专利名称：用于接种的sphingoid聚烷基胺缀合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用鞘脂的聚烷基胺缀合物进行接种以有效地递送生物学活性物质特别是抗原分子。
现有技术列表下列是被认为是有关描述本发明领域内的技术状况的现有技术列表。
US 5,334,761“Cationic lipids”；US 2001/048939“Cationic reagents of transfection”；US 5,659,011“Agents having high nitrogen content andhigh cationic charge based on dicyanimide dicyandiamide orguanidine and inorganic ammonium salts”；US 5,674,908“Highly packed polycationic ammonium，sulfonium and phosphonium lipids”；US 6,281,371“Lipopolyamines，and the preparation anduse thereof”；US 6,075,012“Reagents for intracellular delivery ofmacromolecules”；US 5,783,565“Cationic amphiphiles containing spermineor spermidine cationic group for intracellular delivery oftherapeutic molecules”；Marc Antoniu Ilies & Alexandru T.Balaban，Expert Opin.Ther.Patents.11(11)1729-1752(2001)；Miller AD.Chem.Int.Ed.Eng.371768-1785(1998)；Nakanichi T.等人J.Control Release 61233-240(1999)；
Brunel F.等人Vaccine 172192-2193(1999)；Guy B.等人Vaccine 191794-1805(2001)；Lima KM等人Vaccine 193518-3525(2001)。
背景技术：
许多能够在亚细胞或分子水平影响细胞功能的天然生物分子和其类似物，包括蛋白和多核苷酸、外源物质和药物，优选地整合到细胞中以发挥其作用。细胞膜是对这些试剂表现出不透性的选择性屏障。细胞膜的复杂组成包括磷脂、糖脂和胆固醇以及膜内和膜外蛋白，并且其功能受细胞质组分影响，所述细胞质组分包括Ca++和其它金属离子、阴离子、ATP、微丝、微管、酶和Ca++结合蛋白，也受细胞外糖萼(蛋白聚糖、glycose氨基聚糖和糖蛋白)的影响。结构和细胞质细胞组分之间的相互作用和其对外界信号的反应形成了负责细胞类型之内和之间表现出的膜选择性的运输过程。
也已研究了并非天然地由细胞吸收的试剂进入细胞的成功递送。通过将试剂与脂质制剂以复合方式结合可克服膜屏障，所述脂质制剂与天然细胞膜的脂质组成非常相似。这些制剂可通过与细胞膜接触而与细胞膜融合，或更普便地通过pynocytosis、胞吞作用和/或吞噬作用被吸收。在所有这些过程中，结合的物质被递送入细胞中。
脂质复合物也可通过克服细胞表面之间的电荷排斥而促进细胞内转运，细胞表面在大多数情况下是带负电的。所述制剂的脂质包括两亲性脂质，例如细胞膜的磷脂，并且在水系统中形成各种层或聚集体例如微团或中空脂质小泡(脂质体)。脂质体可用于将要被递送的物质捕获入脂质体中；在其它应用中，目的药物分子可作为内膜成分被整合入脂质小泡中，而不是被捕获到中空的含水的内部，或靠静电吸附在聚集体表面。然而，所用的大多数磷脂是兼性(中性)或带负电的。
细胞内递送领域内的进展是发现带正电荷的合成的阳离子脂质，N-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲铵氯化物(DOTMA)，可以脂质体或小泡的形式自发地与DNA相互作用形成脂质-DNA复合物，所述复合物可以吸附到细胞膜上并通过融合或更可能地通过吸附性内吞作用被细胞吸收，从而导致转基因的表达[Felgner，P.L.等人Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 847413-7417(1987)和美国专利号4,897,355，Eppstein，D.等人]。其它进展已成功地使用DOTMA类似物，1，2-二(油基氧基)-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)，和磷脂形成复合DNA的小泡。LipofectinTM试剂(Bethesda ResearchLaboratories，Gaithersburg，MD.)包含由带正电的脂质DOTMA和称作辅助脂质的中性脂二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)组成的带正电的脂质体，所述LipofectinTM试剂是用于递送高度阴离子的多核苷酸进入活组织培养细胞的有效试剂。这些脂质体自发地与带负电的核酸相互作用形成称作lipoplex的复合物。当使用超过DNA负电荷的带正电的脂质体时，所得到的复合体上的净电荷也是正的。以这种方式制备的带正电的复合物自发地吸附到带负电的细胞表面上或通过吸附性内吞作用或与质膜融合被导入细胞中，两个过程都将功能性多核苷酸递送至例如组织培养细胞中。DOTMA和DOTAP是单阳离子脂质的很好示例。[Illis等人2001，同前]也已显示多价阳离子其自身(包括多胺、无机盐和复合物和脱水溶剂)促进将大分子递送入细胞中。特别地，多价阳离子导致寡和聚阴离子(核酸分子、氨基酸分子等)坍缩成紧凑的结构形式，并且促进这些聚阴离子包装入病毒中，整合入脂质体中，转运至细胞内等。[Thomas T.J.等人Biochemistry 383821-3830(1999)]。最小的能够压缩DNA的天然聚阳离子是多胺亚精胺和精胺。通过连接体将疏水锚附着在这些分子上已发展出新的转染载体种类，聚阳离子lipopolymer。
阳离子脂质和阳离子多聚体与DNA(或任何其它聚阴离子大分子)的阴离子基团通过静电相互作用而形成DNA-脂质复合物(lipoplex)或DNA-聚阳离子复合物(polyplex)。所述复合物的形成与脂质或多聚体的平衡离子释放相关，所述平衡离子的释放是lipoplex和polyplex自发形成的热力学驱动力。阳离子脂质可分为四类；(i)季铵盐脂质(例如，DOTMA(LipofectinTM)和DOTAP)和鏻/鉮同类物；(ii)lipopolyamine；(iii)含有季铵和多胺部分的阳离子脂质；和(iv)脒的鎓盐(amidinium)、胍的鎓盐(guanidinium)和杂环盐脂质。
发明简述根据其一个方面，本发明涉及使用sphingoid-聚烷基胺缀合物制备用于调节受试者免疫应答的药物组合物的用途。
根据优选的实施方案，sphingoid-聚烷基胺缀合物包含sphingoid主链，所述sphingoid主链通过氨基甲酰键携带至少一个聚烷基胺链。
此处所用的术语sphingoid-聚烷基胺缀合物是指sphingoid碱(sphingoid base，此处也指术语“sphingoid主链”)和至少一个聚烷基胺链之间的化学缀合物(连接体)。sphingoid碱和至少一个聚烷基胺链之间的缀合是通过氨基甲酰键进行的，在下文中进一步详细描述。
此处所用的sphingoid碱/主链包括长链脂肪族胺，其包含两个或三个羟基基团，所述脂肪族链可以是饱和的或不饱和的。不饱和sphingoid碱的一个示例是在第4位含有特殊的反式双键的sphingoid碱。
此处所用的术语调节是指任何通过生物学活性物质(由缀合物递送的)表现的可测量的对受试者的免疫应答的调节或生物化学作用，所述应答包括细胞应答和/或体液应答。当将sphingoid-聚烷基胺缀合物和生物学活性物质施用给所述受试者时，调节作用包括抑制，或另一方面刺激或增强两种类型应答中的任一种或两者。所述调节优选地涉及，相对于未与缀合物一起施用的生物学活性分子所起的作用，具有2倍或更高的刺激或增强。本发明也涉及在生物学活性物质当不与缀合物一起施用时基本上不能有效地产生免疫应答的情况下对这种免疫应答的调节。
此外，调节作用涉及受试者免疫应答的抑制或压制，例如用于治疗自身免疫疾病以及用于治疗过敏。
因此，此处所用的术语生物学活性分子是指在与sphingoid-聚烷基胺缀合物一起施用时对受试者的免疫系统具有功效的任何物质。所述生物学活性物质优选地是抗原蛋白、抗原肽、抗原多肽或抗原糖类。
根据另一方面，本发明涉及用于调节受试者免疫应答的方法，所述方法包括为所述受试者提供sphingoid-聚烷基胺缀合物和生物学活性分子，所述sphingoid-聚烷基胺缀合物包含通过氨基甲酰键携带至少一个聚烷基胺链的sphingoid主链。
