专利名称：抑制分泌酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及抑制分泌酶活性的方法和药物组合物。具体来说，涉及通过抑制Synoviolin的表达，促进分泌酶抑制剂的感受性，来抑制分泌酶活性的方法；以及通过使Synoviolin与Herp结合来抑制分泌酶活性的方法；以及含有抑制分泌酶活性的物质的药物组合物。
背景技术：
Synoviolin是作为存在于来自类风湿病患者的滑膜细胞中的膜蛋白质而被发现的新型蛋白质(WO02/05207)。通过使用基因变异动物进行的研究，表明该因子与骨·关节的发生和关节病的发病直接相关，因此，可认为Synoviolin是对正常的骨形成或四肢的发育有贡献的蛋白质。
Synoviolin的表达不仅在骨·关节中，在全身可见其遍在，因此为了分析Synoviolin在生物体内的功能，对于与Synoviolin结合的因子的探究成为有力的方法。特别是检测Synoviolin的底物蛋白，这是鉴定Synoviolin相关的细胞内信号转导途径的重要手段。
因此，本发明人为了了解Synoviolin参与了怎样的细胞内信号转导途径，通过以Synoviolin作为诱饵(Bait)的酵母双杂交(Yeast TwoHybrid)法，进行与Synoviolin结合的因子的探究。结果，鉴定出被称为Herp(高半胱氨酸诱导的内质网应激诱导的遍在蛋白样结构域成员1，homocysteine-indusible endoplasmic reticulum stress-indusibleubiquitin-like domain member 1)的蛋白质是与Synoviolin具有相互作用的分子。Herp是1996年由Miyata等人作为血管内皮细胞中高半胱氨酸应答型基因产物发现的蛋白质(Kokame K，Kato H，Miyata T.Homocysteine respondent Genes in Vascular Endothelial CellsIdentified by Differential Display Analysis.J.Biol.Chem.1996 Nov22；271(47)29659-29665)。
之后的研究表明Herp是其表达受内质网应激的诱导，结构上在N末端一侧具有遍在蛋白样结构域(UBL，ubiquitin-like domain)的膜蛋白质(Kokame K，Agarwala KL，Kato H，Miyata T.Herp，a NewUbiquitin-like Membrane Protein Induced by Endoplasmic ReticulumStress.J.Biol.Chem.2000 Oct 20；275(42)32846-32853)。还有报道称Herp与被视为家族性阿尔茨海默病(FAD)的病因基因的早老蛋白(presenilinPS)具有相互作用，可提高与β-淀粉样蛋白(Aβ)的膜内切断有关的蛋白质分解酶—γ-分泌酶(γ-secretase)的活性(SaiX，Kawamura Y，Kokame K，Yamaguchi H，Shiraishi H，Suzuki R，Suzuki T，Kawaichi M，Miyata T，Kitamura T，Strooper BD，Yanagisawa K，Komano H.J.Biol.Chem.277(15)12915-12920)。
在老龄化日趋严重的现代，阿尔茨海默病是受到高度关心的疾病之一。其最重要的特征就是在脑中可观察到老年斑，即纤维状β-淀粉样蛋白(Aβ)的沉淀。β蛋白是淀粉样蛋白前体蛋白(APP)被β-分泌酶和γ-分泌酶切断而产生的蛋白质，阿尔茨海默病患者中，该切断增加。
因此，抑制分泌酶的酶活性的物质作为阿尔茨海默病的治疗药物而受到人们的重视，世界各地均在进行筛选。
但是，虽然得到了几种候选物质，但分泌酶抑制剂的开发尚未成功。
发明内容
本发明的目的在于提供用于治疗脑神经疾病，特别是阿尔茨海默病的有用的药物。
本发明人为解决上述课题进行了深入地研究，结果发现着眼于抑制分泌酶活性的物质，如果使用该物质，则可抑制Aβ的蓄积，治疗阿尔茨海默病，从而完成了本发明。
即，本发明如下所示。
(1)药物组合物，其含有抑制分泌酶活性的物质。
(2)(1)的药物组合物，其中分泌酶是β-分泌酶或γ-分泌酶。
(3)(1)或(2)的药物组合物，其中抑制分泌酶活性的物质是促进分泌酶抑制剂感受性的物质。
(4)(3)的药物组合物，其中促进分泌酶抑制剂感受性的物质是抑制Synoviolin表达的物质。
(5)(4)的药物组合物，其中抑制Synoviolin表达的物质是针对编码Synoviolin的基因的siRNA或shRNA。
(6)(5)的药物组合物，其中编码Synoviolin的基因含有SEQ IDNO.1所示的碱基序列。
(7)(5)的药物组合物，其中siRNA以SEQ ID NO.1所示的碱基序列中的部分序列为靶。
(8)(7)的药物组合物，其中部分序列为选自SEQ ID NO.3-16所示碱基序列的至少一种序列。
