专利名称：一种抗乙型肝炎病毒药物的新靶标及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗乙型肝炎病毒药物研究新的作用靶点及其用途。具体说是抑制纤连蛋白(fibronectin)的表达可以抑制乙肝病毒的复制及其基因和蛋白的表达。利用其所述的基因和蛋白作为抗乙型肝炎病毒药物新靶点的药学用途。
背景资料 乙型肝炎病毒(HBV)严重威胁人类的健康和生存状态。流行病学统计显示，全世界约有3.5亿慢性乙型肝炎病毒感染者，中国有1.5亿HBV携带者。HBV感染慢性化后会导致肝炎、肝硬化、甚至肝癌。目前还没有理想的抗乙肝药物，现在主要的抗乙肝药物为干扰素、拉米夫定、阿地福韦。在应用干扰素的患者中30％无效，尤其在我国更为明显。拉米夫定疗效较好，但持续使用会产生耐药性。阿地福韦毒性剂量和有效剂量非常接近致阿地福韦的治疗剂量只能控制在10毫克等。近年来发展起来的乙肝疫苗对乙肝病毒的感染起到了一定的预防作用，但已感染者及携带者不能使用。因此，寻找高效抗乙肝药物成为当今医药界的迫切任务。目前为止，大部分抗乙肝药物的研究都是基于病毒这个作用靶点，从而受到了病毒基因组较小、易发生突变的限制。考虑到病毒必须依赖特定的宿主细胞成分方能有效复制，本发明从宿主中发现了新的抗乙肝病毒药靶基因及其蛋白，从而为新型抗病毒药物的筛选及HBV感染的治疗奠定基础。
发明内容
本发明人通过半定量RT-PCR技术以及Western印迹技术，发现纤连蛋白在转染有HBV基因，能够表达HBV所有抗原以及分泌完整Dane氏颗粒的HepG2.2.15细胞中高表达，在HepG2细胞中不表达；用抗HBV药物——拉米夫定、阿地福韦处理HepG2.2.15细胞后纤连蛋白表达发生明显下调。因此，本发明人筛选了靶向纤连蛋白的反义寡核苷酸，应用靶向纤连蛋白的反义寡核苷酸检测纤连蛋白表达受到抑制后对HepG2.2.15细胞中HBV复制及其基因和蛋白的表达的影响，结果显示靶向纤连蛋白的反义寡核苷酸可有效抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制及其基因和蛋白的表达，且这种抑制作用可被外源加入的纤连蛋白所拮抗。本发明人还应用纤连蛋白抗体阻断纤连蛋白的结合位点，发现HBV的复制及其基因和蛋白的表达受到非常显著的抑制。上述实验表明，纤连蛋白可以作为抗乙型肝炎病毒药物的新型作用靶点。
根据本发明，抑制纤连蛋白的表达可特异性抑制HBV的复制及其基因和蛋白的表达，纤连蛋白有可能成为治疗及预防HBV相关疾病的新型药物作用靶点，用于抗HBV药物筛选并指导临床HBV感染的治疗。
根据本发明，针对纤连蛋白mRNA的反义寡核苷酸(ASODNs)、其它核酸类药物如RNAi、多肽类药物等，能特异性抑制乙肝病毒的复制及基因和蛋白的表达，有可能成为治疗及预防HBV相关疾病的新型生物工程药物。
根据本发明，针对纤连蛋白的抗体能特异性抑制乙肝病毒的复制及基因和蛋白的表达，有可能成为治疗及预防HBV相关疾病的新型生物工程药物。
根据本发明，针对纤连蛋白的小分子化合物能特异性抑制乙肝病毒的复制及基因和蛋白的表达，有可能成为治疗及预防HBV相关疾病的新型药物。
根据本发明，本发明的药物治疗组成可应用单独的有效成分或组合物形式包括联合其他药物形式。
根据本发明，本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等，以适宜的剂量给药。
本发明的实施对严重危害人类健康的乙型肝炎及其相关疾病的治疗具有重要的社会效益和经济效益。
附图的简要说明为了使本发明的上面和其他目的和特征将变得明了，结合附图进一步说明如下
图1显示了纤连蛋白mRNA在HepG2细胞、HepG2.2.15细胞以及HepG2.2.15细胞经药物处理前后的表达变化情况图2显示了纤连蛋白在HepG2细胞、HepG2.2.15细胞以及HepG2.2.15细胞经药物处理前后的表达变化情况图3显示了靶向纤连蛋白的5条硫代反义寡核苷酸序列及性质图4显示了硫代纤连蛋白反义寡核苷酸序列FN1——FN5对HepG2.2.15细胞中纤连蛋白的抑制作用，FN1——FN5的浓度均为0.8μM。