根据另一个方面，本发明涉及用于调节受试者免疫应答的药物组合物，所述组合物包含(i)至少一种sphingoid-聚烷基胺缀合物；和(ii)至少一种与所述缀合物相结合的生物学活性分子。
根据另一个实施方案，本发明提供复合物，其包含(i)sphingoid-聚烷基胺缀合物和(ii)能够调节受试者免疫应答的生物学活性物质。
最后，本发明涉及定义为生物学活性分子(例如，抗原分子)的捕获剂的sphingoid-聚烷基胺缀合物的用途。在本上下文中，sphingoid-聚烷基胺缀合物可形成用于捕获生物学活性物质(优选为抗源分子和/或免疫刺激剂和/或免疫抑制剂)的试剂盒的部分，除了所述缀合物以外，所述试剂盒包括说明使用其捕获生物学活性分子的说明书。试剂盒中的缀合物可以干燥的形式存在，在这种情况下，所述试剂盒也可包含合适的液体，在缀合物使用前将所述液体与所述缀合物混合以形成悬浮液或乳液或溶液，或其本身也可以液体(悬浮液、乳液、溶液等)形式存在。所述试剂盒可具有许多应用。例如，所述试剂盒可用于检查不同免疫调节分子在调节免疫应答中的功能，用于分离活性生物分子及其鉴定。本领域技术人员也会知道如何利用这种捕获剂以用于研究目的。
此处所用的术语捕获剂是指缀合物，所述缀合物借助于其聚阳离子结构能够与生物学活性分子结合，后者具有负电荷、负偶极或局部负电荷(分子内携带净负电荷的区域)。所述捕获本身涉及要被捕获的分子和本发明的带正电的缀合物之间的静电相互作用，所述要被捕获的分子携带所述负电荷、负偶极或局部负电荷。
本发明的缀合物也可用作递送载体，通过将生物学活性物质捕获到其中而将其运送到靶位点或运送入靶细胞中。
附图简述为了理解本发明和了解其在实践中可以是如何进行的，现在仅通过非限定性的实例和相关的附图描述一些实施方案，其中
图1A-1D表示几种可能的化学结构，“线性的”、“支化的”或“环形的”脂质样阳离子(LLC)化合物，所述化合物被包括在式(I)sphingoid-聚烷基胺缀合物的一般定义中，其中图1A表示连接到单个聚烷基胺链的sphingoid主链(神经酰胺)，图1B和图1C表示连接到两个聚烷基胺链的相同sphingoid主链，图1D仍表示相同的主链，但其中单个聚烷基胺链通过两个羟基部分相连而形成环形的聚烷基胺缀合物。
图2A-2F表示在胃肠-■-、肺-◆-或脾---中各种荧光标记的脂质制剂的生物分布和药物动力学，未回收的为-◇-图2A表示空DMPCDMPG(摩尔比9∶1)的分布；图2B表示DMPC:DMPG:HN的分布；图2C表示空DOTAP胆固醇的分布；图2D表示DOTAP胆固醇HN的分布；图2E表示空CCS胆固醇的分布；和最后，图2F表示CCS-胆固醇HN的分布。
图3A-3D表示在胃肠-■-、肺-◆-或脾-◇-中各种载有125I-HN的脂质装配制剂的生物分布，未回收的为-X-，特别地，图3A表示游离125I-HN的生物分布；图3B表示由DOTAP胆固醇组成的载有125I-HN的脂质装配物；图3C表示由DMPCDMPG组成的载有125I-HN的脂质装配物；和图3D表示由CCS胆固醇组成的载有125I-HN的脂质装配物。
发明详述本发明涉及作为运载生物学活性分子的捕获剂的sphingoid-聚烷基胺缀合物的用途，所述生物活性分子有效地调节受试者的免疫应答。
sphingoid-聚烷基胺缀合物是脂质样阳离子(LLC)化合物，其可以下列的方式合成。将N-取代的长链碱特别是N-取代的sphingoid或sphingoid碱与不同的聚烷基胺或其衍生物偶联，从而形成聚烷基胺-sphingoid实体，其就如此使用，或进一步烷基化。
在合适的pH下的质子化或所形成的聚烷基胺-sphingoid实体的烷基化归因于脂质样化合物，具有对于与要被递送到靶细胞中的生物学活性生物分子相互作用和与被靶向的细胞相互作用所需的正电荷。通过生物学活性分子的阴离子特性与缀合物的聚烷基胺部分之间的静电相互作用，所述sphingoid-聚烷基胺缀合物可与生物学活性分子有效地结合，从而形成复合物(lipoplex)。
可选择地，sphingoid-聚烷基胺缀合物可形成载有生物学活性分子的装配物。
sphingoid-聚烷基胺缀合物可以单个脂质样分子的形式或以装配物的形式存在。合适的装配物的一个示例包括微团或小泡，特别是脂质体的形成。其它装配物的示例包括微团、反向相(invertedphase)、方体相(cubic phase)等的形成。很明显，sphingoid聚烷基胺缀合物可以组合的小泡/微团形式或任何其它装配物组合的形式存在。
此处所用的脂质装配物是指尤其是形成微团和脂质体的脂质分子的有组织的聚集体。脂质装配物优选地是稳定的脂质装配物。此处所用的稳定的脂质装配物是指在贮存条件(4℃，在生理学介质中)下在化学和物理上稳定至少一个月的装配物。
当装配物以小泡(例如脂质体)的形式存在时，所述生物学活性分子可封装于小泡中、成为其脂双层的一部分或吸附在小泡表面(或任何这三种选择的组合)。当装配物是微团时，所述生物学活性分子可以稳定的方式插入形成微团的两亲性分子中和/或与其通过静电结合。
因此，如此处所用的，术语“被封装入”、“包含入”、“装入”或“结合”表示缀合物和生物学活性分子之间的物理附着。所述物理附着可以是将分子保留在或滞留在由缀合物形成的装配物(例如，小泡、微团或其它装配体)中；生物分子与这些装配物的表面的非共价连接；或生物分子嵌入形成这些装配物的sphingoid-聚烷基胺缀合物之间。应当指出在生理学条件下，由于sphingoid-聚烷基胺缀合物的正电荷或正偶极的作用，缀合物和生物学活性物质之间优选的结合是通过静电、偶极或酸-碱相互作用产生的。
尽管如此，但本发明不应当受限于sphingoid-聚烷基胺缀合物和生物学活性分子之间形成的特定类型的结合。因此，结合是指缀合物或由此形成的装配物与能够获得想要的治疗效应的生物学活性物质之间的任何相互作用。
生物学活性分子和缀合物可通过任何本领域已知的方法结合。这包括但不限于将缀合物和生物学活性分子后冷冻干燥或共冷冻干燥，或仅仅混合sphingoid-聚烷基胺缀合物和生物分子。尤其是在美国专利号6,156,337和6,066,331中描述了用于共冷冻干燥的方法，而尤其是在WO 03/000227中描述了用于后封装的方法。
因此，根据其第一方面，本发明涉及使用sphingoid-聚烷基胺缀合物来制备用于调节受试者免疫应答的药物组合物的用途，其中所述sphingoid-聚烷基胺缀合物包含sphingoid主链，所述主链通过氨基甲酰键携带至少一个，优选地一个或两个聚烷基胺链。
如上所述，sphingoid-聚烷基胺缀合物包括sphingoid主链和至少一个聚烷基胺链之间的连接，所述连接是通过对应的氨基甲酰键进行的。更优选地，sphingoid-聚烷基胺缀合物具有通式(I) 其中
R1表示氢、支化或线性的烷基、芳基、烷基胺或-C(O)R5基团；R2和R5独立地表示支化或线性的C10-C24烷基、烯基或多烯基基团；R3和R4独立地表示-C(O)-NR6R7基团，对于R3和R4，R6和R7可以相同或不同，并且独立地表示氢、或饱和或不饱和的支化或线性的聚烷基胺，其中在所述聚烷基胺中一个或多个胺单元可以是季铵；或R3是氢；或R3和R4和与其结合的氧原子一起形成杂环，所述杂环包含-C(O)-NR9-[R8-NR9]m-C(O)-，R8表示饱和的或不饱和的C1-C4烷基，R9表示氢或式-[R8-NR9]n-的聚烷基胺，其中在所述聚烷基胺中，所述R9或每个烷基胺单元R8NR9可以相同或不同；和n和m独立地表示从1至10，优选地从3至6的整数；W表示选自-CH＝CH-、-CH2-CH(OH)-或-CH2-CH2-的基团。
可根据本发明更特定的实施方案使用的sphingoid或sphingoid碱的非限定性示例包括鞘氨醇、二氢鞘氨醇、植物鞘氨醇、脱氢植物鞘氨醇和其衍生物。这类衍生物的非限定性示例是酰基衍生物，例如分别是神经酰胺(N-酰基鞘氨醇)、二氢神经酰胺、植物神经酰胺和二氢植物神经酰胺，以及ceramine(N-烷基鞘氨醇)和相应的衍生物(例如dihydroceramine、phytoceramine等)。合适地N取代的sphingoid或sphingoid碱拥有游离的羟基基团，所述羟基基团可被激活并随后与聚烷基胺反应形成聚烷基胺-sphingoid实体。激活剂的非限定性示例是N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸盐(N，N’-disuccinimidylcarbonate)、双光气或三光气或咪唑衍生物。这些激活剂与sphingoid或sphingoid碱的反应在一个或两个羟基上分别产生琥珀酰亚胺基氧基羰基(succinimidyloxycarbonyl)、氯甲酸酯或咪唑氨基甲酸盐衍生物。经激活的sphingoid和聚烷基胺的反应可产生如图1所示的支化的、直链的(未支化的)或环形的缀合物。