(9)(1)或(2)的药物组合物，其中抑制分泌酶活性的物质是Synoviolin。Synoviolin例如是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的物质。
(10)(1)-(9)中任一项的药物组合物，该药物组合物用于治疗脑神经系统疾病。
(11)(10)的药物组合物，其中脑神经系统疾病是阿尔茨海默病。
(12)抑制分泌酶活性的方法，其特征在于促进分泌酶抑制剂的感受性。
(13)(12)的方法，其中分泌酶抑制剂的感受性的促进通过抑制Synoviolin的表达来实现。
(14)抑制分泌酶活性的方法，其特征在于使Synoviolin与Herp结合。
(15)(14)的方法，其中Herp与Synoviolin的结合区域是Herp的氨基酸序列第161-200号氨基酸残基所示的区域。
(16)(12)-(15)中任一项的方法，其中分泌酶是β-分泌酶或γ-分泌酶。
图1是表示Synoviolin的全长结构和用于诱饵的Syno dTM和SynoRing的结构的示意图。
图2是表示Herp的全长结构和片段化的Herp结构的示意图。
图3是表示Flag-Syno dTM与Herp各构成的GST融合蛋白的结合实验的结果图。
图4是表示HA/Syno和Flag/Herp的免疫沉淀实验的结果的图。
图5是表示野生型和Synoviolin缺失小鼠胚胎成纤维细胞中γ-分泌酶抑制剂的效果的图。
图6是表示pull-down assay中的Synoviolin与Herp的关系的图。
图7是表示体内Synoviolin与Herp的结合区域的图。
图8A是表示MEF细胞中Herp的表达的图。
图8B是表示Herp遍在蛋白化的图。
图8C是表示Herp分析中所使用的构成的图。
图9是表示MEF中的γ-分泌酶活性的图。
具体实施例方式
下面详细说明本发明。
本发明人着眼于Synoviolin与阿尔茨海默病的发病机理相关的可能性，明确了在敲除了Synoviolin表达的细胞中，分泌酶抑制剂的感受性提高。这意味着在使Synoviolin的表达受到抑制的状态下，分泌酶抑制剂的感受性得到促进，显示通过Synoviolin的缺失，分泌酶抑制剂的感受性得到促进。验证了使用促进分泌酶抑制剂的感受性的物质与阿尔茨海默病的治疗有关。
另外，本发明发现，使Synoviolin与Herp蛋白结合，则Herp蛋白质被遍在蛋白化，被降解，结果，分泌酶活性降低。
1.概要如上所述，阿尔茨海默病中，APP被分泌酶(例如γ-分泌酶活性)切下，Aβ蓄积，形成老年斑。因此本发明人着眼于分泌酶与阿尔茨海默病的发病机理相关这一点，考虑构建以下方法通过抑制分泌酶活性来抑制Aβ的蓄积以及老年斑的形成。
因此，本发明的特征在于通过抑制分泌酶活性来抑制Aβ的蓄积。并通过抑制Aβ的蓄积来抑制老年斑的形成，从而可进行阿尔茨海默病的治疗。
Synoviolin是在全身可见其表达的蛋白质，显示在生物体中承担着必须的功能。因此需要了解Synoviolin在生物体内的功能。通常，为了明确蛋白质的功能，探究与Synoviolin结合的因子是有力的方法之一，特别是检测Synoviolin的底物蛋白，被认为是对Synoviolin参与的细胞内信号转导途径进行鉴定的重要手段。
因此，为了了解Synoviolin参与了哪些细胞内信号转导途径，如前所述，本发明人通过酵母内的结合实验和GST Pull-down assay，显示出Synoviolin与Herp具有相互作用。接着，为了确认在细胞内的相互作用，使Synoviolin与Herp在HEK293细胞内共表达，并通过免疫沉淀来观察，结果与酵母内·体外测定的结果同样可见Synoviolin与Herp的相互作用。这都说明Synoviolin与Herp相互作用。通过蛋白质结构预测系统，显示出Synoviolin上存在环指(RING finger)基序。已知该基序存在于与蛋白质分解有关的E3遍在蛋白-蛋白连接酶中。另外，环指基序被认为是E2遍在蛋白结合酶的结合部位。
因此，可认为Synoviolin与阿尔茨海默病的发病机理、特别是分泌酶活性有关。
这里，本发明中认为作为抑制分泌酶活性的机理有两种情况促进分泌酶抑制剂的感受性的情况、和使Synoviolin与Herp蛋白(以下简称为“Herp”)结合的情况。
前者是通过促进分泌酶抑制剂的感受性来抑制分泌酶的活性，抑制Aβ的蓄积；后者是使Synoviolin与Herp结合，引起Herp的遍在蛋白化，分解Herp，从而抑制Aβ的蓄积。
以下对各方式进行说明。
2.分泌酶抑制剂的感受性的促进本发明人着眼于分泌酶抑制剂的感受性，考虑构建以下方法通过提高该抑制剂的感受性来抑制Aβ的蓄积和老年斑的形成。另外还着眼于Synoviolin与阿尔茨海默病的发病机理有关的可能性，明确了在敲除了Synoviolin表达的细胞中，分泌酶抑制剂的感受性得到提高。这意味着在抑制Synoviolin表达的状态下，分泌酶抑制剂的感受性得到促进，显示通过Synoviolin的缺失，分泌酶抑制剂的感受性得到促进。验证了使用促进分泌酶抑制剂的感受性的物质与阿尔茨海默病的治疗有关。
这里，“促进分泌酶抑制剂的感受性”是指提高分泌酶抑制剂的药物效果，使之有效发挥功能。
(1)Synoviolin表达抑制和活性抑制为了提高分泌酶抑制剂的感受性，采用抑制Synoviolin表达的方法。
