氨基酸负载的三苯甲醇树脂，其生产方法，及其应用的制作方法

专利名称：氨基酸负载的三苯甲醇树脂，其生产方法，及其应用的制作方法
背景技术：
存在各种使用固相肽合成以构造具有生物活性的肽和其它治疗剂的技术。目前，用于构造肽的可选树脂是在1％DVB聚苯乙烯上的氯三苯甲基氯接头。这些树脂已知为CTC树脂和是水分敏感的且非常昂贵。2’CTC可以在$13,500/Kg价格下以100g规模购自ArgonautTechnologies，Inc.(Argonaut树脂和试剂目录，2002第170页)。然而，肽治疗的进步要求更大、合理定价数量的树脂以合成商业数量的治疗肽，生物活性物质，和成本有效的CTC树脂替代物。
虽然CTC树脂的高成本和此肽构造平台的其它缺点，本领域已尝试改进制备CTC固体载体的技术。参见，The Advanced Chem TechHandbook，William D.Bennett等人，1998，第341页，该处建议对亚硫酰氯(SOCl2)使用2eq.的吡啶。吡啶具有毒性和恶臭气味。Orosz等人报导了过量三甲基甲硅烷基氯和二甲亚砜的使用和随后采用AcCl的处理。参见，Orsoz等人，Tetrahedron Letters 39(1998)3241-3242。Orsoz工艺昂贵。也要求广泛洗涤以除去二甲亚砜(DMSO)残余物。Harre等人公开了采用过量N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和接着二氯甲烷(DCM)洗涤树脂和然后采用SOCl2处理。Harre也指出与此特定反应相关的问题。参见，Harre等人，Reactive and Functional Polymers，41(1999)111-114。Sanghvi等人(US6239220)在实施例1中公开了使用乙酰氯(AcCl)的二甲氧基三苯甲醇向二甲氧基三苯甲基氯的转化。
US专利No.5,563,220的实施例2描述了2-氯苯甲酰氯的过夜使用以形成酮树脂，随后将该酮树脂转化成醇树脂。通过采用乙酰氯的处理将醇树脂转化成氯化物形式。这些工艺要求预先CTC树脂在其上负载氨基酸。本领域需要在生物活性物质和肽治疗剂产生中消除CTC树脂的使用的工艺。
申请人发现一种生产固体负载的氨基酸树脂的方法，该方法克服了本领域中存在的问题且满足有效生产大规模数量的坚强工艺的要求。此外，与使用CTC负载的树脂的方法相比，本发明的方法导致基本降低的循环时间，降低的原材料使用量和避免了与水分敏感固体相关的处理问题，且在一个变化方案中，完全消除了CTC树脂的使用。
在本发明之前，在非亲核碱如二异丙基乙胺存在下，通过接触CTC树脂与N-保护的氨基酸，如FMOC-亮氨酸，用第一氨基酸负载初始树脂。DCM是典型的选择溶剂。此负载导致了通过2’氯三苯甲基连接到树脂上的初始氨基酸。仅在CTC中引入用于生产氯化物的水分敏感和昂贵物质，以活化树脂从而与氨基酸反应。先前教导的是必须将氯三苯甲基树脂转化成氯化物形式用于负载(US5198531)。本领域没有教导或清楚地提出聚合物结合的取代或未取代三苯甲醇的直接负载。
发明概述本发明的目的是提供制备没有氯三苯甲基氯接头-树脂的生物活性物质或治疗剂的方法。该方法包括反应活化的N-保护氨基酸或活化的氨基酸衍生物与取代或未取代的三苯甲醇树脂，以获得树脂-CT-AA产物；解保护，和然后反应树脂-CT-AA产物与生物活性物质或治疗剂的其它构件，以获得该生物活性物质或治疗剂。
在一个实施方案中，也在此提供由本方法产生的产物。在仍然进一步的变化方案中，提供用于产生治疗或其它生物活性物质的底物。
本发明的这些和其它目的从发明详述，和从说明书的其它部分来看是显然的。
发明详述本发明提供一种生产固体负载的氨基酸树脂的方法，该方法克服了本领域中存在的问题和满足有效生产大规模数量的坚强工艺的要求。此外，与使用CTC负载的树脂的方法相比，本发明的方法导致基本降低的循环时间，降低的原材料使用和降低的处理问题。本发明的许多优点和获得的测试结果是不可预料的。
在一个变化方案中，本发明提供没有氯三苯甲基氯接头-树脂或其它含卤素接头-树脂的生物活性物质或治疗剂的方法。该方法包括反应活化的N-保护氨基酸或活化的氨基酸衍生物与取代或未取代的三苯甲醇树脂，以获得树脂-CT-AA-PG(“保护基团”)产物。将树脂-CT-AA-PG产物解保护和与生物活性物质或治疗剂的其它所需构件反应，以获得生物活性物质或治疗剂。
在一个实施方案中，N-保护的活化氨基酸选自氨基酸酰氯、氨基酸酰氟、氨基酸酰溴、氨基酸混合酸酐、氨基酸活化酯、包含卤素的氨基酸，和优选FMOC-氨基酸酰氯。用于本发明的取代或未取代三苯甲醇树脂包括氯三苯甲醇树脂、甲氧基三苯甲醇树脂、二甲氧基三苯甲醇树脂、乙氧基三苯甲醇树脂、和/或二甲氧基三苯甲醇树脂。作为例子，氯三苯甲醇树脂是2’氯三苯甲醇树脂。
在进一步的方面，理解在此所述的方法可包括进行工艺步骤以使得该方法具有FDA顺应性。各种FDA顺应性获得步骤是本领域技术人员已知的。
在另一个变化方案中，本发明提供由在此所述的方法产生的产物。理解由于在此所述方法的优点，当产生在此所述的治疗剂或生物活性物质时，有氨基酸或氨基酸衍生物使用量的显著和不可预料的降低。此外，由于使用在此所述的方法降低了循环时间，可以在更短的时间期间内产生更多的药剂或物质。
在仍然另一方面，本发明包括一种制备底物的方法，在该底物上可以产生治疗剂或其它生物活性物质。该方法包括反应活化氨基酸或其衍生物与取代或未取代的三苯甲醇树脂以获得树脂-CT-AA产物。树脂-CT-AA产物然后用作其它所需组分加成的底物，该其它所需组分包括其它氨基酸、或在此所述的其它组分。
在仍然另一方面，本发明提供一种形成树脂-CT-AA产物的方法。此树脂是水分稳定的和由于它要求较少的生产步骤，其较不昂贵。与CTC树脂方法相比，该方法也产生较少的废物。描述了从中间体2’氯三苯甲醇树脂直接生产负载树脂的方法。典型地，为将结合醇到氨基酸上，人们会使用偶合剂如DIC、DCC、HBTU、TATU、PyBOP或其它偶合剂。这些活化剂昂贵，可能是危险和大体积的，减缓或停止与受阻三苯甲醇基团的反应。在非亲核碱存在下通过使用FMOC-氨基酸酰氯，可以将氨基酸直接结合到醇树脂上。氨基酸酰氯可购自Advanced Chem Tech(Louisville，KY)或可以容易地由常规技术制备。
固体负载的2’三苯甲醇可以从Aldrich Chemical购得，或它可以由本领域技术人员已知的方法合成。参见例如Orsoz等人，TetrahedronLetters(39)1998的3241-3241页，其中可以采用苯甲酰氯和路易斯酸催化剂，将交联的聚苯乙烯珠粒转化成聚合物负载的二苯酮。然后采用苯基锂将获得的二苯酮官能度转变成三苯甲醇官能度。然后通过本发明的方法准备将固体负载的三苯甲醇转化成氨基酸负载的树脂。
