专利名称:制备乙型肝炎复合疫苗的方法
本发明涉及生物工艺学领域，更准确地说，涉及制备乙型肝炎复合疫苗的方法，该种疫苗在以人类的疫苗预防接种为目的的医学中得到了应用。
目前，为了与乙型肝炎的广泛传染作斗争，唯一有效的手段就是疫苗。
已知有各种各样的制备乙型肝炎疫苗的方法，其中包括在培养基中培育酵母菌株-HBsAg抗原激活体，接着将酵母细胞破坏，分离并纯化抗原。例如，欧洲专利EP.BO135435叙述了制备乙型肝炎疫苗的方法，该方法是以酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)细胞ATCC 20665的变体H52来培养HBsAg表面抗原，需时四天。首先将细胞置于长颈瓶中，在28℃下培养8小时。然后把细胞培养物放入装有培养基YEHD的发酵器中。发酵过程在28℃及搅拌的情况下进行14-40小时(PH5.0)。经过40小时后把培养物加入到100升的培养基YEHD中，于发酵器中在搅拌情况下培养48小时(PH5.0)，在过程中，溶解氧的浓度为饱和度的20%。
用磷酸盐缓冲液洗涤细胞群体并将其在2-8℃下保存3天，然后往其中加入1%的PMSF，使其中的PMSF最终浓度达到2mM。接着在均化器中将细胞破坏。所获HBsAg抗原的浓度为0.9毫克/升，蛋白质总含量为1.523克/升。然后使HBsAg抗原通过二氧化硅渗滤，用磷酸盐缓冲液洗涤并在56℃下于5mM的硼酸盐缓冲液(PH9.1)中培育20分钟，所说的缓冲液含有0.25%(重量)的脱氧胆烷。然后，在一个含有对HBsAg为抗体的柱中以亲合色谱进行纯化，以3M硫代氰酸氨溶液(PH7.2)洗提。然后进行渗析，以除去磷酸盐缓冲液。往这含水物中加入氢氧化铝，以使其PH达6.7，在室温下搅拌、离心分离、并用生理溶液(0.85%的NaCl溶液)稀释。还有其它的制备疫苗的方法是把按上述方法制得的细胞提取液和二氧化硅混合在一起，在37～39℃下培育2.5小时。然后用磷酸盐缓冲液洗涤该混合物，再用含0.25%(重量)脱氧胆烷的0.05M硼酸盐缓冲液(PH8.9～9.2)来洗提HBsAg抗原。将所获抗原离心分离。将上层清液加入到一个事先用5mM NaCl、6.25mM Tris、及0.5mM MgCl2的混合溶液处理过的纸浆柱上。过程在温度为4℃及PH为7.5的条件下进行。然后用同一种缓冲液洗涤该柱子并以含0.2M NaCl的缓冲液洗提。未吸附的部份，在总蛋白质为13毫克内含7.95毫克的纯HBsAg抗原。然后把所获物质加进琼脂糖凝胶6B柱上并用磷酸盐缓冲溶液洗提，洗提速度为60毫升/小时。在琼脂糖凝胶6B柱上，在PH7.2的条件下对抗原进行16小时的渗析纯化，以除去磷酸盐缓冲液中的3M硫代氰酸氨，然后获得了纯净的抗原。再用强化的渗析方法来把硫代氰酸氨从磷酸盐缓冲液中分离掉，把纯化过的产品用磷酸盐缓冲液稀释并吸附于氢氧化铝上，接着进行与上述方法相同的步骤。
所述的方法包括了使用亲合色谱，这个过程导致HBsAg抗原活性的降低。此外，在洗提抗原时可能导致部份抗体从亲合的吸附剂上解吸下来，这一点，在制备用于人类的疫苗的情况下是很不理想的(异类抗体的存在可提高制品的反应活性)。此外，在所说的方法中使用了PMSF及硫代氰酸氨等有毒物质，这一点在要把所获疫苗用于人类的情况下是不能容许的。