对于Synoviolin表达的抑制并没有特别限定，例如可利用RNA干扰(RNAi)。可设计及合成针对Synoviolin基因的siRNA(小干扰RNA，smallinterfering RNA)，将其导入细胞内，从而引起RNAi。
RNAi是dsRNA(双链RNA)与靶基因特异性且选择性地结合，通过切断该靶基因来有效地抑制其表达的现象。例如将dsRNA导入细胞内，则与该RNA同源序列的基因的表达受到抑制(敲除)。
siRNA的设计可如下进行。
(a)只要是编码Synoviolin的基因即可，没有特别限定，任何区都可作为候选。例如为人时，可以以GenBank Accession numberAB024690(SEQ ID NO.1)的任意区作为候选。
(b)从所选择的区中选择由AA起始的序列，该序列的长度为19-25个碱基，优选19-21个碱基。可以选择其序列的GC含量例如为40-60％的序列。具体来说，可在SEQ ID NO.1所示的碱基序列中使用含有以下碱基序列的DNA作为siRNA的靶序列。特别优选以(i)(SEQID NO.3)、(ii)(SEQ ID NO.4)、(vi)(SEQ ID NO.8)、(vii)(SEQ ID NO.9)、(viii)(SEQ ID NO.10)为靶。
(i)AA TGTCTGCATCATCTGCCGA GA (SEQ ID NO.3)(ii)AA GCTGTGACAGATGCCATCA TG (SEQ ID NO.4)(iii)AA AGCTGTGACAGATGCCATC AT (SEQ ID NO.5)(iv)AA GAAAGCTGTGACAGATGCC AT (SEQ ID NO.6)(v)AA GGTTCTGCTGTACATGGCC TT (SEQ ID NO.7)(vi)AA CAAGGCTGTGTACATGCTC TA (SEQ ID NO.8)(vii)AA ATGTTTCCACTGGCTGGCT GA (SEQ ID NO.9)(viii)AA GGTGTTCTTTGGGCAACTG AG (SEQ ID NO.10)(ix)AA CATCCACACACTGCTGGAC GC (SEQ ID NO.11)(x)AA CACCCTGTATCCAGATGCC AC (SEQ ID NO.12)(xi)AA GGTGCACACCTTCCCACTC TT (SEQ ID NO.13)(xii)AA TGTTTCCACTGGCTGGCTG AG(SEQ ID NO.14)(xiii)AA GAGACTGCCCTGCAACCAC AT (SEQ ID NO.15)(xiv)AA CGTTCCTGGTACGCCGTCA CA (SEQ ID NO.16)
将siRNA导入细胞时，可以采用将体外合成的siRNA与质粒DNA连接，将其导入细胞的方法，以及将2条RNA退火的方法等。
另外，为了产生RNAi效果，本发明也可以使用shRNA。shRNA被称为短发夹RNA(short hairpin RNA)，是单链的一部分区与其它区形成互补链，因而具有茎-环结构的RNA分子。
shRNA可以设计成其一部分形成茎-环结构。例如以某一区的序列为序列A，以与序列A互补的链为序列B，则设计成这些序列以序列A、间隔、序列B的顺序存在于一根RNA链上，全体为45-60个碱基的长度。序列A是成为靶的Synoviolin基因(SEQ ID NO.1)的一部分区的序列，对于靶区域没有特别限定，可以以任意区域作为候选。另外，序列A的长度为19-25个碱基，优选19-21个碱基。
(2)分泌酶抑制活性作为评价分泌酶抑制剂的感受性的方法，在阿尔茨海默病患者的脑中进行感受性测定试验，这在伦理上是极为困难的，必须采用其它评价系统。因此，本发明人采用对细胞处置分泌酶抑制剂，以该细胞的增殖活性作为分泌酶抑制的指标的评价系统。这里，分泌酶的种类没有特别限定，有β-分泌酶、γ-分泌酶。因此，分泌酶抑制剂可以是β-分泌酶抑制剂和γ-分泌酶抑制剂的任意一种。分泌酶抑制剂没有特别限定，例如有L-685，458((株)ペプチド研究所)、(3，5-二氟苯基乙酰基)-Ala-Phg-Obut[DAPT]((株)ペプチド研究所)、Lys-Thr-Glu-Glu-Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Sta-Val-Ala-Glu-Phe((株)ペプチド研究所)、Z-Leu-Leu-Nle-CHO(Wako公司)等。
细胞的增殖活性受到抑制时，则判断为分泌酶活性受到抑制。即，细胞的增殖活性越受到抑制，分泌酶抑制剂的作用、感受性越强。细胞使用具有野生型Synoviolin基因的小鼠、以及敲除了Synoviolin基因的Synoviolin缺失小鼠的胚胎成纤维细胞(MEF)，通过Synoviolin表达的有无来比较分泌酶抑制剂的感受性的变化。
使用上述Synoviolin缺失细胞研究抑制剂的效果，结果缺失Synoviolin的细胞与具有Synoviolin的野生型细胞相比，可见细胞增殖降低。即意味着如果缺失Synoviolin，则分泌酶抑制剂的感受性得到促进。
