专利名称：电化学传感器胆固醇试条和所用试剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物传感器技术领域，是一种电流型生物传感器快速检测总胆固醇试条和所用试剂的制造方法，这种试条可以快速检测总胆固醇的浓度。
背景技术：
糖尿病是目前世界上发病率和死亡率最高的五大疾病之一。糖尿病患者常伴有脂代谢紊乱使血脂增高，而高血脂(总胆固醇是重要指标)是引发高血压和动脉粥样硬化的重要因数。心血管疾病在我国居于死亡的第二位，其中冠心病的发病与死亡率在某些地区正在上升。已有的证据说明冠心病的发病中有若干危险因素起重要作用，包括高胆固醇血症、高血压、吸烟和糖尿病。低高密度脂蛋白血症也是重要的危险因素。在以上各因素中高胆固醇血症最被重视，其临床意义已经反复证实，随血胆固醇的长期增高，冠心病事件的发生率增加；长期控制血胆固醇于合适的水平，可以预防动脉粥样硬化，而降低血胆固醇可以减轻动脉粥样斑块，减少冠心病事件。因此，在广大人群中进行高血脂症的防治成为动脉粥样硬化防治的重要环节。总胆固醇测定是血脂测试的指标之一。同时，几种类型脂蛋白的测定也是基于对胆固醇的检测。由此可知，血总胆固醇测定，对血脂水平的监控，进而控制心血管疾病的发病率很有意义，这种意义包括临床诊断和日常检测，指导治疗。而且试条方法可以为血脂水平普查提供简便、快速、和廉价的手段，使之更具有使用价值。
目前市场上制作单参数的一次性传感器试条以及检测仪表大多数依托于丝网印刷的厚膜技术，采用厚膜技术的传感器试条制作耗时、耗材，用丝网印刷方法得出的电极带的表面非常不平，工艺较为复杂而且在响应时间、灵敏度、稳定性等方面不如基于先进的微机电系统(MEMS)制造技术的薄膜电极。例如德国罗氏公司生产的爱康全(Accutrend)血糖/胆固醇/甘油三酯三用检测系统，该系统的检测原理是用反射光度法测量新鲜毛细血管全血的胆固醇浓度；上海新立电子公司研制的胆固醇测试仪，采用有机导电子介体和固定化酶技术，再同丝网和生物元件喷涂印刷技术相结合的方法。
发明内容
本发明的一个目的是要提供快速检测总胆固醇浓度的电化学传感检测试条的试剂制备方法，在绝缘材料上利用微机电系统(MEMS)技术形成均匀表面的薄膜金电极。
本发明的另一个目的是电极经过表面活化技术处理，用电化学沉积方法在电极表面反应区组装一层金属纳米颗粒层。
为达到上述目的，本发明技术方案是提供一种电化学传感器胆固醇试条，其包括绝缘性基板；电极，在基板上制备出工作电极和对电极；金属纳米层为了获取多孔的电极表面而采用电化学沉积方法在电极的反应区组装高比表面积的金属纳米颗粒；一种试剂固定在纳米颗粒层上的反应试剂包括电子接受体，与被分析物起反应且能产生与被分析物浓度相对应的电流的酶，同时还包括缓冲液、表面活性剂；绝缘层与封装层通过绝缘层、封装层与绝缘性基板围成的空间组成沟道，该沟道为电极反应区。
所述的总胆固醇试条，其所述电极是采用微机电系统技术制备的薄膜金电极。
所述的总胆固醇试条，其在电极表面有一层高比表面积的金属纳米颗粒，其是在氯铂酸和醋酸铅以一定体积比组成的电解质溶液中以电化学沉积的方法得到的。
所述的血胆固醇试条，其所述电极反应区，其入口被制成一个毛细作用空间。
一种电化学传感器胆固醇试条所用的试剂，包括电子接受体、酶、缓冲液和表面活性剂，其特征在于，起氧化还原作用的电子接受体由从铁氰酸盐、亚甲基蓝、二茂铁及其衍生物、对笨醌、吩嗪硫酸甲酯、靛酚及其衍生物和β-萘醌-4-磺酸钾组成的组中选择出的一种；酶可与被分析物起反应且能产生与被分析物胆固醇的浓度相对应的电流。
所述的试剂，其所述酶是胆固醇酯解酶、胆固醇氧化酶。