还有一种已知的制备并纯化乙型肝炎疫苗的方法，该方法适用于大规模地生产乙型肝炎疫苗(欧洲专利EP.BO155007)。该方法包括培养酿酒酵母菌株-HBsAg抗原激活体，接着进行HBsAg的吸附，所用的吸附方法包括把细胞破坏和在10℃下及在添加磷酸盐缓冲液的情况下将其与二氧化硅混合。接着用0.05M Na2CO3或NaHCO3(PH＝10.5)与尿素的混合溶液在37℃下将HBsAg洗提。往上层清液中加入10%的醋酸使溶液达到PH7.2，并在超滤器中将其浓集。在磷酸盐缓冲液中，通过琼脂糖凝胶G1-6B进行胶体过滤并用同一个缓冲液洗提。接着在羟磷灰石上进行抗原的纯化。用添加有0.5M磷酸钾缓冲液的0.05M KCl溶液进行洗提。所获最终产品的产率为46%(重量)。虽然如此，以上述方法来制备纯HBsAg抗原，其产率是不够高的。在最终阶段使用了磷酸钾缓冲液，由于它的毒性，这种方法在制备用于人类的疫苗的情况下是很不理想的。
还有一种已知的由酵母菌株-HBsAg抗原激活体来制备乙型肝炎复合疫苗的方法(Waurpber D等，PNAS，82卷，1985年，6830-6834页)，该方法包括在富含磷的培养基中培养菌株-抗原激活体，将细胞转移到低磷含量的培养基中以使HBsAg繁殖，接着在离心机中进行细胞洗涤。然后把细胞群体从培养基中分离出来，并稀释到磷酸盐缓冲液原先的体积。借助于高压均化器来破坏细胞，并把所获的含有30～70毫克/毫升蛋白质的提取物稀释到4倍体积的内含0.1%去污剂Triton X-100的磷酸盐缓冲液中。然后将混合物离心，将上层清液浓缩至5倍并以二倍体积的磷酸盐缓冲液进行二次过滤。借助于吸附剂XAD-2来分离去污剂Triton-100并进行离心，然后，利用在二氧化硅上的吸附-洗提来进行部份纯化。把所获的产物在-70℃下冻凝。在产物解冻以后用离心法来澄清。把所获产物以丁基琼脂糖柱色谱或亲合色谱进行纯化。所获的最终产物的产率为29%(重量)，含有20%(重量)杂质蛋白质。所说方法的特征在于步骤多，所用的载体含有对人类有危险的有毒溴化氰，最终产物的产率低(29%重量)，而且所合杂质蛋白质多达20%(重量)，这使得要把它作为疫苗来使用是不允许的。此外，在洗提HBsAg时使用了含硫氰酸盐的溶液，这在制备用于人类的疫苗的情况下也是不允许的。
本发明的主要目的是提高最终产品的产率。
本发明的其它目的是提高最终产品的纯度。
本发明的主要任务是以技术操作上不同的处理方法来提高最终产品的产率并增加其纯度。
解决该任务的方法是，在制备乙型肝炎复合疫苗的方法中，包括了依次在富含磷源的培养基内培养酵母菌株-HBsAg抗原激活体，然后在一种能保证抗原繁殖的培养基内培养，接着破坏酵母细胞并分离、纯化抗原，于是获得了最终产物，按照本发明，利用了不含磷源的培养基作为保证抗原繁殖的培养基，使用在多孔二氧化硅上的吸附色谱法同时进行抗原的分离和纯化，继而在密度梯度为1.1～1.3千克/分米3的条件下用超速离心法分离。
采用孔径范围为1500～2000埃的二氧化硅来作为多孔二氧化硅是适宜的。最好是利用PH为9.1～9.5的碳酸氢钠缓冲液来使色谱柱解吸。这个方法可使HBsAg抗原的产率提高到90%。
为了提高抗原的纯度，最好是利用50%的酒石酸钾或酒石酸钠溶液与25%的甘油溶液配成1∶1的混合溶液，按密度梯度来进行超速离心分离。采用此法可把抗原的纯度提高到2倍以上，抗原活性的产率提高10～20%(与已知方法相比)。
为了在破坏酵母细胞这一步骤上提高最终产物的产率，最好加入去污剂，并最好是利用吐温-80作为去污剂。这一方法可使HBsAg抗原的产率提高到已知方法的2倍以上。
本申请的方法可获得60～67%(重量)的最终产品产率，并可获得高纯度的产品(所含蛋白质杂质为10%)。
本申请的方法按下列步骤来实施。