(3)药物组合物本发明中制备的shRNA、siRNA是抑制Synoviolin表达的物质，可用作含有促进分泌酶抑制剂感受性的物质的药物组合物(特别是阿尔茨海默病等脑神经系统疾病的基因治疗药)。
使用本发明的药物组合物作为脑神经系统疾病的基因治疗药物时，以脑(大脑、间脑、中脑、小脑)、延髓、脊髓等中枢神经系统为对象进行使用。
上述脑神经系统疾病可以是单独一种，也可以并发。
使用本发明的药物组合物作为基因治疗剂时，除了将本发明的药物组合物通过注射直接给药的方法之外，还可以是给予掺入了核酸的载体的方法。上述载体有腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体等，通过使用这些病毒载体，可以有效地给药。
另外，还可以将本发明的药物组合物导入脂质体等磷脂小胞体，给予该小胞体。通过脂转染法将保有siRNA或shRNA的小胞体导入给定的细胞中。将所得细胞全身给予如静脉内、动脉内等。也可以是脑等局部给药。
本发明的药物组合物的给药量根据年龄、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型而不同，例如腺病毒时，给药量每天一次，为106-1013个左右，间隔1周-8周给药。
为了将siRNA或shRNA导入目标组织或器官，也可以使用市售的基因导入试剂盒(例如アデノエクスプレスクロ-ンテツク公司)。
3.Synoviolin与Herp的结合如上所述，已知Herp是其表达受内质网应激诱导，结构上在N末端一侧具有UBL的贯穿内质网膜的蛋白质，细胞内源性的Herp被多遍在蛋白化。本发明人着眼于该Herp，考虑构建以下方法通过降解该Herp来抑制γ-分泌酶活性、抑制Aβ的膜内切断，从而抑制Aβ的蓄积以及老年斑的形成。
另一方面，如上所述，通过以Synoviolin为诱饵的酵母双杂交法进行与Synoviolin结合的因子的探究，结果显示Synoviolin与Herp具有相互作用，该相互作用在细胞内也可观察到。因此，本发明人研究了通过使Synoviolin与Herp结合来抑制分泌酶活性的方法。
(1)Synoviolin与Herp的最小结合部位的确定使用Herp的各种切断片段，通过进行该片段与Synoviolin的结合实验，可以确定Synoviolin与Herp的最小结合部位。使用Herp进行与Synoviolin的结合实验时，Herp与Synoviolin的最小结合部位为由人Herp基因(SEQ ID NO.17)编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.18)中的第161-200号的40个氨基酸残基的区域(下述序列)。
GYTPYGWLQLSWFQQIYARQYYMQYLAATAASGAFVPPPS(SEQ ID NO.19)其中，本发明中所使用的Synoviolin可以具有由上述SEQ ID NO.1编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)，另外，也可以是该氨基酸序列中有1个或数个氨基酸缺失、置换或附加而成的氨基酸序列并具有通过遍在蛋白化使Herp分解的活性。本发明中，上述缺失、置换等变异的导入可通过公知的定点诱变法进行，例如可使用GeneTailorTMSite-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司制造)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等(Takara公司制造)。
鉴定培养细胞中与Synoviolin结合所必需的Herp蛋白质区域时，可如下进行。
关于人Herp，制备缺失上述40个氨基酸残基区的Herp(-bind)基因，将该基因插入到适当的载体中，导入HEK293T等细胞中，使之与Synoviolin强表达，则可知缺失部位是否是Synoviolin与Herp结合的必须部位。为了进行免疫沉淀试验，在该Herp(-bind)的N末端带有HA标签(HA tag)，进行标记，同样Synoviolin的标记也可以带FLAG标签。
对结果进行分析可以在强表达后，提取全细胞提取物(WCE)，确认蛋白质的表达，在此基础上用抗HA抗体或抗FLAG抗体进行免疫沉淀。通过蛋白质印迹法对所得免疫沉淀产物进行试验，可知Herp与Synoviolin结合，但Herp(-bind)不与Synoviolin结合，因此Herp蛋白质上的第161号至第200号氨基酸区域(SEQ ID NO.19)是与Synoviolin结合所必须的。
(2)对通过Herp遍在蛋白化进行的降解的确认Herp通过与Synoviolin结合而遍在蛋白化，降解。因此，Herp是否为Synoviolin的底物，可通过Herp的多遍在蛋白化来确认。即，HEK293T细胞中，带有FLAG标签，再制备使氨基酸残基的一部分发生变异的Herp变异体，使HA-遍在蛋白和Synoviolin表达。然后，提取细胞提取物(WCE)，通过蛋白质印迹法确认各蛋白质的表达，然后通过进行抗HA抗体的免疫沉淀，确认Herp在细胞内是否被多遍在蛋白(poly-Ubiquitin；Ub)化。
