专利名称：口蹄疫全病毒基因工程疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医疗卫生技术领域，具体地说是应用T4噬菌体外源蛋白高效表达展示系统创制的口蹄疫基因工程疫苗及其制备方法。
背景技术：
口蹄疫是危害偶蹄兽及人类的重大传染病，国际兽医局及我国农业部列为A类烈性传染病，我国《动物防疫法》规定为第一类危害严重的传染病，疫苗免疫是防治口蹄疫的根本技术措施。目前，口蹄疫预防疫苗弱毒苗一般已停止生产(因恐弱毒株突变返回强毒株散布疫情)，各地用灭活全病毒疫苗，但因口蹄疫不同血清型病毒株变异性甚大(口蹄疫病毒株有7种血清型，70～80种次亚型之多)，一种某地毒株灭活苗难以覆盖预防不同疫区偶蹄动物不同亚型毒株感染。亚单位基因工程苗(如复旦大学研制)仅用O型毒株表面抗原表位的VP1(213个氨基酸)的局部小片段排列重组。目前世界科学家公认能预防口蹄疫强毒株攻击的理想疫苗应由全病毒颗粒表面蛋白的VP1、VP2、VP3所有片段共同参与形成免疫性立体空间结构，基因工程苗也需考虑到全病毒空间结构的原貌，否则，亚单位基因工程苗即使能产生免疫检测反应性，也难产生强毒攻击的保护性，结果，形成世界性口蹄疫分子生物学研究的实际格局只有研究价值，难有实际应用价值。
T4噬菌体外源蛋白高效表达展示系统，是分子免疫学、微生物学、人和动物传染病及蛋白质相互作用研究方面新的有力工具，已发表于1996年国际知名学术杂志Protein Science上。在人和动物传染病、免疫学领域，使用该系统可以创造出基因工程疫苗及快速诊断试剂盒。关于T4噬菌体外源蛋白高效表达展示系统有关技术本发明人已经申请了中国发明专利。
发明内容
本发明的目的是利用T4噬菌体外源蛋白高效表达展示系统，把O，A，C，Asia-I，SAT-1，SAT-2，SAT-3等七个血清型口蹄疫毒株免疫抗原蛋白保持其免疫所需空间结构、克隆表达在T4噬菌体颗粒表面，提供一种对偶蹄动物猪，牛、羊对各型口蹄疫强毒感染有保护作用的实用基因工程疫苗。
本发明的另一目的是提供上述口蹄疫血清型毒株基因工程疫苗的制备方法。
本发明人几年来从口蹄疫功能蛋白转到其基因结构及筛选，进行了大量的深入研究，实现了注射及口服口蹄疫全病毒基因工程疫苗技术的关键突破。
本发明的口蹄疫基因工程疫苗的结构表达式为全病毒基因工程疫苗phage T4-Soc-Hoc-FMDV-P1；亚单位基因工程疫苗phageT4-Soc-Hoc-FMDV-F3。其中F3是口蹄疫病毒FMDV的主要抗原表位。
本发明的口蹄疫全病毒抗原的基因工程疫苗的制备方法为(以O血清型口蹄疫疫苗为例，其他六种血清A，C，Asia-I，SAT-1，SAT-2，SAT-3型口蹄疫疫苗工序完全与此相同)1.取O血清型口蹄疫病毒毒株，使用进口Promega公司TRIZOIL试剂盒抽提其总基因组RNA。
2.从已发表的O血清型口蹄疫病毒毒株的核酸DNA测序信息，设计、合成以下两个DNA核酸探针，使位于并覆盖口蹄疫病毒粒子表面全部结构蛋白基因的起始，终止位点5’CTCAACGCAGAATGGAAAGCA 3’5’GGTCGAAGTTCAGAAGCTGTT 3’3.再用RT-PCR试剂盒，以抽得的口蹄疫基因组总RNA为底物，用以上探针为引物，进行RT-PCR链式DNA基因片断扩增反应，获得口蹄疫病毒粒子全部外壳结构蛋白完整P1基因；4.将基因P1与T4噬菌体外源蛋白高效表达展示系统的质粒pRH-Soc/Hoc进行基因重组，得到T4噬菌体整合质粒pRH-Soc/Hoc-P1(T4噬菌体外源蛋白高效表达展示系统由大肠菌整合表达质粒pSoc，pHoc系列及T4噬菌体展示载体phage T4-ΔSoc & ΔHoc组成)；5.