培养一种含有携带HBsAg基因的复合原生质(плаэмида)的酵母菌株以及能产生免疫HBsAg的菌株。可以利用任何已知的酵母菌株-HBsAg抗原激活体来作为这种起始菌株，例如可利用酿酒酵母菌株DBY746/PNMVG46，这种菌株是把转化的原生质(плаэмцда)PNMVG46引入到接受体DBY746菌株中而制得。原生质PNMVG46可利用基因工程诱变技术由已知的原生质PADG47来制取(Молекулярная генетика микроδцоλотия и вирусолотця1986年，8期，12～19页)。
按下列方法进行培养将3～5组由起始的酵母菌株-HBsAg抗原激活体组成的大菌落接种到富含磷源的培养基中。在30～32℃及搅拌的情况下培养一昼夜，使其浓度达到2～6×107个/毫升。然后把这全部培养物转移到能保证抗体繁殖的培养基中。
在该培养基中进行培养的条件为温度30℃，通入空气，时间24～30小时，所获浓度为1.8～2.1×107个/毫升。
用显微镜检查培养物的纯度。然后在4℃下离心分离，以收集细胞。接着在-40℃下使细胞分解或冻凝。
在破坏细胞群体之前，如果它仍处于冻凝状态，则要先解冻，并将其稀释入缓冲液中。破坏操作例如可借助于粒径0.5毫米的玻璃球来将酵母细胞研碎或者可在高压分解器中进行破坏，在分解器中的500～1000大气压下，细胞被破坏。在细胞破坏到90%时停止分解操作。为了提高最终产物的产率，最好在破坏细胞这一步骤中加入去污剂，并最好利用吐温-80作为这种去污剂。用此法可使HBsAg抗原的产率提高到2倍以上。
将破坏了的细胞冻凝，融化，然后在4℃下离心澄清。将含有复合HBsAg抗原的上层清液(澄清的提取液)在多孔的二氧化硅上进行吸附色谱分离。
为了进行吸附色谱分离，最好采用孔径为1500～2000埃的多孔二氧化硅(大孔玻璃)。这种吸附剂对复合HBsAg具有最大的容量，它能捕集18～22毫微米粒径的粒子，而在酵母细胞澄清提取液中留下的这些粒子少于1%。
将HBsAg吸附到吸附剂上，吸附过程在不断搅拌下进行数小时至一昼夜，在此之后将吸附剂沉淀，用数倍体积的磷酸盐缓冲液洗涤，并将在此缓冲液中的吸附剂转移至吸附柱，并重新用磷酸盐缓冲液洗涤，直到在280毫微米波长处的消光系数达到恒定为止。在经洗涤以后，用PH9～10的缓冲液使HBsAg抗原解吸。
最好是用PH9.1～9.5的碳酸氢钠缓冲溶液来进行抗原的解吸。在此条件下可获最高的HBsAg抗原产率(约90%)，这是利用其它缓冲液来进行解吸所不能达到的。
把含有HBsAg抗原的洗提液各部份合并，如有必要，可用超过滤法浓缩，并在密度梯度为1.1～1.3千克/分米3的条件下进行离心。最好是使用50%的酒石酸钾或酒石酸钠溶液和25%的甘油溶液按1∶1的比例来进行超速离心分离。使用酒石酸盐-甘油所组成的密度梯度与使用其它密度梯度相比，前者可获得最纯的产品并同时能保持它的抗原活性。使用这样的浓度梯度可使产品纯度提高到2倍以上，并且抗原活性的产率提高10～20%。相应地，最终产品的总产率就提高了。
在超速离心分离后，分出了各个不同的级分，在各级分中测定其中的HBsAg的指标，然后把含HBsAg的所有级分集中在一起并进行渗析以除去在0.02M磷酸盐缓冲液(PH7.4～7.6)中的浓度为0.8～0.9%的NaCl。
把经渗析的产品稀释，使其中的HBsAg浓度变为40±6微克/毫升，以微量过滤法进行灭菌，将其吸附在氢氧化铝上并分装入安瓿瓶。一剂量疫苗含大约15微克/毫升HBsAg，并且吸附在1毫克氢氧化铝上的蛋白质杂质不超过10%。所获的疫苗是经灭菌的、无毒的和不含无关病毒的抗原。在动物及人体上的实验已证实了所获疫苗的高度免疫性。