根据一个优选的实施方案，sphingoid主链是连接一个(图1A)或两个(图1B或1C)聚烷基胺链的神经酰胺，或通过两个羟基部分连接而形成环形聚烷基胺部分(图1D)。
所形成的sphingoid-聚烷基胺缀合物可进一步与甲基化试剂反应以形成季铵。所得到的化合物带有不同程度的正电荷，这依赖于所形成的缀合物中季、伯和/或仲胺之间的比例。同样，sphingoid-聚烷基胺缀合物以季铵化的氮盐存在，所述季铵化的氮盐包括但不限于氯化季铵、碘化季铵、氟化季铵、溴化季铵、季铵氧阴离子(oxyanion)盐和其组合。
sphingoid-聚烷基胺缀合物优选地与生物学活性分子一起使用。生物学活性物质是任何这样的分子，即当与sphingoid-聚烷基胺缀合物一起施用时，所述分子对受试者的免疫系统具有作用，根据本发明，具有刺激或增强作用。相对于在不加所述缀合物的情况下给受试者提供生物学活性分子时的生物学活性分子的作用(如果有)，所述作用是其两倍或更多倍。
根据一个实施方案，所述生物学活性物质是蛋白、多肽、肽或糖类。特别地，所述生物学活性分子可以是免疫调节剂，包括抗原蛋白或抗原肽、免疫刺激剂和/或免疫抑制剂。抗原蛋白和肽、免疫刺激剂和免疫抑制剂在本领域都是熟知的。优选地，所述生物学活性蛋白或肽或糖类在生理学pH下具有净负偶极矩、净负电荷或含有至少一个具有净负电荷的带负电的区域。
根据另一个实施方案，所述生物学活性物质是核酸分子，例如寡脱氧核苷酸(ODN)。
sphingoid-聚烷基胺缀合物和生物学活性物质之间的优选重量比是1000∶1至1∶1的重量比。
sphingoid-聚烷基胺缀合物也可与其它已知与抗原分子一起使用的活性物质组合。这些物质包括，例如，免疫刺激性试剂(也称作“免疫刺激剂”或“佐剂”)。其包括任何这样的物质，即当将所述物质加入疫苗中时，其提高免疫应答而使得只需较少的疫苗产生较大的应答。可与缀合物/生物学活性物质一起或在特定的时间间隔内(例如，在施用缀合物/生物学活性分子之前或之后数小时或数天)提供免疫刺激性试剂。
优选的免疫刺激性试剂包括但不限于细胞因子例如白细胞介素(IL-2、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18)、干扰素(IFN-α、β、γ)、寡脱氧核苷酸(ODN)、毒素(例如霍乱毒素(CT)、葡萄球菌肠毒素B(SEB)、热标记大肠杆菌(E.Coli)肠毒素(HLT))以及任何其它已知在本领域用于增强或刺激对抗原分子的免疫应答的佐剂。
装配物可包括作为唯一的脂质样成分的sphingoid-聚烷基胺缀合物(非甲基化或甲基化的)，或与其它辅助脂质物质组合。所述辅助脂质物质可以以不同的与该脂质样化合物的摩尔比包含非阳离子脂质样DOPE、DOPC、DMPC、胆固醇、油酸或其它。胆固醇是优选的用于体内使用的添加物质，而DOPE可以是优选的用于体外使用的辅助脂质。在该特定的实施方案中，胆固醇对阳离子脂质的摩尔比在0.01-1.0范围内，优选地在0.1-0.4范围内。
装配物也可以包括增强物(如本领域已知的，例如CaCl2和可溶性聚烷基胺)。
其它可包括在脂质装配物中和已知用于类似结构中的组分是空间稳定剂。普便使用的空间稳定剂的一个示例是lipopolymer家族，例如聚乙二醇衍生的脂质(PEG-脂质缀合物)。已知该化合物家族尤其可增加(延长)脂质的循环时间。
根据一个实施方案，所形成的脂质体可被塑形成具有大约50-5000nm直径的大小不一的异质和异层(heterolamellar)小泡(UHV)。通过进一步处理可减少所形成的UHV的尺寸并转化成具有大约50-100nm直径的大(更均一)的单层小泡。小泡的结构和尺寸例如其形状和大小对其作为将活性生物学实体递送到靶的载体的效力可具有重要的意义，即，这些决定其递送性能。
上文已就式(I)在结构上定义了形成sphingoid-聚烷基胺缀合体的部分的优选的一组聚烷基胺链。根据该实施方案，在式(I)的缀合体中可以相同或不同的聚烷基胺链选自精胺、亚精胺、聚烷基胺类似物或其组合。术语聚烷基胺类似物表示任何聚烷基胺链，并且根据一个实施方案是指包含1至10个胺基团，优选地3至6个和更优选地3或4个胺基团的聚烷基胺。聚烷基胺链内的每个烷基胺可以是相同的，或不同的，并且可以是伯、仲、叔或季胺。
在聚烷基胺链内可以是相同或不同的烷基部分优选地是C1-C6脂肪族重复单元。一些非限定性的聚烷基胺示例包括亚精胺、N-(2-氨乙基)-1，3-丙烷-二胺、3，3’-亚氨基二丙基胺、精胺和精胺的二(乙基)衍生物、聚乙烯亚胺。
本发明的最优选的sphingoid-聚烷基胺缀合物为N-棕榈酰基D-赤式鞘氨醇基氨基甲酰基精胺(CCS)。该缀合物包含通过氨基甲酰键而与精胺连接的神经酰胺。
本发明的sphingoid-聚烷基胺缀合物优选用于制备疫苗。
根据一个实施方案，sphingoid-聚烷基胺缀合物，优选地为CCS，用于制备流感疫苗。在该特定的实施方案中，生物学活性物质来源于流感病毒或来源于流感病毒的分子的生物学活性类似物。这些类似物包括任何这样的物质，即所述物质包含来源于引起免疫应答的来源于流感的抗原片段。
具体的来源于流感的抗原物质是血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)分子，组合称作HN。
本发明也涉及用于调节受试者免疫应答的方法，所述方法包括用sphingoid-聚烷基胺缀合体和生物学活性物质治疗所述受试者。
组合治疗包括将sphingoid-聚烷基胺缀合物和生物学活性物质一起或在预先确定的时间间隔例如数小时或数天之内施用(任选地和免疫刺激剂一起)。然而，根据优选的实施方案，在给受试者施用前将缀合物和生物学活性物质混合在一起。
将sphingoid-聚烷基胺和生物学活性物质一起施用涉及本发明的另一个方面。因此，提供了药物组合物，所述药物组合物包含生理学可接受的载体以及有效量的sphingoid-聚烷基胺缀合物和生物学活性物质。药物组合物任选地包含免疫刺激剂。
可将sphingoid-聚烷基胺缀合物与生物学活性物质一起施用并且根据考虑了个体患者的临床状况、施用的位点和方法、施用的时间安排、患者年龄、性别、体重和医生已知的其它因素的良好医学实践来确定剂量。
此处的“有效量”是指相对于在无sphingoid-聚烷基胺缀合物的情况下提供生物学活性物质给受试者时所获得的效应，可有效地调节(增强或刺激，如上面所定义的)受试者的免疫应答的量。优选地，所述量对获得有效的受试者抗特定疾病或病症的免疫是有效的。
尽管如上所述，所述量可以为对获得遏制或抑制免疫应答例如用于治疗过敏或自身免疫应答是有效的。
包含与生物学活性物质结合的sphingoid-聚烷基胺的本发明组合物可以各种方式施用。非限定性的施用途径的示例包括经口、皮下(s.c.)、肠胃外(包括静脉内(i.v.)、动脉内(i.a.)、肌内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、直肠内(i.r.)和鼻内(i.n.)施用，以及通过输注技术进行眼内施用。优选的施用模式是鼻内或肌内施用。
根据本发明，生理学可接受的载体通常是指惰性的、非毒性的固体或液体物质，所述物质优选地不与生物学活性物质或缀合物反应并且是对于有效地递送具有生物学活性分子的缀合物所需的。
生理学可接受的载体的非限定性示例包括水、盐水、5％葡萄糖、10％蔗糖等，单独地或与少量(至多10％)醇例如乙醇一起。
优选地，本发明的组合物是液体制剂，包括悬浮液、水溶液或以气雾剂的形式存在，所有这些对本领域技术人员来说是已知的。可将气雾剂制剂置于加压的可接受的推进剂中，例如丙烷、氮气等。它们也可配制成药物，其用于非加压制剂，例如在喷雾器或雾化器中合适的载体。
具体实施例的描述流感装载HN抗原的阳离子脂质体的表征在胆固醇(Chol)存在或不存在的情况下，以不同脂质/蛋白w/w比例(3/1-300/1)检验装载至各种阳离子脂质体制剂的HN(商业可获得的来源于流感病毒的血凝素和神经氨酸酶制剂)的封装效率。表1显示该实验(使用阳离子脂质DOTAP和CCS)的结果。
表1-脂质(DOTAP，CCS)/蛋白比例和胆固醇(Chol)对HN封装效率的影响
单价疫苗用于DOTAP，三价疫苗用于CCS。
在Chol存在或不存在的情况下，使用50/1至300/1的脂质/蛋白w/w比例装载DOTAP的百分比是75-90％。在30/1至300/1的脂质/蛋白w/w比例下获得大约90％的抗原装载，在10/1和3/1的w/w比例下，分别下降至79％和35％。在1/1和2/1的DOTAP/Chol摩尔比例下，向制剂中加入Chol不影响装载，在4/1的比例下加入Chol会稍微降低封装(80％)。对于CCS，在Chol存在或不存在的情况下，加载效率较低(在100/1-300/1的w/w比例下，64-73％)。
也已确定通过简单地将可溶性抗原与预制的空脂质体混合使HN与脂质体结合。在该情况下，无论何种制剂，使用100/1至300/1的脂质/蛋白w/w比例可使40-60％的抗原与脂质体结合。