图5是显示靶向纤连蛋白的反义寡核苷酸FN1，FN5及其正义序列对HepG2.2.15细胞中HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制率。
图6(A)是显示靶向纤连蛋白的反义寡核苷酸FN5对HepG2.2.15细胞分泌HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制作用呈剂量依赖关系图6(B)是显示靶向纤连蛋白的反义寡核苷酸FN1对HepG2.2.15细胞分泌HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制作用呈剂量依赖性图7(A)是显示硫代纤连蛋白反义寡核苷酸序列FN1对HepG2.2.15细胞增殖的影响图7(B)是显示硫代纤连蛋白反义寡核苷酸序列FN5对HepG2.2.15细胞增殖的影响图8显示了1、5μg/ml纤连蛋白对0.8μmol/LFN5抑制HBV复制及其基因和蛋白的表达的拮抗作用图9(A)显示了不同浓度纤连蛋白抗体对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用图9(B)显示了不同浓度纤连蛋白抗体对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制作用图9(C)显示了1μg/ml纤连蛋白抗体对HepG2.2.15细胞分泌HBV DNA的抑制作用图10显示了不同浓度纤连蛋白抗体对HepG2.2.15细胞增殖的影响图11显示了原儿茶醛对HepG2.2.15细胞中fibronectin蛋白表达的抑制作用图12显示了不同浓度原儿茶醛对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg，HBeAg的抑制作用图13显示了不同浓度原儿茶醛对HepG2.2.15细胞增殖的影响具体实施方法在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。
纤连蛋白表达的特异性检测材料与方法1.药物配制拉米夫定用PBS溶解至终浓度为10mmol/L；阿地福韦药物用DMSO溶解至终浓度为100mmol/L，加药时用培养液稀释至1mmol/L，以保证DMSO在培养液中的浓度不高于0.1％。
2.细胞培养所用细胞为肝癌细胞系HepG2细胞株以及转染有HBV DNA的HepG2.2.15细胞株。HepG2.2.15细胞来源于HepG2细胞，含有整合的HBV DNA，在细胞培养过程中可持续稳定地向培养液中分泌Dane氏颗粒以及HBsAg，HBV DNA等。HepG2细胞用含有10％胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM细胞培养液培养，HepG2.2.15细胞用含有10％胎牛血清，380μg/mlG418(Promega)的MEM细胞培养液培养。
3.细胞加药待HepG2.2.15细胞长满后1∶3传代，48小时后换用含2％FBS的MEM培养液，同时加入拉米夫定，阿地福韦。拉米夫定终浓度为25μmol/Lol/L，阿地福韦终浓度为1μmol/Lol/L，同时设立相应的对照组细胞。加药后4天换含有等浓度药物的细胞培养液，第8天收集细胞。