在动物(小猪)的试验中，用按本申请的方法制备的疫苗来对一些动物进行免疫试验，在所有这些动物身上，都显示了很高的指标(320～650ME)的对HBsAg抗原的抗体。
用按本申请的方法制备的疫苗来对四十名不带对HBsAg抗原的抗体的自愿者进行了疫苗接种试验。疫苗接种共进行三次，第一第二次之间相隔一个月，第二第三次之间相隔六个月。每一个月都给自愿者测定血液中HBsAg抗原的含量。结果发现，与已知的方法相比较，按本申请方法制备的疫苗具有较低的疫苗反应性。
在第二次接种疫苗后一个月，在30%的接种者身上发现抗体，而在第三次接种后一个月(即在第一次接种后8个月)，在92%自愿接种疫苗者身上发现抗体，并且抗体指标相当于300～700ME(同时发现其抗体的防护指标为10ME)。
为了对本发明有更好的理解，特举出下列实施方法的具体实施例。
实施例1把酿酒酵母的DBY746/PNMVG20菌株在2%琼脂上的三个酵母细胞菌落(直径4-5毫米)接种到200毫升液体培养基中，该种菌株是由DBY746引入转化的原生质PNMVG20而获得的(Грановский н.н，等Молекулярная генетика，Микроδиология и вирусология1986年，8期，12～19页)，所用培养基的组成如下(1升培养基)KH2PO40.9～1.1克NaCl 0.095～0.10克葡萄糖 19～21克MgSO40.45～0.55克CaCl20.095～0.105克天门冬酰胺 2.1～2.2克维生素
维生素B1190～210微克维生素B2190～210微克维生素B6190～210微克烟酸 190～210微克对氨基苯酸 190～210微克普多酸钾 190～210微克环己六醇 9～11毫克生物素 1.9～2.1微克微量元素KI 99～101微克HBO39.9～10.1微克MnSO49.9～10.1微克(NH4)2M0O49.9～10.1微克FeSO449～51微克把培养物置于振荡机中，以300～350次/分的振荡次数及在30℃下培养3昼夜。最后培养出来的细胞浓度为2.6×107个/毫升。把所获培养物无菌地转移至一个装有9升培养基的发酵器中，该培养基的组成如下(1升培养基)KCl 0.9～1.1克NaCl 0.095～0.10克葡萄糖 19～21克MgSO40.45～0.55克CaCl20.095～0.105克天门冬酰胺 2.1～2.2克维生素维生素B1190～210微克维生素B2190～210微克维生素B6190～210微克烟酸 190～210微克对氨基苯酸 190～210微克普多酸钾 190～210微克环己六醇 9～11毫克生物素 1.9～2.1微克微量元素KI 99～101微克HBO39.9～10.1微克MnSO49.9～10.1微克(NH4)2M0O49.9～10.1微克FeSO449～51微克培养时间为26小时。在培养时的通气强度(空气∶培养基的比值)为1∶2.5。培养结束后在培养基中的细胞浓度达到2.1×107个/毫升。用离心机将细胞沉淀，过程条件为10000xg，时间20分钟，温度4℃。使沉淀的细胞重新悬浮在100毫升的缓冲液中，该缓冲液含0.02M磷酸钠及0.5M NaCl，PH为7.5，接着借助于玻璃球将细胞研磨破坏2小时。用离心机将经过破坏的细胞沉淀，过程条件为10000xg，温度4℃，时间30分钟。把上层清液倒出，往沉淀中重新加入100毫升缓冲液并再重复2次上述步骤。然后把上层清液合并，在-40℃下冻凝14小时。把解冻了的上层清液按同样的条件再进行一次离心澄清。获得280毫升HBsAg抗原含量为5微克/毫升的澄清细胞提取液(按抗原的活性计)。
