子；PEG-20000(PEG20)是指具有平均分子量大约20000的聚乙二醇分子。
本文使用的术语“个体”是指动物，在有些实施方案中是哺乳动物。在有些实施方案中是人。术语“个体”包括从这样的动物中获得的生物样品。
本文使用的术语“病毒疾病”是指由病毒引起的疾病和紊乱。病毒疾病包括但不限于感染动物或哺乳动物包括人的病毒。人类病毒包括来自下列病毒科的病毒痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、乳多空病毒、细小病毒、嗜肝DNA病毒、小核糖核酸病毒、杯状病毒、星状病毒、披膜病毒、黄热病病毒、冠状病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒、棒状病毒、线状病毒、Borna、呼肠弧病毒和逆转录病毒。
可以通过本发明治疗的病毒和相关疾病的例子包括但不限于天花病毒(天花)；疱疹病毒例如单纯疱疹病毒(唇疱疹)、水痘带状疱疹(水痘，带状疱疹)、Epstein-Barr病毒(单核血球增多症，伯基特氏淋巴瘤)、KSHV(卡波济氏肉瘤)和细胞肥大病毒(失明)；腺病毒；肝炎(A/B/C)；脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、风疹、黄热病、西尼罗河病毒、登革热、马脑脊髓炎、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒和烟草花叶病毒。
在有些实施方案中病毒是下列病毒中的一种或多种HIV、流感、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹、乙型肝炎、丙型肝炎和其它的肝炎病毒株、卡波济氏肉瘤、鼻病毒、西尼罗河病毒、天花和牛痘等等。
本文使用的“调节”意味基因表达的增加(刺激)或减小(抑制)。在本发明的有些实施方案中，抑制是基因表达的调节形式。
本文使用的术语“抑制”是指与基线相比在质量或数量上的降低或减少。例如，就本发明而论，病毒复制的抑制是指与基线相比病毒复制的降低。在有些实施方案中，降低了大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约75％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约99％和大约100％。本领域的专业人员可以容易地确定病毒的复制是否已经被抑制，以及抑制到什么程度。
本文使用的术语“大约”是指在数值的+/-20％、+/-15％、+/-10％、或+/-5％范围内。
本文使用的术语“生物相容性”是指一般来说对生物功能没有伤害、不会引起任何程度的不可接受的毒性，包括引起过敏症和疾病状态的材料或化合物。
“循环半衰期”是指在将修饰的ADI注射到病人中后，一直到ADI的量已经被清除到最初血清峰值水平的一半所需要的时间。循环半衰期可以在任何相关的物种中测定，包括人或小鼠。
本文使用的术语“共价键结合”、“键合”和“偶联”可以相互交换使用，是指共价键连接ADI与PEG分子，既可以是直接的也可以通过连接基团。
本文使用的术语“治疗有效量”是指能够有效地产生所需的治疗反应的本发明化合物的量。特定的治疗有效量显然随着一些因素而变化，例如所治疗的具体病症、病人的身体条件、被治疗的哺乳动物或动物的种类、治疗的持续时间、同时进行的治疗(如果有的话)的性质、以及使用的具体剂型和化合物或其衍生物的结构。在改善肝功的情况下，术语“治疗有效量”是指能够改善肝功的与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶的量。在有些实施方案中，治疗有效量能够有效改善个体的Child-Pugh等级或Mayo末期肝病(MELD)评分。在有些实施方案中，治疗有效量能够有效改善肝功，这是基于对肝功指标的比较，包括但不限于胆红素水平、肌酸水平和国际标准率。
本文使用的术语“抑制病毒复制的有效量”是指含有经由连接基团与聚乙二醇共价键合的ADI的化合物，给个体施用后导致病毒复制的水平降低，因而在个体中减少了可检测的病毒，即病毒效价或病毒负荷减少所需要的量。为了确定抑制病毒复制的有效量，可以在用本发明的化合物进行治疗之前确定个体的病毒负荷，然后再进行治疗。病毒复制的水平可以通过任何常规方法进行定量，包括例如在给药化合物之前和之后对样品中的病毒粒子的实际数量进行定量，以及在给药化合物之前和之后对样品中存在的一种或多种病毒抗原的水平进行定量。在有些实施方案中，“抑制病毒复制的有效量”是将血浆精氨酸浓度减少到大约5μM以下所需要的量。测量血浆精氨酸浓度的方法在本技术领域是广为人知的。
分析病毒复制的方法也为人们提供了确定病毒抑制剂的功效的能力，对于本领域的专业技术人员来说是熟悉的。这样的分析方法可以在体内或体外进行。HCV已知在黑猩猩中发生，其中的感染非常类似于在人类中观察到的。在与灵长类非常相近的树鼯属和免疫缺陷的小鼠中也有实验性感染的报道(Xie，Z.C.等，Virology，244，513(1998)；Schinazi，R.F.等，Antiviral Chem.Chemother.10，99，(1999))。
抑制病毒复制对减轻病毒感染的严重性或病毒感染的症状有贡献。
本文使用的术语“预防有效量”是指有效产生所需的预防反应的本发明化合物的量。特定的预防有效量显然随着一些因素而变化，例如具体的病毒、病人的身体条件、被治疗的哺乳动物或动物的种类、治疗的持续时间、同时进行的治疗(如果有的话)的性质、以及使用的具体剂型和化合物或其衍生物的结构。
本文使用的“组合疗法”是指需要治疗的病人施用另一种药物结合PEG-ADI来治疗疾病。组合疗法可以是连续的疗法，个体首先用一种或多种药物治疗，然后再用其它药物治疗，也可以两种或多种药物同时给药。
本文使用的词组“精氨酸脱疗”是指在一种治疗方案中使用的试剂减少、最少化或消除了病人中的精氨酸水平。精氨酸脱疗通常使用ADI来进行。精氨酸脱疗和用在精氨酸脱疗中的试剂在承认的美国专利申请系列号09/023809(1998年2月13日提交)、现在的美国专利6183738(2001年2月6日授权)和在审的美国专利申请系列号09/504280(2000年2月15日提交)中有详细的描述，在此以其全文分别引为参考。
本文使用的术语“怀疑已接触一种或多种病毒的个体”是指个体还没有被诊断为一种或多种病毒阳性，但是由于最近可能将他们与病毒接触的高危活动而可能已接触一种或多种病毒。例如，怀疑已接触HIV的个体是指已经被一根与含有HIV的样品或HIV感染的个体接触过的针刺到的个体。这样的例子包括但不限于实验室或研究样品或来自病人的的血液、精液、身体分泌物等的样品。被怀疑接触HCV的个体包括已经接受了未知质量的血液输血的个体。被输的血液可能还没有被测试，或表明血液不含HCV的测试结果是不可信的或令人怀疑的。在有些实施方案中，怀疑被病毒感染的个体包括通过另一个个体，包括例如通过性交、与另一个个体的体液接触、共用皮下注射针头等，而已接触病毒的个体。病毒所来自的个体可能已经也可能还没有测试病毒的存在和/或不存在。术语“怀疑已接触一种或多种病毒的个体”还包括已经被诊断为一种病毒阳性但同时也被至少一种其他病毒感染的个体。例如通常那些被HIV感染的个体对一种或多种类型的肝炎也是阳性的。这样的个体可以被分类为对一种或多种病毒是“高危的”。
本文使用的术语“选择性抑制”是指选择性地抑制病毒的复制，在有些实施方案中是病毒mRNA水平的CC50/EC50％比率。SI大于10被视为反映了对病毒复制的选择性抑制。
本文使用的术语“样品”是指来自病人的生物材料。本发明分析的样品不限于任何特定的类型。样品以非限制性例子包括单细胞、多细胞、组织、肿瘤、生物流体、生物分子或任何前述物质的上清液或提取物。例子包括用于活检而取出的组织、在切除时取出的组织、血液、尿液、淋巴组织、淋巴液、脑脊液、粘液和粪便样品。所用的样品基于分析方式，检测方法，被分析的肿瘤、组织、细胞或提取物的性质而变化。制备样品的方法在本领域内是广为人知的，可以进行容易的改造以获得与使用的方法相容的样品。
ADI精氨酸脱亚胺酶催化精氨酸转化为瓜氨酸，可以被用来消除精氨酸。在本发明中，精氨酸脱亚胺酶基因可以衍生、克隆或生产自任何来源，包括例如微生物、重组生物技术或它们的任何组合。精氨酸脱亚胺酶可以从支原体(Mycoplasma)属的微生物克隆。在有些实施方案中，精氨酸脱亚胺酶从精氨酸支原体、人形支原体(Mycoplasmahominus)、关节炎支原体(Mycoplasma arthritides)或它们的任何组合克隆。在有些实施方案中，用于本发明的精氨酸脱亚胺酶可以具有SEQ IDNOs1-10和13-21中的一个或多个氨基酸序列。
天然的精氨酸脱亚胺酶可以在微生物中发现，具有抗原性，在病人中可以快速从循环系统中清除。这些问题可以通过用聚乙二醇(PEG)共价修饰精氨酸脱亚胺酶而克服。用聚乙二醇共价修饰的精氨酸脱亚胺酶(带有或不带连接基团)在下文中称为“ADI-PEG”。与天然的精氨酸脱亚胺酶相比，ADI-PEG保留了它的大部分酶活性，具有远远低的抗原性和更长的循环半衰期，在肿瘤的治疗中更为有效。
伴随着从生物体中分离精氨酸脱亚胺酶出现了一些缺点。尽管在体外能够有效杀死肿瘤细胞，从亚臭假单胞菌(Pseudomonas putida)分离的精氨酸脱亚胺酶在体内不能表现出效能，这是因为它在中性pH下酶活力很低，在实验动物中被快速地从循环中清除。来自精氨酸支原体的精氨酸脱亚胺酶(SEQ ID NO5)已经被描述，例如Takaku H，Takase M，Abe S，Hayashi H和Miyazaki K.(1992).从精氨酸支原体纯化的精氨酸脱亚胺酶的体内抗肿瘤活性，Int.J.Cancer 51244-249，以及美国专利No.5474928，其内容在此以其全文引为参考。与这样的异源蛋白在治疗中的使用相关的问题是它的抗原性。Takaku，H，Misawa，S，Hayashi H和Miyazaki K.(1993)，来自精氨酸支原体的抗肿瘤酶精氨酸脱亚胺酶的聚乙二醇化学修饰，Jpn.J.Cancer Res.841195-1200)描述了利用聚乙二醇经由氰尿酰氯连接基团对来自精氨酸支原体的精氨酸脱亚胺酶进行化学修饰。修饰后的蛋白在代谢时是有毒的，因为从氰尿酰氯连接基团中释放了氰化物。