这些发现总地表明在所有制剂中使用简单和快速(5分钟)方法可获得高装载效率(＞60％)。此外，甚至在水悬浮液中预制的脂质体也能够有效地与流感病毒表面抗原结合。
也估计了各种脂质/抗原w/w比例(在加入或不加入胆固醇的情况下)的免疫原性。
在第一个实验中，在用装载HN的中性、阴离子或阳离子脂质体鼻内接种幼(2个月大小)BALB/c小鼠后测定HI、IgG1和IgG2a抗体的血清水平(表2A)。所述HN抗原是来源于A/New Caledonia(H1N1)株系的单价亚单位疫苗。在相同的实验中，也检测HI、IgG1、IgG2a和IgA抗体在肺和鼻中的水平和由脾细胞产生的INFγ水平(表2B和2C)。
表2A-HI、IgG1和IgG2a抗体的血清水平
F-HN，游离抗原；Chol，胆固醇；CT，霍乱毒素。第5-10组是阳离子脂质体。在圆括号内，血清转变百分数-具有HI滴度≥40的小鼠的百分数。
特别地，关于在两次鼻内施用后诱导局部和全身性应答对内装HN抗原的中性(DMPC)、阴离子(DMPC/DMPG，9/1摩尔比)和阳离子(6种制剂)装配物(Lip)进行比较。对于所有制剂，脂质/HN w/w比例为300/1，阳离子脂质/Chol或阳离子脂质/DOPE摩尔比为1/1。平行地检测游离的抗原(F-HN)和与作为佐剂的霍乱毒素(CT，1μg)一起施用的F-HN。在第0和7天施用疫苗，3μg/剂(每鼻孔10μl)，在第二次施用疫苗后4-6周测定应答。
表2B-IgG1、IgG2a和IgA抗体的肺和鼻洗出水平
表2C-脾INFγ水平(pg/ml)
如表2A-2C中所示，游离的抗原以及中性和阴离子Lip-HN实际上是无效的粘膜疫苗。相反地，阳离子Lip-HN，特别是称作DOTAP-HN、DMTAP-HN和CCS-HN的那些引起强烈的具有高IgG1、IgG2a和IgA抗体水平的全身性粘膜体液应答，即混合的Th1+Th2应答。没有检测到IgE抗体。包含DOTAP-HN、DMTAP-HN和CCS-HN的阳离子脂质体疫苗在经抗原刺激的脾细胞中也诱导高水平的IFNγ(但不是IL-4)。由CCS-HN产生的应答甚至比由以CT为佐剂的F-HN诱导的应答要强。基于这些发现，只可进一步使用阳离子脂质体制剂DOTAP-HN、DMTAP-HN和CCS-HN。
在第二个实验中，测定脂质/HN w/w比例对装载HN的阳离子脂质体和与可溶性抗原简单混合的预制的脂质体的免疫原性。显示于表3A-3C中的数据表明所有这三种制剂都诱导强的全身性(血清)和局部性(肺)应答，并且显示将脂质/HN w/w比例降低至低于100/1可显著地降低应答。
表3A-HI、IgG1、IgG2a和IgA抗体的血清水平
在第18-20组中预制的脂质体与可溶性抗原混合。
表3B-HI、IgG1、IgG2a和IgA的肺水平
表3C-脾INFγ水平(pg/ml)
通过高水平的血清和肺IgG2a和IgA抗体(组12-16)的反映，再一次看到Lip CCS-HN疫苗优于其它疫苗制剂的优势。有趣地，将可溶性抗原与预制的脂质体简单混合产生与封装有所述抗原的质脂体相同的非常有效的疫苗(组18-20)。这暗示着真正的抗原封装对阳离子装配物/脂质体的佐剂性可能不是必需的。
在另一个实验中，检验胆固醇对装载HN的脂质体的免疫原性的影响。表4A-4C显示该实验的结果，结果表明在2/1和4/1的摩尔比例(组4，5)下，Chol的加入稍微减少了对DOTAP-HN的全身性HI应答，但在1/1的摩尔比例(组3)下没有减少该应答，而在所有比例(组7-9)下中度地增加了对DMTAP-HN的总体应答和在1/1的比例(组11)下中度地增加了对CCS-HN的局部(肺)应答。
表4A-HI、IgG1、IgG2a和IgA抗体的血清水平
表4B-HI、IgG1、IgG2a和IgA抗体的肺水平
表4C-脾INFγ水平(pg/ml)
在对老(18个月)C57BL/6小鼠肌内(一次，在第0天)或鼻内(2次，第0和7天)分别施用1μg和2μg亚单位(HN)疫苗(来源于A/Panama[H3N2]病毒)后评估CCS-HN疫苗的免疫原性。脂质装配物由CCS/胆固醇(3∶2的摩尔比例)组成，脂质/HN w/w比例为200∶1。与商业可购得的疫苗的0活性相反，CCS-HN疫苗引起高水平的血清HI和IgG2a抗体(接种后4周检测的)和肺(接种后6周检测的)IgG2a和IgA抗体，可在表5A和5B中看到所述结果(数据显示平均滴度)。
表5A-老年小鼠中HI、IgG1、IgG2a和IgA的血清水平
表5B-老年小鼠中IgG1、IgG2a和IgA的肺水平
此外，检测各种疫苗制剂对于细胞应答的诱导。具体地，用各种阳离子脂质体制剂鼻内免疫幼年小鼠并在接种6周后测量脾细胞应答-细胞毒性、增殖和IFNγ的产生。在所述实验中，所得结果显示于表6中，装载HN的脂质体(组3-10)和单独给予的(组2)或与预制的空脂质体混合的(组11-13)游离抗原(F-HN)之间进行比较。也测定以不同脂质/HN w/w比例(30/1-300/1)制备的Lip(DMTAP)-HN和Lip(CCS)-HN的免疫原性。
表6-通过鼻内施用的阳离子脂质体对细胞应答的诱导
只用100/1的脂质/HN w/w比例的CCS-HN(组8)和用所有三种预制的与游离抗原共施用的脂质体(DOTAP、DMTAP和CCS)获得优选的抗特定靶细胞(用流感肽脉冲的P815)的细胞毒性。用DMTAP-HN在50/1和30/1的脂质/HN w/w比例下和用CCS-HN在300/1、100/1和50/1的比例下观察到最大的增殖应答。由最有效的脂质体制剂引起的增殖和细胞素性应答比由游离抗原诱导的高2-3倍。
这些发现暗示在体液应答(表3)中，在100/1-300/1的脂质/HN w/w比例下获得测量的所有类型抗体的最高水平，与之相比，较低w/w比例(例如，30/1-100/1)对细胞应答是最佳的。此外，尽管DMTAP-HN引起强体液应答，但与CCS-HN相比，该制剂是较弱的细胞毒性活性的诱导剂。有趣地，用悬浮液中游离抗原和预制的阳离子脂质体(所有三种制剂)的混合物进行疫苗接种引起良好的细胞应答，所述应答在程度上与由封装的抗原诱导的应答相似。因此，简单地将游离抗原与预制的阳离子脂质体混合可足以诱导强体液(表3A-3C)和细胞(表6)应答。
在另一个实验中，其结果显示于表7A-7C，就免疫原性和对活病毒攻击的保护性免疫性方面，在通过肌内施用1剂、通过鼻内施用1或2剂和经口施用2剂包含DOTAP、DMTAP或CCS的装载单价HN的阳离子脂质体之间进行比较。在该实验中，脂质/HN w/w比例是300/1，对于DOTAP和DMTAP系统阳离子脂质/Chol比例为1/1，对于CCS系统为3/2。在这三条途径中，鼻内施用两次产生最强的体液和细胞应答以及保护性免疫性。在3种制剂中，CCS诱导最高的应答，特别是在IgG2a和IgA抗体方面。
表7A-HI、IgG1、IgG2a和IgA的血清水平
表7B-肺抗体
表7C-细胞应答和保护性免疫性
在描述于表8-10的实验中，检验商业可获得的三价疫苗并在单剂基于CCS的疫苗(使用2或4μg各病毒株系的抗原[HN])和两剂疫苗(2μg/株/剂)之间进行比较，施用之间间隔3、7或14天。脂质装配物由3/2摩尔比例的CCS/Chol(胆固醇)组成，对于所有制剂脂质/HN w/w比例是100/1。作为对照，标准的三价商业可购得的疫苗(HN)单独地或与1μg霍乱毒素(CT)(用作粘膜佐剂)一起施用。在第一剂疫苗接种后5-6周检测血清、肺匀浆和鼻洗出物中的HI抗体(表8)以及抗原特异性IgG1、IgG2a、IgA和IgE抗体(图9)。此外，用活病毒(使用小鼠适应的重排列X-127病毒)鼻内攻击来自选出组的5只小鼠并在4天后通过定量肺部病毒滴度估量保护性(表10)。
与弱的或无免疫原性的商业可获得的流感疫苗(HN)(组2-6)相反，CCS/Chol-流感疫苗诱导高滴度的所有类型的受试抗体(除了IgE未检测到)，特别是抗两个A病毒株系(组8-11；表8，9)的抗体。对于2剂方案，1周的间隔似乎是最优的(组10)。对于单剂方案，4μg抗原，但不是2μg(组8和组7相比较)，诱导高滴度的血清HI、IgG1和IgG2a抗体和肺IgG1抗体。然而，与2剂方案相比，所述1剂方案既不引发肺IgG2a和IgA抗体，也不引发鼻抗体(表9)。
在保护性测定(表10)中，鼻内施用(一次(4μg)或两次(2μg/剂))的CCS-流感疫苗提供完全的抗病毒感染的保护(肺部病毒滴度减少6个log)，而标准的疫苗仅减少0.5-1个log的病毒滴度。因此，尽管对于某些抗体同种型，使用CCS-流感疫苗的单剂方案不如两剂方案，但两种方案都提供相似程度的保护性。