Herp野生型中，只使遍在蛋白强表达时、或者使遍在蛋白和Synoviolin同时强表达时，可观察到多遍在蛋白化的条带。另外，使遍在蛋白和Synoviolin同时强表达时，与只使遍在蛋白强表达时相比，Herp和Herp变异体的Ub化条带弱，由此可知Ub化的Herp的降解亢进。另一方面，Herp(-bind)中，只使遍在蛋白强表达的场合，以及使遍在蛋白与Synoviolin同时强表达的场合，均未检测出多遍在蛋白化的条带。另外，为由Herp缺失遍在蛋白区(UBL)而得到的Herp(-UBL)时，使遍在蛋白和Synoviolin同时强表达的情况与只使遍在蛋白强表达的情况相比，Herp(-UBL)的Ub化条带强。由以上可知Herp的UBL区对于与Synoviolin的结合或通过Synoviolin进行的Ub化不是必须的，但对于降解是必须的。
(3)MEF中的γ-分泌酶活性的比较阿尔茨海默病中Synoviolin的参与性，可通过使用敲除了Synoviolin的细胞(例如MEF(syno(-/-))，与野生型细胞(例如MEF(syno(+/+))中的γ-分泌酶活性进行比较而研究。即，将MEF细胞用溶解缓冲液处理，制成细胞溶解液，然后加入反应缓冲液和荧光标记的底物，进行酶促反应，用给定的激发波长、测定波长测定荧光，则可以确认MEF中γ-分泌酶活性有无增加。
本发明中，使Synoviolin与Herp结合，则Herp被降解，可以抑制γ-分泌酶的活性。另外，已知Herp与被视为FAD的病因基因的早老蛋白(presenilinPS)具有相互作用，通过形成复合物，可提高γ-分泌酶的活性。因此证实了，如果使用Synoviolin与Herp的结合体、以及Synoviolin与Herp-PS复合物的结合体，则与阿尔茨海默病的治疗相关。
(4)药物组合物本发明中，使Synoviolin与Herp或Herp-PS复合物结合，通过遍在蛋白化引起Herp的降解，继而抑制成为阿尔茨海默病病因的Aβ蛋白质的蓄积，因此，Synoviolin是与分泌酶活性的抑制相关的物质，可以作为用于治疗阿尔茨海默病等脑神经系统疾病的药物组合物使用。
使用本发明的药物组合物作为脑神经系统疾病的治疗药物时，以脑(大脑、间脑、中脑、小脑)、延髓、脊髓等中枢神经系统为对象进行使用。本发明的药物组合物可以直接用于患处，也可以通过所有的公知方法、例如静脉、肌肉、腹腔内或皮下等的注射，或者由鼻腔、口腔或肺的吸入，口服，使用导管等的血管内给药等导入成为对象的细胞或脏器。
另外，例如通过冷冻等方法，使其容易处理后，可直接或与赋型剂、增量剂、粘合剂、润滑剂等公知的药学上可接受的载体，公知的添加剂(包含缓冲剂、等渗剂、螯合剂、着色剂、防腐剂、香料、风味剂、甜味剂等)等混合。
本发明的药物组合物可根据片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、液体制剂、糖浆剂等口服给药制剂，注射剂、外用剂、栓剂、滴眼剂等非口服给药制剂等的形式，口服给药或非口服给药。优选肌肉、腹腔等的局部注射、静脉注射等。
给药量可根据有效成分的种类、给药途径、给药对象、患者的年龄、体重、性别、症状及其它条件适当选择，作为每天的维持量，成人每1kg约为0.1mg-约100mg，优选0.1mg-10mg，更优选0.1mg-1.0mg。Synoviolin可以每天给药一次，也可以分多次给药。
使本发明的药物组合物(Synoviolin)在生物体内进行基因表达并使用时(基因治疗时)，与对上述基因治疗药物阐述的同样，除通过注射直接给予Synoviolin基因的方法之外，还有给予掺入了Synoviolin基因的载体的方法。作为上述载体，有腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体等，通过使用这些病毒载体，可以有效地给药。
其中，本发明中使用的Synoviolin基因不仅限定为具有上述SEQID NO.1所示的碱基序列的基因，也包含在严谨条件下与该碱基序列的互补序列杂交且编码具有与Herp的结合活性的蛋白质的基因。“严谨条件”是指杂交过程中，漂洗时的盐浓度为100-500mM，优选150-300mM，温度为50℃-70℃，优选55-65℃的条件。
另外，也可以将Synoviolin基因导入脂质体等磷脂小胞体中，给予该小胞体。通过脂转染法将保有上述基因的小胞体导入给定的细胞中。另外，将所得细胞全身给予如静脉内、动脉内等。也可以是脑等的局部给予。
Synoviolin基因的给药量根据年龄、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型而不同，例如腺病毒的场合，给药量每天一次，为106-1013个左右，间隔1周-8周给药。
为了将Synoviolin基因导入目标组织或器官，也可以使用市售的基因导入试剂盒(例如アデノエクスプレスクロ一ンテツク公司)。
以下，通过实施例具体说明本发明。但是本发明并不受这些实施例限定。
本实施例是通过酵母双杂交系统进行的Herp筛选的实施例。
酵母双杂交系统使用MATCHMAKER系统(CLONTECH)，通过酵母形质转化法(Pro.Natl.Aca.Sci.USA，889578-9582，1991)进行。