通过重组DNA技术生产精氨酸脱亚胺酶也提供了某些缺点。例如在大肠杆菌(Escherichia coli)中生产的精氨酸脱亚胺酶没有酶活性，因此必须先变性然后适当地复性才使它变得有酶活性。常用的对大肠杆菌生产的精氨酸脱亚胺酶进行复性的方法是分离无活性的酶，在盐酸胍中将其溶解，然后通过快速稀释至低离子强度的缓冲液而使其复性。最后一步需要非常大量的缓冲液，因而使得精氨酸脱亚胺酶的生产既费钱也费时。但是，重组技术也有一些优点，例如更利于发酵的微生物可以用做宿主。此外，这些发酵的宿主一般来说具有更低的致病性，可以获得大量的精氨酸脱亚胺酶。已经显示大肠杆菌可以生产大量的支原体精氨酸脱亚胺酶。
精氨酸脱亚胺酶的化学和遗传修饰可能影响它的生物学活性。例如，已经显示精氨酸脱亚胺酶通常具有抗原性，在病人中被快速地从循环中清除。但是，也已经显示带有聚乙二醇的精氨酸脱亚胺酶制剂减少了抗原性，增加了酶的循环半衰期(Abuchowski等，Cancer Biochem，Biophys.7175-186(1984)；Abuchowski等，J.Biol.Chem.2523582-3586(1977))。特别是精氨酸脱亚胺酶可以被聚乙二醇共价修饰。用聚乙二醇共价修饰的精氨酸脱亚胺酶(带有或不带连接基团)在下文中称为“ADI-PEG”。在美国专利申请系列号09/023809中，Clark描述了用聚乙二醇对来自人形支原体(SEQ ID NO1)、精氨酸支原体(SEQ IDNO5)和关节炎支原体(SEQ ID NO7)的精氨酸脱亚胺酶的改良的修饰，其内容在此以其全文引为参考。与天然的精氨酸脱亚胺酶相比，ADI-PEG保留了它的大部分酶活性，具有远远低的抗原性和更长的循环半衰期，在肿瘤的治疗中更为有效。为了本发明目的，用聚乙二醇对任何精氨酸脱亚胺酶进行的修饰可以被称为PEG化。
已经了解到来自其它生物体的精氨酸脱亚胺酶可能也具有相应于人形支原体的精氨酸脱亚胺酶的112位的PEG化位点。例如来自化脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)的精氨酸脱亚胺酶在104位具有赖氨酸，来自肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的精氨酸脱亚胺酶在106位具有赖氨酸，以及来自Qiardia intestinalis的精氨酸脱亚胺酶在114位具有赖氨酸。此外，来自某些生物体的精氨酸脱亚胺酶可能在相应于人形支原体的精氨酸脱亚胺酶的112位的同样的普遍位置具有赖氨酸。来自这些生物体的精氨酸脱亚胺酶的赖氨酸位置如下所示表1来自不同生物体的精氨酸脱亚胺酶的PEG化位点
现在已经相信将聚乙二醇连接到这些赖氨酸或其组合上可能使酶失活。现在已经相信在这些赖氨酸上的氨基酸取代可能导致蛋白在PEG化后失去少量的酶活性。
在本发明的有些实施方案中提供了对精氨酸脱亚胺酶肽链的某些氨基酸取代。这些氨基酸取代提供了在PEG化后失去少量活性的修饰的精氨酸脱亚胺酶，即经过PEG化后，PEG化后修饰的精氨酸脱亚胺酶中酶活性的减少少于PEG化后未修饰的精氨酸脱亚胺酶中酶活性的减少。通过消除酶的催化区域处或其附近的PEG化位点，可以获得最适的PEG化，不象传统那样损失活性。正如上面讨论的那样，来自某些生物体的精氨酸脱亚胺酶其PEG化位点位于肽链的不同位置。尽管对本发明没有限制，现在已经相信精氨酸脱亚胺酶可能在酶的催化区域处或其附近具有赖氨酸，这些位点的PEG化可以使酶失去活性。通过消除至少一个这样的PEG化位点，可以进行PEG化并保留更多的酶活性。根据本发明，在有些实施方案中赖氨酸被谷氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或其组合取代。在有些实施方案中赖氨酸被谷氨酸取代。在本发明的有些实施方案中，修饰的人形支原体的精氨酸脱亚胺酶在Lys112、Lys374、Lys405、Lys408或其组合或其分组合上有氨基酸取代。在有些实施方案中，修饰的人形支原体的精氨酸脱亚胺酶的氨基酸取代为Lys112到Glu112、Lys374到Glu374、Lys405到Glu405、Lys408到Glu408或它们的组合。在有些实施方案中，修饰的人形支原体的精氨酸脱亚胺酶112位的赖氨酸被谷氨酸取代(SEQ IDNO2)。
因此本发明在精氨酸脱亚胺酶肽链上提供了某些氨基酸取代。这样的氨基酸取代可以消除精氨酸脱亚胺酶肽链中有问题的结构特点。这样的氨基酸取代改进了修饰的精氨酸脱亚胺酶的复性。这些氨基酸取代使得使用较少量的缓冲液快速复性修饰的精氨酸脱亚胺酶成为可能。这些氨基酸取代也可以增加复性的修饰的精氨酸脱亚胺酶的产量。在本发明的有些实施方案中，修饰的精氨酸脱亚胺酶在Pro210有单一的氨基酸取代。正如上面提到的，人形支原体的精氨酸脱亚胺酶在210位有氨基酸脯氨酸。尽管对本发明没有限制，现在已经相信210位氨基酸脯氨酸的存在导致正常肽链中的弯曲或扭折，增加了精氨酸脱亚胺酶复性(即重新折叠)的难度。取代210位的脯氨酸使得使用较少量的缓冲液快速复性修饰的精氨酸脱亚胺酶成为可能。取代210位的脯氨酸也可以增加复性的修饰的精氨酸脱亚胺酶的产量。在有些实施方案中，210位的脯氨酸被丝氨酸取代(SEQ ID NO3)。应理解根据本发明的这个方面，210位的其它取代也可以进行。取代的例子包括Pro210到Thr210、Pro210到Arg210、Pro210到Asn210、Pro210到Gln210或Pro210到Met210。通过消除这些与野生型精氨酸脱亚胺酶210位的氨基酸相关的结构特点，可以使酶获得适当的重新折叠。
在本发明的有些实施方案中，修饰的精氨酸脱亚胺酶具有多个氨基酸取代。修饰的精氨酸脱亚胺酶可以具有至少一个氨基酸取代，它消除了位于或临近酶的催化区域的PEG化位点。修饰的精氨酸脱亚胺酶也可以具有至少一个氨基酸取代，它消除了那些干扰酶的复性的结构特点。因此氨基酸取代为本发明提供了修饰的精氨酸脱亚胺酶。氨基酸取代使得无需损失酶活性而对修饰的精氨酸脱亚胺酶进行PEG化。氨基酸取代使得使用较少量的缓冲液快速复性修饰的精氨酸脱亚胺酶成为可能。氨基酸取代也可以增加复性的修饰的精氨酸脱亚胺酶的产量。在有些实施方案中，修饰的人形支原体的精氨酸脱亚胺酶包括用丝氨酸取代210位的脯氨酸和用谷氨酸取代112位的赖氨酸(SEQID NO4)。但是，正如上面讨论的，应该理解修饰的精氨酸脱亚胺酶可以包括其他取代。在有些实施方案中，可以在野生型精氨酸脱亚胺酶的112和/或210位进行保守的氨基酸取代。
修饰的精氨酸脱亚胺酶在JM101细胞中的表达如前面Takaku等，同上的描述。修饰的精氨酸脱亚胺酶包括112位的谷氨酸和210位的丝氨酸。在有些实施方案中，修饰的人形支原体的精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列是SEQ ID NO4的序列。
在有些实施方案中精氨酸脱亚胺酶是来自人形支原体、肺炎支原体(Mycoplasma pneumonias)、精氨酸支原体、Qiardia intestinalis、产气莢膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、Borrelia burgdorferi、Borrelia afzellii、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、化脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniaes)、清酒乳芽孢杆菌(Lactobacillus sake)或Qiardia intestinalis的精氨酸脱亚胺酶。
在有些实施方案中精氨酸脱亚胺酶是来自人形支原体的精氨酸脱亚胺酶(SEQ ID NO1)。在有些实施方案中，精氨酸脱亚胺酶与SEQ IDNO1相比取代或缺失了至少一个脯氨酸残基。在有些实施方案中，至少一个脯氨酸残基的取代或缺失包括取代或缺失位于或相应于SEQID NO1的210位残基的脯氨酸残基。在一些实施方案中，取代或缺失至少一个脯氨酸残基包括用丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或甲硫氨酸取代或缺失位于或相应于SEQ ID NO1的210位残基的脯氨酸残基。在有些实施方案中，取代或缺失至少一个脯氨酸残基包括用丝氨酸取代位于或相应于SEQ ID NO1的210位残基的脯氨酸残基。
在本发明的有些实施方案中精氨酸脱亚胺酶被修饰，含有至少一个氨基酸取代或缺失，其中修饰的精氨酸脱亚胺酶与SEQ ID NO1相比在催化区域处或其附近的PEG化位点数被减少了。在有些实施方案中，取代或缺失至少一个赖氨酸残基包括取代或缺失位于或相应于SEQ ID NO1的112、374、405或408位残基的至少一个赖氨酸残基。在有些实施方案中，取代或缺失至少一个赖氨酸残基包括用谷氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代位于或相应于SEQID NO1的112、374、405或408位残基的至少一个赖氨酸残基。在有些实施方案中，取代或缺失至少一个赖氨酸残基包括用谷氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代位于或相应于SEQ IDNO1的112位残基的赖氨酸残基。在有些实施方案中，取代或缺失至少一个赖氨酸残基包括用谷氨酸取代位于或相应于SEQ ID NO1的112位残基的赖氨酸残基。在有些实施方案中，修饰的精氨酸脱亚胺酶还包括取代或缺失至少一个脯氨酸残基。
在有些实施方案中，至少一个脯氨酸残基的取代或缺失包括用丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或甲硫氨酸取代位于或相应于SEQ ID NO1的210位残基的脯氨酸残基。
在有些实施方案中，精氨酸脱亚胺酶含有修饰后与SEQ ID NO1相比在催化区域或其附近失去至少一个PEG化位点的精氨酸脱亚胺酶，其中该修饰的精氨酸脱亚胺酶位于或相应于SEQ ID NO1的112、374、405或408位残基含有至少一个氨基酸取代或缺失。在有些实施方案中，取代或缺失至少一个氨基酸包括用谷氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代位于或相应于SEQ ID NO1的112位残基的赖氨酸残基。在有些实施方案中，取代或缺失至少一个氨基酸还包括取代或缺失至少一个脯氨酸残基。在有些实施方案中，取代或缺失至少一个脯氨酸残基包括取代或缺失位于或相应于SEQ IDNO1的210位残基的脯氨酸残基。在有些实施方案中，至少一个脯氨酸残基的取代或缺失包括用丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或甲硫氨酸取代位于或相应于SEQ ID NO1的210位残基的脯氨酸残基。
