专利名称：小檗碱作为抗真菌药物增效剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是小檗碱增强抗真菌药物作用的新用途。
背景技术：
小檗碱，又名黄连素，是临床上常用的抗菌药，临床治疗作用广泛，可用于治疗肠道感染、细菌性痢疾、眼结膜炎、化脓性中耳炎、心率失常、充血性心力衰竭等，未见其有抗真菌作用的报道，更未见其与抗真菌药物联合使用治疗真菌病的报道。
发明内容
本发明提供一种小檗碱作为抗真菌药物增效剂的新用途。经体外细胞实验和体内动物实验证实，其对氟康唑、酮康唑、硫康唑、咪康唑等抗真菌化合物具有明确的增效作用，对于临床耐药性菌株和实验室诱导的耐药性菌株，当抗真菌药物与小檗碱合用时，能明显降低抗真菌药物的用药剂量，增强对耐药真菌的抑制作用。因此可将小檗碱用作抗真菌药物的增效剂，用于不同深部和浅表真菌感染的治疗。
本发明为小檗碱开辟了新的用途，将其用于抗真菌药物的增效剂，不仅能提高药物的抗真菌作用，而且在临床致病真菌耐药性日趋普遍，耐药程度日趋严重的情况下，使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，其意义可想而知。
图1为0.25μg/ml小檗碱和10μg/ml氟康唑合用时，治疗深部白念珠菌感染小鼠的存活数与存活时间折线图。
图2为0.5μg/ml小檗碱和20μg/ml氟康唑合用时，治疗深部白念珠菌感染小鼠的存活数与存活时间折线图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，对本发明作详细描述。
实施例1小檗碱与氟康唑合用对不同临床真菌株的作用材料和方法1.试药盐酸小檗碱上海利生制药厂，批号Y-001-001007。
氟康唑常州第二制药厂，批号20000928。
二甲亚砜中国医药(集团)上海化学试剂公司，批号20011022。
盐酸小檗碱用二甲亚砜分别配成1600、100、50、10μg/ml不同浓度，氟康唑用三蒸水配成6.4mg/ml的浓度，受试药物于-20℃保存。实验前，将药物贮存液取出置35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学试验。
2.菌株临床株白念珠菌(930612、9703154、960468、950812、010213)、烟曲霉菌(102163)、申克氏孢子丝菌(9912063-23)，均由上海长海医院真菌室提供，分别采自该医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。
所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)划板活化，白念珠菌于30℃培养2天，烟曲霉菌和申克氏孢子丝菌于35℃培养1周后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。
3.培养液RPMI 1640培养液RPMI1640(Gibco BRL公司)10.0g，NaHCO3 2.0g，吗啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g，加三蒸水900ml溶解，1N NaOH调pH至7.0，定容至1000ml，滤过消毒，4℃保存。
沙堡葡萄糖琼脂(SDA)培养基蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后4℃保存。
YEPD培养液酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，定容至1000ml，高压灭菌后4℃保存。
4.仪器隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；511型酶标分析仪(上海第三分析仪器厂)；5.菌液制备(1)白念珠菌菌液从4℃保存的SDA培养基上挑取白念珠菌少量，接种至1ml YEPD培养液，于30℃以200rpm振荡培养活化，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1mlYEPD培养液中，用上述方法再次活化16小时后，用血细胞计数板计数，以RPMI1640培养液调整菌液浓度至3×103～5×103个/ml的浓度。
从4℃保存的SDA培养基上挑取丝状菌少量接种至SDA斜面，于35℃培养一周后，再次挑取少量接种至SDA斜面，于35℃培养一周。实验前加适量RPMI1640培养液于SDA斜面，用吸管吹打菌落，使真菌孢子游离于RPMI1640培养液中，然后经四层无菌纱布过滤。培养液经血细胞计数板计数后，加RPMI1640培养液调整孢子浓度至3×103～5×103个/ml的浓度浓度。
6.药敏板制备取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI 1640培养液100μl作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的菌液99μl；2号孔分别加菌液196μl和6.4mg/ml的氟康唑溶液2μl。在2号孔中加入相应浓度的小檗碱2μl，而3～11号孔加入小檗碱1μl。
对2～11号孔进行10级倍比稀释，使2～11各孔的最终氟康唑浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml，而小檗碱浓度保持恒定；1号孔为不含药物的RPMI 1640培养液，作为阴性对照，12号孔为不含药物的菌液，作为阳性对照。各药敏板于30℃培养。
7.MIC80值判定白念珠菌和丝状菌分别于30℃培养24小时和一周后，用酶标分析仪于620nm测各孔OD值。与阳性对照孔比，以OD值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC80(真菌生长80％被抑制时的药物浓度)。
当药物的MIC80值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计MIC80值高于最高浓度64μg/ml时，计为“＞64μg/ml”；MIC80值低于最低浓度0.125μg/ml时，计为“≤0.125μg/ml”。
上述实验均平行操作2到3次，当MIC80值能准确重复时才被接受；当MIC80值相差一个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。
实验结果见表1、表2表1 小檗碱与氟康唑合用对4株临床白念珠菌的MIC80值白念 白念 白念白念编号 化合物(μg/ml)930612 9703154 960468 9508121 Flu+Ber(1.0)0.25 0.5 0.5 0.52 Flu+Ber(0.5)0.25 0.25 0.5 0.53 Flu+Ber(0.1)0.5 21 14 Flu 0.5 22 15 Ber(1) --- -注Flu表示氟康唑，Ber表示小檗碱(下同)表2 小檗碱与氟康唑合用对2株临床孢子丝菌和烟曲霉菌的MIC80值化合物编号.