固体负载的三苯甲醇可以是取代或未取代的。取代基包括，但不限于卤素，卤素包括但不限于氯、溴和氟；取代或未取代的烷氧基，该烷氧基包括但不限于乙氧基、甲氧基、丙氧基、亚甲氧基、亚乙氧基、乙二醇、和丙二醇；取代或未取代的烷基聚醚基团，该聚醚基团包括但不限于二甘醇、二丙二醇、三甘醇、和三丙二醇；取代或未取代的含有1-6个碳原子的低级烷基，该低级烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、和三氟甲基；取代或未取代的芳基，该芳基包括但不限于苯基、苄基、甲苯基、甲氧基苯基、和氯苯基、取代或未取代的杂芳基、和取代或未取代的环烷烃。
用于本发明实施的非亲核碱化合物包括，但不限于二异丙基乙胺(DIEA)、三乙胺、吡啶、2，4，6-可力丁、DMAP、苯基二甲胺、其它取代胺及其混合物。更优选的非亲核碱化合物是二异丙基乙胺(DIEA)、三乙胺、和吡啶及其混合物。最优选的非亲核碱化合物是三乙胺。
含酰胺的催化剂化合物的优选范围是0.5-10.00eq，更优选的范围是0.7-5eq，和最优选的范围是1-3eq。
在本发明的一个方面，消除昂贵的树脂官能化步骤和相关的洗涤步骤。此方法也采用具有更长存放期的水分稳定和较不昂贵树脂，替换具有有限存放期的水分敏感树脂的使用。因此，在此所述的方法提供相对于常规树脂显示更长，优异存放期的负载树脂。理解本发明的这些优点是不可预料的。
典型地在负载之后封端肽树脂。这可以采用甲醇进行，得到取代或未取代的三苯甲基甲基酯。其进行以防止新肽链的基团(该基团不被第一氨基酸酯化)和破坏产物纯度。采用本发明的较不反应性CTOH树脂允许构造肽而不采用甲醇封端。在本发明的一个变化方案中，由于CTOH是颇为受阻，不活化，和不与典型的大体积活化(DCC、HBTU、PyBOP等)氨基酸反应，人们不需要进行端封。这也使树脂更为亲水且增加在聚合物凝胶中肽/氨基酸的溶解度。在本发明的另一个变化方案中，其中发现残余CTOH是反应性的，非必要地采用乙酰氯、乙酸酐或其它所需的封端化合物将它封端。
理解本发明极大地影响树脂的循环，和提供具有增加循环性的树脂。如果与如下文献中的新低空隙空间共聚物结合甚至更极大地提供此优点Bohling等人，2002年8月16日提交的，题目为“低空隙空间树脂”(摘要号DN#A01406)的U.S.临时专利申请系列No.60/404,045，该文献如在此完全说明的那样引入作为参考。
典型地为循环此树脂，人们采用在有机溶剂中的稀酸从树脂断裂肽。然后将获得的三苯甲基碳正离子采用碱骤冷以得到CTOH树脂，然后将该CTOH树脂洗涤和采用SOCl2或AcCl处理以再生水分敏感的CTC。此方法概略于如完全说明的那样在此引入的US6239220B1，和讨论于Harre等人(反应性和官能聚合物41(1999)111-114)。此外，跳过氯化反应和产生水分不敏感产物的益处，该方法也避免了断裂封端甲氧基的要求，允许更温和的断裂条件和更高的循环产量。
可用于本发明，和负载在此处所述树脂上的例示“氨基酸”是由NH2--CHR--COOH表示的化合物，其中R是H、脂族基团、取代的脂族基团、芳族基团或取代的芳族基团。在自然界中发现“天然氨基酸”。例子包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和组氨酸。R是氨基酸的侧链。天然氨基酸侧链的例子包括甲基(丙氨酸)、异丙基(缬氨酸)、仲丁基(异亮氨酸)、--CH2CH(--CH)2(亮氨酸)、苄基(苯基丙氨酸)、对羟基苄基(酪氨酸)、--CH2OH(丝氨酸)、CHOHCH3(苏氨酸)、--CH2-3-吲哚基(色氨酸)、--CH2COOH(天冬氨酸)、CH2CH2COOH(谷氨酸)、--CH2C(O)NH2(天冬酰胺)、--CH2CH2C(O)NH2(谷氨酰胺)、--CHSSH(半胱氨酸)、CH2CH2SCH3(蛋氨酸)、--(CH2)4NH2(赖氨酸)、--(CH2)3NH2(鸟氨酸)、-[(CH)2]4NHC(.-dbd.NH)NH2(精氨酸)和--CH2-3-咪唑基(组氨酸)。丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的侧链是脂族的，即仅包含碳和氢，和每个在此称为“天然氨基酸的脂族侧链”。
可用于本发明的其它天然氨基酸的侧链包括含杂原子的官能团，如醇(丝氨酸、酪氨酸、羟脯氨酸和苏氨酸)、胺(赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸和精氨酸)、硫醇(半胱氨酸)或羧酸(天冬氨酸和谷氨酸)。当改性含杂原子的官能团以包括保护基团时，该侧链称为氨基酸的“保护的侧链”。
合适保护基团的选择依赖于被保护的官能团，保护基团曝露的条件和分子中可存在的其它官能团。用于以上讨论的官能团的合适保护基团描述于Greene和Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基团)”，John Wiley & Sons(1991)，该文献的整个教导内容如在此完全说明的那样引入此说明书作为参考。只使用常规试验，熟练技术人员可选择用于公开的合成中的合适保护基团，该保护基团包括除如下描述的那些以外的保护基团，以及用于施加和除去保护基团的条件。
合适醇保护基团的例子包括苄基、烯丙基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、乙酸酯等。合适氨基保护基团的例子包括苄氧基羰基、叔丁氧基羰基、叔丁基、苄基和芴基甲氧基羰基(Fmoc)。叔丁氧基羰基是优选的胺保护基团。合适羧酸保护基团的例子包括叔丁基、Fomc、甲基、甲氧基甲基、三甲基甲硅烷基、苄氧基甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基等。叔丁基是优选的羧酸保护基团。合适硫醇保护基团的例子是S-苄基、S-叔丁基、S-乙酰基、S-甲氧基甲基、S-三苯甲基等。
赖氨酸、天冬氨酸和苏氨酸是优选在本发明一个变化方案中保护的氨基酸侧链的例子。脂族基团包括直链、支化C1-C8或环状C3-C8烃，该烃是完全饱和的或包含一个或多个不饱和单元。在一个例子中，脂族基团是C1-C4烷基。芳族基团包括碳环芳族基团如苯基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基和2-蒽基，杂环芳族基团如N-咪唑基、2-咪唑、1-噻吩基、3-噻吩基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、2-吡喃基、3-吡喃基、3-吡唑基、4-吡唑基、5-吡唑基、2-吡嗪基、2-噻唑、4-噻唑、5-噻唑、2-噁唑基、4-噁唑基和5-噁唑基。