4.RT-PCR检测纤连蛋白mRNA的表达情况待HepG2细胞、HepG2.2.15细胞长满或HepG2.2.15细胞加药后第8天，吸去培养液，用PBS清洗两遍后，按照Trizol试剂盒(Invitrogen)说明书提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量，OD260/280在1.8-2.0之间，RNA甲醛变性电泳显示无降解。然后进行逆转录，具体方法如下各取总RNA 1μg，OligodT(15)0.5μg，RNA酶抑制剂(40U)0.1μl，共10.3μl，混匀，70℃温育10min，立即冰上冷却。加入第一链反应缓冲液5μl，DTT 2.5μl，RNA酶抑制剂0.7μl，dNTP(A、G、C、T10mM)1.0μl，混匀，42℃反应2min，加入逆转录酶superscript II0.5μl，42℃温育1h，最后70℃变性15min。反转录产物取0.5μl作为PCR扩增的模板，以看家基因GAPDH作为内标进行双重PCR。靶基因纤连蛋白上游引物为5’TAGCCCTGTCCAGGAGTTCA3’，下游引物为5’CTGCAAGCCTTCAATAGTCA3’，扩增片断为307bp。GAPDH的上游引物为5’ACCACAGTCCATGCCATCAC3’，下游引物为5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA3’，扩增片断449bp。PCR反应体系总体积20μl，上下游引物终浓度为1μM，Mg2+浓度1.5mM，加入反转录产物0.5μl，Taq 1U。PCR循环参数为94℃预变性2min，94℃20s，61℃30s，72℃20s，循环22次，最后72℃延伸2min。2％琼脂糖凝胶(Sigma)电泳检测。
5.Western印迹方法检测纤连蛋白的表达情况待HepG2细胞、HepG2.2.15细胞长满或HepG2.2.15细胞加药后第8天，吸去培养液，用PBS清洗两遍后，RIPA-PICT(Pharmacia)法提取细胞总蛋白，蛋白定量后将各提取物调至相同浓度。每孔30-50μg总蛋白，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用半干转印法将蛋白转至硝酸纤维素膜(PROTRANBA-S 83 Reinforced NC，Schleicher & Schuell)上。4℃封闭过夜，封闭液组成10％脱脂奶粉，1×TBST。然后与鼠抗人纤连蛋白抗体(Santa cruz)或鼠抗人β-actin抗体(Sigma)结合1h，TBST洗膜3次，每次10min，再与辣根过氧化酶标记的抗鼠二抗(中山)结合1h，TBST洗膜3次，每次10min，ECL(Pharmacia)显色系统显色，X光片曝光。
结果1.纤连蛋白mRNA表达的特异性检测结果等量的HepG2细胞、HepG2.2.15细胞总RNA反转录PCR后，2％琼脂糖凝胶电泳检测表达情况，看家基因GAPDH作为内标。结果如图1中所示，在HepG2细胞中几乎检测不到纤连蛋白mRNA的表达，而在HepG2.2.15细胞中其表达水平与GAPDH表达水平接近。在25μmol/L拉米夫定处理后，HepG2.2.15细胞中纤连蛋白mRNA表达明显下调。但在1μmol/L阿地福韦处理后HepG2.2.15细胞中纤连蛋白mRNA表达只发生微弱下调。图1中control代表纤连蛋白mRNA在对照组细胞中的相对表达情况；lamivudine、adefovir代表纤连蛋白mRNA分别在2种药物处理组细胞中的相对表达情况；HepG2、HepG2.2.15代表纤连蛋白mRNA在HepG2、HepG2.2.15细胞中的相对表达情况。
2.纤连蛋白表达的特异性检测结果图2中显示，纤连蛋白在HepG2.2.15细胞中相对表达量较高，而在HepG2细胞中几乎检测不到纤连蛋白的表达。25μmol/L拉米夫定处理HepG2.2.15细胞后纤连蛋白明显下调，Iμmol/L阿地福韦处理后HepG2.2.15细胞中纤连蛋白表达微弱下调。
结论纤连蛋白在HBV感染后表达上调，而在药物干预后表达明显下调，因此可能成为治疗及预防HBV相关疾病的新型特异性药物治疗靶点。