孢子丝9912063-23 烟曲102163(μg/ml)1Flu+Ber(16)≤0.0625 ≤0.06252Flu＞32 ＞323Ber(16)--由表1和表2可见，1μg/ml的小檗碱可使5种临床白念珠菌对氟康唑的MIC80值下降2-4倍，16μg/ml的小檗碱可使临床孢子丝菌和烟曲霉菌的MIC80值从32μg/ml降为0.0625μg/ml，说明小檗碱能明显增强氟康唑的抗真菌作用。
实施例2小檗碱与氟康唑合用对不同临床和实验室诱导耐药株的作用材料和方法1.试药盐酸小檗碱上海利生制药厂，批号Y-001-001007。
氟康唑常州第二制药厂，批号20000928。
二甲亚砜中国医药(集团)上海化学试剂公司，批号20011022。
盐酸小檗碱用二甲亚砜分别配成1600、1280、200、50μg/ml不同浓度，氟康唑用三蒸水配成6.4mg/ml，受试药物于-20℃保存。实验前，将药物贮存液取出置35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学试验。
2.菌株临床耐药株白念珠菌(01、13、16、25、55)均由上海长海医院真菌室提供，分别采自该医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。
实验室诱导耐药株白念珠菌(resis-Y01、resis-010213、resis-5314)分别为白念珠菌标准株ATCC76625、长海临床株01021、国际通用株SC5314经氟康唑诱导形成的耐药株，经形态学和生化学鉴定。
其它实验步骤与方法同实施例1。
实验结果见表3、表4表3小檗碱与氟康唑合用对3株实验室诱导白念珠菌耐药株的MIC80值编号 化合物(μg/ml)resis-Y01 resis-01023 resis-53141Flu+Ber(16) 0.5 ≤0.1252Flu+Ber(12.8) 0.5 ≤0.125 0.253Flu+Ber(2)0.5 ≤0.1254Flu+Ber(0.5) 15Flu ＞64＞64 ＞326Ber(16) - --表4小檗碱与氟康唑合用对5株临床白念珠菌耐药株的MIC80值白念白念白念 白念 白念编号.化合物(μg/ml)01 13 1625 551Flu+Ber(2)32 1 2 2 12Flu+Ber(1)＞6416 164 ＞643Flu+Ber(0.5) ＞6432 ＞64 ＞64 ＞644Flu ＞6464 ＞64 ＞64 ＞645Ber(2)- - - - -由表3、表4可以看出，原先对氟康唑耐药的临床白念珠菌株MIC80值＞64，合用2μg/ml的小檗碱即可使氟康唑的MIC80值下降为1-2μg/ml，对实验室诱导的耐药白念珠菌，合用2μg/ml的小檗碱即可使氟康唑的MIC80值下降为0.5-0.125μg/ml，说明小檗碱能使菌株恢复对药物的敏感性，大大增强氟康唑的抗真菌效力，且具有剂量依赖性。
实施例3小檗碱与其他唑类抗真菌药的联合用药材料和方法1.药物硫康唑第二军医大学药学院有机教研室合成，批号19991005。
咪康唑第二军医大学药学院有机教研室合成，批号19990716。
酮康唑第二军医大学药学院有机教研室合成，批号19970407。
硫康唑、咪康唑、酮康唑分别用二甲亚砜配成6.4mg/ml浓度，盐酸小檗碱用二甲亚砜分别配成1600、800、400、200、100、50和0.25μg/ml不同浓度。受试药物于-20℃保存。实验前，将药物贮存液取出置35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学试验。
其它实验步骤和方法同实施例1。
实验结果见表5、6、7表5小檗碱与硫康唑合用对3株临床白念珠菌耐药株的MIC80值编号 化合物(μg/ml)白念55 白念13白念161Sulcon+Ber(16)≤0.125≤0.125 ≤0.1252Sulcon+Ber(8) 0.25 ≤0.125 13Sulcon+Ber(4) 0.25 ≤0.1254Sulcon+Ber(2) 0.25 0.55Sulcon+Ber(1) 1 26Sulcon+Ber(0.5) 1 27Sulcon+Ber(0.25) 1 28Sulcon(64)8 ＞64 2注Sulcon表示硫康唑，Ber表示小檗碱表6小檗碱与咪康唑合用对2株临床白念珠菌耐药株的MIC80值编号 化合物(μg/ml) 白念55 白念131Micon+Ber(16)0.25 ≤0.1252Micon+Ber(8) 0.25 ≤0.1253Micon+Ber(4) 1 0.54Micon+Ber(2) 2 15Micon+Ber(1) 4 