在该实验中，我们也比较了单独的CCS和作为疫苗载体的CCS/Chol，并且在免疫原性上在两种制剂之间没有发现差异(数据未显示)。另一种制剂修饰是通过挤出(直径≤0.02μm)减小CCS/Chol脂质装配物的大小(直径0.05-5μm)。由经挤出的疫苗诱导的抗体滴度比由非挤出的疫苗产生的滴度低50-80％(数据未显示)。因此，在胆固醇存在或不存在的情况下，大小不一的CCS脂质装配物作为三价流感疫苗的疫苗载体是高度有效的。
表8-在用游离的和在CCS脂质装配物中的三价流感疫苗(以不同的时间间隔给幼(2个月)BALB/C小鼠施用一次或两次)进行鼻内接种后，对血凝抑制(HI)抗体的引发
a用游离的(F-HN)或整合入CCS/Chol(3/2摩尔比例)脂质装配物(第7，9，10，11组0.6mg；第8组1.2mg)的Fluvirin2003/2004三价亚单位疫苗制剂免疫小鼠，所述制剂由A/New Caledonia/20/99(H1N1)-like、A/Moscow/10/99(H3N2)-like和B/Hong Kong/330/2001-like组成b在第一剂疫苗施用后35天在单个小鼠上测定血清HI滴度。在第42天检测肺(汇集的)HI滴度。在括号中，具有HI滴度≥40.0的小鼠百分数表示HI滴度＜20。
表9-在用游离的和在CCS脂质装配物中的三价流感疫苗(以不同的时间间隔给幼(2个月)BALB/C小鼠施用一次或两次)进行鼻内接种后，对血清、肺和鼻抗原特异性IgG1、IgG2a和IgA抗体的引发
a实验细节参见表8。在第一剂疫苗施用后42天汇集样品并通过抗3个病毒株系(汇集的HN)的ELISA检测样品。0表示滴度＜10。
表10-在用游离的和在CCS脂质装配物中的三价流感疫苗进行鼻内接种后，幼BALB/c小鼠抗病毒攻击的保护性
a实验细节参见表8。在第4，5组中脂质/HN w/w比例是100/1。
b在第一剂疫苗施用后42天，使用大约106个卵感染剂量50％(EID50)的小鼠适应的重排列X-127病毒(A/Beijing/262/95[H1N1]×X-31[A/Hong Kong/1/68×A/PR/8/34)鼻内感染小鼠。4天后收集肺，匀浆、系列稀释并注射到10天的受精鸡蛋的尿囊中。在37℃下48小时后和在4℃下16小时后，取出0.1mL尿囊液体并通过血细胞凝集检查病毒的存在。
在描述于表11和12的实验中，使用各种量的HN抗原和脂质，用CCS/Chol脂质装配物配制三价流感疫苗。在该实验中，使用下列材料制备所述疫苗(a)变化的量的抗原(每个病毒株系0.25-2μg)和脂质(0.075-0.6mg)，保持脂质/HN w/w比例恒定在100/1；(b)分级变化的量的抗原(0.25-2μg)和恒定量的脂质(0.6mg)，从而改变脂质/HN w/w比例，从100/1至800/1。如在表11(HI滴度)和表12(同种型滴度)中可看到的，分别使用2或1μg各株系的抗原和0.6或0.3mg脂质以100/1的脂质/HN w/w比例配制的疫苗产生高的和相似水平的抗所述3个病毒株系的抗体(组2，3)。在较低的抗原(0.5，0.25μg/株系)和脂质(0.15，0.075mg)剂量下，所述应答特别是粘膜应答(肺、鼻)显著降低(组4，5)(表12)。当使用恒定剂量的脂质时，即使使用两个更低剂量的抗原(0.25，0.5μg/株系)(组6-8)也获得高水平的抗体。因此，CCS脂质的量是极其重要的，在合适的脂质剂量下所述抗原的剂量可降低4-8倍(从1-2μg至0.25-0.5μg)。
表11-在使用用CCS脂质装配体配制的三价流感疫苗鼻内接种(给幼(2个月)BALB/c小鼠施用2次(以1星期的间隔))后，抗原剂量和脂质剂量对诱导HI抗体的影响
a实验细节参见表8。
表12-在使用用CCS脂质装配体配制的三价流感疫苗鼻内接种(给幼BALB/c小鼠施用2次(以1星期的间隔))后，抗原剂量和脂质剂量对诱导血清、肺和鼻抗原特异性IgG1、IgG2a和IgA抗体的影响
a实验细节参见表8、9。
在另一实验中，对游离的(HN)或与CCS/Chol脂质装配物结合的(Lip HN)亚单位流感疫苗就其诱导HI抗体的能力进行检测，所述HI抗体与各种不包含于所述疫苗中的流感A和B亚株系交叉反应。显示于表13中的数据表明用单价或三价基于CCS的流感疫苗实施一或二次的鼻内(i.n.)和肌内(i.m.)接种引发抗免疫株系的HI抗体和与几种A/H1N1、A/H3N2和B株系(在1986-1999年流行并且不包含于所述疫苗中)交叉反应的HI抗体的高血清滴度。在鼻内单剂施用疫苗(组6和组7对比)后发现稍微降低的HI滴度。肺匀浆HI滴度(组4，8)比对应的血清滴度低。因此，用基于CCS的疫苗进行肠胃外或鼻内疫苗接种可提供抗广谱A和B病毒株系的保护作用。这些抗原变体可在由于抗原飘移导致的流感流行/全球流行期间出现。相反地，鼻内施用的标准的商业可购得的疫苗在诱导抗同源和异源株系的抗体方面完全无效(组1，5)。
表13-在用基于CCS的单价和三价流感疫苗鼻内或肌内接种幼BALB/c小鼠后对株系交叉反应性HI抗体的诱导
a检测接种5周后获得的汇集的血清和肺匀浆中的HI抗体。实验细节参见表8。脂质(Lip)装配物由CCS/Chol(3/2的摩尔比例)组成，在组2-4中脂质/HN w/w比例是300/1，组6-8中为100/1。除了组3和6以外，两剂疫苗之间间隔1周。粗体表示抗免疫株系的抗体滴度。0表示HI滴度＜10。
载有HN并鼻内施用的阴离子和阳离子脂质体的生物分布在生物分布实验中，将空的或载有流感HN抗原的脂质装配物的3种制剂DMPC/DMPG(阴离子)、DOTAP/Chol(阳离子)和CCS/Chol(阳离子)经鼻内施用(每只小鼠200μg脂质，2μg抗原)给BALB/c小鼠。然后在24小时内(在施用后1，5和24小时)在各种组织的匀浆中追踪荧光标记的脂质。
可在下列的表14和在图2A-2F中看出，在1和5小时后，经施用的所检测的所有三种制剂的脂质回收了75-100％。然而在所有制剂中(除了CCS制剂外)该回收率在24小时时显著下降。在3个靶器官(鼻、肺、GI道)中含有HN抗原的CCS制剂表现最长的保留时间(＞24小时)，而在脑中没有脂质积累并且在其它受试器官(肝、肾、心脏、脾)中没有显著的积累。
表14鼻内施用的荧光标记的脂质装配物在1、5和24小时的回收率
当使用125I标记的HN时，其生物分布类似于荧光脂质(数据未显示)。CCS疫苗组分在呼吸道和GI道中的这种长时间保留可部分地解释其优于其它脂质体制剂的免疫原性。这显示于下列追踪疫苗的抗原组分的研究中。用125I标记HN蛋白，并游离地或与一种用于荧光生物分布实验中的脂质制剂一起经鼻内施用。在滴注后1，5和24小时测定各种组织的放射性。
表15说明在该实验验中抗原的回收率也很高。在图3A-3D中可看出，125I标记的HN生物分布模式与脂质(图2A-2F)的生物分布模式相似，进一步确定(a)在体内HN蛋白和脂质装配物之间确实存在结合，和(b)当与阳离子脂质装配物结合时抗原在鼻内延长的保留可归因于阳离子装配物而不是HN蛋白本身的性质，因为当HN蛋白自身以可溶形式施用时无HN保留。
该实验还可说明当单独地或与脂质装配物(主要出于安全考虑使用鼻内接种)结合施用HN蛋白时在脑中无HN蛋白积累。因为放射性追踪方法远比荧光方法灵敏，所以该结果更具可信性。
表15单独地或与脂质装配体结合地经鼻内施用的125I标记的HN在1、5和24小时的回收率
为了检测在各种组织中蛋白和脂质是否以相似或不同的动力学保留和/或清除，进行另一种数据分析，其中确定在各时间点在各种组织中抗原保留百分数(占施用的总剂量)和脂质保留百分数之间的比例。当比例是恒定的且恒等于1，其表示在相同的器官中两种组分都得以相似地保留，而当该比例大于或小于1时，其暗示各组分的清除动力学不相同，并且一种组分的清除快于另一组分。
从下面的表16中可看出，随时间保持恒定的比例只有CCS/Chol-HN在鼻中的比例(比例为大约0.45)。这暗示着(a)相对于DMPC/DMPG，在鼻中使用CCS和DOTAP的抗原的高保留性与结合的水平相关，并且归因于这些制剂与鼻粘膜的结合；和(b)其它制剂的组分在体内解离并以不同的速率被清除，而基于CCS-HN的制剂是稳定的，特别是在鼻中，这可能是在使用基于CCS的疫苗时观察到增强的免疫原性的原因。
表16 在鼻内施用后脂质和HN抗原的保留
所述值显示所施用的总脂质或HN蛋白的保留百分数鼻内流感疫苗的初步安全研究毒性(局部的、全身的)是使用肌内和鼻内疫苗的主要考虑问题，因此进行实验性毒性研究。对小鼠(n＝4/组)鼻内施用(两次，间隔1周)载有流感抗原血凝素+神经氨酸酶(HN)的阳离子脂质制剂(基于DMTAP、DOTAP、CCS)，72小时后进行血细胞计数(总的，分类的)、血液化学和组织学检查(鼻、肺切片)。小鼠显示没有明显的任何毒性迹象。血细胞计数和血液化学在正常的范围之内，并且如所预期的，在用阳离子制剂处理的小鼠的鼻和肺内观察到最小至中等的炎症应答。类似地，虽然较不显著，也在一些单独地用盐水或用非封装的抗原处理的小鼠中观察到炎症应答。