将pRH-Soc/Hoc-P1与T4噬菌体展示系统的展示载体phage T4-ΔSoc& ΔHoc进行同源重组，转化进入大肠杆菌E.coli.CR63宿主菌体中，就得到了口蹄疫全病毒抗原蛋白已表达展示在T4噬菌体表面的口蹄疫基因工程疫苗株phage T4-Soc-Hoc-FMDV-P1；口蹄疫基因工程疫苗的生产运用制备方法是在LB培养液中大量扩增繁殖口蹄疫基因工程疫苗株T4噬菌体phage T4-Soc-Hoc-FMDV-P1，在中速离心机上进行6000RPM-20000RPM的差速离心，去除宿主细胞碎片沉淀，分离纯化T4噬菌体颗粒，就制备成了O血清型口蹄疫全病毒基因工程疫苗T4噬菌体疫苗株。(待国家兽医生物制品检定所及农业部药证部门质量、安全性等检定、批准后成为正式生产应用疫苗)本发明的口蹄疫疫苗包括T4噬菌体构建的全病毒疫苗及T4噬菌体构建的口蹄疫亚单位疫苗。
免疫效果检测实验室检测分别在免疫原蛋白的质粒表达层次及T4噬菌体表达层次用猪、牛、羊的口蹄疫抗体血清，分别用Western Blotting免疫杂交及Dot-ELISA免疫学方法检验T4噬菌体phage T4-Soc-Hoc-FMDV-P1表面展示的P1抗原条带，呈强阳性反应。
动物试验这种新型口蹄疫基因工程疫苗，分别在三达生物技术公司及保山疫苗厂进行了多批次分组实验动物小白鼠口蹄疫强病毒攻击保护试验，结果在100多头实验动物中显示了100％免疫保护作用。(具体数据见附表)攻毒保护试验结果见下表
注全病毒T4-FMDV-P1T4噬菌体口蹄疫O型血清型全病毒表达疫苗株亚单位T4-FMDV-F3T4噬菌体口蹄疫O型FMDV国际株O1K亚单位基因工程疫苗达株。F3是口蹄疫病毒FMDV的主要抗原表位。空白对照为同龄未免疫小白鼠组。T4噬菌体本底对照注射不表达口蹄疫抗原的T4噬菌体载体本身。
本发明使用T4噬菌体外源蛋白高效表达展示系统，在国内外首次克隆表达了口蹄疫全病毒外壳基因P1长度的模拟口蹄疫天然全病毒基因工程实验疫苗，在O血清型口蹄疫病毒强毒攻击保护效果试验中，结果数据显示对小动物有100％免疫保护作用。以国家的野外动物强毒攻毒保护效果超过60％即为考虑有效作参考，本发明的全病毒及亚单位两类T4-基因工程苗，都具潜在的大动物免疫保护及实用疫苗开发价值。
本发明涉及生命科学和生物技术前沿性研究的重大专项，此项T4噬菌体表面展示口蹄疫全病毒抗原的基因工程疫苗是T4噬菌体外源蛋白高效表达展示系统与口蹄疫病毒相结合的产物。
本发明在中国经多年努力，成功创制出一种崭新的T4噬菌体表面展示口蹄疫全病毒抗原的基因工程疫苗。与灭活全病毒疫苗相比，因在基因水平去除了口蹄疫病毒感染宿主细胞必须的结构位点，不需灭活，保持全病毒抗原性但不具传染性。该项目全病毒抗原基因工程疫苗开发的成功，将告别费力、费时、麻烦、盲目的亚单位基因工程苗研制阶段。这种新型基因工程疫苗既可注射，也可口服。既无现在广泛使用的病毒灭活疫苗的万一灭活不彻底、导致疫情扩散的潜在危险性，而且比灭活苗的造价低得多，成本只有目前普遍使用的灭活苗的1/5至1/10，免疫效果不比目前使用的灭活苗差。
本发明可针对亚洲、欧洲及非洲曾流行世界许多地区的口蹄疫血清型O型、A型、Asia-I型、C型、SAT-1、SAT-2、SAT-3共七种亚型口蹄疫主要病毒株构建基因工程疫苗，把创产值数亿元的现行灭活全病毒苗推到另一个更适用、价廉的产品平台。对偶蹄动物猪，牛、羊有强毒感染保护作用，且成本价格低廉。发展倾向将逐步替代现广泛使用的口蹄疫灭活全病毒疫苗，市场将覆盖中国，亚洲，欧洲，非洲及世界其他国家。