靶向纤连蛋白的反义寡核苷酸可抑制HBV的复制及其基因和蛋白的表达材料与方法1.S-ASODN的设计和合成检索GeneBank中的核酸序列数据库，选择NCBI公布的纤连蛋白mRNA参考序列X02761，通过对其进行基于多预测RNA二级结构的计算机辅助设计，选择了5个不稳定的茎环结构作为ASODN的作用靶点。通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达(见图3)。所有寡核苷酸均采用ABI8909型自动DNA合成仪合成并在合成时进行硫代修饰。合成完毕浓氨水55℃切割并脱保护15小时后，经Micro Pure II反相纯化柱(Oligo Prep OP120，SAVANT)纯化，紫外定量后真空干燥，-20℃保存备用。
2.ASODN转染Hep2.2.15细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培养液中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将Hep2.2.15细胞接种6孔板，1.5×105细胞/孔，37℃，5％CO2孵育48-72小时，待长至40-60％细胞汇合后，在无血清状态下，采用脂质体Lipofectin(Invitrogen，1mg/ml)试剂并参照说明书操作进行转染。反义寡核苷酸的浓度分别为0.2μM、0.4μM、0.8μM并设细胞对照、脂质体对照。转染22小时后，换正常细胞培养液(含10％FBS的MEM细胞培养液)，37℃，5％CO2孵育72小时。提取Hep2.2.15细胞总RNA(Trizol RNA提取试剂盒，Invitrogen)以及Hep2.2.15细胞总蛋白，-20℃保存备用。收集细胞培养液，-20℃保存备用。
3.纤连蛋白表达水平检测RIPA-PICT(Pharmacia)提取细胞总蛋白，蛋白定量后将各提取物调至相同浓度。然后进行western印迹实验。实验方法参考实施例一。
4.HBV DNA检测取细胞培养液，100℃煮沸15min，12000r/min离心10min，取上清作为荧光定量PCR的模板，实验过程按本实验室建立的复合探针PCR定量检测HBV的方法操作(何云燕，王升启等，中华肝脏病杂志，2001，V9N6376-377)。定量检测HBV DNA的引物序列为P15’-GGA GTA TGG ATT CGC ACT CCT C-3’；P25’-TTG TTG TTG TAG GGG ACC TGCCT-3’；荧光探针序列F5’-ACT TCC GGA AAC TAC TGT TAG ACG A-3’；淬灭探针序列Q5’-GTA GTT TCC GGA AGT-3’。20μl反应体系含200nmol/L引物，670nmol/L荧光探针F，180nmol/L淬灭探针，200μmol/LdNTP，4.0mmol/L的Mg2+，2μl模板，混匀后将各反应管与标准曲线反应管一起放入iCycle自动PCR仪中进行扩增，扩增条件为94℃30s，55℃30s，72℃30s，共40个循环，反应结束后由电脑自动计算出定量结果。
5.HBsAg，HBeAg检测取收集好的细胞培养液，按照HBsAg，HBeAgELISA检测试剂盒(华美公司)说明书操作步骤检测。取50μl细胞培养液加入乙肝表面抗原或e抗原包被的96孔板中，每孔加入50μl表面抗原或e抗原对应的酶标结合物，37℃孵育1h后，用洗液洗板5次，加入显色液A50μl，再加入显色液B50μl，37℃孵育15min，加入终止液50μl，在多标记检酶联免疫检测仪(VICTORTMWallac 1420 Multilabel Counter，Wallac)上测定450nm处1s吸光值A。根据IR＝(A450对照-A450给药)/A450对照计算抑制率。