芳族基团也包括稠合多环芳族环体系，其中碳环芳族环或杂芳基环稠合到一个或多个其它杂芳基环上。例子包括2-苯并噻吩基、3-苯并噻吩基、2-苯并呋喃基、3-苯并呋喃基、2-吲哚基、3-吲哚基、2-喹啉基、3-喹啉基、2-苯并噻唑、2-苯并噁唑、2-苯并咪唑、2-喹啉基、3-喹啉基、1-异喹啉基、3-喹啉基、1-异吲哚基、3-异吲哚基、和吖啶基。
芳族基团和脂族基团的合适取代基是与公开的反应相容的那些，即不显著降低反应收率和不引起显著量的副反应。合适的取代基一般包括脂族基团、取代的脂族基团、芳基、卤素、卤代烷基(如三卤代甲基)、硝基、腈、--CONHR、--CON(R)2、--OR、--SR、--S(O)R、--S(O)2R，其中每个R独立地是脂族基团、或芳基。尽管某些官能团可能不与一个或多个公开的反应相容，这些官能团可以保护的形式存在。然后可除去保护基团以再生原始官能团。只使用常规试验，熟练技术人员能够选择与公开的反应相容的保护基团。
肽模拟物，或其组分也可用于本发明、如在此所述负载到树脂上、或由在此所述的方法产生。肽模拟物是具有对肽足够结构相似性的化合物，使得由模拟物保持肽的所需性能。例如，用作治疗HIV感染的蛋白酶抑制剂的肽模拟物，公开于Tung等人，WO94/05639、Vazquez等人，WO94/04491、Vazquez等人，WO94/10134和Vazquez等人，WO94/04493。这些公开文献的完全相关教导在此引入作为参考。为用作药物，肽模拟物应当保持肽的生物活性，但也具有一种或多种与被模拟的肽相比改进的性能。例如，一些肽模拟物在体内耐水解或降解。制备肽模拟物的一种策略是采用基团替换一个或多个氨基酸残基，该基团与被替换的氨基酸残基结构相关和可形成肽键。可用于替换肽中氨基酸残基的新氨基酸衍生物的开发会促进新肽模拟物药物的开发。
例示肽模拟物描述于Gabriel，Richard L.等人，2002年12月12日提交的，题目为“氨基酸衍生物及其制备方法”的美国专利申请系列No.20020188135。此专利申请如完全说明的那样在此引入作为参考。同样用于本发明的是这些化合物的生理可接受盐。例如，可以通过与合适的有机或无机酸，如氯化氢、溴化氢、乙酸、高氯酸等反应，获得包含胺或其它碱性基团的化合物盐。含有季铵基团的化合物也包含反荷阴离子(counteranion)如氯根、溴根、碘根、乙酸根、高氯酸根等。可以通过与合适的碱，例如氢氧化物碱反应制备包含羧酸或其它酸性官能团的化合物盐。酸性官能团的盐包含反荷阳离子(countercation)如钠、钾等。
本发明也用于治疗剂和生物活性物质的产生和制造，该治疗剂和生物活性物质含有一个或多个肽、肽衍生物、或肽模拟物作为其构件或组分。也可以由本发明产生由酯官能度终止的化合物或化合物片段。使用本发明制造或产生的治疗剂可随组合物的目的而广泛地变化。药剂可描述为单一实体或实体的结合。设计输送系统以与具有高水溶性的治疗剂或与具有低水溶性的那些一起使用，以生产具有受控释放速率的输送系统。术语“治疗剂”和“生物活性物质”非限制性地包括药剂；维生素；矿物质补充物；用于疾病或病情治疗、预防、诊断、治愈或减轻的物质；或影响身体结构和功能的物质；或药物前体，在将其放置在预定的生理环境中之后它们变成生物活性的或更为活性的。
有用治疗剂和生物活性物质的例子包括如下扩展的治疗类别同化激素类药、抗酸剂、抗哮喘剂、抗胆固醇剂和抗脂质剂、抗凝血剂、抗惊厥剂、止泻剂、止吐药、抗感染剂、抗炎剂、抗躁狂剂、止恶心剂、抗肿瘤剂、抗肥胖剂、解热剂和止痛剂、镇痉剂、抗血栓剂、抗尿血剂、抗心绞痛药、抗组胺剂、镇咳药、食欲抑制剂、生物制剂、脑扩张剂、冠状扩张剂、减充血剂、利尿剂、诊断剂、红细胞生成剂、祛痰剂、胃肠镇静剂、促血糖增高剂、催眠剂、降血糖剂、离子交换树脂、缓泻剂、矿物质补充物、粘液溶解剂、神经肌肉药物、末梢血管扩张药、精神药物、镇静剂、刺激剂、甲状腺粉和抗甲状腺剂、子宫松弛剂、维生素、抗原材料、和药物前体。
有用治疗剂和生物活性物质的其它例子也包括(a)抗肿瘤剂、抗代谢物、细胞毒素剂、免疫调节剂；(b)镇咳药；(c)抗组胺剂；(d)减充血剂；(e)各种生物碱；(f)抗心律不齐药；(g)解热药；(h)食欲抑制剂；(i)祛痰剂；(j)抗酸剂；(k)生物制剂如肽、多肽、蛋白质和氨基酸、激素、干扰素或细胞因子和其它生物活性肽化合物，如HGH、tPA、降钙素、ANF、EPO和胰岛素；(l)抗感染剂如抗真菌剂、抗病毒剂、抗菌剂和抗生素；和(m)抗原材料，特别是在疫苗应用中发现的那些。
治疗剂或生物活性物质可非必要地包括含DNA或RNA的生物活性物质、含多糖的生物活性物质、生长因子、激素、血管生成抑制剂、干扰素或细胞因子、和药物前体。以治疗有效的数量使用在此所述方法产生的治疗剂。尽管治疗剂的有效量依赖于使用的特定材料，约1％-约65％的治疗剂数量是有用的。可以使用更小或更大的数量以达到某些治疗剂治疗的有效水平。
实施例1表面官能化交联珠粒由Fmoc-L-亮氨酸酰氯的负载将根据Bohling等人，2002年8月16日提交的，题目为“用于固相合成的树脂(DN# A010407)”的U.S.临时专利申请系列No.60/404,044生产的2-氯三苯甲醇树脂，该文献如完全说明的那样在此引入作为参考，采用Fmoc-L-亮氨酸负载，采用甲醇处理以除去残余的溶剂并干燥。重量增量用于定量化负载。假定树脂的能力是1.3mmol/g。将一部分树脂采用1％TFA/DCM断裂，并由HPLC分析溶液以确定氨基酸的断裂收率(回收率)。
将每个树脂样品(1.0000+/-0.05g)称重加入含有侧口和可除去盘的60mL玻璃合成器容器。采用二氯甲烷(DCM)预溶胀合成器中的树脂。排出DCM和向每个合成器中加入Fmoc-L-Leu-Cl和二异丙基乙胺(DIEA)在10ml DCM中的溶液。开始缓慢的氮气搅拌。每个样品，分别地以克计的Fmoc-L-Leu-OH数量是0.358，和以mL计的DIEA数量是0.177。使每个混合物在环境温度下反应两小时，然后将溶液排出。如需要，采用在DCM(10mL)中的DIEA(1mL)和乙酰氯(2mL)处理至少30分钟，而将任何剩余的三苯甲醇端基封闭。将每个树脂样品采用5×10mL部分的DCM洗涤和转移到配衡的30mL多孔玻璃漏斗中，然后采用另外2×10mL部分的DCM洗涤。然后将每个负载的树脂采用4×10mL部分的异丙醇(IPA)解溶胀和由如下方式部分干燥采用真空通过滤饼拉动空气，然后在真空烘箱中在30℃下干燥过滤器和树脂过夜。然后将过滤器和树脂再称重和计算质量的差异。Leu的质量＝最终重量-(过滤器皮重+1.000g树脂)。