小鼠中CCS-流感疫苗的免疫调节活性在这些实验中，用具有或不具有HN抗原的各种脂质体制剂(0.5-1mg脂质)(由DMPC、DMPC/DMPG、DOTAP/Chol、CCS/Chol组成)腹膜内注射小鼠。在注射脂质体制剂前2天用巯基乙酸盐(TG，增加巨噬细胞产生)腹膜内注射或不处理小鼠。在施用脂质体后24-48小时收获腹膜细胞，然后就这样使用或在37℃下在吸附至塑料培养皿4小时并除去非粘附的细胞后使用。在其他实验中，从TG处理的小鼠中收获腹膜细胞并用脂质体制剂温育24-48小时。通过流式细胞仪就MHC II和共刺激剂分子CD40和B7的表达检测细胞。检测上清液中的细胞因子干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素12(IL-12)，和检测一氧化氮(NO)。
所有阳离子制剂(CCS/Chol、DOTAP/Chol、DMTAP/Chol)在上调B7和CD40的表达方面超过其它制剂(DMPC[中性]、DMPC/DMPG[阴离子])并且诱导更高水平的IFNγ和IL-12。在一些情况下，CCS/Chol制剂比其它阳离子制剂更有效。没有任何一种所述制剂诱导显著的TNFα和NO水平。阳离子制剂导致的抗原呈递细胞上的共刺激分子的增强表达和IL-12和TNFγ的诱导可部分地解释这些制剂更高的佐剂活性。这些发现和在鼻内施用后CCS-流感疫苗在呼吸道内的长保留时间(图2C和2F以及图3A-3D)可解释为什么CCS是如此有效的粘膜疫苗载体/佐剂。
甲型肝炎病毒(HAV)除了流感以外，也就通过鼻内(i.n.)和直肠内(i.r.)途径施用的HAV疫苗检测了CCS脂质装配物的免疫增强潜力。
以2周的间隔两次施用10EU(约1.5μg蛋白)的HAV疫苗(Aventis Pasteur)，并在第二剂疫苗施用之后3周通过ELISPOT技术检测应答。以10μg/剂的量施用用作粘膜佐剂的CpG-ODN。根据上面描述的用于流感疫苗的方法(表1)制备HAV-CCS脂质装配物。
表17中提供的数据显示，尽管商业可购得的HAV疫苗不能通过两条施用途径(鼻内，直肠内)在两种受试组织(固有层，淋巴集结)中诱导IgA应答，但用CCS或CpG-ODN配制的疫苗在大多数情况下产生显著的应答。HAV-CCA脂质装配物与CpG-ODN的组合在所有情况下导致协同应答。因此，CCS脂质装配物单独地和特别是与CpG-ODN一起作为用于抗HAV的粘膜接种的载体/佐剂也是有效的。
表17-在用甲型肝炎病毒(HAV)疫苗单独地和与CCS脂质装配物和/或CpG-ODN一起通过鼻内(i.n.)或直肠内(i.r.)接种BALB/c小鼠后，对IgA抗体的诱导
AFC-抗体形成细胞肉毒梭菌(C.BOTULINUM)在另一个实验中，用0.4μg剂量的商业可购得肉毒梭菌类毒素(作为bioterror剂的模型，Uruguay，不含明矾)鼻内免疫小鼠，在第二剂疫苗施用后4周通过ELISA检测抗体滴度。
用肉毒梭菌类毒素进行的实验的结果归纳于表18中，所述结果显示在鼻内滴注后CCS-类毒素制剂优于标准疫苗，特别是在小肠和粪便中的IgA水平方面。预期这些抗体在口部暴露时中和毒素。单独地用疫苗鼻内免疫的小鼠不产生IgA。
表18-在用游离的或CCS结合的肉毒梭菌(Clostridium botulinum)类毒素(CBT)鼻内接种(两次，之间间隔1周)的BALB/c小鼠中，IgG1、IgG2a和IgA抗体的诱导
材料化学N-棕榈酰基D-赤式鞘氨醇基-1-氨基甲酰基精胺(CCS)的合成(i)通过加热将N-棕榈酰基鞘氨醇(1.61g，3mmol)溶解在无水THF(100ml)中。将澄清的溶液置于室温下并加入N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸盐(1.92g，7.5mmol)。加入DMAP(0.81g，7.5mmol)并搅拌，进一步搅拌反应16小时。在减少的压力的情况下除去溶剂，从正庚烷中重结晶残留物，产生1.3g(68％)的白色粉末状的二琥珀酰亚胺基神经酰胺基碳酸盐(熔点73-76℃)。
(ii)通过搅拌将精胺(0.5g，2.5mmol)和二琥珀酰亚胺基神经酰胺基碳酸盐(0.39g，0.5mmol)溶解在无水二氯甲烷中，然后用催化量的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)处理。在室温下搅拌溶液16小时，蒸发溶剂并用水处理残留物，过滤并在真空下干燥，产生0.4g(82％)粗材料，通过使用60∶20∶20丁醇∶AcOH∶H2O洗脱液在硅胶上进行柱层析进一步纯化所述材料。
(iii)为获得该化合物的季胺，可用DMS或CH3I甲基化步骤(ii)中的产物。
通过1H-和13C-NMR光谱测定法确定CCS的结构(数据未显示)。在共同未决的国际专利申请号___________中对所述分析进行了详细的描述。
其它合成方法类似于上述方法，可使用下列方法图1A中所描述的线性单取代神经酰胺-精胺的合成在DMAP存在的情况下将1当量的神经酰胺与2.5当量的二琥珀酰亚胺基碳酸盐反应以获得相应的1，3-二-O-琥珀酰亚胺基衍生物。
在室温下使用催化量的DMAP将所获得的二琥珀酰亚胺基衍生物与等当量的精胺反应以获得图1B的3-单取代的神经酰胺-精胺缀合物。
图1B中所描述的线性双取代神经酰胺-精胺缀合物的合成在80℃下在催化量的DMAP存在的情况下将1当量如上所述制备的1，3-二-O-琥珀酰亚胺基sphinogid衍生物与2.5当量的精胺反应。结果获得1，3-双取代的CCS。
图1C中描述的线性双取代的神经酰胺-支化的精胺缀合物的合成在80℃下在催化量的DMAP存在的情况下将1当量如上所述制备的1，3-二-O-琥珀酰亚胺基神经酰胺衍生物与2.5当量的α-ω双保护的精胺反应。
除去保护从而获得1，3-“支化的”双取代神经酰胺-精胺缀合物。
图1D所描述的线性双取代神经酰胺-环状精胺缀合物的合成在80℃下在催化量DMAP存在的情况下将1当量如上所述制备的1，3-二-O-琥珀酰亚胺基神经酰胺衍生物与0.75当量的精胺反应。
流感抗原由Berna Biotech，Bern，Switzerland的Drs.Gluck和Zurbriggen慷慨提供来源于流感A/New Caledonia/20/99-like(H1N1)株系的单价亚单位抗原制剂。该制剂(此处称为HN)由80-90％血凝素、5-10wt％神经氨酸酶和微量NP和M1蛋白组成。含有来源于A/NewCaledonia/20/99(H1N1)、A/Panama/2007/99(H3N2)和B/Shangdong/7/97的HN的商业可购得的三价亚单位疫苗(Fluvirin)(2003/2004季)获自Evans Vaccines Ltd.，Liverpool，UK。在封装前将该疫苗浓缩大约8倍(Eppendorf Concentrator 5301，Eppendorf AG，Hamburg，Germany)。将整个失活的病毒用于一些进行体外刺激的实验中。
脂质磷脂(PL)二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)来自Lipoid GmbH，Ludwigshafen，Germany。除了DMPC(中性)和DMPC/DMPG(9/1摩尔比，阴离子)脂质体之外，制备6种阳离子脂质体/脂质装配物的制剂。单阳离子脂质，二甲基氨基乙烷氨基甲酰基胆固醇(DC-Chol)、1，2-二硬脂酰基-3-三甲基铵-丙烷(氯化物盐)(DSTAP)、二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(氯化物盐)(DOTAP)和二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵-丙烷(氯化物盐)(DMTAP)来自Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL，USA)。单阳离子脂质，二甲基二(十八烷基)铵溴化物(DDAB)和胆固醇(Chol)来自Sigma。新型的、专有的聚阳离子鞘脂，N-棕榈酰基D-赤式鞘氨醇基氨基甲酰基-精胺(醋酸盐)(神经酰胺氨基甲酰基-精胺，CCS)来自Biolab Ltd.，Jerusalem，Israel。其中说明，以1/1至4/1的脂质/辅助脂质摩尔比使用辅助脂质(DOPE、Chol)。
小鼠使用(每组5-10只)无特定病原体(SPF)的雌性BALB/c小鼠(6-8周大)和C57BL/6小鼠(18个月大)。在SPF条件下饲养动物。