6.细胞毒性检测Hep2.2.15细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，接种96孔板，0.75×105细胞/孔，37℃，5％CO2孵育48-72小时，待长至40-60％细胞汇合后，在无血清状态下，采用脂质体Lipofectin(Invitrogen，1mg/ml)试剂并参照说明书操作进行转染。反义寡核苷酸FN1，FN5的浓度分别为0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、10μM并设细胞对照，每浓度重复三孔。转染22小时后，换正常细胞培养液(含10％FBS的MEM细胞培养液)，37℃，5％CO2孵育72小时后，参照MTS(Promega)使用说明书，每孔加入MTS20μl/100μl培养液，37℃避光孵育1.5小时，在多标记检酶联免疫检测仪490nm检测吸光度。同时，转染ASODN后每日在倒置显微镜下观察细胞形态。
结果1.ASODN对细胞纤连蛋白的抑制作用靶向纤连蛋白mRNA的五条反义序列FN1-FN5，分别以0.8μmol/L给药处理Hep2.2.15细胞，72h后提取总蛋白，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用半干转印法将蛋白转至硝酸纤维素膜上，以β-actin(43kD)为对照，通过Western Blot方法检测硫代反义寡核苷酸对纤连蛋白表达量的影响。由图4可见，FN1，FN5可显著抑制纤连蛋白的表达，FN2，FN4对纤连蛋白无明显抑制作用，FN3对纤连蛋白无抑制作用。
2.靶向纤连蛋白的ASODN对HBV复制及其基因和蛋白的表达的抑制作用结果1中获得的靶向纤连蛋白的ASODNs(FN1、FN5)，以及他们的正义序列FN1s(5’-GAG TGA GGA GGG AGA TGA GC-3’)、FN5s(5’-TG GAG AGA AGT GGG ACC GTC-3’)分别以0.8μmol/L给药处理Hep2.2.15细胞，同时设立细胞对照，脂质体对照以及阳性药拉米夫定对照组，72小时后收集细胞培养液，荧光定量PCR检测各组细胞中分泌的HBV DNA拷贝数，HBsAg、HBeAg ELISA检测试剂盒分别检测Hep2.2.15细胞培养液中HBeAg、HBsAg的表达情况，按照公式IR％＝(加药组检测数值-细胞对照组检测数值)/细胞对照组检测数值×100％计算抑制率。重复三次实验，计算抑制率的平均值以及标准差，结果见图表5。从图表中可看出，0.8μmol/L时，FN1，FN5的正义序列对HBV DNA，HBsAg，HBeAg没有明显的抑制作用，而FN1、FN5对HBV复制及其基因和蛋白的表达的抑制作用与25μmol/L拉米夫定对HBV复制及其基因和蛋白的表达的抑制作用类似。图6(A)、6(B)显示随着FN1、FN5浓度的增加，对HBV复制及其基因和蛋白的表达的抑制作用显著增加。
3.硫代反义寡核苷酸FN1，N5对细胞增值的影响硫代反义寡核苷酸FN1，FN5以0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L、1.6μmol/L、10μmol/L处理细胞过程中，每日在倒置显微镜下观察细胞形态，加药组细胞形态与对照组细胞形态没有显著变化。细胞增殖实验检测结果见图7(A)，图7(B)。图中显示，在0.2μM-10μM范围内，FN1、FN5各剂量组OD值与正常细胞对照基本相同，表明靶向纤连蛋白仅特异性作用于HBV而对宿主细胞无明显毒性。
结论1.靶向纤连蛋白mRNA分子可以特异性抑制纤连蛋白及HBV的复制及其基因和蛋白的表达，而不影响细胞增殖。
2.五条靶向纤连蛋白的硫代反义寡核苷酸序列中，FN1，FN5可以抑制纤连蛋白的表达。
3.FN1，FN5可特异且剂量依赖性地抑制HBV的复制及其基因和蛋白的表达，在0.8μmol/L时对HBV复制及其基因和蛋白的表达的抑制作用与25μmol/L拉米夫定类似。
外源纤连蛋白可拮抗靶向纤连蛋白的ASODN对HBV复制及其基因和蛋白的表达的抑制作用材料和方法1.纤连蛋白纤连蛋白购自sigma公司，用无菌水溶解为1mg/ml，-20℃储存备用。
2.细胞转染和检测取靶向纤连蛋白的硫代反义寡核苷酸FN5以0.8μM转染HepG2.2.15细胞，转染方法同实施例2。转染后6小时，换正常细胞培养液，同时加入纤连蛋白，至终浓度为1μg/ml和5μg/ml。72小时后收集细胞培养液，检测细胞中HBVDNA，HBsAg，HBeAg的表达情况。检测方法同实施例2。