16Micon+Ber(0.5) 4 27Micon+Ber(0.25) 4 28Micon(64)8 32注Micon表示咪康唑，Ber表示小檗碱表7小檗碱与酮康唑合用对3株临床白念珠菌耐药株的MIC80值编号 化合物(μg/ml) 白念55 白念13 白念161Ketocon+Ber(16) ≤0.125 ≤0.125 ≤0.1252Ketocon+Ber(8) ≤0.125 ＞64≤0.1253Ketocon+Ber(2) ≤0.125 ＞64≤0.1254Ketocon 4 ＞64≤0.125注Ketocon表示酮康唑，Ber表示小檗碱由表5、6、7可见，小檗碱不但可与氟康唑合用产生协同作用，而且与硫康唑、咪康唑、酮康唑等抗真菌药同样具有抗菌增效作用。合用16μg/ml的小檗碱即可使硫康唑、咪康唑、酮康唑对耐药白念珠菌的MIC80值从8-64μg/ml下降为0.25-0.125μg/ml，且随小檗碱剂量增加效用增强，具有剂量依赖性。
实施例4小檗碱与氟康唑合用对小鼠系统性真菌感染的保护作用实验方法实验用小鼠种系为ICR小鼠，由中科院实验动物饲养中心提供。
耐药白念珠菌(25号临床株)经小鼠体内毒力恢复后，重新在SDA培养基上活化，YEPD液体培养基中生长至对数生长期，调整浓度为3.2×107个/ml，给予小鼠尾静脉注射，造成小鼠深部真菌感染模型。
48只小鼠分两批进行实验。第一批18只小鼠，分成对照组、氟康唑(0.25mg/kg)组、氟康唑(0.25mg/kg)合用小檗碱(10mg/kg)组3个实验组，每组6只，雌雄各半。在造成小鼠深部真菌感染后，开始灌胃给药，每天1次，连续7天，共观察14天，对照组给予等量的生理盐水。第二批30只小鼠，分成对照组、氟康唑(0.5mg/kg)组、氟康唑(0.5mg/kg)合用小檗碱(20mg/kg)组3个实验组，每组10只，雌雄各半。灌胃给药，每天1次，连续7天，共观察21天，对照组给予等量的生理盐水。计算各组小鼠的平均存活天数，并以感染天数为横坐标，以小鼠存活只数为纵坐标作折线图，折线下降的缓急程度表示小鼠死亡的快慢程度。
实验结果分别见表8、图1和表9、图2表8小檗碱与氟康唑合用对白念珠菌深部感染小鼠存活时间的影响鼠号\组别 生理盐水氟康唑(0.25mg/kg)合用小檗碱(10mg/kg)1 3.5天 4天 ＞14天2 3.5天 3.5天4天3 3天 5天 4天4 3.5天 2天 12天5 3天 5.5天11天6 3天 9天 13天平均存活时间(天)3.254.83 8.80标准差 0.272.38 4.44P 0.1370.013表9小檗碱与氟康唑合用对白念珠菌深部感染小鼠存活时间的影响鼠号\组别 生理盐水氟康唑(0.5mg/kg) 合用小檗碱(20mg/kg)1 7天 6天 6天2 3天 4天 9天3 3天 9天 6天4 7天 6天 3天5 3天 6天 9天6 3天 12天 12天7 5天 14天 13天8 7天 12天 15天9 3天 13天 19天10 3天 11天 20天平均存活时间(天)4.409.30 11.20标准差 1.903.56 5.65P 0.0010.002
由上述表和图可见，0.25μg/ml的小檗碱和10μg/ml的氟康唑合用治疗深部白念珠菌感染小鼠，与单独使用氟康唑相比较，可使小鼠的平均存活时间从4.8天延长到8.8天；0.5μg/ml的小檗碱和20μg/ml的氟康唑合用治疗深部白念珠菌感染小鼠，与单独使用氟康唑相比较可使小鼠的平均存活时间从9.3天延长到11.2天，说明小檗碱和氟康唑合用，均可延长白念珠菌深部感染小鼠的存活时间，显示了小檗碱对抗菌药的增效作用。
权利要求
1.小檗碱用作抗真菌药物增效剂的用途，其特征在于所说抗真菌剂为氟康唑、酮康唑、硫康唑、咪康唑，小檗碱在抗真菌剂有效浓度中加入量不低于0.5μg/ml。
2.按权利要求1所述小檗碱用作抗真菌药物增效剂的用途，其特征在于小檗碱的加入量为0.5～16μg/ml。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是将小檗碱用作抗真菌药物增效剂的新用途。经体内外实验，小檗碱与氟康唑、酮康唑、硫康唑等抗真菌药合用，能不同程度地提高对浅表部或深部真菌感染的治疗效果，并能使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用。因此可用作抗真菌药物的增效剂。
文档编号A61K31/4375GK1596894SQ200410052989
公开日2005年3月23日 申请日期2004年7月20日 优先权日2004年7月20日
发明者徐铮, 曹永兵, 高平挥, 张军东, 曹颖瑛, 权华, 姜远英 申请人:中国人民解放军第二军医大学