具体实施例方式
实施例1主要流行于亚洲的O血清型口蹄疫基因工程疫苗，由以下制备方法获得1.取O血清型口蹄疫病毒毒株，使用进口Promega公司TRIZOIL试剂盒抽提其总基因组RNA。
2.从已发表的O血清型口蹄疫病毒毒株的核酸DNA测序信息，设计、合成以下两个DNA核酸探针，使位于并覆盖口蹄疫病毒粒子表面全部结构蛋白基因的起始，终止位点5’CTCAACGCAGAATGGAAAGCA 3’5’GGTCGAAGTTCAGAAGCTGTT 3’3.再用RT-PCR试剂盒，以抽得的口蹄疫基因组总RNA为底物，用以上探针为引物，进行RT-PCR链式DNA基因片断扩增反应，获得口蹄疫病毒粒子全部外壳结构蛋白完整P1基因。
4.将基因P1与T4噬菌体外源蛋白高效表达展示系统的质粒pRH-Soc/Hoc进行基因重组，得到T4噬菌体整合质粒pRH-Soc/Hoc-P1；5.将pRH-Soc/Hoc-P1与T4噬菌体展示系统的展示载体phage T4-ΔSoc&ΔHoc进行同源重组，转化进入大肠杆菌E.coli.CR63宿主菌体中，就得到了口蹄疫全病毒抗原蛋白已表达展示在T4噬菌体表面的口蹄疫基因工程疫苗株phage T4-Soc-Hoc-FMDV-P1；6.口蹄疫基因工程疫苗的在生产运用中在LB培养液中大量扩增繁殖口蹄疫基因工程疫苗株T4噬菌体phage T4-Soc-Hoc-FMDV-P1，在中速离心机上进行6000RPM-20000RPM的差速离心，去除宿主细胞碎片沉淀，分离纯化T4噬菌体颗粒，就制备成了O血清型口蹄疫全病毒基因工程疫苗T4噬菌体疫苗株。(待国家兽医生物制品检定所及农业部药证部门质量、安全性等检定、批准后成为正式生产应用疫苗)实施例2T4噬菌体外源蛋白高效表达展示系统表达口蹄疫基因工程疫苗株小动物试验该口蹄疫基因工程苗，在我们使用实验室免疫反应检测阳性的基础上(PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，Western Blotting免疫杂交，用猪及羊口蹄疫血清抗体，进行了免疫原生物活性检测，均取得阳性结果)，然后，先后在三达生物技术公司及保山口蹄疫疫苗厂进行了猪源、牛源口蹄疫强毒在实验小动物的攻击保护效果试验。试验使用了我们上述的T4噬菌体口蹄疫基因工程疫苗的以下二个样品
1)T4噬菌体口蹄疫O型血清型全病毒表达疫苗株T4-FMDV-P1；2)T4噬菌体口蹄疫O型FMDV国际株O1K亚单位基因工程疫苗亚单位表达株T4-FMDV-F3试验动物小白鼠考核指标用T4噬菌体口蹄疫基因工程疫苗株口服及注射实验动物后，1)用猪及牛源口蹄疫强病毒对实验动物的攻击保护性％测定，2)进行动物内脏剖检，观察病变。3)从内脏、血液、粪尿取样，测定疫苗株T4噬菌体活颗粒分布及含量。
试验方法1.先进行牛源口蹄疫强毒的小白鼠适应性传代，传了6代后用于本试验；2.猪、牛源口蹄疫强毒对小白鼠半数致死量SM50LD测定；3.对免疫成年小白鼠用口蹄疫强毒进行接种攻毒，取2-3月龄小白鼠(公鼠)，每组5只，以T4噬菌体疫苗株免疫动物(华南农大免疫二次，保山疫苗厂免疫五次)，每次间隔时间半月，设传统灭活疫苗阳性对照组及阴性空白对照组，末次免疫后10天，用血清型O型口蹄疫病毒猪/牛强毒株接种每只受试动物及对照动物，给予强毒攻毒。
4.接种乳鼠进行毒血症检测，攻毒后36小时取每受试动物外周血，稀释20倍后，每头成年鼠的外周血再注射接种5只乳鼠，从死亡或存活以判定是否产生毒血症viremia，及判定噬菌体疫苗株是否产生了免疫保护作用.