结果检测结果见图表8。从表中可看出纤连蛋白可拮抗FN5抗HBV复制及其基因和蛋白的表达的作用。
纤连蛋白抗体对HBV复制及其基因和蛋白表达的抑制作用材料与方法1.纤连蛋白抗体处理HepG2.2.15细胞纤连蛋白抗体来源于santa cruz公司，为鼠源单克隆抗体。将Hep2.2.15细胞接种96孔板，1.5×104细胞/孔，37℃，5％CO2孵育48小时，加入纤连蛋白抗体至终浓度分别为0.25、0.5、1、2、4μg/ml。
2.HBV DNA，HBsAg，HBeAg表达检测
Hep2.2.15细胞中加入纤连蛋白抗体72小时后，ELISA方法检测HBsAg，HBeAg表达情况，具体方法同实施例2。半定量PCR检测HBV DNA分泌情况，模板处理方法同实施例2。上游引物为5’-CATCCTGCTGCTATGCCTCATCT-3’，下游引物为5’-CGAACCACTGAACAAATGGCACT-3’，PCR循环参数为94℃预变性3min后，94℃30s，55℃30s，72℃30s，循环30次，然后再72℃延伸5min。2％琼脂糖凝胶(Sigma)电泳检测。
3.纤连蛋白抗体的细胞毒性检测Hep2.2.15细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，接种96孔板，0.75×105细胞/孔，37℃，5％CO2孵育48-72小时，加入纤连蛋白抗体，抗体浓度分别为0.25、0.5、1、2、10、50μg/ml并设细胞对照，每浓度重复三孔。37℃，5％CO2孵育72小时后，参照MTS(Promega)使用说明书，每孔加入MTS20μl/100μl培养液，37℃避光孵育1.5小时，在多标记检酶联免疫检测仪490nm检测吸光度。同时，加入纤连蛋白抗体后每日在倒置显微镜下观察细胞形态。
结果1.纤连蛋白抗体对Hep2.2.15细胞中HBV复制及其基因和蛋白的表达的影响图9(A)、9(B)所示，在0.25～4μg/ml范围内，纤连蛋白抗体对s，e抗原的抑制作用具有显著的剂量依赖关系。纤连蛋白抗体浓度在1μg/ml时对s，e抗原的平均抑制率可达77.45％，72.91％。图9(C)显示，细胞对照组具有明显的HBV DNA片断电泳条带，1μg/ml纤连蛋白抗体处理细胞组，HBV DNA片断的条带很弱，定量分析结果显示，纤连蛋白抗体对HBV DNA分泌的平均抑制率为78.89％。
2.纤连蛋白抗体对HepG2.2.15细胞增值的影响纤连蛋白抗体以0.25、0.5、1、2、10、50μg/ml处理细胞过程中，每日在倒置显微镜下观察细胞形态，加药组细胞形态与对照组细胞形态没有显著变化。细胞增殖实验检测结果见图10。图中显示，在0.25μg/ml-50μg/ml范围内，纤连蛋白抗体各剂量组OD值与正常细胞对照基本相同。
结论1.纤连蛋白抗体可显著抑制Hep2.2.15细胞中HBV的复制及其基因和蛋白的表达而不影响Hep2.2.15细胞增殖。
靶向纤连蛋白的小分子化合物对HBV复制及其基因和蛋白的表达的抑制作用本实验室其它课题组研究发现在人脐静脉内皮细胞中，原儿茶醛等可下调TNF-α刺激引起的纤连蛋白表达上调，而不正常人脐静脉内皮细胞中纤连蛋白的表达。因此，我们检测了原儿茶醛对HepG2.2.15细胞中纤连蛋白表达的影响，以及他们对HBV复制及其基因和蛋白表达的影响。
材料和方法1.药物原儿茶醛购自中国生物制品鉴定所，用无菌水溶解至1mg/mL(7.25mM)，-20℃保存。
2.细胞培养和加药HepG2.2.15细胞培养方法同实施例1。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，接种96孔板或6孔板，96孔板细胞数为7.5×103细胞/孔，6孔板细胞数为1.5×105细胞/孔，37℃，5％CO2孵育48-72小时，加入原儿茶醛，终浓度分别为17.4、43.4、86.8μM，同时设立拉米夫定阳性对照细胞和不加药阴性对照细胞。