往所获产品中加入大孔玻璃，它所带孔的直径为1050埃。这些玻璃预先经过再生处理，并在蒸馏水中浸湿过。所用大孔玻璃的体积为140cm3。把装有悬浮液的烧瓶在4℃下放置10小时。在经此吸附后，上层清液中的HBsAg抗原含量为0.04微克/毫升。把上层清液倒出，用磷酸盐缓冲液(1∶1)把吸附剂洗涤2次，洗涤时要待玻璃沉淀后再加缓冲液。然后把吸附剂转移入一柱子中，用磷酸盐缓冲液洗涤该柱子，以除去大部分的杂质，然后把解吸了HBsAg的缓冲液(0.05M三羟甲氨基甲烷-HCl，PH9)通过该柱子，把洗提液按4毫升为一级进行分离收集，测定其中的HBsAg抗原。合并各级溶液，共获64毫升HBsAg含量为18微克/毫升的洗提液(用免疫-酶素的方法测定各级溶液中的HBsAg含量)。HBsAg的产率占上层清液抗原活性的80%。
把所获的洗提液加到蔗糖浓差溶液(Градиент)中(25～55%，密度为1.1～1.26千克/分米3)，加入比例是按每24毫升浓差溶液加入10毫升洗提液，该浓差溶液事先混入三羟甲氨基甲烷-HCl(трис-HCI)缓冲液中。在4℃下以95000xg的条件进行超速离心分离一昼夜，然后进行浓差分级，测定每一级中的HBsAg值，把含有抗原的级分合并，进行渗析以除去PH7.6的磷酸盐缓冲液。结果获得16毫升HBsAg含量为42微克/毫升的产品。以加入浓差溶液中的量为基准，最后HBsAg的产率为58%。
把产品用过滤方法灭菌，再用浓度为2毫克/毫升的氢氧化铝稀释至2倍体积，过一小时后，把产品按每剂1毫升分装入安瓿瓶。在与氢氧化铝混合之前，事先用电泳法测定其中的杂质。结果是杂质合量不超过蛋白质总含量的15%。
最终获得的产品，在PH7.6的磷酸盐缓冲液中含HBsAg 20微克/毫升，含氢氧化铝1毫克/毫升。
最终产品的总产率为47%(相对于澄清的细胞提取液)。
实施例2按与实施例1相同的方法来制备酵母菌株DBY746/PNMVG20-HBsAg激活体的细胞澄清提取液。此外，利用在专门的分解器内的高压来破坏细胞。在澄清提取液(上层清液)中的HBsAg抗原的最终浓度为5微克/毫升。把一种带有孔径为1900埃的小孔的大孔玻璃用于吸附色谱中。把预先在水中浸湿过的70厘米3大孔玻璃加入280毫升的细胞澄清提取液中。搅拌10小时，然后象实施例1那样用磷酸盐缓冲液洗涤吸附剂2次，并将其转入柱子中。用磷酸盐缓冲液洗涤柱子，直到在280毫微米处的消光系数变成恒定为止，然后象实施例1那样使HBsAg解吸。结果获得30毫升抗原含量为40微克/毫升的洗提液。该值相当于在细胞澄清提取液中初始活性的86%。
象实施例1那样，将产品进行超速离心分离、渗析、灭菌以及分装。疫苗中的抗原最终产率相当于澄清提取液中所含的56%，杂质含量相当于蛋白质总含量的10%。
实施例3按与实施例1所述相同的方法来制备酵母菌株-HBsAg激活体的细胞澄清提取液。按与实施例2所述相同的方法把抗原吸附于大孔玻璃上。用0.05M的碳酸氢钠缓冲液(PH9.1)来解吸HBsAg抗原。按4毫升一级来分级收集洗提液并测定其中的HBsAg抗原活性。获得28毫升抗原活性为45微克/毫升的洗提液，该值相当于初始HBsAg活性的90%。在经过超速离心、灭菌及分装后，在疫苗中的抗原产率为细胞澄清提取液的63%，而其中所含杂质蛋白质不大于总蛋白质的10%。
实施例4按与实施例3所述相同的方法来制备酵母菌株-HBsAg激活体的细胞澄清提取液并且进行吸附色谱处理。