将从Synoviolin cDNA的706bp(第236号氨基酸)至1851bp(第617号氨基酸)、或从805bp(第269号氨基酸)至1260bp(第420号氨基酸)的末端作为EcoR I/Xho I，插入到pGBT9载体的EcoR I/XhoI位点(以下，将Synoviolin的706bp(第236号氨基酸)至1851bp(第617号氨基酸)称为Syno dTM，将从805bp(第269号氨基酸)至1260bp(第420号氨基酸)称为Syno Ring。参照图1)。图1中，“bp”表示碱基序列的位置编号。
Herp的筛选所使用的文库采用将来自人软骨的cDNA插入pACT2载体而得到的文库(pACT2-Y)。在42℃进行15分钟的热休克之后，向酵母株Y190中导入pGBT9-Syno dTM或pGBT9-Syno Ring(2.0μg)、pACT2-Y(20μg)。
将导入了各载体的Y190用Tris-EDTA(pH 7.5)缓冲液(TE)漂洗，然后在SD-Trp-Leu-His板上铺展用TE稀释的Y190溶液，在30℃培养10天。对产生的集落进行以0.5mg/ml X-gal为底物的β-半乳糖苷酶滤膜测定，检测出阳性克隆。
将阳性克隆在SD-Leu-His培养基中、在30℃振荡培养10天，通过碱-SDS法(Methods Enzymol.，194169-182，1991)提取质粒DNA。将提取的质粒DNA形质转化至大肠杆菌菌株HB101，铺于M9板(-Leu)，在37℃培养2天。将产生的集落在20μg/ml LB培养基中、在37℃振荡培养16小时，通过碱-SDS法提取质粒DNA。
使用BigDye Terminater Cycle Sequencing system(AppliedBiosystems)对插入到提取的质粒DNA中的来自人软骨的cDNA片段进行分析。通过BLAST检索测序的分析结果，结果得到了高半胱氨酸诱导性的内质网蛋白质——高半胱氨酸诱导的内质网应激诱导的遍在蛋白样结构域成员1(homocysteine-indusible endoplasmic reticulumstress-indusible ubiquitin-like domain member 1)(ACCESSIONNO.BC032673，以下简称为Herp)。
本实施例是体外使Synoviolin与Herp结合的实施例。
制备插入了TNT-coupled Translation System(Promega)和Synoviolin的706bp至1854bp的pcDNA3-Flag-Syno dTM。使用它进行体外翻译，制备(i)Flag-Syno dTM融合蛋白、(ii)Herp的GST融合蛋白、(iii)片段化的Herp的GST融合蛋白(图2)。图2中，“a.a.”表示氨基酸序列的位置编号，UBQ表示遍在蛋白结构域。
将这些融合蛋白和(iv)作为对照的GST蛋白质加入到含有20mMHepes(pH 7.9)、100mM氯化钠、1mM EDTA、0.05％吐温、5％甘油、1mM DTT、0.2mM NaVO4、5mM NaF、1mM PMSF的结合缓冲液中，在4℃反应16小时。对该反应物进行SDS-PAGE，通过图像分析仪(BAS2000，Fujiix)检测放射活性。
结果，观察到Herp-M和Herp-C的GST融合蛋白与[35S]pcDNA3-Flag-Syno dTM的结合。
未见作为对照的GST与pcDNA3-Flag-Syno dTM的结合(图3)。由该结果可推测Synoviolin与Herp通过蛋白质的相互作用结合。
本实施例是体内使Synoviolin与Herp结合的实施例。
将2×106个HEK293细胞接种于10cm培养皿中，培养24小时，然后将插入了Synoviolin的由1bp至1854bp的pcDNA3-HA/Syno、和插入了Herp的由1bp至1176bp的pcDNA3-Flag/Herp各3μg进行基因导入。基因导入24小时后回收细胞，溶解于Lysis缓冲液，然后通过抗HA和抗Flag抗体在4℃下进行过夜的免疫沉淀。通过离心操作将结合蛋白质和游离蛋白质分开，通过蛋白质印迹法进行检测。检测使用抗HA和抗Flag抗体。
结果，在Synoviolin和Herp共表达的细胞中，使用抗HA抗体进行免疫沉淀后，用抗Flag抗体进行检测，则可确认Flag-Herp的条带。另外，使用抗Flag抗体进行免疫沉淀后，用抗HA抗体检测，则可确认HA-Synoviolin的条带。由该结果可推测与体外条件下同样地，Synoviolin与Herp通过蛋白质的相互作用结合(图4)。另外，图4中，IP表示免疫沉淀中所使用的抗体的种类，WB表示蛋白质印迹中使用的抗体的种类。*号表示IgG HC(IgG重链)。
本实施例是确认Synoviolin缺失细胞中γ-分泌酶抑制剂对细胞增殖活性的影响的实施例。
将由导入了Synoviolin基因的小鼠(野生型小鼠)和Synoviolin基因缺失小鼠得到的胚胎成纤维细胞(MEF)接种于96孔板，使之为1×103个细胞/孔，培养过夜。对培养后的细胞进行γ-分泌酶抑制剂(Z-Leu-Leu-Nle-CHO、Wako)处理，培养24小时后加入AlamerBlue，2小时后测定吸光度。