在有些实施方案中，来自人形支原体的精氨酸脱亚胺酶含有用谷氨酸取代SEQ ID NO1的112位赖氨酸残基(SEQ ID NO2)。在有些实施方案中，来自人形支原体的精氨酸脱亚胺酶含有用丝氨酸取代SEQ ID NO1的210位脯氨酸残基(SEQ ID NO3)。在有些实施方案中，来自人形支原体的精氨酸脱亚胺酶含有用谷氨酸取代SEQ ID NO1的112位赖氨酸残基和用丝氨酸取代SEQ ID NO1的210位脯氨酸残基(SEQ ID NO4)。在有些实施方案中，来自精氨酸支原体的精氨酸脱亚胺酶含有用谷氨酸取代SEQ ID NO5的111位赖氨酸残基(SEQ IDNO6)。在有些实施方案中，来自关节炎支原体的精氨酸脱亚胺酶含有用谷氨酸取代SEQ ID NO7的111位和112位赖氨酸残基(SEQ IDNO8)。在有些实施方案中，来自关节炎支原体的精氨酸脱亚胺酶含有用谷氨酸取代SEQ ID NO7的111位赖氨酸残基(SEQ ID NO9)。在有些实施方案中，来自关节炎支原体的精氨酸脱亚胺酶含有用谷氨酸取代SEQ ID NO7的112位赖氨酸残基(SEQ ID NO10)。
这样的修饰和/或取代以及核苷酸和多肽序列被描述在美国专利No.6183738(2001年2月6日授权)和共同未决的美国专利申请系列号09/564559(2000年5月4日提交)中，在此以其全文分别引为参考。
聚乙二醇有许多聚乙二醇可以获得，它们在分子量和连接基团上有所不同。这些PEG对蛋白的抗原性、免疫原性和循环半衰期的影响可发生变化(Zalipsky，S.和Lee，C.聚乙二醇化学生物技术和生物医学应用，第347-370页，Plenum出版社，纽约，1992年；Monfardini，C.等，Bioconjugate Chem，6，62-69，1995；Delgado C，Francis GE，Fisher D，PEG结合的蛋白的使用和性质，Crit.Rev.Ther，Drug Carrier Sys.，9249-304，1992)。
在本发明的有些实施方案中，每个聚乙二醇分子的平均分子量为大约10000到大约50000；从大约12000到大约40000，从大约15000到大约30000；以及大约20000。一般来说，分子量30000或以上的聚乙二醇难以溶解，制成的产品的产量大大降低。
聚乙二醇可以是支链的也可以是直链的。在有些实施方案中聚乙二醇是直链。一般来说增加聚乙二醇的分子量倾向于减少ADI的免疫原性。具有本发明所描述的分子量的聚乙二醇可以被用来结合ADI以及生物相容的连接基团，以治疗病毒疾病。
PEG化ADI可以经由生物相容的连接基团与PEG共价键合，使用的方法在本技术领域是公知的，例如Park等，Anticancer Res.，1373-376(1981)；Zalipsky，S.和Lee，C.聚乙二醇化学生物技术和生物医学应用，J.M.Harris主编，Plenum出版社，纽约，第21章，1992年，其内容在此以其全文引为参考。
用来共价键合PEG和ADI的连接基团可以是任何相容的连接基团。在有些实施方案中，连接基团是生物相容的连接基团。正如上面所讨论的，“生物相容”表明化合物或基团是无毒性的，可以在体外或体内使用而不会引起损伤、不适、疾病或死亡。PEG可以经由例如醚键、酯键、硫氢键或酰胺键与连接基团键合。合适的连接基团包括例如酯基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸基、羰基、羟基、糖、琥珀酰亚胺基(包括例如琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺基羧基甲酸酯(SCM)、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))、环氧基、氧基羰基咪唑基(包括例如羰基二咪唑(CDI))、硝基苯基(包括例如硝基苯基碳酸酯(NPC)或三氯苯基碳酸酯(TPC))、trysylate基、醛基、异氰酸基、乙烯砜基、酪氨酸基、半胱氨酸基、组氨酸基或伯胺。在有些实施方案中，连接基团是酯基或琥珀酰亚胺基。在有些实施方案中，连接基团是SS、SPA、SCM、SSA或NHS。
在本发明中，具体的连接基团不表现出影响PEG-ADI的循环半衰期或其酶的比活性。但是，如果使用了连接基团，在有些实施方案中重要的是使用生物相容的连接基团。与蛋白相连的PEG既可以是在SS-PEG、SPA-PEG和SC-PEG时的单链，也可以是在PEG2-NHS时的支链PEG。
此外，ADI可以通过氨基、硫氢基、羟基或羰基直接与PEG偶联(即不带有连接基团)。在有些实施方案中，PEG偶联到ADI的赖氨酸残基上。
ADI-PEGADI上连接PEG增加了ADI的循环半衰期。ADI上的PEG分子数量表现出与酶的循环半衰期相关，而保留的酶活力的量表现出与所用的PEG的平均分子量相关。增加ADI上的PEG单位的数量降低了酶的酶活。此外，已经知道有些PEG制剂难以生产，生成的产物产量相对低。因此，为了获得有效的产物，在循环半衰期、抗原性、生产效率和酶活之间需要一个平衡。
一般来说，PEG被连接到ADI的伯胺上。聚乙二醇在精氨酸脱亚胺酶上结合位点的选择由蛋白活性结构域中每个位点的功能所决定，正如专业技术人员公知的。PEG可以被连接到精氨酸脱亚胺酶的一级胺上而基本上不损失酶活。例如，从精氨酸支原体、关节炎支原体和人形支原体克隆的ADI具有大约17个可以被这个步骤修饰的赖氨酸。换句话说，这17个赖氨酸都是ADI经由生物相容的连接基团，例如SS、SPA、SCM、SSA和/或NHS与PEG连接的可能位点。PEG也可以连接到ADI上的其它位点，这对于本领域的专业技术人员来说根据本发明公开内容是显然的。
ADI上可以共价键合从1到大约30个PEG分子。在有些实施方案中，ADI用大约7到大约15个PEG分子、从大约9到大约12个PEG分子来修饰。换句话说，精氨酸脱亚胺酶中大约30％到大约70％的一级氨基被PEG修饰，精氨酸脱亚胺酶中大约40％到大约60％、大约45％到大约55％以及大约50％的一级氨基被PEG修饰。在有些实施方案中，当PEG与ADI的末端共价键合时，只有一个PEG分子被利用。增加ADI上PEG单位的数量增加了酶的循环半衰期。但是增加ADI上PEG单位的数量降低了酶的比活性。因此，在有些实施方案中需要在这二者之间达到平衡，这对于本领域的专业技术人员来说根据本发明公开内容是显然的。
在本发明中，在有些实施方案中连接基团经由马来酰亚胺基与精氨酸脱亚胺酶的伯胺结合。一旦与精氨酸脱亚胺酶偶联，SS-PEG在PEG后有酯键，可以赋予这个位点对血清酯酶的敏感性，可以在体内从ADI上释放出PEG。SPA-PEG和PEG2-NHS没有酯键，因此它们对血清酯酶不敏感。
用于本发明的某些连接基团的结构式如下。

治疗方法在一些实施方案中，本发明提供抑制个体中病毒复制的方法，包括给所述个体施用治疗或预防性有效量的包含经由连接基团与聚乙二醇共价键合的ADI的化合物，其中各个聚乙二醇分子的平均分子量为大约10,000到大约30,000。在一些实施方案中，ADI修饰有聚乙二醇分子，各个分子的平均分子量为大约20,000。在一些实施方案中，连接基团选自琥珀酰亚胺基，酰胺基，酰亚胺基，氨基甲酸酯基，酯基，环氧基，羧基，羟基，糖，酪氨酸基，半胱氨酸基，组氨酸基及其组合。在一些实施方案中，连接基团为琥珀酰亚胺基琥珀酸酯。在一些实施方案中，有大约7到大约15个聚乙二醇分子键合于精氨酸脱亚胺酶。在一些实施方案中，有大约9到大约12个聚乙二醇分子键合于精氨酸脱亚胺酶。在一些实施方案中，精氨酸脱亚胺酶衍生自支原体属的微生物。在一些实施方案中，精氨酸脱亚胺酶衍生自精氨酸支原体，人形支原体，关节炎支原体及其组合。在一些实施方案中，病毒为HCV。在一些实施方案中，所述方法进一步包括下列步骤在给药精氨酸脱亚胺酶之前，同时或之后给药治疗有效量的其他抗病毒剂。
本发明化合物之一的治疗有效量为有效抑制病毒复制的量。一般而言，治疗起始时用小剂量，随后以小的增量增加，直到在环境下实现最佳效果。通常，本发明化合物的治疗剂量为大约1到大约200mg/kg，从每周两次到每两周大约一次。例如，剂量可为大约1mg/kg，每周一次，以2ml静脉内注射，到大约20mg/kg，每3天一次。化合物以一个剂量在全疗程中连续或间歇给药。ADI-PEG的给药可每天几次，每天一次，每周一次或每两周一次。
在一些实施方案中，ADI-PEG给药的周剂量为至少大约40IU/m2，至少大约80IU/m2，至少大约160IU/m2，或至少大约200IU/m2。在一些实施方案中，给药的剂量使精氨酸的血浆水平降低至小于大约10μM，5μM，1μM，或100nM。在一些实施方案中，ADI-PEG20以周剂量为大约160IU/m2给药，导致患者血浆水平小于大约5μM。
本发明提供抑制一种或多种病毒在个体中复制的方法，包括给所述个体施用治疗或预防有效量的与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶。在一些实施方案中，病毒为人类病毒。在一些实施方案中，病毒为HCV。在一些实施方案中，个体感染有两种或多种不同的病毒。在一些实施方案中，两种或多种病毒为HIV和HCV。在一些实施方案中，在给药时或给药之前感染病毒的存在和/或身份是未知的。在一些实施方案中，所述方法进一步包括下列步骤在给药精氨酸脱亚胺酶之前，同时或之后，给药治疗有效量的其他抗病毒剂。
本发明还提供治疗怀疑已接触一种或多种病毒的个体的方法，包括给所述个体施用治疗或预防有效量的与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶。如上所述，将一些未被诊断为感染有一种或多种病毒的个体置于可能会接触病毒的环境中。如上所述，怀疑接触一种或多种病毒的个体的治疗也包括给药其他治疗剂。预防性疗程可结合周期性监控病毒感染的指示进行。在一些实施方案中，本发明治疗开始之后，个体对一种或多种病毒被诊断为阳性。
在一些实施方案中，本发明提供抑制病毒在个体中复制的方法，所述个体处于一种或多种病毒的风险之中。所述方法包括给所述个体施用一定量的含有与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶的组合物，以有效抑制病毒复制。