3.HBV DNA，HBsAg，HBeAg以及纤连蛋白水平检测Hep2.2.15细胞中加入86.8μM原儿茶醛4天后，提取总蛋白，Western印迹技术检测纤连蛋白的表达水平，方法同实施例1。收集细胞培养液，半定量PCR检测HBV DNA，方法同实施例4，ELISA检测HBsAg，HBeAg的水平，方法同实施例2。
4.原儿茶醛的细胞毒性检测在原儿茶醛加药期间，每天在倒置显微镜下观察细胞形态。在给药后第四天，MTS方法检测原儿茶醛对细胞增殖的影响，具体方法同实施例2。
结果1.原儿茶醛对纤连蛋白表达的影响Hep2.2.15细胞接种6孔板，加入原儿茶醛至终浓度86.8μM，4天后，提取总蛋白，Western印迹技术检测纤连蛋白的表达水平，结果见图11。从图中可以看出，原儿茶醛可显著抑制Hep2.2.15细胞中纤连蛋白的表达。
2.原儿茶醛对Hep2.2.15细胞中HBV复制及其基因和蛋白的表达的影响图12显示原儿茶醛可显著抑制Hep2.2.15细胞中HBV复制及其基因和蛋白的表达，尤其是在162.5μg/mL时，对Hep2.2.15细胞中HBsAg的平均抑制率达76.55％。
3.原儿茶醛的细胞毒性检测结果在原儿茶醛加药期间，每天在倒置显微镜下观察细胞形态，加药组细胞与对照组细胞形态上没有肉眼可见的差异。MTS检测结果见图13。图中显示，在17.4、43.4、86.8μM，原儿茶醛各剂量组OD值与正常细胞对照基本相同。
结论原儿茶醛可显著抑制Hep2.2.15细胞中纤连蛋白的表达，进而抑制Hep2.2.15细胞中HBV复制及其基因和蛋白的表达而不影响细胞活性。
权利要求
1.纤连蛋白(fibronectin)是抗乙型肝炎病毒(HBV)药物的新靶标。
2.以纤连蛋白为靶可以有效地抑制HBV的复制及其基因和蛋白的表达，从而用于抗HBV药物的筛选和HBV感染的治疗。
3.以纤连蛋白为靶筛选抗乙型肝炎病毒药物的方法。
4.以纤连蛋白为靶的抗HBV药物筛选模型包括分子，细胞和动物模型。
5.权利要求书4中的分子模型包括基因、蛋白及其结构片断。
6.以纤连蛋白为靶的抗乙型肝炎病毒药物包括小分子化合物或其混合物。
7.权利要求书6中的小分子化合物可以是原儿茶醛或其衍生物和含原儿茶醛或其衍生物的混合物。
8.以纤连蛋白为靶的抗乙型肝炎病毒药物包括中药、植物药提取物、有效部位或有效成分。
9.以纤连蛋白为靶的抗乙型肝炎病毒药物包括大分子类药物如核酸类药物，多肽类药物，抗体类药物和疫苗类药物等。
全文摘要
本发明涉及一种抗乙型肝炎病毒(HBV)药物的新发明靶点及其用途。具体说是抑制纤连蛋白(fibronectin)的表达可以抑制HBV的活性，以纤连蛋白为靶可以有效地抑制HBV的复制及其基因和蛋白的表达，从而用于抗HBV药物的筛选和HBV感染的治疗。本实验室通过应用半定量RT－PCR和WESTERN印迹技术，发现纤连蛋白在转染有HBV基因组能够表达完整Dane氏颗粒的HepG2.2.15细胞中高表达，而在HepG2细胞中不表达，且在抗病毒药物处理HepG2.2.15细胞后，纤连蛋白表达发生显著下调。应用靶向纤连蛋白mRNA的反义序列抑制纤连蛋白的蛋白表达，可显著抑制HepG2.2.15中HBV的复制及其基因和蛋白的表达，这种抑制作用可被外源加入的纤连蛋白拮抗。应用纤连蛋白抗体以及可抑制fibronectin表达的小分子化合物亦可显著抑制HepG2.2.15中HBV的复制及其基因和蛋白的表达。因此，确定纤连蛋白可以作为抗HBV药物的新靶点，可用于抗HBV药物的筛选及指导临床HBV感染的治疗。
文档编号A61K31/352GK1661373SQ20051000196
公开日2005年8月31日 申请日期2005年1月13日 优先权日2005年1月13日
发明者王升启, 杨静, 伯晓晨, 丁晓然, 张毅, 张敏丽 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所