结果如图5所示。图5中，实心柱表示来自野生型小鼠的细胞，空心柱表示来自Synoviolin缺失小鼠的细胞。来自Synoviolin缺失小鼠的细胞中，γ-分泌酶抑制剂的作用比来自野生型小鼠的细胞显著。另外，Tuni.表示衣霉素。
由图5可知Synoviolin缺失小鼠胚胎成纤维细胞(Syno-/-)中，与Synoviolin小鼠胚胎成纤维细胞(Syno+/+)比较，抑制γ-分泌酶活性的情况下，细胞的增殖活性也受到抑制。这意味着细胞对γ-分泌酶抑制剂的感受性根据Synoviolin的有无而变化，即如果Synoviolin缺失，则γ-分泌酶抑制剂的感受性得到促进。因此，Synoviolin的抑制剂调节被视为阿尔茨海默病病理过程的第一阶段的Aβ蓄积，由此可作为阿尔茨海默病的药疗药物加以利用。
本实施例是确定Herp与Synoviolin的最小结合部位的实施例。
即，通过以Synoviolin为诱饵的酵母双杂交筛选，对由人软骨cDNA文库得到的Synoviolin的底物候选分子Herp确定其与Synoviolin的最小结合部位。即，以掺入到pcDNA3 Flag或HA载体中的Herp为模板，通过PCR，进行片段化插入片段的制备。为了进行GST Pull Downassay，将Synoviolin和Herp片段化，插入到pGEX和pcDNA3载体中。
结果可以推测Herp的氨基酸序列编号中的第161-200号与synodTM结合(图6)。
本实施例是鉴定与培养细胞中的Synoviolin结合所必须的Herp蛋白质区域的实施例。
由实施例5的结果可知Synoviolin与Herp的结合所必须的Herp一侧的氨基酸是第161-200号共40个氨基酸(图6)。因此，制备除去Herp的第161-200号共40个氨基酸的Herp(-bind)，进行细胞内与Synoviolin的结合实验。
明确了Herp与Synoviolin进行结合，同时进行Herp蛋白质上与Synoviolin结合的区域(氨基酸序列的第161-200号之间)的鉴定。本实施例中，对于缺失该区域时Herp与Synoviolin的结合会受到怎样的影响，进行以下的实验。
Herp基因上，通过PCR法使编码第161号至第200号氨基酸的部分缺失，制备Herp(-bind)基因(图7上)。然后，使该基因的N端带上HA标签，插入到pcDNA3载体中。接着，在HEK293T细胞中，分别使带HA标签的Herp、Herp(-bind)、空载体与带FLAG标签的Synoviolin一起强表达。24小时后，提取全细胞提取物(WCE)，确认各蛋白质的表达，在此基础上用抗HA抗体或抗FLAG抗体进行免疫沉淀。
用含有150mM氯化钠的漂洗缓冲液漂洗免疫沉淀产物，用该产物进行蛋白质印迹法，结果可知，Herp与Synoviolin结合，但Herp(-bind)不与Synoviolin结合(图7下)。由此表明Herp蛋白质上的第161号至第200号氨基酸区域是与Synoviolin结合的必须区域。
本实施例是研究Herp为Synoviolin的底物的实施例。
实验方法如下所示。
通过酵母双杂交、GST-pull down实验，明确了Herp在细胞内与Synoviolin结合。有报告称Herp是N端具有UBL的贯穿内质网膜的蛋白质，在细胞中表达的Herp被多遍在蛋白化(Kokame K，Kato H，Miyata T.Homocysteine respondent Genes in Vascular EndothelialCells Identified by Differential Display Analysis.J.Biol.Chem.1996Nov 22；271(47)29659-29665)。另外，与Synoviolin(+/+)MEF细胞中的相比，可观察到Synoviolin(-/-)MEF细胞中Herp蛋白蓄积(图8A)。因此认为Herp为Synoviolin的底物的可能性很大。
另外，在上述实验中，使用含有Herp的氨基酸序列中第37-50号的区域LKAHLSRVYPERPR(SEQ ID NO.20)的氨基酸序列作为抗Herp(N)抗体的识别部位。
但是，体外的遍在蛋白反应系统中，在Synoviolin非存在下，对Herp的GST融合蛋白GST-Herp也观察到遍在蛋白化的条带。
因此，本实施例中，对于Herp为Synoviolin的底物，自身是否遍在蛋白化进行研究。
HEK293T细胞中，使用带有FLAG标签的各种Herp变异构成(图8C)，分别与HA-遍在蛋白/pcDNA3或Synoviolin/pcDNA3一起强表达。
强表达24小时后，由细胞提取全细胞提取物(WCE)，通过蛋白质印迹法确认各蛋白质的表达，并用抗HA抗体进行免疫沉淀，通过抗FLAG抗体研究是否有Herp蛋白的多遍在蛋白化。