所述的试剂，其所述缓冲液为磷酸缓冲液、TRIS缓冲液、MES缓冲液组成的组中选择出的一种。
所述的试剂，其所述表面活性剂为TritonX-100。
一种电化学传感器胆固醇试条所用试剂的制备方法，其将铁氰酸盐溶解在磷酸缓冲液中，将表面活性剂加入溶液中，搅拌至完全均匀溶解；再加入胆固醇酯解酶和胆固醇氧化酶，经搅拌至溶解完全，将上述溶液4～6l滴加在毛细作用沟道中的纳米铂黑颗粒层上，在35～37℃干燥箱中干燥20～25分钟后，备用。
所述的制备方法，其所述铁氰酸盐为8.2mg，缓冲液为1ml、pH7.4，表面活性剂为10l，胆固醇酯解酶为6.0mg和胆固醇氧化酶为7.1mg。
所述的制备方法，其所述铁氰酸盐为铁氰酸钾，缓冲液为磷酸缓冲液。
本发明的试条采用毛细虹吸设计。可以将血滴从试条的侧面吸入试条的反应区内，由于毛细原理，样品更容易迅速铺满整个反应区，使反应进行的更迅速、更充分，检测结果更准确。
本发明的试条和介绍的方法与已经商业化的用来检测葡萄糖的本系列的电流型仪表是兼容的，即可以让电流型检测仪表检测葡萄糖的用户检测总胆固醇的浓度。
本产品采用微机电系统(MEMS)工艺技术，微机电系统(MEMS)是MicroElectromechanical System的简称，也称微系统(Micro System)，它泛指体积微小(1μm---1mm)，可批量制作，集微型结构、微型传感器、微型执行器以及信号处理和控制电路、直至接口、通讯和电源等于一体，具有多种功能的系统。基于微机电系统(MEMS)技术制备的生物传感器器件，较之丝网厚膜印刷技术，具有体积小，灵敏度高(约400mM，比丝网厚膜印刷技术高约2倍)，一致性好(CV％≤5％，甚至更低)，相关性佳(可达0.99)，工艺简单等优点， 大批量生产成本低。
本产品与目前国内外产品比较具有许多优势由于一次性试条的生产工艺采用先进的微机电系统(MEMS)工艺，既保证了检测的可靠性和一致性，又降低了试条的生产成本；采用简单有效的酶的固定方法，采用了电化学电流检测的原理，较之比色法原理精确，使得试条的生产更为简便；试条采用毛细设计，使进样更快，需血量更少(3～5μl)，而且系统的响应快，灵敏度高等优点。
图1是本发明设计的两电极分层示意图；图2是本发明的电极立体图，表示的是图1中各层被组合后的状态；图3本发明实施例的胆固醇实时响应图。
具体实施例方式
本发明的试条绝缘基板材料是由从聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯对苯二甲酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯和丙烯晴-丁二烯-苯乙烯等组成的组中选择出来的一种聚合物制成。
电极系由两层结构组成，包括金属的下层和由从金、铂和钯中构成的组中选择出来的一种贵金属制成的上层。贵金属适合作电极，因为它们在电极表面区域的稳定性、电化学的还原性、抗氧化性等方面的电化学性质都非常好。其中最经常应用的是金，因为它加工简单，与塑料的粘接性好且导电率高，本发明将金制成的电极作成薄至几十纳米，很适合一次性使用。电极经过表面活化处理后，不仅可以去除电极表面的污染物，同时还能起到活化电极表面的作用，刻蚀的条件可根据电极表面的情况做适当的调整。用等离子体法快速活化电极表面的技术参照已申请专利02154524.3号。
本发明一实施例，提供了一种用电化学方法在电极表面反应区内组装一层金属纳米颗粒的方法。该方法解决了纳米颗粒的生长与贵金属电极的结合，通过控制纳米颗粒的尺寸，使在纳米颗粒上固定生物酶技术有重大突破。电解液由氯铂酸和醋酸铅溶液组成。电镀电压、沉积时间以及不同电解液配比都将影响膜的厚度和致密度，高疏松状的铂黑电极表面能有效增大传感器电流信号输出的信噪比，提高电极表面的亲水性，从而减少酶损失。