在一些实施方案中，本发明提供抑制病毒在个体中复制的方法，所述个体已被鉴定为患有病毒感染。所述方法包括给所述个体施用一定量的含有与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶的组合物，以有效抑制病毒复制。
在一些实施方案中，含有与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶的组合物在浓度小于0.1mM时，就能使得在测量病毒复制的体外分析中50％以上细胞的病毒复制有效抑制至少50％。在一些实施方案中，含有与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶的组合物在浓度小于0.05mM时，就能使得在测量病毒复制的体外分析中50％以上细胞的病毒复制有效抑制至少50％。在一些实施方案中，含有与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶的组合物在浓度小于0.01mM时，就能使得在测量病毒复制的体外分析中50％以上细胞的病毒复制有效抑制至少50％。
在一些实施方案中，本发明提供同时治疗肿瘤和抑制一种或多种病毒在个体中复制的方法。所述方法包括给所述个体给药治疗或预防有效量的经由连接基团与聚乙二醇共价键合的精氨酸脱亚胺酶。在一些实施方案中，肿瘤选自黑素瘤，肉瘤和肝癌。在一些实施方案中，肿瘤为肝癌，而病毒为HCV。在一些实施方案中，肿瘤的存在和/或身份在治疗时是未知的。在一些实施方案中，病毒的存在和/或身份在治疗时是未知的。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在给药精氨酸脱亚胺酶之前，同时或之后，给药治疗有效量的其他抗病毒剂。
在一些实施方案中，本发明提供调节个体中一氧化氮水平的方法，包括给所述个体给药治疗或预防有效量的与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶。在一些实施方案中，调节是抑制一氧化氮水平。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在给药精氨酸脱亚胺酶之前，同时或之后，给药治疗或预防有效量的其他抗病毒剂。在一些实施方案中，个体已被鉴定为感染有一种或多种病毒。
在一些实施方案中，本发明提供确定病毒复制对调节精氨酸水平的灵敏度的方法，包括将样品与包含键合于聚乙二醇的精氨酸脱亚胺酶的组合物接触，以及测量病毒RNA的水平或病毒RNA的产物。测量病毒RNA的水平或其产物的方法对本领域技术人员而言是熟知的。
在一些实施方案中，本发明提供选择性抑制病毒在感染有一种或多种病毒的个体中复制的方法。所述方法包括给所述个体给药治疗或预防有效量的包含与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶的组合物。在一些实施方案中，病毒为HCV。在一些实施方案中，SI大于10，大于15，大于20，或大于25。
在一些实施方案中，本发明提供改善个体肝功的方法，包括给所述个体给药治疗或预防有效量的包含与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶的组合物。
本领域技术人员能够容易地确定肝功的质量。在一些实施方案中，一种或多种指标的相对数量在无症患者和患有肝病或紊乱的病人之间进行比较。
在一些实施方案中，肝功的评价方法采用Child-Pugh等级或mayo末期肝病(MELD)评分。肝功分级的Child-Pugh等级利用若干因素来预测肝病的死亡率。在Child-Pugh等级中涉及的因素包括胆红素水平，肌酸水平，国际标准率(INR，也称为凝血酶原时间(血液凝结能力的量度))，腹水的存在，以及脑病的等级。级别分配给肝功异常增加的水平；级别“A”反映Child-Pugh评分为5-6点，并且显示肝异常的最低水平。级别“B”反映Child-Pugh评分为7-9点，并且显示肝异常的中间水平。级别“C”反映Child-Pugh评分为10-15点，并且显示肝异常的最高水平。肝功分级的MELD评分涉及胆红素水平，肌酸水平以及国际标准化比。
在一些实施方法中，在给药与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶之前，个体肝功为Child-Pugh水平A，水平B，或水平C。
在一些实施方案中，本发明提供鉴定个体可被精氨酸脱疗的方法，所述个体已知患有一种或多种病毒感染。所述方法包括从个体中获得病毒样品，以及在适于病毒复制的条件下，比较病毒在存在和缺乏包含与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶的组合物的样品中的复制。在一些实施方案中，在与ADI-PEG接触的样品中的病毒复制抑制至少40％，至少50％，或至少80％，是个体作为精氨酸脱疗的候选对象的指示；而通过ADI-PEG抑制病毒复制小于40％，小于30％，或小于20％，是个体不作为精氨酸脱疗的候选对象的指示。
在一些实施方案中，本发明提供治疗个体中一种或多种病毒感染的方法。所述方法包括确定个体是否是如上所述的精氨酸脱疗的候选对象，以及如果个体是精氨酸脱疗的候选对象，则用精氨酸脱疗治疗个体，而如果个体不是精氨酸脱疗的候选对象，则用常规抗病毒处理治疗个体。
确定给药的最有效途径和剂量的方法是本领域技术人员熟知的。在一些实施方案中，采用每周两次服药，持续至少几周。通常，抗病毒化合物会给药延长的时间段，并且可给药个体一生。确定给药的最有效途径和剂量的方法是本领域技术人员熟知的。可实施单次或多次给药，一个剂量水平和模式由医生选择。
当然，给药剂量将随公知因素而变，这些因素诸如，特定药剂的药效特征及其给药方式和途径；个体的年龄，健康状况和/或体重；症状的性质和程度；同时治疗的种类；治疗频率；个体所显现的症状，以及所需的效果。
在大多数病毒感染的情形下，对抗病毒治疗反应的症状或标准居于病毒复制水平的中心。用于病毒循环其中的RNA水平和变化的测试是标准的，并可应用于细胞和动物，包括人。在人类患者中，对肝活性进行测试。一个示例性测试为ALT(血清谷丙转氨酶)测试。ALT主要在肝脏中发现，但在心脏和其他组织中也存在，只是含量较小，其在诊断肝功中是有用的。成人正常范围为0到大约48U/L，成人最适读数为大约24U/L。这些标准中的一种或多种改善预示着有效量或治疗。
化合物可与合适的药物稀释剂，填充剂，赋形剂或载体(在此统称为可药用载体)混合给药，可药用载体的选择根据给药所需的形式以及与常规药物实践相一致。例如，在一些实施方案中，ADI-PEG可与磷酸盐缓冲液或其他本领域技术人员熟知的任何适当溶液混合后再注射。如果需要，ADI-PEG剂型可以固体(冷干物)或液体给药。
本发明的组合物根据待用给药方式加以配制。在药物组合物为可注射的情形下，它们是无菌，无热原和无颗粒的。在一些实施方案中，组合物为等渗制剂。在一些实施方案中，等渗性添加剂包括氯化钠，葡萄糖，甘露醇，山梨醇和乳糖中的一种或多种。在一些实施方案中，组合物以诸如磷酸盐缓冲液的等渗溶液提供。组合物的稳定剂在一些实施方案中包括明胶和白蛋白。
本发明还提供治疗个体广谱遗传上多种多样的病毒的方法，包括该所述个体施用治疗有效量的包含经由连接基团与聚乙二醇共价键合的ADI的化合物。
组合疗法本发明的化合物可另与其他抗病毒化合物组合提供组合疗法。任何公知的抗病毒剂可与本发明的组合物组合，只要该组合不会消除化合物ADI-PEG的抗病毒活性。在HIV情形下，ADI-PEG与AZT，TC-3或蛋白酶抑制剂的组合疗法比任意药剂单个都更有效。在肝炎情形下，ADI-PEG与阿昔洛韦(cyclovir)，泛昔洛韦(famciclovir)或伐西洛韦(valacyclovir)，利巴韦林(ribavirin)，干扰素或β球蛋白中的一种或多种组合作为组合疗法给药。对疱疹而言，重组α干扰素可与ADI-PEG用作组合疗法。
适用于组合疗法的其他抗病毒剂对本领域技术人员是公知的，并且包括但不限于下列抗病毒剂中的一种或多种AZT(齐多夫定(zidovudine)，Retrovir)，ddI(去羟肌苷(didanosine)，Videx)，3TC(拉米夫定(lamivudine)，Epivir)，d4T(司他夫定(stavudine)，Zerit)，阿巴卡韦(abacavir)(Ziagen)，ddC(扎西他滨(zalcitabine)，Hivid)，内维拉平(nevirapine)(Viramune)，地拉韦定(Delavirdine)(Rescriptor)，茚地那韦(indinavir)(Crixivan)，利托那韦(ritonavir)(Norvir)，奈非那韦(nelfinavir)(Viracept)，沙奎那维(saquinavir)，洛匹那韦/利托那韦(lopinavir/ritonavir)(Kaletra)，安普那韦(Amprenavir)(Agenerase)，阿扎那韦(Atazanavir)，替拉那韦(tipranavir)，融合抑制剂T-20，白介素-2，羟基脲，AR177(Zintevir)，福米韦生(fomivirsen)钠(Vitravene)，GEM132，GEM 91，GEM 92，AMD 3100，正二十二烷醇(1-二十二烷醇)，PR02000，T-1249，T-20，阿比朵尔(arbidol)，SP-303(Virend)，金丝桃素(hypericin)(VIMRxyn)，MDL 28574，SC-48334，ADA，咪喹漠特(imiquimod)(Aldera)，ISIS 5320，瑞西喹漠(resiquimod)，阿德福韦(adefovir dipivoxil)(Preveon)，DAPD，恩曲他滨(emtricitabine)(Coviracil)，恩替卡韦(entecavir)，拉米夫定(lamivudine)(Zeffix，Epivir-HBV，Heptovir，Heptodin)，金刚烷胺(amantadine)(Symmetrel)，奥司他韦(oseltamivir)(Tamiflu)，吡罗达韦(pirodavir)，普来可那利(pleconaril)(VP-63843)，利巴韦林(ribavirin)(Virazid/Virazide/Virazole)，金刚乙胺(rimantadine)(Flumadine)，WIN 