Herp野生型中，只使遍在蛋白强表达时、或者使遍在蛋白和Synoviolin同时强表达时，可观察到多遍在蛋白化的条带。另外，使遍在蛋白和Synoviolin同时强表达时，与只使遍在蛋白强表达时相比，Herp的Ub化条带变弱，由此可知Ub化的Herp的分解亢进。与此相对，Herp(-bind)中，只使遍在蛋白强表达时、或者遍在蛋白与Synoviolin同时强表达时，均未检测出多遍在蛋白化的条带。另外，Herp(-UBL)的场合，遍在蛋白和Synoviolin同时强表达的情况与只有遍在蛋白强表达的情况相比，herp(-UBL)的Ub化条带强(图8B)。由此可认为Herp的UBL区对于与Synoviolin结合或通过Synoviolin进行Ub化不是必须的，但对于分解是必须的。
本实施例是为了研究Synoviolin在阿尔茨海默病中的关系，而对MEF(syno(+/+)和(-/-))中的γ-分泌酶活性进行比较。
将MEF(syno(+/+)和(-/-))用溶解缓冲液处理，制成细胞溶解液，然后加入反应缓冲液、荧光标识的底物——合成APP，在37℃进行2小时酶促反应。通过用360nm的激发波长、465nm的测定波长测定荧光来进行测定。
结果，与syno(+/+)相比，syno(-/-)的MEF中可见γ-分泌酶活性的增加(图9)。
工业实用性本发明提供抑制分泌酶活性的方法。另外，本发明提供含有抑制分泌酶活性的物质的药物组合物。本发明的药物组合物作为阿尔茨海默病等脑神经系统疾病的治疗药物是有用的。
序列表<110>Locomogene，Inc.
<120>抑制分泌酶活性的方法<130>P03-112PCT<150>JP2003-359704<151>2003-10-20<160>20<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3374<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(403)..(2256)<223>
<400>1gccctttctt atgagcatgc ctgtgttggg ttgacagtga gggtaataat gacttgttgg60ttgattgtag atatagggct ctcccttgca aggtaattag gctccttaaa ttacctgtaa120gattttcttg ccacagcatc cattctggtt aggctggtga tcttctgagt agtgatagat180tggttggtgg tgaggtttac aggtgttccc ttctcttact cctggtgttg gctacaatca240ggtggcgtct agagcagcat gggacaggtg ggtaagggga gtcttctcat tatgcagaag300tgatcaactt aaatctctgt cagatctacc tttatgtagc ccggcagtcg cgcggattga360
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1 5 10
权利要求
1.药物组合物，含有抑制分泌酶活性的物质。
2.权利要求1的药物组合物，其中分泌酶是β-分泌酶或γ-分泌酶。
3.权利要求1或2的药物组合物，其中抑制分泌酶活性的物质是促进分泌酶抑制剂感受性的物质。
4.权利要求3的药物组合物，其中促进分泌酶抑制剂感受性的物质是抑制Synoviolin表达的物质。
5.权利要求4的药物组合物，其中抑制Synoviolin表达的物质是针对编码Synoviolin的基因的siRNA或shRNA。
6.权利要求5的药物组合物，其中编码Synoviolin的基因含有SEQID NO.1所示的碱基序列。
7.权利要求5的药物组合物，其中siRNA以SEQ ID NO.1所示的碱基序列中的部分序列为靶。
8.权利要求7的药物组合物，其中部分序列为选自SEQ ID NO.3-16所示的碱基序列中的至少一种序列。
9.权利要求1或2的药物组合物，其中抑制分泌酶活性的物质是Synoviolin。
10.权利要求1-9中任一项的药物组合物，其用于治疗脑神经系统疾病。
11.权利要求10的药物组合物，其中脑神经系统疾病是阿尔茨海默病。
12.抑制分泌酶活性的方法，其特征在于促进分泌酶抑制剂的感受性。
13.权利要求12的方法，其中分泌酶抑制剂感受性的促进通过抑制Synoviolin的表达来实现。
14.抑制分泌酶活性的方法，其特征在于使Synoviolin与Herp结合。
15.权利要求14的方法，其中Herp与Synoviolin的结合区域是Herp的氨基酸序列第161-200号的氨基酸残基所示的区域。
16.权利要求12-15中任一项的方法，其中分泌酶是β-分泌酶或γ-分泌酶。
全文摘要
本发明提供抑制分泌酶活性的方法。为了抑制分泌酶活性，采用促进分泌酶抑制剂的感受性的方法、或使Synoviolin与Herp(高半胱氨酸诱导的内质网应激诱导的遍在蛋白样结构域成员1，homocysteine－indusible endoplasmic reticulum stress－indusible ubiquitin－like domain member 1)结合的方法等。
文档编号A61K48/00GK1871030SQ20048003087
公开日2006年11月29日 申请日期2004年10月20日 优先权日2003年10月20日
发明者中岛利博, 天野彻也, 山崎聪士, 八木下尚子, 池田理惠, 张蕾 申请人:株式会社洛科摩基因