本发明将反应试剂固定在电极上形成试剂层，该反应试剂包括起氧化还原作用的电子接受体，与被分析物血清胆固醇起反应酶，还至少包括表面活性剂和缓冲液。当被分析物总胆固醇通过毛细作用滴加到反应试条上后，用电化学生物传感器检测系统可以快速检测所产生的与胆固醇的浓度相对应的电输出信号。
本发明的实施例，提供了在纳米颗粒上固定反应试剂的方法。
将胆固醇氧化酶、胆固醇酯解酶溶解在添加了表面活性剂、电子受体的缓冲液中，滴加在亲水的纳米铂黑分子层上，在37℃以下干燥。
血液中胆固醇约有2/3以酯型存在，1/3以游离型存在。在胆固醇酯解酶作用下，将酯型胆固醇转化为游离胆固醇，在胆固醇氧化酶作用下，产生与胆固醇浓度呈线性关系的电流。胆固醇酯解酶的浓度为1～2U/l，胆固醇氧化酶的浓度为0.5～1U/l。当酶的浓度过低时，在干燥等过程中，失活的比例提高，并且反应时间延长。当酶的浓度过高时，造成一定的浪费。
起氧化还原作用的电子接受体可以是铁氰酸盐、亚甲基蓝、二茂铁及其衍生物、对笨醌、吩嗪硫酸甲酯、靛酚及其衍生物和β-萘醌-4-磺酸钾组成的组中选择出的一种。通过电子介体将酶反应过程中产生的电子从酶反应中心转移到电极表面，使得电流型酶传感器的响应速度和检测灵敏度得到了提高，同时降低了反应的电压。
缓冲液为磷酸缓冲液、TRIS缓冲液、MES缓冲液组成的组中选择出的一种。缓冲液用于提供一个pH值稳定的反应环境，最佳pH反应为6～7。
表面活性剂为TritonX-100。添加0.05～1％非离子型的表面活性剂，提高了酯类胆固醇的溶解率，使干试条上的反应试剂更容易溶解。当表面活性剂浓度高于1％时，血红细胞开始溶血。因此选择0.3～0.5％浓度表面活性剂。
本发明的上述各种目的、方法、特点和优点，通过下面结合附图和实施例可以得到更加详细的说明。
实施例1图1与图2是本发明设计的两电极图。首先，采用微机电系统(MEMS)工艺在绝缘性基材1上制备好薄膜金电极2、3，在薄膜金电极2、3上粘加第二绝缘层4，第二绝缘层4中设有毛细作用沟道7，毛细作用沟道7形成反应区。然后，采用电沉积法在毛细作用沟道7中组装纳米铂黑层8，其方法参照已申请专利03141154.1，电沉积后用大量去离子水冲洗电极2、3和纳米铂黑层8表面，去除残留在电极2、3和纳米铂黑层8表面的各种离子，在37℃电热鼓风干燥箱内干燥10分钟，取出保存备用。添加试剂层9用8.2mg的铁氰酸钾溶解在1ml、pH7.4的磷酸缓冲液中，将10l表面活性剂TritonX-100加入溶液中，搅拌至完全均匀溶解。加入6.0mg胆固醇酯解酶，7.1mg胆固醇氧化酶。轻搅拌至溶解完全。将5l上述溶液滴加在毛细作用沟道7中的纳米铂黑颗粒层8上，在37℃的干燥箱中干燥20分钟，形成试剂层9。从干燥箱中取出试条，加盖封装层5，形成毛细作用沟道7。置干燥处或真空封装备用。
其工作过程是在制备好的试条上，滴入3~5l血清，通过毛细作用血清进入毛细作用沟道7中，与添加试剂9和纳米铂黑颗粒层发生作用，产生电流，经电极2、3流出，在电化学生物传感器检测系统上可以快速检测出与总胆固醇的浓度相对应的电流(见图3)。
本发明用了优选实施例进行说明，优选实施例只是为了说明的目的，而不是对本发明的限制。在上述说明的基础上可以对本发明作许多改进和改变。因此，在所附权利要求书的范围内，本发明可以有不是上述的其他实现方式。例如其它组合的试剂配方、在试剂层上覆盖过滤膜从而消除红细胞的干扰而用于全血胆固醇的检测、非纳米颗粒修饰的电极反应区、三电极形式、厚膜电极的制备形式等。