T-20实施例此实施例描述已知为T-20的肽的十个肽片段制备，该肽于U.S.Pat.No.6,015,881，表1，描述为包含氨基酸17-26的肽No.11。U.S.Pat.No.6,015,881在此如完全说明的那样引入作为参考。通过在偶合期间周期性取树脂样和运行Kaiser测试以确定任何未反应伯胺的存在，而研究反应动力学。将树脂与两种对比树脂比较，一种对比树脂来自Novabiochem，和另一种对比树脂来自Polymer Labs。
如在实施例1中那样，将2-氯三苯甲醇树脂采用Fmoc-L-亮氨酸Cl负载。将树脂样品(1.0g)称重加入含有侧口和可除去盘的60mL玻璃合成器容器。将DCM(10mL)加入到容器中和采用氮气搅拌30分钟，然后排出。然后通过如下方式解保护亮氨酸衍生的树脂加入10mL哌啶在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的25％溶液，搅拌10分钟，排液和重复一次。通过采用7×10mL体积NMP洗涤而除去解保护残余物。通过在室温下将1.5eq氨基酸(以此顺序首先加入Fmoc-glu(t-Bu)-OH，关于加入量和化学式量参见表)，1.5eq的1-羟基苯并三唑(HOBT)(0.149g)和1.5eq的DIEA(0.126g)溶于7.5mL NMP，制备序列中下一氨基酸的活化酯。然后骤冷溶液和加入1.5eq的六氟磷酸O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’，-四甲基脲鎓(HBTU)(0.370g)并搅拌30分钟。然后将DCM(2.5mL)加入到溶液中且使其静置30分钟。然后将活化的氨基酸溶液加入到排出的树脂中和采用氮气搅拌。每15分钟获得和分析样品(Kaiser测试)并记录结果。在反应完成时，将树脂排出和采用NMP(3×10mL)洗涤。然后对于序列中的剩余氨基酸，从采用哌啶的解保护重复此过程。(Glu(tBu)，Lys(Boc)，Asn(trt)，Glu(tBu)，Gln(trt)，Glu(tBu)，leu，leu)。理解与其它已知技术相比，使用在本发明中所述方法和组分的肽合成循环时间极大地降低。
表1肽合成效率比较
以到阴性(negative)Kaiser测试的时间给出结果。
附录1 AA使用单体 fwt 要求的克数FMOC Glu(t-Bu) 425.48 0.415FMOC Lys(Boc) 468.55 0.457FMOC Asn(trt) 596.68 0.582FMOC Glu(t-Bu) 425.48 0.415FMOC Gln(trt) 610.71 0.595FMOC Glu(t-Bu) 425.48 0.415FMOC Leu 353.42 0.345FMOC Leu 353.42 0.345FMOC Glu(t-Bu) 425.48 0.415HOBT 153.15 0.149DIEA 129.25 0.126HBTU 379.25 0.370LeuCT-树脂(g)＝ 1.00总NMP 1035.5mL负载水平(mmol/g)＝ 0.65总DCM 72.5mL样品数目＝ 1.00总哌啶 32mL总树脂(g)＝ 1.00总HOBT 1.344g总mmol＝0.65总DIEA 1.134G单体加料的eq.＝ 1.50总HBTU 3.328G每个步骤的偶合循环＝1.00单体使用/循环(mmol)＝ 0.975加入的AA9理解在此所述的方法可用于肽，特别是T-20，和T-20类肽的非常低成本和有效的合成。这样的方法采用固相和液相合成过程以合成和结合具体肽片段的组，以得到感兴趣的肽。在其它的变化方案中，也产生单个肽片段，该片段用作感兴趣肽(如T-20)合成中的中间体。在仍然另一个方面，本发明提供这样肽中间体片段的组，该组可以一起被采用以生产全长型T-20和T-20类肽。本领域技术人员理解基本降低了用于生产肽的循环时间，该肽包括但不限于包括许多更小片段的组合体的T-20，其处于聚集体中。不仅仅降低循环时间，而且极大地降低了废物，和极大地增加了效率。
在另一方面，精制由在此所述方法产生的肽或肽片段，和/或也精制用作目标肽合成中的中间体的单个肽片段。
进一步理解本发明也可用于产生肽和肽片段，该肽和肽片段显示抑制融合相关活动的能力，和也显示有效的抗病毒活性。这些肽和肽片段描述于U.S.Pat.Nos.5,464,933、5,656,480和PCT公开No.WO96/19495，该文献在此如明确说明的那样引入作为参考。本发明提供在大规模数量下产生这些治疗剂的方法。
使用固相和液相合成过程制备T-20和T-20片段，以合成和结合具体肽片段的组以得到感兴趣的肽。一般情况下，本发明的方法包括在由在此所述本发明产生的固体载体上，合成T-20或T-20类肽具体侧链保护的肽片段中间体，在溶液中偶合保护的片段以形成保护的T-20或T-20类肽，随后进行侧链的解保护以得到最终的T-20或T-20类肽。本发明方法的优选实施方案包括具有氨基酸序列如U.S.专利No.6,015,881(“881专利”)中所示的T-20肽合成。
本发明进一步涉及单个肽片段，该片段用作感兴趣肽(如T-20)的合成中的中间体。本发明的肽片段包括，但不限于氨基酸序列如’881专利中所示的那些。
理解本发明也可使用常规技术，使用CTC-树脂，产生一个或多个肽片段，和使用在此所述的技术，使用醇类树脂，产生一个或多个肽片段。其后可结合获得的肽以获得T-20肽或T-20类肽。
理解除T-20以外，本发明的方法，片段和片段组和用于选择片段和片段组的技术可用于合成T-20类片段。术语“T-20类”在此用于表示列于U.S.Pat.Nos.5,464,933、5,656,480或PCT公开No.WO96/19495的任何HIV或非HIV肽，每个文献在此全文引入作为参考。
除以上所述的T-20和T-20类肽以外，本发明的方法，片段和片段组可用于合成含有改性氨基和/或羧基端基的肽。
在优选的实施方案中，本发明的方法用于合成具有通式的肽，其中X是乙酰基和Z是酰胺基团。在优选的方法中，可以使用任何非二氧化硅类塔填料(为了负载能力的最大化)精制T-20和T-20类肽和中间体，该填料包括但不限于锆类填料、聚苯乙烯、聚丙烯酸类物或在高(大于＞7)pH范围下稳定的其它聚合物类填料。例如，在显示宽pH范围的非二氧化硅负载塔填料中，该pH包括大于由Tosohaus(Montgomeryville，Pa.)销售的产品的pH值。由这样材料填充的塔可以在低、中或高压色谱中运行。
本发明也提供如在’881专利的表1中所列的具有特定氨基酸序列的T-20和T-20类肽的肽片段中间体，和’881专利的表2中所列的肽片段中间体组的大规模有效生产。这样的肽中间体，特别是’881专利的表2中所列的组中的肽中间体用于生产T-20和T-20类肽。