方法流感抗原在脂质体/脂质装配物中的封装将HN抗原(参见上面)封装在大的(平均直径0.1-5μm)异质的(大小不一的)小泡中。下列方法通常用于制备所有疫苗制剂。将脂质(10-30mg)溶解在1ml叔丁醇中，然后通过过滤(GF92，Glasforser，Vorfilter no.421051，Schleicher & Schuell，Dassel，Germany)灭菌。将灭菌的脂质溶液于-72℃下冷冻，然后冻干24小时至完全干燥。可将经干燥的脂质贮存在4℃下超过2年而无显著(＜5％)的脂质降解或“封装”能力的丢失。在需要时，用抗原溶液(在PBS pH7.2中)以3/1至800/1的脂质抗原(蛋白)w/w比例水化脂质粉末。以20-50μl的增量逐渐加入抗原溶液并在每次加入后剧烈涡旋振荡，直至终体积为0.5-1ml。在一些实验中，用PBS水化经干燥的脂质并将预制的“空”脂质装配物与抗原溶液混合。涡旋振荡混合物1-2分钟并在30-60分钟内使用。
为确定“封装”的效率，依赖于制剂，使用两种方法，其导致游离抗原和与脂质结合的抗原之间≥80％的分离。对于所有疫苗制剂，除了CCS外，使用下列的分离技术。将含有HN抗原(50-100μg蛋白)的脂质装配物(1-30mg脂质)悬浮于0.5ml PBS中并小心地加到0.5mlD2O(99.9％，Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI，USA)上面。然后将样品在30℃在45,000rpm下离心1小时。游离的、非封装的HN沉淀下来而被装配的(脂质体的)HN和无蛋白的装配物/脂质体保留在上清液中。收集整个上清液，通过向上清液和沉淀部分加入0.2ml温热的10％Triton X-100而溶解装配物/脂质体。通过经改进的Lowry技术测定两个部分的蛋白浓度。对于CCS制剂，将CCS-HN悬浮于0.5ml的PBS-D2O(1体积的PBS X10+9体积的D2O)中，然后与0.5ml PBS混合。然后将该混合物在20℃在10,000rpm下离心10分钟。CCS+/-抗原沉淀而游离HN保留在上清液中。如上所述在两个部分中进行脂质溶解和蛋白测定。在两种分离技术中，HN抗原的总回收率大于95％。
免疫一次肌内(i.m.，30μl)、一次或间隔3、7或14天的两次鼻内(i.n.，每个鼻孔5-50μl)或间隔1周的两次经口(50μl)施用游离的(F-HN)和经装配的/脂质体的(Lip-HN)疫苗，0.25-4μg抗原/株系/剂和0.075-1.2mg脂质/剂。在所有情况下，将0.15ml 4％的PBS中的水合氯醛经腹膜内施用而轻微麻醉小鼠。对于经口的接种，在接种前30分钟用0.5ml抗酸溶液(8份Hanks’平衡的盐溶液+2份7.5％的碳酸氢钠)经口处理小鼠。在所有实验中使用霍乱毒素(CT，Sigma，USA)(1μg/剂)作为用于比较的标准粘膜佐剂。在两个实验中，使用游离的或脂质体的CpG-ODN(ODN 1018，由University ofCalifornia，San Diego，CA，USA的Dr.E.Raz慷慨提供)(10μg/剂)作为佐剂。
体液应答的评估在接种后4-6周，从1/10或1/20样品稀释度开始，单个地或汇集地检测血清、肺匀浆和鼻洗出物。从1/10样品稀释度开始，通过标准的血凝抑制(HI)测定法测定血凝抑制性抗体。具有HI滴度≥40(在人中被认为是保护性滴度)的小鼠被确定为血清转变的小鼠。通过ELISA测量抗原特异性IgG1、IgG2a、IgA和IgE水平。产生高于对照(抗原+正常小鼠血清，OD＜0.1)0.2 OD的吸光度的最高样品稀释度被认为是ELISA抗体滴度。
细胞应答的评估在用抗原在体外刺激后，就增殖应答、IFNγ和IL-4产生和细胞毒性活性对接种后5-6周获得的脾细胞进行检测。在5×10-5M 2-巯基乙醇存在(用于细胞毒性)或不存在的情况下，在37℃下在补充有5％(用于增殖，细胞因子)或10％(用于细胞毒性)胎牛血清(FCS)的富集RPMI 1640或DMEM培养基中进行培养。如下进行细胞培养(i)增殖在抗原(每孔0.5-5μg)存在或不存在的情况下，以终体积0.2ml将每孔0.5×106个细胞按三份重复温育在U型96孔板中。72-96小时后，用1μCi3H胸苷脉冲培养物16小时。结果以Δcpm＝(用抗原培养的细胞的每分钟平均计数)-(无抗原培养的细胞的每分钟平均计数)表示。(ii)细胞因子在抗原(每孔5-10μg)存在或不存在的情况下，以终体积1ml将每孔2.5×106至5×106个细胞按二份重复温育在24孔板中。48-72小时后收集上清液并使用Opt EIA Set(Pharmingen，USA)通过ELISA检测上清液中鼠IFNγ和IL-4。(iii)细胞毒性如(ii)中一样将响应性脾细胞(2.5×106)和等数目的刺激性BALB/c细胞一起温育7天，所述刺激性BALB/c细胞已用X/127(H1N1)流感病毒感染(参见下面)。为进行感染，用150血凝单位/1×106脾细胞的病毒与所述脾细胞在37℃下在RPMI 1640培养基(无FCS)中温育(间歇搅拌)3小时，之后洗涤。随后，在10IU/ml rhIL-2存在的情况下以1/4的效应/刺激细胞比例用经感染的、经辐射的(3,000rad)脾细胞再刺激接触过抗原的效应细胞5天。使用标准的4小时51Cr释放测定法以100/1的效应/靶细胞比例测量细胞毒性。所使用的被标记的靶细胞是未修饰的P815和用HA2189-199肽(IYSTVASSLVL，20μg/1×106细胞)在37℃脉冲90分钟的P815。
保护性免疫性的测定将小鼠麻醉并用重排列的病毒X-127(A/Beijing/262/95(H1N1)×X-31(A/HongKong/1/68×A/PR/8/34)以每个鼻孔25μl活病毒悬浮液(大约107EID 50(卵感染剂量50％))进行施用，所述病毒对小鼠具有感染性并且与A/New Caledonia交叉反应。在第4天取出肺，在冷PBS中清洗三次，在PBS(1.5ml/肺/小鼠，称作1/10稀释)中匀浆。汇集各组的匀浆液并在4℃和2000rpm下离心30分钟，收集上清液。进行系列10倍稀释并以两份重复将0.2ml各稀释度的液体注射入11天大的含胚鸡蛋的尿囊中。在37℃进行48小时和4℃进行16小时后，取出0.1ml的尿囊液并用鸡红细胞(0.5wt.％，0.1ml)通过血细胞凝集(在室温下30分钟)检查病毒的存在。肺病毒滴度被确定为在尿囊液中产生病毒的(阳性的血细胞凝集)肺匀浆物的最高稀释度。各种荧光标记的脂质制剂和放射性标记的HN抗原的生物分布和药物动力学用20μl空的或与三价亚单位流感疫苗(HN)结合的丽丝胺罗丹明标记的脂质装配物制剂接种小鼠一次。在1，5或24小时后，杀死小鼠并取出各种器官。将器官贮存在-20℃下过夜，第二天上午在裂解缓冲液中匀浆。随后将0.2ml的匀浆液转移至eppendorf管中，加入0.8mL异丙醇，并离心15分钟以便将荧光探针释放到上清液中。将50μL上清液加入384黑色平板中并读取荧光(Em545，Ex596)。
在另外的测定中，将450μg三价HN疫苗(5mL)逆DDW进行透析(以除去盐)，然后浓缩1000倍至5μL。然后将蛋白在0.1M硼酸盐缓冲液(pH8.5)中稀释至15μL中有450μg的母液。然后按照厂商说明书，使用Bolton Hunter试剂用125I标记蛋白。给小鼠提供125I标记的HN(2μg)，并在1,5和24小时杀死小鼠，取出各种器官(参见图3)放入瓶中并在经校准用于125I的γ-计数器中读数。
本发明由所附的权利要求定义，其内容将被看成包括在本说明书的公开内容中。
权利要求
1.sphingoid-聚烷基胺缀合物在制备用于调节受试者免疫应答的药物组合物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述sphingoid-聚烷基胺缀合物包含sphingoid主链，所述主链通过氨基甲酰键携带至少一个聚烷基胺链。
3.权利要求1或2的用途，其中所述调节包括刺激或增强免疫应答。
4.权利要求1至3中任一项的用途，其与生物学活性分子组合。
5.权利要求4的用途，其中所述生物学活性分子在生理学pH下具有净负偶极矩或净负电荷或含有至少一个具有净负电荷的区域。
6.权利要求4或5的用途，其中所述生物学活性分子是免疫调节性氨基酸分子、核酸分子或低分子量化合物。
7.权利要求6的用途，其中所述生物学活性分子是抗原蛋白、抗原肽、抗原多肽、糖类或免疫刺激剂。
8.权利要求6的用途，其中所述核酸分子是寡脱氧核苷酸(ODN)。
9.权利要求1至8中任一项的用途，其与免疫刺激剂组合。
10.权利要求1至9中任一项的用途，其中所述sphingoid-聚烷基胺缀合物形成脂质装配物。
11.权利要求10的用途，其中所述sphingoid-聚烷基胺缀合物形成小泡、微团或其混合物。
12.权利要求1至11中任一项的用途，其中所述sphingoid选自神经酰胺、二氢神经酰胺、植物神经酰胺、二氢植物神经酰胺、ceramine、dihydroceramine、phytoceramine、dihydrophytoceramine。
13.权利要求12的用途，其中所述sphingoid是神经酰胺。
14.权利要求1至13中任一项的用途，其中所述聚烷基胺选自精胺、亚精胺、聚烷基胺类似物或其组合。