权利要求
1.一种电化学传感器胆固醇试条，其特征在于，包括绝缘性基板；电极，在基板上制备出工作电极和对电极；金属纳米层为了获取多孔的电极表面而采用电化学沉积方法在电极的反应区组装高比表面积的金属纳米颗粒；一种试剂固定在纳米颗粒层上的反应试剂包括电子接受体，与被分析物起反应且能产生与被分析物浓度相对应的电流的酶，同时还包括缓冲液、表面活性剂；绝缘层与封装层通过绝缘层、封装层与绝缘性基板围成的空间组成沟道，该沟道为电极反应区。
2.如权利要求1所述的总胆固醇试条，其特征在于，所述电极是采用微机电系统技术制备的薄膜金电极。
3.如权利要求1所述的总胆固醇试条，其特征在于，在电极表面有一层高比表面积的金属纳米颗粒，其是在氯铂酸和醋酸铅以一定体积比组成的电解质溶液中以电化学沉积的方法得到的。
4.如权利要求1所述的血胆固醇试条，其特征在于，所述电极反应区，其入口被制成一个毛细作用空间。
5.一种电化学传感器胆固醇试条所用的试剂，包括电子接受体、酶、缓冲液和表面活性剂，其特征在于，起氧化还原作用的电子接受体由从铁氰酸盐、亚甲基蓝、二茂铁及其衍生物、对笨醌、吩嗪硫酸甲酯、靛酚及其衍生物和β-萘醌-4-磺酸钾组成的组中选择出的一种；酶可与被分析物起反应且能产生与被分析物胆固醇的浓度相对应的电流。
6.如权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述酶是胆固醇酯解酶、胆固醇氧化酶。
7.如权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述缓冲液为磷酸缓冲液、TRIS缓冲液、MES缓冲液组成的组中选择出的一种。
8.如权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述表面活性剂为TritonX-100。
9.一种电化学传感器胆固醇试条所用试剂的制备方法，其特征在于，将铁氰酸盐溶解在缓冲液中，将表面活性剂加入溶液中，搅拌至完全均匀溶解；再加入胆固醇酯解酶和胆固醇氧化酶，经搅拌至溶解完全，将上述溶液4～6l滴加在毛细作用沟道中的纳米铂黑颗粒层上，在35～37℃干燥箱中干燥20～25分钟后，备用。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述铁氰酸盐为8.2mg，缓冲液为1ml、pH7.4，表面活性剂为10l，胆固醇酯解酶为6.0mg和胆固醇氧化酶为7.1mg。
11.如权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，所述铁氰酸盐为铁氰酸钾，缓冲液为磷酸缓冲液。
全文摘要
本发明涉及生物传感器技术领域，是一种检测总胆固醇试条和所用试剂的制备方法。总胆固醇试条是在绝缘材料上利用微机电系统(MEMS)技术制备薄膜金电极，电极经过表面活化技术处理，用电化学沉积方法在电极表面的反应区组装一层金属纳米颗粒，再将反应试剂固定在纳米颗粒层上形成试剂层。当被分析物血胆固醇通过毛细作用滴加到试条反应区上后，用电化学生物传感器检测系统可以快速检测出总胆固醇的浓度。
文档编号A61K38/43GK1563970SQ20041003021
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月22日 优先权日2004年3月22日
发明者刘春秀, 蔡新霞, 李华清, 姜利英, 罗贤波 申请人:中国科学院电子学研究所