可以采用标准保护基团如叔丁基(t-Bu)、三苯甲基(trt)和叔丁氧基羰基(Boc)保护肽片段氨基酸残基的任意一个或多个侧链。t-Bu基团是氨基酸残基Tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)和Asp(D)的优选侧链保护基团；trt基团是氨基酸残基His(H)、Gln(Q)和Asn(N)的优选侧链保护基团；和Boc基团是氨基酸残基Lys(K)和Trp(W)的优选侧链保护基团。
在片段的合成期间，要保护组氨酸残基的侧链，优选采用三苯甲基(trt)保护基团保护组氨酸残基的侧链。如果不保护，用于从树脂断裂肽片段的酸可有害地与组氨酸残基反应，引起肽片段的降解。
采用三苯甲基(trt)基团保护本发明肽片段的谷氨酰胺残基。然而，可以在某些片段的羧基末端不保护谷氨酰胺残基。可以保护本发明每个肽片段的所有天冬酰胺残基。此外，采用Boc基团保护色氨酸残基。
使用在此所述的固相合成技术制备一些单个肽片段，而使用固相和溶液相合成技术的结合非必要地制备本发明的其它肽。或者可合成本发明的肽使得连接肽的氨基酸残基的一个或多个键是非肽键。这些另外的非肽键可以采用本领域技术人员公知的反应形成，和可包括但不限于亚氨基、酯、酰肼、氨基脲、和偶氮键，其是列举但只是少数。
在本发明的仍然另一个实施方案中，可以采用在它们的氨基和/或羧基末端存在的另外化学基团合成包括上述序列的T-20和T-20类肽，使得例如，增强肽的稳定性，反应性和/或溶解性。例如，可以将疏水性基团如苄氧羰基、丹磺酰基、乙酰基或叔丁氧基羰基加到肽的氨基末端。同样，可以在肽的氨基末端布置乙酰基或9-芴基甲氧基-羰基。另外，可以将疏水性基团，叔丁氧基羰基、或酰氨基加到肽的羧基末端。相似地，可以在肽的羰基末端布置对硝基苄基酯基团。
此外，可以合成T-20和T-20类肽使得改变它们的空间构型。例如，可以使用肽的一种或多种氨基酸残基的D-异构体，而不是通常的L-异构体。
仍然进一步，本发明肽的至少一个氨基酸残基可以由一种公知的非天然氨基酸残基取代。如这些的改变可用于增加本发明肽的稳定性，反应性和/或溶解性。
优选，使用标准FMOC方案由在此所述的固相肽合成(SPPS)技术合成本发明的一个或多个肽片段，参见如Carpino等人，1970，J.Am.Chem.Soc.92(19)5748-5749；Carpino等人，1972，J.Org.Chem.37(22)3404-3409。在本发明的另一个变化方案中，在超酸敏感性固体载体上，使用本发明的肽片段的固相合成制备一个或多个片段，该固体载体包括，但不限于2-氯三苯甲基氯树脂(参见，如Barlos等人，1989，Tetrahedron Letters 30(30)3943-3946)和4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸树脂(参见如Seiber，1987，Tetrahedron Letters28(49)6147-6150，和Richter等人，1994，Tetrahedron Letters 35(27)4705-4706)。2-氯三苯甲基氯树脂和4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸树脂两者可以购自Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego，Calif。
除在此所述的新颖技术以外，或与在此所述的新颖技术结合，可以使用常规技术的树脂生产和负载的一般过程。可以使用例如，通过如下技术进行的树脂负载制备一些片段将树脂，优选超酸敏感性树脂如2-氯三苯甲基树脂加入到反应腔中。将树脂采用氯化溶剂如二氯甲烷(DCM)洗涤。将床排液和加入1.5当量氨基酸和2.7当量二异丙基乙胺(DIEA)在约8-10个体积的二氯乙烷(DCE)中的溶液。应当保护氨基酸的N-末端，优选采用Fmoc保护氨基酸的N-末端，和其中必须或适当地应当保护氨基酸的侧链。将混合物采用氮气鼓泡而搅拌2小时。在搅拌之后，将床排液和采用DCM洗涤。将树脂上的活性位置采用9∶1的MeOH∶DIEA溶液封端约20-30分钟。将床排液，采用DCM洗涤4次和采用氮气净化干燥以得到负载的树脂。然后按照标准洗涤，解保护，偶合和断裂方案构造片段。使用在此所述的新颖技术制备其它片段。然后如所述结合由各种技术制备的片段。
Fmoc是氨基酸N-末端的优选保护基团。依赖于要负载的氨基酸，可以保护或可以不保护它的侧链。例如，当负载Trp时，应当采用Boc保护它的侧链。相似地，可以采用trt保护Gln的侧链。然而，当在1-16个肽片段合成的制备中负载Gln时，应当不保护它的侧链。不需要保护Leu的侧链。
用于负载树脂和用于肽合成的Fmoc保护的氨基酸可购自Sean或Genzyme，含有或不含有如要求的侧链保护基团。可以使用在此所述的新颖技术，单独或与其它常规技术结合，制备描述于U.S.专利No.6,281,331(如完全说明的那样在此引入作为参考)的其它例示肽和片段。
实施例2人降钙素的侧链保护片段24-33(Boc-Cys(Trt)-Gly-Asn(Trt)-Leu-Ser-(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-OH)的合成将根据Bohling等人，2002年8月16日提交的，题目为“用于固相合成的树脂”的DN# A010407，U.S.临时专利申请系列No.60/404,044(如完全说明的那样在此引入作为参考)生产的2-氯三苯甲醇树脂，采用Fmoc-L-甘氨酸负载，采用甲醇处理以除去残余的溶剂并干燥。重量增量用于定量化负载。假定树脂的能力是1.3mmol/g。将一部分树脂采用1％TFA/DCM断裂，和由HPLC分析溶液以确定氨基酸的断裂收率(回收率)。
初始负载将每个树脂样品(1.0000+/-0.05g)称重加入含有侧口和可除去盘的60mL玻璃合成器容器。采用二氯甲烷(DCM)预溶胀合成器中的树脂。排出DCM和向每个合成器中加入Fmoc-L-Gly-Cl和二异丙基乙胺(DIEA)在10ml DCM中的溶液。开始缓慢的氮气搅拌。每个样品，分别地以克计的Fmoc-L-Leu-OH数量是0.358，和以mL计的DIEA数量是0.177。使每个混合物在环境温度下反应两小时，然后将溶液排出。如需要，采用在DCM(10mL)中的DIEA(1mL)和乙酰氯(2mL)处理至少30分钟，而将任何剩余的三苯甲醇端基封闭。将每个树脂样品采用5×10mL部分的DCM洗涤和转移到配衡的30mL多孔玻璃过滤漏斗中，然后采用另外2×10mL部分的DCM洗涤。然后将每个负载的树脂采用4×10mL部分的异丙醇(IPA)解溶胀和由如下方式部分干燥采用真空通过滤饼拉动空气，然后在真空烘箱中于30℃下干燥过滤器和树脂过夜。然后将过滤器和树脂再称重和计算质量的差异。Gly的质量＝最终重量-(过滤器皮重+1.000g树脂)。
肽构造如在实施例1中那样，将2-氯三苯甲醇树脂采用Fmoc-L-Gly-Cl负载。将树脂样品(1.0g)称重加入含有侧口和可除去盘的60mL玻璃合成器容器。将DCM(10mL)加入到容器中和采用氮气搅拌30分钟，然后排出。然后通过如下方式解保护甘氨酸衍生的树脂加入10mL哌啶在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的25％溶液，搅拌10分钟，排液和重复一次。通过采用7×10mL体积NMP洗涤而除去解保护残余物。通过在室温下将1.5eq氨基酸(以此顺序首先加入Fmoc-Leu-OH，关于加入量和化学式量参见表)，1.5eq的1-羟基苯并三唑(HOBT)(0.149g)和1.5eq的DIEA(0.126g)溶于7.5mL NMP，制备序列中下一氨基酸的活化酯。然后骤冷溶液和加入1.5eq的六氟磷酸O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’，-四甲基脲鎓(HBTU)(0.370g)并搅拌30分钟。然后将DCM(2.5mL)加入到溶液中并使其静置30分钟。然后将活化的氨基酸溶液加入到排出的树脂中和采用氮气搅拌。每15分钟获得和分析样品(Kaiser测试)并记录结果。在反应完成时，将树脂排出和采用NMP(3×10mL)洗涤。然后对于序列中的剩余氨基酸，从采用哌啶的解保护重复此过程。(Met，Cys(Trt)，Thr(tBu)，Ser(tBu)Leu，Asn(Trt)，Gly，Cys(Trt))。
然后通过加入14mL在DCM中的1％TFA和混合5分钟，断裂肽。然后将断裂溶液收集入包含相对TFA等同量吡啶的烧瓶中。重复断裂和结合2个断裂溶液。将溶剂交换成乙醇和通过加入水而沉淀产物。收集固体和采用水洗涤，然后在室温下干燥。
使用在此所述的方法，已经产生了人降钙素的三(3)个片段。已经产生了具有如下序列的三个例示片段片段1HGln(Trt)-Thr(tBu)-Ala-IIe-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-Gly-CTC片段2Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln(tBu)-Asp(OtBu)-Phe-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Phe-His(Trt)-Thr(tBu)-Phe-Pro-OH片段3Boc-Cys(Trt)-Gly-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr-(tBu)-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-OH
附录2 AA使用附录1 AA使用单体 fwt要求的克数FMOC Gly 297.32 0.357FMOC Leu 353.42 0.424FMOC Met 371.46 0.446FMOC Cys(Trt) 585.72 0.703FMOC Thr(t-Bu) 397.46 0.477FMOC Ser(t-Bu) 383.44 0.460FMOC Leu 353.42 0.424FMOC Asn(trt) 596.68 0.716596.680.582FMOC Gly 297.32 0.357FMOC Cys(Trt) 585.72 0.703HOBT 153.15 0.149DIEA 129.25 0.126HBTU 379.25 0.370LeuCT-树脂(g)＝ 1.00 总NMP 1035.5mL负载水平(mmol/g)＝ 0.65 总DCM 72.5mL样品数目＝ 1.00 总哌啶 32mL总树脂(g)＝ 1.00 总HOBT 1.344g总mmol＝ 0.65 总DIEA 1.134g单体加料的eq.＝ 1.50 总HBTU 3.328g每个步骤的偶合循环＝ 1.00单体使用/循环(mmol)＝0.975加入的AA 9实施例3
T-1249的合成在此所述的方法和底物也可用于构造描述于U.S.专利No.6,469,136(′136专利)的多肽，该专利如完全说明的那样在此引入作为参考。特别地，可以使用在此所述的新颖技术，单独或与在此所述的常规方法结合，构造在此称为T-1249和T-1249类肽的肽。这些方法采用固相和液相合成过程，以合成和结合特定肽片段的组，以得到感兴趣的肽。
在此描述肽，特别是在此称为T-1249和T-1249类肽的肽合成的新颖方法。这些方法采用固相和液相合成过程，以合成和结合特定肽片段的组，以得到感兴趣的肽。一般情况下，该方法包括在固体载体上合成T-1249或T-1249类肽的特定侧链保护的肽片段中间体，在溶液中偶合保护的片段以形成保护的T-1249或T-1249类肽，随后进行侧链的解保护以得到最终的T-1249或T-1249类肽。本发明方法的优选实施方案包括具有氨基酸序列如’136专利中所示的T-1249肽。
本发明进一步提供构造单个肽片段的低成本，高度有效的方法，该肽片段用作感兴趣的肽(如T-1249)合成中的中间体。本发明的肽片段包括，但不限于，氨基酸序列如’136专利的表1中所示的那些。
在此所述的固相液相合成反应的结合允许以大规模制造高纯度T-1249和T-1249类肽，其具有比现有技术中所述那些更高的产量和更高的收率。可以一千克或更多千克的规模合成T-1249和T-1249类肽。
全长型肽的产生本发明用于合成已知为T-1249的肽。T-1249是39个氨基酸残基多肽，它的序列衍生自HIV-1，HIV-2和SIV gp41病毒多肽序列。理解除T-1249以外，本发明的方法，片段和片段组和用于选择片段和片段组的技术可用于合成T-1249类片段。在此使用的术语“T-1249类”表示以下文献中所列的任何HIV或非HIV肽1999年5月20日提交的国际申请No.PCT/US99/11219，1999年11月25日公开的国际公开No.WO99/59615，该文献在此全文引入作为参考。
除上述T-1249和T-1249类肽以外，本发明的方法，片段和片段组可用于合成含有改性氨基和/或羧基端基的肽，或其它聚合物类填料，它们在高和低pH范围下稳定。