54954，扎纳米韦(zanamivir)(Relenza)，膦甲酸(foscarnet)(Foscavir)，maribavir，ABT-378，阿替韦啶(atevirdinemesylate)，绵毛胡桐内酯A(calanolide A)，capravirine，依发韦仑(efavirenz)(Sustiva)，emivirine(Coactinon)，GW420 867X(aka HBY1293)，HBY 097，L-697，66I，洛韦胺(loviride)，MIV-150，PETT-5，R165335-TMC125，他韦林(talviraline)，tivirapine，曲韦定(trovirdine)，阿昔洛韦(acyclovir)(Zovirax)，嗅呋啶(brivudin)(Helpin，Zostrex)，西多福韦(cidofovir)(Vistide(静脉内))，Forvade(局部)，环HPMPC，泛昔洛韦(famciclovir)(Famvir)，非西他滨(fiacitabine)，非阿尿苷(fialuridine)，更昔洛韦(ganciclovir)(Cymvene/Cytovene)，GW-273175X，碘脱氧尿苷(idoxuridine)(Herpid，Kerecid/Herplex Liquifilm，Idoxene，Virudox，Iduridin，Stoxil)，罗布卡韦(lobucavir)，奈替夫定(netivudine)(Zonavir)，喷昔洛韦(penciclovir)(Vectavir/Denavir)，索立夫定(sorivudine)(Usevir)，三氟尿苷(trifluridine)(Viroptic)，伐西洛韦(valaciclovir)(Valtrex；Zelitrex)，valomaciclovir硬脂酸盐(MIV-606)，阿糖腺苷(vidarabine)(Vira-A)，935U83，阿巴卡韦(abacavir)(Ziagen/Trizivir)，阿的福韦(adefovir)，adefovirdipivoxil(Preveon)，alovudine，AzdU，CS-92，DAPD，去羟肌苷(didanosine)(Videx)，dOTC，恩曲他滨(emtricitabine)(Coviracil)，fozivudine tidoxil，拉米夫定(lamivudine)(Epivir/Combivir/Trizivir)，罗布卡韦(lobucavir)，lodenosine，司他夫定(stavudine)(Zerit)，替诺福韦(tenofovir)(Viread)，tenofovir disoproxil富马酸盐，扎西他滨(zalcitabine)(Hivid)，齐多夫定(zidovudine)(Retrovir)，A-77003，AG7088，安普那韦(amprenavir)(Agenerase)，BMS-232632，地拉韦啶(delavirdine)(Rescriptor)，DMP-323，DMP-450，GW 433 908，茚地那韦(indinavir)(Crixivan)，KNI-272，lasinavir，洛匹那韦(lopinavir)(Kaletra)，Mozenavir，奈非那韦(nelfinavir)(Viracept)，PD178390，利托那韦(ritorlarir)(Norrir)，RPI312，沙奎那维(Saquinavir)(Invirase/Fortovase)，SC-52151，SDZ PRI 053，替普那韦(tipranavir)，U-103017，U-96988，羟基脲(Hydrea)，AGI549，膦甲酸(foscarnet)(Foscavir)，LiGLA，阿昔洛韦-伐西洛韦(Aciclovir-Valaciclovir)，泛昔洛韦(Famciclovir)，碘脱氧尿苷(Idoxuridine)，更昔洛韦(Ganciclovir)，膦甲酸(Foscarnet)，西多福韦(Cidofovir)，和阿德福韦(Adefovir)，恩福韦地(enfuvirtide)，万赛维(Valcyte)，克力夫定(clevudine)，胸腺法新(thymalfasin)，IL-12等。
组合疗法可以顺序进行，即先用一种药剂治疗，再用另一种药剂治疗，或者用两种药剂同时治疗。顺序疗法在第一种疗法完成后但在第二种疗法开始前的合理时间内。用两种药剂同时治疗可以每天相同的剂量或单独的剂量进行。例如，在一些实施方案中，第1天用一种药剂治疗，而在第2天用另一种药剂治疗。实际方案取决于在治疗的疾病，感染的严重性和对治疗的反应。
本发明化合物的体内给药途径将随所需用途而变。正如本领域技术人员所认识到的，给药本发明的ADI-PEG组合物，例如对粘膜组织可通过吸入或栓剂，而对阴道，直肠，尿道，口腔和舌下组织可通过灌洗进行，以及口服，局部，鼻内，腹膜内，肠胃外，静脉内，淋巴内，肿瘤内，肌内，间隙内，动脉内，皮下，眼内，滑液内，经上皮和经皮方式。本发明化合物的口服给药剂型可以为片剂，胶囊，丸药，粉剂，颗粒，酏剂，酊剂，悬浮液，糖浆和乳剂。本发明化合物还可在静脉内(团注或灌注)，腹膜内，皮下，或肌内形式给药，全部采用药物领域普通技术人员所熟知的剂型。
实施例本发明进一步在下列实施例中阐述，所述实施例为说明之目的，不应解释成限制本发明的范围。
实施例1重组ADI的生产精氨酸支原体(ATCC 23243)，人形支原体(ATCC 23114)和关节炎支原体(ATCC 23192)的培养物获自美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，Rockville，Maryland)。
将精氨酸脱亚胺酶克隆自精氨酸支原体，人形支原体和关节炎支原体，并且表达在大肠杆菌(E.coli)中，如S.Misawa等，J.Biotechnology，36145-155(1994)所述，其内容在此以其全文引作参考。通过本领域技术人员公知的方法，各种蛋白的酶比活，Km，Vmax和最适pH的特征揭示出它们在生化上彼此是不可分的。最适pH采用柠檬酸缓冲液(pH5-6.5)，磷酸缓冲液(pH6.5-7.5)和硼酸缓冲液(pH7.5-8.5)确定。Km和Vmax的确定方法是将酶与各种不同浓度的精氨酸温育，并且定量测定瓜氨酸的产生。各种酶的Km为大约0.02-0.06μM，而Vmax为大约15-20μmol/min/mg，所述值皆在彼此误差范围内。
通过聚合酶链式反应，利用下列来自公布的精氨酸支原体(M.Arginini)序列的引物对，对精氨酸脱亚胺酶基因进行扩增，所述M.arginini序列，例如由T.Ohno等，Infect.Immun.，583788-3795(1990)所述，其内容在此以其全文引作参考5’-GCAATCGATGTGTATTTGACAGT-3’(SEQ ID NO11)5’-TGAGGATCCTTACTACCACTTAACATCTTTACG-3’(SEQ IDNO12)。
将聚合酶链式反应产物以BamH I-Hind III片段克隆到表达质粒pQE16中。DNA序列分析显示该片段具有与Ohno等，Infect.Immun.，同上所述的精氨酸脱亚胺酶基因相同的序列。将在支原体中编码色氨酸的ADI基因的5个TGA密码子通过寡核苷酸导向的突变在基因表达于大肠杆菌之前改变为TGG密码子，正如，例如，由J.R.Sayers等，Biotechniques，13592-596(1992)所教导的。重组ADI以包含体表达的水平为总细胞蛋白的10％。
上述3种支原体的各个蛋白具有约95％的同源性，并且容易地通过柱层析纯化。近1.2g的纯蛋白可分离自1升的发酵液。重组ADI在37℃下稳定大约2周，以及在4℃下存储时稳定至少8个月。正如由本领域技术人员公知的方法所确定的，蛋白对精氨酸具有高亲和性(0.04μM)，而最适生理pH为大约7.2到大约7.4。
实施例2重组ADI的复性和纯化将ADI蛋白复性，方法与Misawa等，J.Biotechnology，36145-155(1994)中所述稍有区别，其内容在此以其全文引作参考。使100g的细胞浆重悬在800ml的10mM K2PO4 pH7.0，1mM EDTA(缓冲液1)中，在微型流化仪(microfluidizer)(Microfluidics Corporation，Newton，MA)中通过两次将细胞破碎。加入Triton X-100至终浓度为4％(v/v)。匀浆液在4℃下搅拌30分钟，然后以13,000g离心30min。收集沉淀，并重悬于1升含有0.5％Triton X-100的缓冲液1中。利用100kD截留级的中空纤维滤筒(Microgon Inc.，Laguna Hills，CA)，将溶液对5倍体积的变性缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.5，10mM DTT)透析。加入盐酸胍至终浓度6M，并在4℃下搅拌溶液15min。该溶液稀释100倍至重新折叠缓冲液1(10mm K2PO4，pH7.0)中，并在15℃下搅拌48小时，颗粒通过15,000×g离心去除。
所得上清液在预先平衡在重新折叠缓冲液中的Q Sepharose FastFlow(Pharmacia Inc.，Piscataway，NJ)柱上浓缩。利用含有0.2M NaCl的重新折叠缓冲液稀释ADI。纯化工艺生成ADI蛋白，经SDS-PAGE分析评估，其纯度大于95％。8g纯复性ADI蛋白产自1kg的细胞浆，其对应于200mg纯化的ADI/升发酵液。
ADI活性的确定方法与Oginsky等，Meth.Enzymol.，(1957)3639-642所述的方法稍有修饰。把10μl样品的0.1M Na2PO4，pH7.0(BUN分析缓冲液)置于96孔微量滴定板上，加入40μl的0.5mM精氨酸的BUN分析缓冲液，覆盖平板并在37℃温育15min。加入20μl的完全BUN试剂(Sigma Diagnostics)，并在100℃下温育平板10分钟。然后，冷却平板至22C，通过微型滴定板读数仪(MolecularDevices，Inc)在490nm处分析。一个IU为每分钟将1μmol的L-精氨酸转化成L-瓜氨酸的酶量。蛋白浓度的确定利用Pierce考马斯亮兰蛋白分析试剂(Pierce Co.，Rockford，IL)，以牛血清白蛋白作为标准。纯化的ADI制剂的酶活为17-25IU/mg。
实施例3PEG与ADI的连接在100mM磷酸盐缓冲液，pH7.4中，将PEG共价键合于ADI。简而言之，AID的磷酸盐缓冲液与100M过量的PEG混合。反应在室温下搅拌1小时，然后充分透析混合物以去除未掺入的PEG。