利用50%的酒石酸钾-钠溶液作为重溶液，利用25%的甘油溶液作为轻溶液，将所获的含有HBsAg抗原的洗提液，在磷酸盐缓冲液中(PH7.8)按密度梯度进行超速离心分离。在90000xg和4℃的条件下离心分离18小时。象实施例1那样按密度梯度分级收集、测定其中的HBsAg抗原含量并进行渗析。获得12毫升抗原活性为82微克/毫升的抗原产品，该值相当于投入浓差溶液中的抗原活性的76%。在疫苗中HBsAg抗原的最终产率相当于澄清提取液的68%，而其中所含杂质蛋白质为总蛋白质的5%。
实施例5按与实施例1所述相同的方法制备酵母菌株-抗原激活体的细胞澄清提取液，所不同的是往磷酸盐缓冲液中添加Triton X-100，使其最终浓度为0.2%(重量)，所说的缓冲液是在破坏细胞之前用来稀释细胞的。经澄清后，获得250毫升HBsAg抗原浓度为8微克/毫升的提取液，象实施例4那样将所获的澄清提取液纯化，获得16毫升抗原活性为82微克/毫升的产品。象实施例1那样将疫苗进行稀释、灭菌和分装。
实施例6按与实施例1所述相同的方法制备酵母细胞澄清提取液，所不同的是往磷酸盐缓冲液中添加去污剂吐温-80，使其浓度为1%(重量)。在澄清后获得280毫升抗原浓度为10微克/毫升的细胞提取液。象实施例4那样以吸附色谱与超速离心法来纯化所获的提取液。获得18毫升抗原浓度为104微克/毫升的产品。象实施例1那样将产品进行稀释、灭菌和分装。
实施例7利用复合的酵母菌株(DBY746/PMVG46)-HBsAg抗原激活体来制备复合疫苗(Грановскийн.н.等，Молекулярная генетцна，Мцкроδцологця и Вирусология，1986年，8期，12-19页)。按与实施例1所述相同的方法来制备澄清提取液。获得250毫升HBsAg抗原含量为30微克/毫升的澄清提取液。然后按与实施例4所述相同的方法进行以后的过程。获得6毫升HBsAg抗原活性为760微克/毫升的产品，在疫苗中的抗原最终产率为细胞澄清提取液所含的61%。
权利要求
1.制备乙型肝炎复合疫苗的方法，包括先在富含磷源的培养基中，然后再在能保证抗原繁殖的培养基中来培养酵母菌株-HBsAg抗原激活体，接着破坏酵母细胞、分离和纯化抗原并获得最终产品，其特征在于，利用不含磷源的培养基作为保证抗原繁殖的培养基，利用在多孔二氧化硅上的吸附色谱同时进行抗原的分离和纯化，然后按1.1～1.3千克/分米3的密度梯度进行超速离心分离。
2.按照权利要求
1所述的方法，其特征在于，利用孔径范围为1500～2000埃的二氧化硅作为多孔二氧化硅。
3.按照权利要求
1～2所述的方法，其特征在于，利用PH9.1～9.5的碳酸氢钠缓冲液进行色谱柱的解吸。
4.按照权利要求
1～3所述的方法，其特征在于，利用50%的酒石酸钾或酒石酸钠的溶液和25%的甘油溶液按1∶1的组成关系组成密度梯度来进行超速离心分离。
5.按照权利要求
1～4所述的方法，其特征在于，为了提高最终产品的产率，在破坏酵母细胞的步骤中加入了去污剂。
6.按照权利要求
5所述的方法，其特征在于，利用吐温-80作为去污剂。
专利摘要
本发明涉及生物工艺学领域。
文档编号A61K39/29GK87106697SQ87106697
公开日1988年10月5日 申请日期1987年8月13日
发明者伊格尔·维克托罗维克·克拉希尼科夫, 尼科拉·尼科拉维克·格拉诺夫斯基, 维克托尔·米克哈洛维奇·茨丹诺夫, 里姆·维克托罗维奇·彼特罗夫, 伯里斯·米克哈洛维奇·吉尔多, 伊里纳·朱里夫纳·科特科瓦 申请人:免疫所, 苏联医学科学院伊万诺夫斯基病毒所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan