含CpG单链脱氧核苷酸作为狂犬疫苗的佐剂的制作方法

专利名称：含CpG单链脱氧核苷酸作为狂犬疫苗的佐剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含CpG二核苷酸的单链脱氧核苷酸，特别是涉及作为狂犬疫苗佐剂的含CpG二核苷酸的单链脱氧核苷酸，本发明还涉及含CpG二核苷酸单链脱氧核苷酸的序列。
背景技术：
狂犬病(rabies)又名恐水症(hydrophobia)，在世界的60多个国家均有发生，(WolfgangHaupt.Rabies-risk of exposure and current trends in prevention of human cases.Vaccine 1999(17)1742-1749)，在东南亚国家的发病率高于世界的其它地区，在中国大陆的发病率为0.4/10万-1.58/10万。近年来，在许多国家(包括中国)，狂犬病的发生率呈上升趋势(David W Dreesen.A global review of rabies vaccines for human use.Vaccine，1997，15，suppl s2-s6.D.Zienius，J.Bagdonas，A.Dranseika.Epidemiologicalsituation of rabies in Lithuaniafrom 1990 to 2000.Veterinary Microbiology，2003(93)91-100.)，发病患者的死亡率几乎达100％。
人狂犬病通常是由携带狂犬病毒的动物如犬以咬伤人的方式传染给人。在中国，80-90％的人狂犬病由病犬传播引起。人狂犬病是以侵犯中枢神经系统为特征的急性传染病(ALAN C.JACKSON，WILLIAM H.WUNNER.Detection of Rabies Virus Genomic RNA and mRNA in MouseandHuman Brains by Using In Situ Hybridization.JOURNAL OF VIROLOGY，1991，65(6)2839-2844.)。临床表现为特有的恐水、怕风、恐惧不安、咽肌痉挛、进行性瘫痪等。
狂犬病毒属弹状病毒科(Rhabdoviridae)病毒，大小约75×180nm，为单股负链RNA，外绕以蛋白质衣壳，表面有脂蛋白包膜，包膜上有由糖蛋白组成的刺突。狂犬病毒具有免疫原性，能够诱生中和性抗体，且能凝集雏鸡、鹅等动物的红细胞。狂犬病毒易被紫外线、季胺化合物、碘酒、高锰酸钾、酒精、甲醛等所灭活。加热100℃2分钟也可将狂犬病毒灭活。狂犬病毒耐低温，在-70℃或-4℃(冻干状态)条件下能存活数年。
目前对狂犬病尚无特殊有效的治疗方法，接种狂犬病毒疫苗(以下简称狂犬疫苗)和使用抗狂犬病血清至今仍是预防感染狂犬病的主要方法。在我国使用的狂犬疫苗是地鼠肾细胞疫苗，其免疫程序是全程注射5针，在0、3、7、14和30天各肌注1针。对严重咬伤者，可加大狂犬疫苗的用量，全程10针，即被咬的当日至第6日每日1针，后分别于10、14、30、90日再各注1针。人被病犬咬伤后的平均发病率为15-20％。注射狂犬疫苗可有效地预防狂犬病的发生，全程注射后的发病率为0.15％。
CpG ODN是一类含非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸(CpG)的寡聚脱氧核苷酸(Oligodeoxynucleotides，ODN)，其中CpG两个侧翼紧邻的碱基排列大多遵循以下规律5’PurPurCGPyrPyr 3’，即5’端为两个嘌呤，3’端为两个嘧啶(G.Mutwiri，R.Pontarollo，S.BaBIUK.Bological activity of immunostimulatory CpG ODN motif in domestic animals.Veterinary Immunopathology，2003，9189-103)。研究表明，CpG ODN可激活多种免疫效应细胞，增强疫苗的免疫效果。

发明内容
本发明提供一种激发机体抗原特异性免疫反应的方法，该方法包括给被施用者狂犬病毒疫苗(以下简称狂犬疫苗)和佐剂以诱导狂犬病毒特异性的免疫反应，其中所述的佐剂至少包括一个含CpG二核苷酸的单链脱氧核苷酸，该含CpG的单链脱氧核苷酸中可含一个或多个CpG二核苷酸，该佐剂与狂犬疫苗联合应用时，能够显著增强狂犬疫苗的免疫效果。
本专利中的狂犬疫苗可以与CpG ODN联合应用，或者狂犬疫苗与CpG ODN及其它的非核酸佐剂联合应用，此处所述的非核酸佐剂包括铝佐剂、弗氏佐剂、MPL、乳剂等。
本专利所涉及的CpGODN的结构可以用下式所表示1.(G)n(L)n X1X2CGY1Y2(M)n(G)n
X1＝A，T，G；X2＝A，T；Y1＝A，T；Y2＝A，T，C；L，M＝A，T，C，G；n为0-6。
X1可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶；X2可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶；Y1可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶；Y2可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤；L，M可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶。
2.(G)n(L)nCG(XY)nCG(M)n(G)nX＝A，T；Y＝A，T；L，M＝A，T，C，G；n为0-6。
X可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶；Y可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶；L，M可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶。
3.(TCG)n(L)nCG(M)n(G)nL，M＝A，T，C，G；n为0-6。
L，M可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶。
4.(TCG)n(L)nX1X2CG(M)nX1＝A，T，G；X2＝A，T；L，M＝A，T，C，G；n为0-6。
X1可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶；X2可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶；L，M可以是腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶。
5TTCGTCG本发明中所涉及的狂犬疫苗及其佐剂联合应用时，能够显著提高机体对狂犬疫苗的反应，且能够减少狂犬疫苗的注射次数。
图例说明

图1不同剂量CpGODN增强狂犬疫苗刺激抗体产生作用的比较图2不同剂量CpGODN与铝佐剂联合增强狂犬疫苗刺激抗体产生作用的比较图3CpGODN对狂犬疫苗刺激特异性抗体产生速度的影响图4CpGODN作为狂犬疫苗佐剂能否降低狂犬疫苗免疫次数的评价图5CpGODN作为狂犬疫苗佐剂能否降低狂犬疫苗用量的评价图6不同CpGODN增强狂犬疫苗刺激抗体产生作用的比较实施例实施例1CpG单链脱氧核苷酸的设计设计序列如下(G)n(L)n X1X2CGY1Y2(M)n(G)nX1＝A，T，G；X2＝A，T；Y1＝A，T；Y2＝A，T，C；L，M＝A，T，C，G；n为0-65’-ggggTCgTTCgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO1)[121]5’-ggggATAACgTTgCgggggg-3’(SEQ ID NO2)[143]5’-ggggTgCAACgTTCAgggggg-3’(SEQ ID NO3)[402]5’-ggggTCCTACgTAggAgggggg-3’(SEQ ID NO4)[123]5’-ggggTCCATgACgTTCCTgAAgggggg-3’(SEQ ID NO5)[603]5’-gggggACgTCgCCggggggg-3’(SEQ ID NO6)[118]5’-ggATCCgTACgCATgggggg-3’(SEQ ID NO7)[320]5′-gggggAATCgATTCgggggg-3′(SEQ ID NO8)[154]5′-gggATgCATCgATgCATCgggggg-3′(SEQ ID NO9)[464]5′-ggTgCgACgTCgCAgggggg-3′(SEQ ID NO10)[471]5′-gggACgTACgTCgggggg-3′(SEQ ID NO11)[390]5′-gggggATCgACgTCgATCgggggg-3’(SEQ ID NO12)[322]5′-ggCgATCgATCgATCggggggg-3′(SEQ ID NO13)[333]
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5’-TCgTCgCTTTgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO100)[418]5’-TCgTCgTTTTgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO101)[208]5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO102)[302]5’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO103)[290]5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAggggggg-3’(SEQ ID NO104)[627]5’-TCgTCgTTTTgACgATCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO105)[500]5’-TCgTTCggggTgCCg-3’(SEQ ID NO106)[103]5’-TCgTTCggggTACCgATgggg-3’(SEQ ID NO107)[578]5’-TCgTTgCgCTCCCATgCCgggggg-3’(SEQ ID NO108)[319]5’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO109)[205]5’-TCgTTgTCgTTTCgCTgCCggCggggg-3’(SEQ ID NO110)[417]5’-TgCTTgggTggCAgCTgCCAgggggg-3’(SEQ ID NO111)[427]5’-TgCTgCTTTgCTgCTTgggg-3’(SEQ ID NO112)[421]5’-AACgTTCgACgTCgAACggggggg-3’(SEQ ID NO113)[453]5’-AACgACgACgTTggggg-3’(SEQ ID NO114)[580](TCG)n(L)nX1X2CG(M)nX1＝A，T，G；X2＝A，T；L，M＝A，T，C，G；n为0-6设计序列如下5’-TCgTAACgTTgTTTTTAACgTT-3’(SEQ ID NO115)[470]5’-TCgTCgTATACgACgATCgTT-3’(SEQ ID NO116)[502]5’-TCgTCgTTTgCgTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO117)[601]5’-TCCTgTCgTTTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO118)[625]5’-TCgTCgTTgTCgTTCgCT-3’(SEQ ID NO119)[430]5’-TCgTCgTTACCgATgACgTCgCCgT-3’(SEQ ID NO120)[480]5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAgTCgTCgTT-3’(SEQ ID NO121)[108]5’-TCgCCTCgTCgCCTTCgAgC-3’g-3’(SEQ ID NO122)[102]5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’T-3’(SEQ ID NO123)[406]5’-TCgTCgAgggCgCCggTgAC-3’-3’(SEQ ID NO124)[560]5’-TCgTCgCCggTgggggTgTg-3’3’(SEQ ID NO125)[629]5’-TCgTCgTACgCAATTgTCTT-3’3’(SEQ ID NO126)[440]5’-TCgCCCACCggTgggggggg-3’3’(SEQ ID NO127)[207]5’-TCgTCgCAgACCggTCTgggg-3’(SEQ ID NO128)[615]5’-TCgTCgCggCCggCgCCCCC-3’(SEQ ID NO129)[610]5’-TCgTCgCggCCgCgAggggg-3’(SEQ ID NO130)[206]5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgC-3’(SEQ ID NO131)[119]5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgCAggCC-3’(SEQ ID NO132)[570]5’-TCgTgCAggCCAACgAggCCg-3’(SEQ ID NO133)[631]5’-TCgTTgCCgTCggCCC-3’(SEQ ID NO134)[115]5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTTTCC-3’(SEQ ID NO135)[370]5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCCCC-3’(SEQ ID NO136)[309]5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCC-3’(SEQ ID NO137)[506]5’-TCgTTgCCgTCggCCCCC-3’(SEQ ID NO138)[404]5’-TCgTTgCCgTCggCCCC-3’(SEQ ID NO139)[203]5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCC-3’(SEQ ID NO140)[501]
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5’-TCgTCgTTTTCgTCgTTTTCgTCgTT-3’(SEQ ID NO185)[633]实施例2CpG单链脱氧核苷酸的合成采用固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速偶联等优点，已在DNA化学合成中广泛使用。
DNA化学合成不同于酶促的DNA合成，酶促的DNA合成过程是从5’→3’方向延伸，而DNA化学合成是由3’端开始。具体的反应步骤如下一、脱保护基用三氯乙酸脱去连结在CPG(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5’-羟基端，以供下一步缩合反应使用。
二、活化将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。
三、连接亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。
四、封闭缩合反应后为了防止连在CPG上的未参与反应的5’-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
五、氧化缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，从而得到稳定的寡核苷酸。
经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5’-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到一个DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)、纯化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。
固相合成寡核苷酸是在DNA合成仪上进行的，上述方法合成的寡核苷酸在脱去保护基后，目的寡核苷酸纯度是极低的，含有大量的杂质，主要杂质有脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异丁酸氨，腈磷基上脱下的腈乙基以及合成时产生的短链等，以至于粗产品中寡核苷酸含量仅为15％左右。尽管合成时每一步的效率都在97％～98％，但累积的效率并不高。因此，在粗产品中目的寡核苷酸含量很低，甚至达不到10％。这些杂质，尤其是存在于粗产品中的大量盐和短链，不但造成定量不准，而且影响下一步的反应，因此必须对寡核苷酸进行纯化。建议采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)纯化，该方法纯化的产品纯度高，可用于绝大部分的分子生物学实验，还可避免许多意想不到的麻烦。若考虑节约经费，对于要求较低的实验，如简单的PCR反应，则采用脱盐纯化即可。
寡核苷酸片段是以OD260值来计量的。在1ml的1cm光程标准石英比色皿中，260nm波长下吸光度为1的寡核苷酸溶液定义为1OD260。虽然对于每种特定的寡核苷酸来说，其碱基的组成不尽相同，但1260OD的寡核苷酸重量约为33μg。
实施例3不同剂量CpGODN增强狂犬疫苗刺激抗体产生作用的比较1.实验动物小白鼠200只，雌、雄各半，体重18-22克，购自北京维通利华实验动物有限公司。
2.狂犬疫苗1ml/支(含2.5IU)，购自长春生物制品所。
3.CpGODN上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
4.实验分组每组8只小鼠，雌雄各半。
狂犬疫苗狂犬疫苗+1.25μg CpG667狂犬疫苗+1.25μg CpG705狂犬疫苗+1.25μg CpG309狂犬疫苗+1.25μg CpG205狂犬疫苗+5μg CpG667狂犬疫苗+5μg CpG705狂犬疫苗+5μg CpG309狂犬疫苗+5μg CpG205狂犬疫苗+20μg CpG667狂犬疫苗+20μg CpG705狂犬疫苗+20μg CpG309狂犬疫苗+20μg CpG205狂犬疫苗+80μg CpG667狂犬疫苗+80μg CpG705狂犬疫苗+80μg CpG309狂犬疫苗+80μg CpG205狂犬疫苗+320μg CpG667狂犬疫苗+320μg CpG705狂犬疫苗+320μg CpG309狂犬疫苗+320μg CpG205狂犬疫苗+640μg CpG667狂犬疫苗+640μg CpG705狂犬疫苗+640μg CpG309狂犬疫苗+640μg CpG2055.CpGODN配制用50μl PBS溶解不同剂量CpGODN制备成相应浓度的CpGODN溶液。
6.小白鼠免疫于0天、3天、7天、14天、28天，按不同的分组分别给小白鼠腹腔注射如实验分组中所示的狂犬疫苗或狂犬疫苗+CpG ODN。进行免疫。狂犬疫苗的用量为0.5ml。
7.实验分组每组8只小鼠，雌雄各半。
(体积0.5ml)进行免疫。
8.狂犬疫苗抗体的检测于35天小白鼠尾静脉取血。用快速狂犬疫苗荧光灶抑制实验(RFFIT)方法(严家新，李承平，朱家鸿等.检测狂犬病病毒中和抗体的快速荧光灶抑制试验方法的建立.中国生物制品杂志，1998，11(2)93-96；中华人民共和国卫生部.中国生物制品规程(一部)，北京中国人口出版社，1996，201.)检测小白鼠血清中狂犬病毒特异性抗体的存在。于免疫的前两天小鼠尾静脉取血，获得的血清作阴性对照。
9.结果随着CpG ODN剂量的增加，小鼠血清中狂犬病毒特异性抗体的水平升高，结果见图1。
10.结论CpG ODN能够显著提高狂犬疫苗刺激小白鼠产生的狂犬病毒特异性抗体，说明CpG ODN可以作为狂犬疫苗的有效佐剂。
实施例4不同剂量的CpGODN和铝佐剂联合增强狂犬疫苗刺激抗体产生作用的比较1.实验动物小白鼠200只，雌、雄各半，体重18-22克，购自北京维通利华实验动物有限公司。
2.狂犬疫苗1ml/支(含2.5IU)，购自长春生物制品所。
3.CpGODN上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
4.实验分组每组8只小鼠，雌雄各半。
狂犬疫苗狂犬疫苗+1.25μg CpG667+Al佐剂狂犬疫苗+1.25μg CpG705+Al佐剂狂犬疫苗+1.25μg CpG309+Al佐剂狂犬疫苗+1.25μg CpG205+Al佐剂狂犬疫苗+5μg CpG667+Al佐剂狂犬疫苗+5μg CpG705+Al佐剂狂犬疫苗+5μg CpG309+Al佐剂狂犬疫苗+5μg CpG205+Al佐剂狂犬疫苗+20μg CpG667+Al佐剂狂犬疫苗+20μg CpG705+Al佐剂狂犬疫苗+20μg CpG309+Al佐剂狂犬疫苗+20μg CpG205+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG667+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG705+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG309+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG205+Al佐剂狂犬疫苗+320μg CpG667+Al佐剂狂犬疫苗+320μg CpG705+Al佐剂狂犬疫苗+320μg CpG309+Al佐剂狂犬疫苗+320μg CpG205+Al佐剂狂犬疫苗+640μg CpG667+Al佐剂狂犬疫苗+640μg CpG705+Al佐剂狂犬疫苗+640μg CpG309+Al佐剂狂犬疫苗+640μg CpG205+Al佐剂5.CpGODN配制用50μl PBS溶解不同剂量CpGODN制备成相应浓度的CpGODN溶液。
6.小白鼠免疫于0天、3天、7天、14天、28天，按不同的分组分别给小白鼠腹腔注射如实验分组中所示的狂犬疫苗+Al佐剂或狂犬疫苗+Al佐剂+CpG ODN进行免疫。狂犬疫苗的用量为0.5ml。
7.狂犬疫苗抗体的检测于35天小白鼠尾静脉取血。用快速狂犬疫苗荧光灶抑制实验(RFFIT)方法检测小白鼠血清中抗狂犬疫苗抗体的效价。于免疫的前两天小鼠尾静脉取血，获得的血清作阴性对照。
8.结果随着CpG剂量的增加，小鼠血清中狂犬病毒特异性抗体的水平升高，不同剂量CpGODN和铝佐剂联合增强狂犬疫苗刺激抗体产生作用的比较见图2。
9.结论CpGODN和铝佐剂能够显著提高狂犬疫苗刺激小白鼠产生的狂犬病毒特异性抗体的作用，说明CpGODN可以和铝佐剂联合应用作为狂犬疫苗的强效佐剂。
实施例5CpGODN对狂犬疫苗刺激特异性抗体产生速度的影响1.实验动物小白鼠80只，雌、雄各半，体重18-22克，购自北京维通利华实验动物有限公司。
2.狂犬疫苗1ml/支(含2.5IU)，购自长春生物制品所。
3.CpGODN上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
4.实验分组实验动物雌雄各半，每组8只小白鼠。
狂犬疫苗狂犬疫苗+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG667狂犬疫苗+80μg CpG667+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG705狂犬疫苗+80μg CpG705+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG309狂犬疫苗+80μg CpG309+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG205狂犬疫苗+80μg CpG205+Al佐剂上述狂犬疫苗和CpGODN均溶于PBS中。
5.小白鼠免疫方式于0天、3天、7天、14天、28天分别给小鼠按不同的分组腹腔注射狂犬疫苗或狂犬疫苗+Al佐剂或狂犬疫苗+Al佐剂+CpG ODN。
6.狂犬疫苗抗体的检测于0天、5天、7天、14天、28天、35天、49天、63天、77天时，分别进行小白鼠尾静脉采血，分离血清，用快速狂犬疫苗荧光灶抑制实验(RFFIT)方法检测小白鼠血清中狂犬疫苗抗体的效价。于免疫的前两天小鼠尾静脉取血，获得的血清作阴性对照。
7.结果CpGODN和Al佐剂联合应用时，在任何一个时间点所产生的抗体效价均高于单独应用狂犬疫苗和单独应用铝佐剂及单独应用CpGODN，见图3。
8.结论CpG ODN+Al佐剂联合应用可加快狂犬疫苗免疫小鼠的狂犬病毒特异性抗体的出现速度。
实施例6CpGODN作为狂犬疫苗佐剂能否降低狂犬疫苗免疫次数的评价1.实验动物小白鼠80只，雌、雄各半，体重18-22克，购自北京维通利华实验动物有限公司。
2.狂犬疫苗1ml/支(含2.5IU)，购自长春生物制品所。
3.CpGODN上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
4.实验分组实验动物分为10组，每组8只小鼠，雌雄各半。
狂犬疫苗狂犬疫苗+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG667狂犬疫苗+80μg CpG667+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG705狂犬疫苗+80μg CpG705+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG309狂犬疫苗+80μg CpG309+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG205狂犬疫苗+80μg CpG205+Al佐剂上述狂犬疫苗和CpGODN均溶于PBS中5.免疫方式按照不同的分组，分别对小白鼠进行免疫。免疫方式是小鼠腹腔注射。狂犬疫苗用量为0.5ml。免疫次数分别设定为5次、4次和3次。免疫5次的时间分别为0天、3天、7天、14天、和28天。免疫4次的时间分别为0天、7天、14天、28天。免疫3次的时间分别为0天、7天和21天。分别给小鼠按不同的分组腹腔注射狂犬疫苗或狂犬疫苗+Al佐剂或狂犬疫苗+Al佐剂+CpG ODN。
6.狂犬疫苗抗体的检测于末次免疫后7天进行小白鼠尾静脉采血，分离血清，用快速狂犬疫苗荧光灶抑制实验(RFFIT)方法检测小白鼠血清中狂犬疫苗抗体的效价。于免疫的前两天小鼠尾静脉取血，获得的血清作阴性对照。
7.结果CpGODN和Al佐剂联合应用可使免疫狂犬疫苗3次、4次、5次的小鼠均能产生较高水平的狂犬病毒特异性抗体，结果见图4。
8.结论CpGODN和Al佐剂联合应用可使免疫狂犬疫苗三次的小鼠产生较高水平的抗体。
实施例7CpGODN作为狂犬疫苗佐剂能否降低狂犬疫苗用量的评价1.实验动物小白鼠128只，雌、雄各半，体重18-22克，购自北京维通利华实验动物有限公司。
2.狂犬疫苗1ml/支(含2.5IU)，购自长春生物制品所。
3.CpGODN上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
4.实验分组每组8只，雌雄各半。
狂犬疫苗+80μg CpG705+Al佐剂1/2狂犬疫苗+80μg CpG705+Al佐剂1/4狂犬疫苗+80μg CpG705+Al佐剂1/8狂犬疫苗+80μg CpG705+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG667+Al佐剂1/2狂犬疫苗+80μg CpG667+Al佐剂1/4狂犬疫苗+80μg CpG667+Al佐剂1/8狂犬疫苗+80μg CpG667+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG309+Al佐剂1/2狂犬疫苗+80μg CpG309+Al佐剂1/4狂犬疫苗+80μg CpG309+Al佐剂1/8狂犬疫苗+80μg CpG309+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG205+Al佐剂1/2狂犬疫苗+80μg CpG205+Al佐剂1/4狂犬疫苗+80μg CpG205+Al佐剂1/8狂犬疫苗+80μg CpG205+Al佐剂上述狂犬疫苗和CpGODN均溶于PBS中。
5.小白鼠免疫于0天、3天、7天、14天、21天，按不同的分组分别给小白鼠进行免疫。免疫方式是小鼠腹腔注射。
6.狂犬疫苗抗体的检测于28天小白鼠尾静脉采血，分离血清，用快速狂犬疫苗荧光灶抑制实验(RFFIT)方法检测小白鼠血清中狂犬疫苗抗体的效价。于免疫的前两天小鼠尾静脉取血，获得的血清作阴性对照。
7.结果狂犬疫苗减量后与CpG联合应用仍然能够刺激小白鼠产生较高水平的狂犬病毒特异性抗体，说明CpG ODN能够降低狂犬疫苗的用量，结果见图5。
8.结论CpG ODN能够降低狂犬疫苗的用量。
实施例8不同CpGODN增强狂犬疫苗刺激抗体产生作用的比较1.实验动物小白鼠112只，雌、雄各半，体重18-22克，购自北京维通利华实验动物有限公司。
2.狂犬疫苗1ml/支(含2.5IU)，购自长春生物制品所。
3.CpGODN上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
4.对照序列5’-TCgTCgTTTTgTCgTTTTgTcgTT-3’
5.实验分组每组8只，雌雄各半。
狂犬疫苗狂犬疫苗+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG667狂犬疫苗+80μg CpG667+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG705狂犬疫苗+80μg CpG705+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG309狂犬疫苗+80μg CpG309+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG205狂犬疫苗+80μg CpG205+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG607狂犬疫苗+80μg CpG607+Al佐剂狂犬疫苗+80μg CpG2006狂犬疫苗+80μg CpG2006+Al佐剂上述狂犬疫苗和CpG ODN均溶于PBS中。
6.小白鼠免疫于0天、3天、7天、14天、28天，按不同的分组分别给小白鼠进行免疫。免疫方式是小鼠腹腔注射。
7.狂犬疫苗抗体的检测于35天进行小白鼠尾静脉采血，分离血清，用快速狂犬疫苗荧光灶抑制实验(RFFIT)方法检测小白鼠血清中狂犬疫苗抗体的效价。于免疫的前两天小鼠尾静脉取血，获得的血清作阴性对照。
8.结果狂犬疫苗+CpG667和狂犬疫苗+CpG309刺激抗体产生的作用显著好于狂犬疫苗+CpG2006，结果见图6。
9.结论CpGODN667和CpGODN309能够显著增加强狂犬疫苗的免疫效果。
seq序列表<110>OrganizationName长春华普生物技术有限公司<120>Title含CpG单链脱氧核苷酸作为狂犬疫苗的佐剂<210>1<211>22<212>DNA<213>Artificial<400>1ggggtcgttc gtcgttgggg gg22<210>2<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>2ggggataacg ttgcgggggg 20<210>3<211>21<212>DNA<213>Artificial<400>3ggggtgcaac gttcaggggg g 21<210>4<211>22<212>DNA<213>Artificial<400>4ggggtcctac gtaggagggg gg22<210>5<211>27<212>DNA<213>Artificial<400>5ggggtccatg acgttcctga agggggg 27<210>6<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>6gggggacgtc gccggggggg 20<210>7<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>7ggatccgtac gcatgggggg 20<210>8<211>20<212>DNA<213>Artificial
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seqtcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23<210>185<211>26<212>DNA<213>Artificial<400>185tcgtcgtttt cgtcgttttc gtcgtt 2权利要求
1.一种含CpG二核苷酸的单链脱氧核苷酸，它含一个或多个CpG二核苷酸。
2.按照权利要求1所述的单链脱氧核苷酸，它们具有SEQ ID NO1至SEQ ID NO179所示的序列。
3.按照权利要求1所述的单链脱氧核苷酸，其单链脱氧核苷酸中碱基上各个基团的修饰，基于权利要求1所述的单链脱氧核苷酸碱基的各种修饰方式
4.按照权利要求1所述的单链脱氧核苷酸，其修饰方式包括非硫代修饰，硫代修饰，部分硫代修饰，稀有碱基修饰(dI，dU等)，甲基化修饰，巯基、Aminolinker C6、Thiol-C6S-S等用于与其他物质偶联所应用的修饰方式。
5.按照权利要求1所述的单链脱氧核苷酸，与狂犬疫苗混合或经化学偶联后应用；将其克隆到狂犬病毒DNA疫苗中应用，可提高狂犬疫苗的免疫效果。狂犬疫苗包括但不限于狂犬病毒血源性疫苗、狂犬病毒基因工程蛋白类疫苗、狂犬病毒病毒载体疫苗、狂犬病毒细菌载体疫苗、狂犬病毒转基因植物疫苗和狂犬病毒DNA疫苗。
6.按照权利要求1所述的单链脱氧核苷酸，与其他佐剂(铝佐剂、弗氏佐剂、MPL等)联合应用作为狂犬疫苗的佐剂。
7.按照权利要求1所述的单链脱氧核苷酸，作为狂犬疫苗的佐剂用于防治狂犬病毒感染及其相关的疾病。狂犬疫苗包括但不限于狂犬病毒血源性疫苗、狂犬病毒基因工程蛋白类疫苗、狂犬病毒病毒载体疫苗、狂犬病毒细菌载体疫苗、狂犬病毒转基因植物疫苗和狂犬病毒DNA疫苗。
8.应用方式包括肌肉、皮下、粘膜、胃肠、静脉、腹腔等应用方式，其中单链脱氧核苷酸与狂犬疫苗可以联合应用或者分别单独应用。
9.按照权利要求1～8所述，应用对象为所有人群。
10.按照权利要求1～8所述，应用对象为所有哺乳类动物。
全文摘要
本发明提供了一种佐剂，该佐剂至少包括一个含CpG二核苷酸的单链脱氧核苷酸，该含CpG的单链脱氧核苷酸含一个或多个CpG二核苷酸，该佐剂与狂犬疫苗联合应用时，能够显著增强狂犬疫苗的免疫效果。
文档编号A61K39/39GK1781929SQ20041009608
公开日2006年6月7日 申请日期2004年11月29日 优先权日2004年11月29日
发明者王丽颖, 包木胜, 于永利 申请人:长春华普生物技术有限公司