进行第一实验，其中对PEG-ADI组合物中所用的连接基团的效果进行评价。把PEG 10,000和ADI经由下列4种不同的连接基团共价键合酯基或马来酰亚胺基，包括SS，SSA，SPA和SSPA，其中各个PEG分子的平均分子量为5,000，10,000，12,000，20,000，30,000和40,000；环氧基，PEG-环氧基，其中各个PEG分子的平均分子量为5,000；以及支化PEG基团，PEG2-NHS，其中各个PEG分子的平均分子量为10,000，20,000和40,000。
将5IU的所得组合物注射到小鼠(每组5只小鼠)中。为了确定精氨酸的血清水平，从小鼠后眼窝丛中放血(100μl)。采集后立即加入等体积的50％(w/v)的三氯乙酸。离心(13,000×g，30min)去除沉淀，取出上清液，在-70℃下冷冻存储。然后，利用Beckman Instruments的全自动氨基酸分析仪和试剂，遵从厂商提供的流程，对样品进行分析。该方法对瓜氨酸的灵敏度极限约为2-6μM，测量的再现性在约8％以内。血清精氨酸的量由氨基酸分析确定。共价键合PEG和ADI的连接基团对ADI减少体内血清精氨酸的能力没有一点影响。
进行第二实验，其中评估了连接基团和PEG的分子量对体内血清瓜氨酸水平的影响。小鼠(每组5只)以5.0IU的量施用各种不同的ADI和PEG-ADI的组合物。为了确定瓜氨酸的血清水平，从小鼠后眼窝丛中放血(100μl)。采集后立即加入等体积的50％(w/v)的三氯乙酸。离心(13,000×g，30min)去除沉淀，取出上清液，在-70℃下冷冻存储。然后，利用Beckman Instruments的全自动氨基酸分析仪和试剂，遵从厂商提供的流程，对样品进行分析。该方法对瓜氨酸的灵敏度极限约为2-6μM，测量的再现性在约8％以内。确定瓜氨酸的量，估计曲线下面积，并且表示成μmol天。
结果表明，PEG的分子量决定了PEG-ADI组合物的有效性。PEG-ADI组合物的有效性似乎未基于PEG与ADI连接的方法或途径。
结果显示，PEG的最适分子量为大约20,000。尽管在药效方面，PEG30,000似乎优于PEG20,000，但是PEG30,000可溶性较差，这使得它难以发挥作用。基于酶活回收的产率对PEG5,000和PEG12,000而言，为大约90％；对于PEG20,000而言为大约85％，以及对于PEG30,000而言为大约40％。所以，在一些实施方案中，PEG20,000似乎是产率和循环半衰期之间的良好平衡，正如由瓜氨酸的产生所确定。
在第三实验中，利用ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000，确定了血清精氨酸消耗和瓜氨酸产生的剂量反应。小鼠(每组5只小鼠)单注射施用0.05IU，0.5IU或5.0IU的ADI-SS-PEG5,000或ADI-SS-PEG20,000。在指示时间，如上所述，采集血清，进行氨基酸分析以定量测定血清精氨酸和血清瓜氨酸。两种剂型均诱导了剂量依赖的血清精氨酸减少和血清瓜氨酸升高。然而，通过ADI-SS-PEG20,000诱导的效果比通过ADI-SS-PEG5,000诱导的效果更显著和具有更长的持续时间。
实施例4循环半衰期用单剂量5.0IU的天然精氨酸脱亚胺酶或修饰有聚乙二醇的精氨酸脱亚胺酶的各种不同的制剂静脉内注射Balb C小鼠(每组5只小鼠)。为了确定精氨酸和瓜氨酸的血清水平，从小鼠后眼窝丛中放血(100μl)。采集后立即加入等体积的50％(w/v)的三氯乙酸。离心(13,000×g，30min)去除沉淀，取出上清液，在-70℃下冷冻存储。然后，利用BeckmanInstruments的全自动氨基酸分析仪和试剂，遵从厂商提供的流程，对样品进行分析。该方法对精氨酸的灵敏度极限约为6pM，测量的再现性在约8％以内。
从单剂量给药天然ADI或ADI-SS-PEG中检测剂量依赖的血清精氨酸水平的减少和血清瓜氨酸水平的升高。然而，血清精氨酸减少和血清瓜氨酸升高是短期的，不久就返回到正常。精氨酸消耗的半衰期概括在下表2中。
表2血清精氨酸消耗的半衰期
实施例5PEG修饰的ADI的抗原性为了确定天然ADI，ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000的抗原性，按照例如Park，Anticaner Res.，同上，和Kamisaki，J.Pharmacol.Exp.Ther.，同上中所述的程序进行操作。简而言之，Balb C小鼠(每组5只小鼠)每周用约0.5IU(100μg的蛋白)的天然ADI，ADI-SS-PEG5,000，或ADI-SS-PEG20,000静脉内注射，历时12周。在实验开始和第4，8和12周从动物后眼窝丛中放血(0.05ml)。血清分离并存储在-70℃。通过ELISA确定抗ADI IgG的效价。向96孔微量滴定板的各个孔中加入50μg的ADI，并在室温下温育4小时。平板用PBS冲洗，然后用牛血清白蛋白(1mg/ml)包被，以封闭非特异蛋白结合位点，并在4℃存储过夜。次日，小鼠血清稀释后加入到孔中。1小时后，平板用PBS冲洗，并将与过氧化物酶偶联的兔抗小鼠IgG加入到孔中。平板温育30min，接着利用微量滴定板读数仪测量所得UV吸光度。效价定义为最高的血清稀释度，其导致背景吸光度的两倍增加(约0.50OD)。
与天然ADI相比，ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000的抗原性是显著低的。例如，少至4次注射天然ADI导致大约106的效价，而4次注射任意PEG-ADI制剂不能产生任何可测量的抗体。然而，在8次注射后，ADI-PEG5,000的效价为大约102，ADI-PEG20,000直到12次注射后才诱导出如此多的免疫应答。结果表明，PEG与ADI的连接减弱对蛋白的免疫应答。
实施例6给人施用PEG5,000-ADI和PEG20,000-ADI离体与正常人血清温育，通过氨基酸分析确定对精氨酸浓度的影响，其中酶发现是完全有活性的，并能够以与包括小鼠的实验中相同的动力学降解所有可检测的精氨酸。以0.1ml体积在37℃反应进行1小时。
另外，精氨酸和瓜氨酸在人血清中的水平与小鼠中发现的相同。PEG-蛋白在人中比其在小鼠中循环时间更长。例如，PEG共轭的腺苷脱亚胺酶，天冬酰胺酶，葡糖脑苷脂酶，尿酸酶，血球蛋白和超氧化物歧化酶的循环半衰期都长于同样制剂在小鼠中的5-10倍。过去认为，人剂量通常为小鼠中所用的1/5到1/10。因此，PEG-ADI在人中比在小鼠中应循环更长的时间。
实施例7ADI-PEG20的抗病毒活性在通过转染人肝胚细胞瘤细胞系Huh7(Blight等，HCV RNA复制在细胞培养物中的有效起始(EffcientInitiation of HCV RNA Replication in Cell Culture)，Science 2000 2901972-1974)而衍生的稳定的HCV RNA复制细胞系AVA5中进行测试。
体外复制分析使用通过转染人肝胚细胞瘤细胞系Huh7而衍生的稳定的HCVRNA复制细胞系AVA5。AVA5细胞的分裂培养物用4种浓度的测试化合物(每种浓度3个培养物)每天处理一次，历时3天(每次加入化合物时更换培养基)。总共6个未处理的对照培养物，以及用10，3，和1IU/mlα干扰素(有抗病毒活性，但没有细胞毒性)，以及100，10和1μM ribavirin(没有抗病毒活性和细胞毒性)处理的三份培养物，用作对照。HCV RNA和细胞β-肌动蛋白RNA水平利用斑点印迹杂交在化合物的最后剂量后24小时进行评价。3-肌动蛋白RNA水平用于使各个样品中的细胞RNA量标准化。在用于抗病毒分析的单独平板上进行毒性分析。培养毒性分析用细胞，用测试化合物处理，程序和培养条件与抗病毒评价中所用的相同。各个化合物以4种浓度测试，每种浓度三份培养物。在最后处理后24小时，中性红染料的摄取用于确定毒性的相对水平。510nm处的内在化染料的吸光度用于定量分析。测试培养物中的值与9个未处理细胞的培养物进行比较，未处理细胞维持在与测试培养物相同的平板上。计算50％和90％抗病毒有效浓度(EC50，EC90)和50％细胞毒性浓度(CC50)，并用于生成选择性指数(CC50/EC50)。S.I.为10或更大视为选择性抗病毒效果。
ADI-PEG20的抗病毒活性当这些细胞的分裂培养物有50％汇合时，向其中加入单剂量的ADI-PEG20(0.01IU/ml)。作为对照，α干扰素(10IU/ml)和ribavirin(100μM)用作阳性对照。处理3天后，利用标准实验室技术，RNA分离自培养物，以及通过斑点印迹进行分析。确定HCV mRNA的量，并与肌动蛋白的mRNA(用作对照)比较。确定抑制50％对照水平的HCVmRNA所需的药物(ADI，α干扰素或raboviron)量。导致50％抑制肌动蛋白mRNA的任何剂量的药物被视为具有非特异抑制活性。获白该实验的结果示下。
这些数据表明，ADI-PEG体外抑制HCV病毒复制几乎与α干扰素一样好，并比ribavirin更好。
实施例8AVA5细胞的分裂培养物用各种浓度的PEG-ADI(或者在对照实验中为α干扰素或ribavirin)处理3天。同上分析HCV mRNA水平。利用中性红确定细胞生存能力。确定抑制50％(IC50)和90％(IC90)的HCVmRNA水平的浓度。还确定杀死50％的细胞(CC50)的药物浓度。计算CC50/EC50以确定选择性指数(SI)。SI＞10被视为选择性抑制病毒复制。结果示下。
这些数据确认，ADI-PEG20抑制HCV复制，以及该药物是选择性的。
实施例9肿瘤患者中的抗病毒活性和NO合成在既患有肝细胞癌又长期感染有HCV的患者中测试ADI-PEG20的抗肿瘤活性。利用通过Hoffman La Roche开发的标准临床分析，还确定HCV在这些患者血浆中的病毒效价。在用ADI-PEG20处理之前获得血浆。每周一次用160IU/m2的ADI-PEG20注射患者，历时3周。用ADI-PEG 20第3次注射后1周，从患者中分离血浆，并再次利用同样的分析方法测定HCV效价。该实验结果示下。
这些数据表明，用ADI-PEG处理长期感染有HCV的病人导致HCV在其血浆中的效价显著降低。此外，由于α干扰素仅在约50％的病人中有效，并且通常需要3-6个月处理才能实现HCV效价减少50％，ADI-PEG 20在这方面似乎更有效。
根据Richard Simon对快速最佳两步阶段2测试的统计学设计(Simon R.1989.对II期临床试验的最佳两步设计(Optimal two-stagedesigns for phase II clinical trials).Control Clin Trials 101-10；SimonRM，Steinberg SM，Hamilton M，Hildesheim A，Khleif S，Kwak LW，Mackall CL，Schlom J，Topalian SL，Berzofsky JA.2001.对早期临床开发治疗性癌症疫苗的临床试验设计(Clinical trial designs for the earlyclinical development of therapeutic cancer vaccines)。J Clin Oncol191848-1854)，ADI-SS PEG 20,000在患有不能施行手术的HCC的个体的阶段2研究中进行测试。该测试得到了意大利卫生部和当地研究检查委员会(institutional review board)的批准，在意大利那不勒斯的Pascale National Cancer Institute进行。所有测试对象根据Helsinki声明提供了知情同意书。总共有18位患有不能施行手术的HCC的个体在该研究中登记，它们长期感染有HCV(Izzo提交)。在此研究中，3位死于进行性疾病，未能接受全部3个轮次的治疗，因而被排除在进一步分析之外。所有剩余15位测试对象以最佳生物剂量接受3个轮次(每个轮次由每周1次，共4次注射组成)的ADI-SS PEG 20,000。最佳生物剂量定义成血浆精氨酸从静止水平约130μM减少到检测水平之下(＜2μM)至少持续7天的ADI-SS PEG 20,000的量(约160IU/m2)。
该疗法对肿瘤作用通过每4周一次CT扫描进行评价。根据国立癌症研究所(NCI)的标准，将反应定义成进行性疾病(PD)，稳定疾病(SD)，部分反应(PR)或完全反应(CR)。该测试结果显示，在患有HCC和HCV的15位测试对象中可见下列反应
在该研究之前或过程中，没有一个测试对象曾接受任何全身性抗肿瘤治疗(或抗病毒治疗)。在研究过程中，每周至少两次进行临床实验室测试，每周一次采集血浆样品，并存储在-70℃中。正是这些冷冻的血浆样品其后用于HCV的测试。
HCV效价测定和人血浆样品的血清型分类利用标准临床聚合酶链式反应(PCR)分析，Cobas Amplicor HCV监控仪测试，版本2.0，Roche Diagnostics(Germer 1999)在医院传染性疾病临床实验室中确定HCV病毒效价。基因型以类似方式确定。在ADI-SS PEG 20,000处理之前和治疗12周之后，对采集的血浆样品确定病毒效价。
NO合成用ADI-SS PEG 20,000处理导致剂量依赖的血浆精氨酸的降低和NO合成的同时降低(数据未示出)。尽管该处理显著减少NO水平，但该处理对血压或心脏速率没有可测量的影响。
下表3列出了ADI-SS PEG 20,000对肝炎C效价和肝功测试的影响。
表3ADI-SS PEG 20,000对肝炎C效价和肝功测试的影响
备注所有后RX值为在OBD处3轮次后的值。
本说明书中所述的专利，Genbank登录号，专利申请和出版物分别在此以其全文引作参考。
除了在此描述的之外，本发明的各种不同的修饰在参照上述说明书后对本领域技术人员是显而易见的。这样的修饰也应落入随附的权利要求书中的范围内。
序列表<110>德西涅RX制药公司(DesigneRx Pharmaceuticals Inc.)<120>体内抑制病毒复制的方法(METHODS FOR INHIBITING VIRAL REPLICATION IN VIVO)<130>SCT052002-47<150>US 60/427,497<151>2002-11-18<160>21<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>409<212>PRT<213>Mycoplasma hominus<400>1Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu1 5 10 15Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile20 25 30Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile35 40 45Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Ser Phe Val Lys Ile50 55 60Met Lys Asp Arg Gly Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala65 70 75 80Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Lys Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Glu85 90 95Thr Phe Leu Glu Glu Thr Val Pro Val Leu Thr Glu Ala Asn Lys Lys100 105 110Ala Val Arg Ala Phe Leu Leu Ser Lys Pro Thr His Glu Met Val Glu115 120 125Phe Met Met Ser Gly Ile Thr Lys Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ser Glu130 135 140Asn Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp145 150 155 160
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Pro Ala Ala Tyr Thr Arg Tyr Leu Gly Leu Glu Gln Ala Asp Ile Cys565 570 575Val Asp Ile Lys580<210>18<211>413<212>PRT<213>Clostridium perfringens<400>18Met Arg Asp Asp Arg Ala Leu Asn Val Thr Ser Glu Ile Gly Arg Leu1 5 10 15Lys Thr Val Leu Leu His Arg Pro Gly Glu Glu Ile Glu Asn Leu Thr20 25 30Pro Asp Leu Leu Asp Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Tyr Leu Lys35 40 45Val Ala Arg Glu Glu His Asp Ala Phe Ala Gln Thr Leu Arg Glu Ala50 55 60Gly Val Glu Val Leu Tyr Leu Glu Val Leu Ala Ala Glu Ala Ile Glu65 70 75 80Thr Ser Asp Glu Val Lys Gln Gln Phe Ile Ser Glu Phe Ile Asp Glu85 90 95Ala Gly Val Glu Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala Leu Ile Glu Tyr Phe100 105 110Asn Ser Phe Ser Asp Asn Lys Ala Met Val Asp Lys Met Met Ala Gly115 120 125Val Arg Lys Glu Glu Leu Lys Asp Tyr His Arg Glu Ser Leu Tyr Asp130 135 140Gln Val Asn Asn Val Tyr Pro Phe Val Cys Asp Pro Met Pro Asn Leu145 150 155 160Tyr Phe Thr Arg Glu Pro Phe Ala Thr Ile Gly His Gly Ile Thr Leu165 170 175Asn His Met Arg Thr Asp Thr Arg Asn Arg Glu Thr Ile Phe Ala Lys
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<211>413<212>PRT<213>Bacillus licheniformis<400>19Met Ile Met Thr Thr Pro Ile His Val Tyr Ser Glu Ile Gly Pro Leu1 5 10 15Lys Thr Val Met Leu Lys Arg Pro Gly Arg Glu Leu Glu Asn Leu Thr20 25 30Pro Glu Tyr Leu Glu Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Phe Leu Pro35 40 45Ala Val Gln Lys Glu His Asp Gln Phe Ala Glu Thr Leu Lys Gln Gln50 55 60Gly Ala Glu Val Leu Tyr Leu Glu Lys Leu Thr Ala Glu Ala Leu Asp65 70 75 80Asp Ala Leu Val Arg Glu Gln Phe Ile Asp Glu Leu Leu Thr Glu Ser85 90 95Lys Ala Asp Ile Asn Gly Ala Tyr Asp Arg Leu Lys Glu Phe Leu Leu100 105 110Thr Phe Asp Ala Asp Ser Met Val Glu Gln Val Met Ser Gly Ile Arg115 120 125Lys Asn Glu Leu Glu Arg Glu Lys Lys Ser His Leu His Glu Leu Met130 135 140Glu Asp His Tyr Pro Phe Tyr Leu Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe145 150 155 160Thr Arg Asp Pro Ala Ala Ala Ile Gly Ser Gly Leu Thr Ile Asn Lys165 170 175Met Lys Glu Pro Ala Arg Arg Arg Glu Ser Leu Phe Met Arg Tyr Ile180 185 190Ile Asn His His Pro Arg Phe Lys Gly His Glu Ile Pro Val Trp Leu195 200 205Asp Arg Asp Phe Lys Phe Asn Ile Glu Gly Gly Asp Glu Leu Val Leu210 215 220