15.权利要求4至14中任一项的用途，其中将所述sphingoid-聚烷基胺缀合物与所述生物学活性分子共冻干，或将所述生物学活性物质与预制的sphingoid-聚烷基胺缀合物装配物混合。
16.权利要求1至15中任一项的用途，其中所述sphingoid-聚烷基胺缀合物是N-棕榈酰基D-赤式鞘氨醇基氨基甲酰基-精胺(CCS)。
17.权利要求1至16中任一项的用途，用于制备疫苗。
18.权利要求17的用途，用于制备流感疫苗。
19.权利要求18的用途，其中所述生物学活性物质来源于流感病毒或为来源于流感病毒的分子的类似物。
20.权利要求19的用途，其中所述生物学活性物质是血凝素和神经氨酸酶的组合物(HN)。
21.权利要求1至20中任一项的用途，用于鼻内或肌内接种物的制备。
22.N-棕榈酰基D-赤式鞘氨醇基氨基甲酰基-精胺(CCS)用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于增强或刺激受试者对流感病毒的免疫应答。
23.用于调节受试者免疫应答的方法，所述方法包括为所述受试者提供治疗有效量的sphingoid-聚烷基胺缀合物和生物学活性分子。
24.权利要求23的方法，其中所述sphingoid-聚烷基胺缀合物包含sphingoid主链，所述主链通过氨基甲酰键携带至少一个聚烷基胺链。
25.权利要求23或24的方法，其中所述调节包括刺激或增强免疫应答。
26.权利要求23至25中任一项的方法，其中所述生物学活性分子与所述sphingoid-聚烷基胺缀合物结合。
27.权利要求26的方法，其中所述生物学活性分子在生理学pH下具有净负偶极矩或净负电荷或含有至少一个具有净负电荷的区域。
28.权利要求23至27中任一项的方法，其中所述生物学活性分子是选自核酸分子、氨基酸分子或低分子量化合物的免疫调节剂。
29.权利要求28的方法，其中所述生物学活性分子选自抗原蛋白、抗原肽、抗原多肽或糖类。
30.权利要求28的方法，其中所述核酸分子是寡脱氧核苷酸(ODN)。
31.权利要求23至30中任一项的方法，其包括施用与生物学活性分子结合的所述Sphingoid-聚烷基胺缀合物以及免疫刺激剂。
32.权利要求31的方法，其中将所述免疫刺激剂与所述sphingoid-聚烷基胺缀合物一起施用，或在施用sphingoid-聚烷基胺缀合物前后一定的时间间隔内施用。
33.权利要求23至32中任一项的方法，其中所述sphingoid-聚烷基胺缀合物形成脂质装配物。
34.权利要求33的方法，其中所述脂质装配物包含小泡或微团或其组合。
35.权利要求23至34中任一项的方法，其中所述sphingoid选自神经酰胺、二氢神经酰胺、植物神经酰胺、二氢植物神经酰胺、ceramine、dihydroceramine、phytoceramine、dihydrophytoceramine。
36.权利要求35的方法，其中所述sphingoid是神经酰胺。
37.权利要求23至36中任一项的方法，其中所述聚烷基胺选自精胺、亚精胺、聚烷基胺类似物或其组合。
38.权利要求23至37中任一项的方法，其中所述sphingoid-聚烷基胺缀合物是N-棕榈酰基D-赤式鞘氨醇基氨基甲酰基-精胺(CCS)。
39.权利要求23至38中任一项的方法，其中所述生物学活性物质来源于流感病毒或为来源于流感病毒的分子的类似物。
40.权利要求39的方法，其中所述生物学活性物质是血凝素和神经氨酸酶的组合(HN)。
41.权利要求23至40中任一项的方法，其包括鼻内或肌内施用所述缀合物。
42.用于调节受试者对流感病毒的免疫应答的方法，所述方法包括为所述受试者提供N-棕榈酰基D-赤式鞘氨醇基氨基甲酰基-精胺(CCS)和流感抗原。
43.用于调节受试者免疫应答的药物组合物，所述组合物包含(i)至少一种sphingoid-聚烷基胺缀合物；和(ii)至少一种生物学活性分子。
44.权利要求43的药物组合物，其中所述sphingoid-聚烷基胺缀合物包含sphingoid主链，所述主链通过氨基甲酰键携带至少一个聚烷基胺链。
45.权利要求43或44的组合物，其包含至少一种生理学可接受的载体。
46.权利要求43至45中任一项的组合物，其中所述调节包括刺激或增强免疫应答。
47.权利要求43至46中任一项的组合物，其中所述生物学活性分子在生理学pH下具有净负偶极矩或净负电荷或含有至少一个具有净负电荷的区域。
48.权利要求43至47中任一项的组合物，其中所述生物学活性分子是选自氨基酸分子、核酸分子或低分子量分子的免疫调节剂。
49.权利要求48的组合物，其中所述生物学活性分子选自抗原蛋白、抗原肽、抗原多肽或糖类。
50.权利要求48的组合物，其中所述核酸分子是寡脱氧核苷酸(ODN)。
51.权利要求43至50中任一项的组合物，其包含免疫刺激剂。
52.权利要求43至51中任一项的组合物，其中所述sphingoid-聚烷基胺缀合物形成脂质装配物。
53.权利要求52的组合物，其中所述sphingoid-聚烷基胺缀合物形成小泡或微团或其组合。
54.权利要求43至53中任一项的组合物，其中所述sphingoid主链选自神经酰胺、二氢神经酰胺、植物神经酰胺、二氢植物神经酰胺、ceramine、dihydroceramine、phytoceramine、dihydrophytoceramine。
55.权利要求54的组合物，其中所述sphingoid是神经酰胺。
56.权利要求43至55中任一项的组合物，其中所述聚烷基胺选自精胺、亚精胺或者精胺或亚精胺的聚烷基胺类似物。
57.权利要求43至56中任一项的组合物，其中所述sphingoid-聚烷基胺缀合物是N-棕榈酰基D-赤式鞘氨醇基氨基甲酰基精胺(CCS)。
58.权利要求43至57中任一项的组合物，所述组合物用于接种受试者抵抗流感病毒。
59.权利要求58的组合物，其中所述生物学活性分子来源于流感病毒或为来源于流感病毒的分子的类似物。
60.权利要求59的组合物，其中所述生物学活性分子是血凝素和神经氨酸酶的组合(NH)。
61.权利要求43至60中任一项的组合物，其以适合鼻内或肌内施用的剂型存在。
62.包含N-棕榈酰基D-赤式鞘氨醇基氨基甲酰基-精胺(CCS)和血凝素神经氨酸酶的疫苗。
63.一种复合物，其包含(i)sphingoid-聚烷基胺缀合物和(ii)能够调节受试者免疫应答的生物学活性分子。
64.权利要求63的复合物，其中所述sphingoid通过氨基甲酰键连接至少一个聚烷基胺链。
65.权利要求63或64的复合物，其中所述生物学活性分子在生理学pH下具有净负偶极矩或净负电荷或含有至少一个具有净负电荷的区域。
66.权利要求63至65中任一项的复合物，其中所述生物学活性物质是选自氨基酸分子、核酸分子或低分子量分子的免疫调节剂。
67.权利要求66的复合物，其中所述生物学活性分子选自抗原蛋白、抗原肽、抗原多肽或糖类。
68.权利要求66的复合物，其中所述核酸分子是寡脱氧核苷酸(ODN)。
69.权利要求63至68中任一项的复合物，其中所述sphingoid-聚烷基胺缀合物形成脂质装配物。
70.权利要求69的复合物，其中所述sphingoid-聚烷基胺缀合物形成小泡或微团或其组合。
71.权利要求63至70中任一项的复合物，其中所述sphingoid选自神经酰胺、二氢神经酰胺、植物神经酰胺、二氢植物神经酰胺、ceramine、dihydroceramine、phytoceramine、dihydrophytoceramine。
72.权利要求71的复合物，其中所述sphingoid是神经酰胺。
73.权利要求63至71中任一项的复合物，其中所述聚烷基胺选自精胺、亚精胺或者精胺或亚精胺的多胺类似物。
74.权利要求63至73中任一项的复合物，其中所述sphingoid-聚烷基胺缀合物是N-棕榈酰基D-赤式鞘氨醇基氨基甲酰基精胺(CCS)。
75.用于捕获生物学活性分子的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1至22中任一项定义的sphingoid-聚烷基胺缀合物，和作为捕获剂的所述缀合物的使用说明书。
全文摘要
本发明涉及作为生物学活性分子(例如抗原)的捕获剂的sphingoid－聚烷基胺缀合物的用途。在一个特殊的实施方案中，使用sphingoid－聚烷基胺制备用于调节受试者免疫应答的药物组合物。本发明的其它方面涉及通过使用所述缀合物、包含sphingoid－聚烷基胺缀合物和能够调节受试者免疫应答的生物学活性分子的复合物、包含所述缀合物的组合物来调节受试者免疫应答的方法，以及利用所述缀合物的试剂盒。本发明优选的缀合物是N－棕榈酰基D－赤式鞘氨醇基－1－氨基甲酰基精胺。
文档编号A61P37/02GK1829535SQ200480021919
公开日2006年9月6日 申请日期2004年6月17日 优先权日2003年6月18日
发明者Y·巴兰霍尔茨, A·约瑟夫, E·科达 申请人:耶路撒冷希伯来语大学依苏姆研究开发公司, 生物试验室有限公司