结果1.攻毒保护试验结果见前已给出表。
2.内脏剖检，观察受试动物未见脏器明显病理改变。
3.疫苗株T4噬菌体活颗粒分布及含量从粪、尿、肾、脾、血中都检出展示口蹄疫病毒基因的T4噬菌体疫苗活颗粒，数量由多到少按粪、尿、肾、脾、血，顺序排。
其它实施例如O血清型以外所有其他口蹄疫A，C，Asia-I，SAT-1，SAT-2，SAT-3共六个血清型口蹄疫毒株的全病毒及亚单位基因工程疫苗的制备均与
权利要求
1.一种口蹄疫基因工程疫苗，其特征在于其结构表达式为全病毒基因工程疫苗phage T4-Soc-Hoc-FMDV-P1；亚单位基因工程疫苗phageT4-Soc-Hoc-FMDV-F3。
2.如权利要求1所述的口蹄疫基因工程疫苗的制备方法，其特征在于由以下的方法获得1)取O血清型口蹄疫病毒毒株，用RNA抽提试剂盒抽提其总基因组RNA；2)从O血清型口蹄疫病毒毒株的核酸DNA测序信息设计、合成以下两个DNA核酸探针，使位于并覆盖口蹄疫病毒粒子表面全部结构蛋白基因的起、始位点为5’CTCAACGCAGAATGGAAAGCA 3’5’GGTCGAAGTTCAGAAGCTGTT 3’3)再用RT-PCR试剂盒，以抽得的口蹄疫基因组总RNA为底物，用以上探针为引物，进行RT-PCR链式DNA基因片断扩增反应，获得口蹄疫病毒粒子全部外壳结构蛋白完整的P1基因；4)将P1基因与T4噬菌体外源蛋白高效表达展示系统的质粒pRH-Soc进行基因重组，得到T4噬菌体整合质粒pRH-Soc-P1；5)将pRH-Soc-P1与T4噬菌体展示系统的展示载体phage T4-ΔSoc & ΔHoc进行同源重组，转化进入大肠杆菌E.coli.CR63宿主菌体中，就得到了口蹄疫全病毒抗原蛋白已表达展示在T4噬菌体表面的口蹄疫基因工程疫苗株phage T4-Soc-FMDV-P1；
3.根据权利要求2所述的口蹄疫基因工程疫苗的制备方法，其特征在于口蹄疫基因工程疫苗的生产运用制备方法是在LB培养液中大量扩增繁殖口蹄疫基因工程疫苗株T4噬菌体phage T4-Soc-FMDV-P1，在中速离心机上进行6000RPM-20000RPM的差速离心，去除宿主细胞碎片沉淀，分离纯化T4噬菌体颗粒，制备成O血清型口蹄疫全病毒基因工程疫苗T4噬菌体疫苗株产品。
4.根据权利要求2所述的口蹄疫基因工程疫苗的制备方法，其特征在于口蹄疫基因工程疫苗的制备方法包括T4噬菌体外源蛋白高效表达展示系统创制的O血清型以外所有其他口蹄疫A，C，Asia-I，SAT-1，SAT-2，SAT-3共六个血清型口蹄疫毒株的全病毒及亚单位基因工程疫苗。
全文摘要
本发明是一种口蹄疫基因工程疫苗及其制备方法。其结构表达式为全病毒基因工程疫苗phage T4－Soc－Hoc－FMDV－P1；亚单位基因工程疫苗phageT4－Soc－Hoc－FMDV－F3。制备方法是取O血清型口蹄疫病毒毒株，抽提总基因组RNA；从血清毒株的DNA测序合成两个DNA核酸探针；用探针为引物，进行RT－PCR链式DNA扩增反应，获得病毒粒子P1基因；将P1基因与T4噬菌体质粒pRH－Soc进行基因重组，得到T4噬菌体整合质粒pRH－Soc－P1；将pRH－Soc－P1与T4噬菌体载体phage T4－ΔSoc&ΔHoc进行同源重组，进入大肠杆菌E.coli.CR63宿主菌体中，就得到本发明的基因工程疫苗株phageT4－Soc－FMDV－P1。本发明与灭活全病毒疫苗相比，不需灭活，保持全病毒抗原性但不具传染性。既可注射，也可口服，方便、快捷，免疫效果良好。
文档编号A61K48/00GK1602962SQ200410040389
公开日2005年4月6日 申请日期2004年8月4日 优先权日2004年8月4日
发明者任兆钧 申请人:任兆钧, 大理三达生物科技有限公司