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1.一种抑制个体中一种或多种病毒复制的方法，包括以有效抑制所述个体中病毒复制的量给所述个体施用包含与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶的组合物。
2.权利要求1的方法，其进一步包括下列步骤给所述个体施用一种或多种选自抗生素，抗病毒，抗真菌和抗原生动物药物的化合物。
3.权利要求1的方法，其进一步包括下列步骤给所述个体施用一种或多种其他抗病毒化合物。
4.权利要求2的方法，其中所述抗病毒化合物为下列物质中的一种或多种azidovudine(AZT)，去羟肌苷(二脱氧肌苷，ddI)，d4T，扎西他滨(二脱氧胞嘧啶，ddC)，内维拉平，拉米夫定(epivir，3TC)，沙奎那维(Invirase)，利托那韦(诺亿亚)，茚地那韦(Crixivan)，地拉韦定(Rescriptor)，PEG化的干扰素α(IFN)，或利巴韦林。
5.权利要求1的方法，其中所述组合物以肌内，皮内或腹膜内给药。
6.权利要求1的方法，其中所述包含与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶的组合物在浓度小于大约1mM时，就能使得在测量病毒复制的分析中50％以上细胞的病毒复制有效抑制至少50％。
7.权利要求1的方法，其中与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶有效抑制病毒复制的量为每周大约40IU/m2到大约160IU/m2。
8.权利要求1的方法，其中与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶有效抑制病毒复制的量为每周大约160IU/m2。
9.权利要求1的方法，其中与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶有效抑制病毒复制的量使血浆精氨酸水平降低至小于5μM。
10.权利要求1的方法，其中精氨酸脱亚胺酶经由连接基团共价键合于聚乙二醇，其中各个所述聚乙二醇分子的分子量为大约10,000到大约30,000。
11.权利要求1的方法，其中各个所述聚乙二醇分子的分子量为大约20,000。
12.权利要求10的方法，其中连接基团选自琥珀酰亚胺基，酰胺基，酰亚胺基，氨基甲酸酯基，酯基，环氧基，羧基，羟基，糖，酪氨酸基，半胱氨酸基，组氨酸基及其组合。
13.权利要求10的方法，其中连接基团为琥珀酰亚胺基琥珀酸酯。
14.权利要求1的方法，其中大约7到大约15个聚乙二醇分子键合于精氨酸脱亚胺酶。
15.权利要求1的方法，其中大约9到大约12个聚乙二醇分子键合于精氨酸脱亚胺酶。
16.权利要求1的方法，其中所述精氨酸脱亚胺酶衍生自支原体属的微生物。
17.权利要求16的方法，其中所述微生物选自精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)，人形支原体(Mycoplasma hominus)，关节炎支原体(Mycoplasma arthritides)及其组合。
18.权利要求1的方法，其中精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列为SEQID NO1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，13，14，15，16，17，18，19，20或21。
19.权利要求1的方法，其中精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列为SEQID NO1或4。
20.权利要求1的方法，其中病毒为肝炎病毒。
21.权利要求1的方法，其中病毒为HCV。
22.权利要求1的方法，其中病毒为HCV 1b。
23.一种治疗怀疑已接触一种或多种病毒的个体的方法，包括下列步骤给所述个体施用一定量的包含与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶的组合物，以有效抑制病毒在所述个体中的复制。
24.一种抑制病毒在个体中复制的方法，所述个体处于一种或多种病毒的风险之中，所述方法包括给所述个体施用一定量的含有与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶的组合物，以有效抑制病毒在所述个体中的复制。
25.一种抑制病毒在个体中复制的方法，所述个体已被鉴定为感染有一种或多种病毒，所述方法包括给所述个体施用一定量的含有与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶的组合物，以有效抑制病毒在所述个体中的复制。
26.一种在个体中同时治疗肿瘤和抑制一种或多种病毒复制的方法，所述方法包括下列步骤给所述个体施用治疗或预防有效量的含有经由连接基团与聚乙二醇共价键合的精氨酸脱亚胺酶的组合物，以有效抑制肿瘤生长和病毒复制。
27.权利要求26的方法，其中个体在给药组合物之前已被鉴定为患有一种或多种病毒感染。
28.权利要求26的方法，其中肿瘤为黑素瘤，肉瘤或肝癌。
29.权利要求26的方法，其中肿瘤为肝细胞瘤。
30.权利要求23-27任一项的方法，其中病毒为肝炎病毒。
31.权利要求23-27任一项的方法，其中所述病毒为HCV。
32.权利要求26的方法，其中所述肿瘤为肝细胞瘤，而所述病毒为HCV。
33.一种调节个体中一氧化氮水平的方法，包括给所述个体施用一定量的与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶，以有效调节一氧化氮。
34.权利要求33的方法，其中精氨酸脱亚胺酶经由连接基团共价键合于聚乙二醇，其中多个所述聚乙二醇分子的分子量为大约10,000到大约30,000。
35.权利要求33的方法，其中多个所述聚乙二醇分子的分子量为大约20,000。
36.权利要求34的方法，其中连接基团选自琥珀酰亚胺基，酰胺基，酰亚胺基，氨基甲酸酯基，酯基，环氧基，羧基，羟基，糖，酪氨酸基，半胱氨酸基，组氨酸基中的一种或多种。
37.权利要求34的方法，其中大约7到大约12个聚乙二醇分子键合于精氨酸脱亚胺酶。
38.权利要求33的方法，其中所述精氨酸脱亚胺酶衍生自支原体属的微生物。
39.一种确定病毒复制对调节精氨酸水平的灵敏度的方法，包括(a)将含有一种或多种病毒的样品与包含键合于聚乙二醇的精氨酸脱亚胺酶的组合物接触；以及(b)在存在和缺乏包含键合于聚乙二醇的精氨酸脱亚胺酶的组合物下比较病毒复制的水平；其中在与精氨酸脱亚胺酶接触的样品中病毒复制降低是病毒灵敏度对精氨酸脱亚胺酶的指示。
40.一种确定病毒复制对调节一氧化氮水平的灵敏度的方法，包括(a)将含有一种或多种病毒的样品与包含键合于聚乙二醇的精氨酸脱亚胺酶的组合物接触；以及(b)在存在和缺乏包含键合于聚乙二醇的精氨酸脱亚胺酶的组合物下比较病毒复制的水平；其中在与精氨酸脱亚胺酶接触的样品中病毒复制降低是病毒灵敏度对一氧化氮的指示。
41.权利要求2或3的方法，其中所述化合物给所述个体施用，同时给药所述包含与聚乙二醇键合的精氨酸脱亚胺酶的组合物。
42.一种选择性抑制病毒在需要其的个体中复制的方法，包括给所述个体施用治疗或预防有效量的包含键合于聚乙二醇的精氨酸脱亚胺酶的组合物。
43.权利要求42的方法，其中病毒为HCV。
44.一种改善个体肝功的方法，包括给所述个体施用治疗有效量的包含键合于聚乙二醇的精氨酸脱亚胺酶的组合物。
45.权利要求44的方法，其中肝功利用Child-Pugh等级或Mayo终端肝病评分进行评价。
46.权利要求44的方法，其中肝功的评价方法是测量至少一种肝功指标，其中所述指标为胆红素，白蛋白，凝血酶原时间，腹水存在，或脑病的等级。
47.权利要求44的方法，其中在给药包含键合于聚乙二醇的精氨酸脱亚胺酶的组合物之前，所述个体的肝功为Child-Pugh水平A。
48.权利要求44的方法，其中在给药包含键合于聚乙二醇的精氨酸脱亚胺酶的组合物之前，所述个体的肝功为Child-Pugh水平B。
49.权利要求44的方法，其中在给药包含键合于聚乙二醇的精氨酸脱亚胺酶的组合物之前，所述个体的肝功为Child-Pugh水平C。
50.一种鉴定个体可被精氨酸脱疗的方法，所述个体已知患有一种或多种病毒感染，所述方法包括a)从个体中获得包含一种或多种病毒的样品；以及b)在适于病毒复制的条件下，将在接触有包含键合于聚乙二醇的精氨酸脱亚胺酶的组合物的样品中的病毒复制，与缺乏包含键合于聚乙二醇的精氨酸脱亚胺酶的组合物的样品中的病毒复制进行比较，其中病毒在所述样品中的复制抑制至少40％是个体作为精氨酸脱疗的候选对象的指示；而病毒复制的抑制小于40％是个体不作为精氨酸脱疗的候选对象的指示。
51.一种治疗个体中一种或多种病毒的方法，包括a)根据权利要求50，确定个体是否是精氨酸脱疗的候选对象；b)如果个体是精氨酸脱疗的候选对象，则用精氨酸脱疗治疗个体；以及c)如果个体不是精氨酸脱疗的候选对象，则用常规抗病毒处理治疗个体。
全文摘要
本发明涉及体内调节病毒复制的方法，包括给个体施用治疗或预防有效量的包含修饰有聚乙二醇的精氨酸脱亚胺酶的组合物，涉及同时调节病毒复制和治疗癌症的方法，以及涉及调节患者中一氧化氮水平的方法等。
文档编号A61K38/50GK1809378SQ03825264
公开日2006年7月26日 申请日期2003年9月29日 优先权日2002年11月18日
发明者迈克·A·克拉克 申请人:德西涅Rx制药公司