肽中间体也使用在此所述的新颖方法，单独或与其它本领域方法结合，构造特定氨基酸序列如’136专利的表1中所列的T-1249和T-1249类肽的一个或多个肽片段中间体，和如’136的专利表2中所列的一个或多个肽片段中间体组。
肽合成优选使用固相合成技术制备单个肽片段，而非必要地使用固相和溶液相合成技术的结合制备本发明的其它肽。合成在T-1249或T-1249类肽的生产中达到极点。
可另外合成本发明的肽使得一个或多个键是非肽键，该键连接肽的氨基酸残基。这些另外的非肽键可以采用本领域技术人员公知的反应形成，且可包括但不限于亚氨基、酯、酰肼、氨基脲、和偶氮键，这些键是列举但只是少数。此外，可以合成T-1249和T-1249类肽使得改变它们的空间构型。例如，可以使用肽的一种或多种氨基酸残基的D-异构体，而不是通常的L-异构体。
仍然进一步，本发明肽的至少一个氨基酸残基可以由一种公知的非天然氨基酸残基取代。如这些的改变可用于增加本发明肽的稳定性，反应性和/或溶解性。可以合成任何T-1249或T-1249类肽以另外具有共价连接到它的氨基和/或羧基末端的大分子载体基团。这样的大分子载体基团可包括，例如，脂质-脂肪酸共轭物、聚乙二醇、碳水化合物或另外的肽。
使用在此所述的新颖技术制备氨基酸负载的树脂。在搅拌之后，将床排液和采用DCM洗涤。将床排液，采用DCM洗涤4次并采用氮气净化干燥以得到负载的树脂。
Fmoc是氨基酸N-末端的优选保护基团。依赖于要负载的氨基酸，可以保护或可以不保护它的侧链。例如当负载色氨酸(Trp)时，应当采用Boc保护它的侧链。然而，不需要保护亮氨酸(Leu)的侧链。优选，将谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)保护为叔丁基醚或叔丁基酯。和将色氨酸(Trp)和赖氨酸(Lys)保护为叔丁氧基羰基氨基甲酸酯(Boc)。可以采用或可以不采用三苯甲基保护天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)的酰胺侧链。
同时，将要加入到树脂的序列中的随后氨基酸在它的羧基末端活化用于反应。应当采用Fmoc保护每种氨基酸的胺末端。依赖于加入的氨基酸，可以保护或可以不保护它的侧链。优选，采用t-Bu保护tyr(Y)，Thr(T)，Ser(S)，Glu(E)和Asp(P)的侧链；采用trt保护Gln(Q)和Asn(N)的侧链，和采用Boc保护Lys(K)和Trp(w)的侧链。不需要保护Leu或Ile的侧链。
氨基酸可以按如下方式活化。在室温下，将Fmoc保护的氨基酸(1.5eq)，1-羟基苯并三唑水合物(HOBT)(1.5eq)，和二异丙基乙胺(DIEA)(1.5eq)溶于极性，非质子溶剂如N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基乙酰胺(DMAC)(约7.5vol)。将溶液急冷到0-5℃和然后加入六氟磷酸O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’，-四甲基脲鎓(HBTU)或O-苯并三唑-1-基-四甲基四氟硼酸酯(HBTU)(1.5eq)，随后搅拌5-15分钟以溶解。重要的是在0-5℃下进行活化以最小化氨基酸的外消旋化。HBTU是最后加入到冷溶液中的试剂，因为它不存在时不能进行活化和外消旋化。
将活化的氨基酸的溶液加入到排液的树脂中，采用DCM(大约2.5vol)洗涤。注意由于HBTU在DCM中的不溶性，在NMP中进行氨基酸的活化。然而，在此点之前将DCM加入到反应中以保持树脂珠粒的适当溶胀。在20-30℃下采用N2鼓泡约1小时而搅拌反应。
如果在偶合循环之间要将树脂贮存过夜，可以将树脂床排液和在氮气保护下采用NMP覆盖。或者，可以将床排液，在氮气保护下贮存，然后在进行下一个偶合循环之前采用DCM洗涤调节。如果在断裂之前要将完成的片段贮存过夜，由于可以在NMP中发生显著的Fmoc解保护，应当将树脂床采用IPA洗涤到没有NMP。
在判断偶合完成之后，将树脂排液和采用3个NMP的等分试样(大约10vol)洗涤。对于肽片段的随后链节(即氨基酸)重复循环。在最终的偶合反应之后，将树脂采用4个NMP的等分试样(大约10vol)洗涤，然后采用2个等分试样(大约10vol)的DMC和2 IPA洗涤。可以采用氮气净化或在烘箱中干燥树脂结合的肽。
例如，根据如下的非限制性技术，可以将通过固相合成技术合成的肽断裂和分离可以使用本领域技术人员公知的技术从树脂断裂肽。例如，1％或2％三氟乙酸(TFA)在DCM中的溶液或TFA在DCM中的1％和2％溶液结合物可用于断裂肽。乙酸(HOAC)、盐酸(HCl)或甲酸也可用于断裂肽。断裂要求的具体断裂剂，溶剂和时间依赖于被断裂的特定肽。在断裂之后，将断裂级分进行标准加工过程以分离肽。典型地，将结合的断裂级分在真空下浓缩，随后采用极性非质子或极性非质子溶剂如乙醇(EtOH)、甲醇(MeOH)、异丙醇(IPA)、丙酮、乙腈(ACN)、二甲基甲酰胺(DMF)、NMD、DMAC、DCM等重组，随后采用抗溶剂如水或己烷沉淀或结晶，和由真空过滤收集。或者，可以在肽分离之后将产物采用有机溶剂或水研磨。
对于全长型T-1249肽的合成，可以将肽中间体偶合在一起以得到T-1249肽。例如，可以使用在此所述的一种或多种方法，将以上的肽中间体的组偶合在一起以生产T-1249全长型肽。
在某些实施方案中，对于T-1249的合成，可以遵循三片段的途径。“三片段途径”合成表示这样的T-1249合成方案，该方案采用三个T-1249中间体肽片段开始，使用固相和液相合成技术将该片段合成和偶合成全长型T-1249肽。
固相肽合成(SPPS)的方法；一般过程向SPPS腔中加入FmocLeu-树脂(1eq)。将树脂在5％哌啶DCM(7.5vol)中采用氮气净化15-30分钟而调节。将溶剂排出和将树脂采用在NMP中的20％哌啶(5体积)处理30分钟2次，以除去Fmoc保护基团。在第二个20％哌啶/NMP处理之后，将树脂采用NMP(5vol)洗涤5-7次达到阴性(negative)choranil测试。
同时，将随后的氨基酸(1.5eq)，HOBT(1.5eq)和DIEA(1.5eq)在3∶1NMP/DCM(10vol)中结合，使其在室温下完全溶解和冷却到0℃。加入HBTU，将溶液搅拌10-15分钟以溶解固体，然后加入到树脂中。将悬浮液采用搅拌在氮气气氛下搅拌1-3小时。采用定性茚三酮测试监测偶合完成。如果反应在3h之后未完成(阳性(positive)茚三酮测试持续)，应当将反应器排液和应当采用活化氨基酸的新鲜溶液(0.5eq)进行再偶合。正常地在再偶合30min-1h之后，获得阴性(negative)茚三酮测试。对于片段中的剩余氨基酸重复此循环。当构造片段时，可需要从5体积增加用于洗涤的溶剂体积。在最终偶合之后，将树脂采用5-8体积的NMP洗涤3次，然后采用10体积的DCM洗涤2次和在真空烘箱中在40℃下干燥到恒重。
肽从树脂断裂的优选方法以下的方法描述了肽AcAA1-12OH从树脂的断裂。然而，相同的方法可用于本发明其它肽片段的断裂。
方法AHOAc的使用将树脂(1g，0.370mmol)采用AcOH/MeOH/DCM(5∶1∶4，20vol，20mL)的混合物采用氮气搅拌处理1.5h和将溶液转移到圆底烧瓶，搅拌，和采用水(20vol)处理。将获得的白色淤浆浓缩(旋转蒸发，40℃浴)以除去DCM和由过滤收集产物。干燥到恒重以87A％的纯度提供0.69g(74％)AcAA1-12OH。如以上的树脂的第二处理提供较不纯材料(83Area％)的另外0.08g(8.5％)AcAA1-12OH，建议稍＞1.5hr的所需反应时间。
方法BTFA的使用将树脂(1wt，20g)采用1.7体积的在DCM中1％TFA洗涤5-6次，每次洗涤3-5分钟。将1％TFA/DCM洗液在包含吡啶的烧瓶中收集(与洗液中TFA的1∶1体积比)。结合包含洗液的产物(600mL，30vol)和由蒸馏除去DCM到最小罐体积(约1/3原始体积)。调节真空以保持15-25℃的罐温度。加入乙醇(6.5vol)和继续蒸馏直到除去DCM(由馏出物的温度增加确定)。再次调节真空以保持15-20℃的罐温度。最终罐体积应当为约8-9体积。将溶液冷却到5-10℃和在30分钟内加入水(6.5vol)以沉淀AcAA1-12OH。将固体由真空过滤收集和采用水(2-3vol)洗涤。将淤浆在0-5℃下搅拌30分钟，将固体由真空过滤收集和干燥到恒重，以90％收率和84Area(A％)纯度得到16.80g的AcAA1-12OH。
FmocAA27-38OH的SPPS和从树脂的断裂如上所述采用10g以0.75mmol/g负载的FmocTrp(Boc)OR开始，进行FmocAA27-38OH的SPPS。使用断裂方法B(169/120/1，78％收率，87.9A％)。
HPLC条件Vydac C8，cat.No.208TP54，5u，300A，0.9mL/min.，280nm，A0.1％TFA/水，B80％I-PrOH/20％乙腈的混合物和0.1％TFA.60-80％B/30min。典型的样品制备在0.10mL NMP中溶解1mg，采用1mL乙腈稀释。向20.mul.L回路中注入20.mu.L。
CTOH树脂的循环本发明特别用于取代三苯甲基树脂的循环。典型地为循环这些树脂，人们首先采用弱酸从树脂断裂产物，形成未结合的肽和氯三苯甲基阳离子。然后将阳离子采用碱性溶液如甲醇中的氢氧化钠处理(参见，如完全说明的那样在此引入作为参考的US专利No.6,239,220)，洗涤和干燥以再生取代的三苯甲醇。传统的方法是然后通过将它转化成取代的三苯甲基氯树脂而活化取代的三苯甲醇树脂。此步骤是有问题的且提出许多挑战，如果人们反而活化保护的氨基酸可避免这些挑战。由于树脂典型地溶胀5-8cc/g，树脂的活化要求每树脂体积的大设备体积。当洗涤树脂时通常存在材料构造问题，如通常用于转化的亚硫酰氯可损害标准不锈钢过滤器，要求使用更特殊的材料以防止腐蚀。玻璃衬里的反应釜是通常的。耐氯化物的过滤器是非通常和昂贵的。在OH向Cl转化之后的树脂洗涤也要求许多溶剂，然后必须对其进行循环或处理。最后，取代的三苯甲基氯树脂产物则是水分敏感性的，导致处理和干燥问题。由于使用液体产物而不是固体，采用氨基酸活化的本发明具有较为更少的挑战。消除过滤器的使用和消除或降低大量洗涤溶剂。由于氨基酸并不如树脂那样溶胀，这也更是体积有效的。此外，本发明并不要求甲氧基封端，故循环断裂条件更为温和。同样，羟基使树脂更为亲水性和改进了试剂和产物通过凝胶相的输送。
尽管以上仅描述了本发明的少数，优选的实施方案，本领域技术人员认识到可以改进和改变实施方案而不背离本发明的精神和范围。因此，以上所述的优选实施方案在所有方面解释为说明性的和不是限制性的，本发明的范围由所附的权利要求限定，而不是由上述的说明书限定，且希望在此包括权利要求同等意义和范围内的所有变化。
权利要求
1.一种制备没有氯三苯甲基氯接头-树脂的生物活性物质，生物活性物质的片段，治疗剂，或治疗剂的片段的方法，包括活化氨基酸或活化氨基酸衍生物与取代或未取代的三苯甲醇树脂反应，以获得树脂-CT-AA产物；和反应该树脂-CT-AA产物与该生物活性物质，该治疗剂，或该片段的其它构件，以获得该生物活性物质，该治疗剂，该生物质活性物质的片段，或该治疗剂的片段。
2.权利要求1的方法，其中该活化氨基酸选自保护的氨基酸酰氯、保护的氨基酸酰氟、保护的氨基酸酰溴、和保护的氨基酸混合酸酐、保护的氨基酸活化酯、和FMOC-氨基酸酰氯。
3.权利要求1的方法，其中该取代或未取代的三苯甲醇树脂选自氯三苯甲醇树脂、用烷氧基取代的三苯甲醇树脂、用卤素取代的三苯甲醇树脂、用取代烷基取代的三苯甲醇、和用结合到三苯甲基芳族环上的一个或多个基团取代的三苯甲醇。
4.权利要求3的方法，其中该氯三苯甲醇树脂是2’氯三苯甲醇树脂。
5.权利要求1的方法，进一步包括断裂一个或多个该片段，该生物活性物质，或该治疗剂。
6.权利要求1的方法，进一步包括循环该树脂。
7.由权利要求1的方法产生的产物。
8.权利要求7的产物，其中该生物活性物质或其片段选自T-20的片段、T-20、T-20类肽的片段、和T-20类肽、T-1249的片段、T-1249、T-1249类肽的片段、和T-1249类肽。
9.一种制备用于产生生物活性物质或治疗剂的底物的方法，包括活化氨基酸或其衍生物与取代或未取代的三苯甲醇树脂反应，以获得树脂-CT-AA产物。
10.权利要求9的方法，进一步包括使用该树脂-CT-AA产物以产生生物活性物质前体、治疗剂前体、该生物活性物质、或该治疗剂。
11.权利要求9的方法，进一步包括循环该树脂用于随后的产生步骤。
12.权利要求1的方法，其中该取代或未取代的三苯甲醇树脂包括低空隙空间树脂。
全文摘要
本发明涉及制备没有氯三苯甲基氯接头－树脂的生物活性物质或治疗剂的方法。该方法包括反应活化氨基酸或活化氨基酸衍生物与取代或未取代的三苯甲醇树脂，以获得树脂－CT－AA产物；和反应树脂－CT－AA产物与生物活性物质或治疗剂的其它构件，以获得该生物活性物质或治疗剂。也在此提供由该方法产生的产物。本发明特别用于产生T－20和T－1249治疗剂。
文档编号A61K38/00GK1520827SQ20041000486
公开日2004年8月18日 申请日期2004年2月10日 优先权日2003年2月12日
发明者J·C·博林, J·J·迈克纳, M·K·金斯, W·A·齐亚诺, J C 博林, 迈克纳, 金斯, 齐亚诺 申请人:罗姆和哈斯公司