专利名称：双黄连在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及双黄连在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。
背景技术：
心脑血管疾病是当代危害人体健康和生命的最严重病症，是中、老年人的常见病和多发病，在许多国家和地区的发病率和死亡率皆位于众病之首。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的主要病理基础，迄今为止其病因和发病机理尚未完全阐明，故目前没有简明有效的防治措施和治疗药物。
此外，自首例艾滋病(AIDS)于1981年6月被美国疾病控制中心(CDC)确认以来，艾滋病横行肆虐于全球，严重威胁着人类的健康和生存。自蛋白酶抑制剂(PI)引入临床后，迅速降低了血浆HIV病毒载量，疗效突出，延缓了AIDS的进展，改善了患者的生活质量。但长期的临床观察已经发现PI类药物可致诸多严重的副作用，尤其是引起胆固醇含量增高，动脉粥样硬化形成及诱发糖尿病等，严重影响病人的生存质量。由于目前常用的降脂药，存在严重的横纹肌溶解等副作用，不适用于PI类药物副作用的预防，故国内外尚无有效的方法应对这一副作用的发生。我国几千味传统的天然药物历经数千年临床，为寻找有效预防药物提供了丰富的药源，因此从天然，传统药物中筛选治疗或辅助治疗爱滋病的药物不仅是可行的，而且是经济的。
双黄连制剂是我国的传统中药，其主要成分为金银花、黄芩、连翘，具有较强的抗菌和抗病毒作用，临床主要用于急性上呼吸道感染、疱疹性咽峡炎、急性喉炎、急性扁桃体炎、急性支气管炎和肺炎的治疗，但双黄连防治动脉粥样硬化及PI类药物引起的动脉粥样硬化副作用未见报道。
发明内容
本发明就是针对上述问题提供双黄连在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用，用双黄连制备的抗动脉粥样硬化的药物，具有较好的疗效，且副作用少。
本发明提供的技术方案是双黄连在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。以及双黄连在制备防治PI类药物引起的动脉粥样硬化副作用的药物中的应用。
本发明可用作抗人或动物的动脉粥样硬化及防治使用PI类药物引起的动脉粥样硬化副作用。本发明所述药物可通过口服或静脉注射给予。本领域技术人员可根据实际情况容易地确定给药剂量，一般可按照现有技术中双黄连制剂的常规剂量给予；如口服时每天3次，1.6克/次。
具体实施例方式
本发明通过以下实施例作进一步说明中医药学在抗动脉粥样硬化方面发挥着重要作用，具有毒副作用小、疗效确切等特点。本发明选择金银花、黄芩、连翘的复方提取物双黄连作为抗动脉粥样硬化药物，用细胞培养的方法，探讨双黄连对动脉粥样硬化的影响及药物作用机制。旨在选择一种抗动脉粥样硬化作用强、毒性小的药物。
本发明通过细胞水平的研究及建立动脉粥样硬化模型等技术揭示了双黄连对动脉粥样硬化的作用及机制。
本发明经口及静脉注射给予双黄连提取物(提取比例金银花∶黄芩∶连翘＝1∶1∶2)0.12g(生药)/kg、0.6g(生药)/kg、3.0g(生药)/kg，一天一次，20天后，可使动脉粥样硬化大鼠斑块面积/内膜面积(％)、内膜厚度(μm)/中膜厚度(％)显著降低；使血中甘油三脂、总胆固醇及低密度脂蛋白含量下降，表明双黄连可治疗动脉粥样硬化。
材料与方法1.实验材料1.1动物和饲料实验动物健康大鼠，雌雄各半，体重(200.0±20)g由武汉大学实验动物中心提供。
饲料基础饲料由湖北省卫生防预站实验动物中心提供。
高脂饲料胆固醇2％，猪油10％，基础饲料88％.由湖北省卫生防预站实验动物中心加工完成。
1.2药品及试剂胆固醇平顶山市东珠牧畜废品提取有限公司；猪油市购猪肥膘自行熬制；胆固醇试剂盒批号571/010/05，上海申能公司；甘油三脂试剂盒批号130/010/05，上海申能公司；高密度脂蛋白试剂盒批号122R1A，日本第一化学试剂公司；低密度脂蛋白试剂盒批号R201AAD，日本第一化学试剂公司；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒南京建成生物工程研究所MDA测定试剂盒南京建成生物工程研究所SOD测定试剂盒南京建成生物工程研究所；1.3器材美国雅培AEROSET全自动生化分析仪；JY601电子天平上海海康电子仪器厂；TN-100B型托盘扭力天平上海上平仪器公司；OLYMPUS倒置型系统显微镜；WF10X-18MM光学显微镜重庆光学仪器厂；TGL-16G离心机上海安亭科技仪器厂2.实验方法2.1内皮细胞培养及双黄连作用研究2.1.1建立高脂血清损伤的内皮细胞模型取健康日本大耳白兔6只，每日饲喂高脂饲料(2％胆固醇，10％猪油，88％基础饲料)，4周后无菌条件下心脏取血5ml，分离血清，合并，56℃水浴30min灭活处理，再以0.45及0.22双层微孔滤膜过滤后，-30冷冻保存备用。
2.1.2细胞培养和传代将传代培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304培养于含20％小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100g/L链霉素的DMEM培养基中。用0.25％胰蛋白酶液与0.02％EDTA(1∶1)消化传代。接种于100ml培养瓶中，送入5％CO2培养箱中培养。以备实验用。
双黄连，临用前用无血清培养基稀释。
2.1.3分组取对数生长期的细胞用于实验。细胞加处理因素前24h更换无血清培养基，使细胞同步化至G1期，然后随机分6组对照组、高脂血清组、双黄连组0.004mg/ml组、双黄连组0.02mg/ml、双黄连组0.1mg/ml组。其中对照组加无血清DMEM培养基；高脂血清组加含5％高脂血清DMEM培养基。
2.1.4MTT法检测细胞存活率将生长良好的EVC304细胞制备成5×107个·L-1的细胞悬液，按每孔0.1ml接种于96孔板，37℃，5％CO2温育24h，无血清同步化处理及分组同上。各组细胞作用24h后，每孔加入20μl MTT(5.0g·L-1)，37℃孵育4h，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜100μl，充分溶解后于酶标仪上读取570nm处吸光度值(A570nm)，细胞的存活率按下列公式计算。细胞存活率(％)＝处理组A570nm/对照组A570nm×100％2.1.5MDA和SOD含量测定细胞分组及处理同上。作用24h后弃去上清液，用PBS洗3次后每孔加入0.5ml细胞裂解液(150mmol/L NaCl，150mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，1％TritonX-100)，待细胞充分裂解后，参照MDA和SOD检测试剂盒说明书测定细胞MDA含量。
2.2双黄连对高脂动物的影响2.2.1动物以基础饲料喂养1w，作为适应期。随机等分为6组正常组、模型组、双黄连低剂量组(0.12g(生药)/kg)、双黄连中剂量组(0.6g(生药)/kg)双黄连高剂量组(3.0g(生药)/kg)和多烯康对照组。正常组喂以基础饲料100g·只-1·d-1；模型组及其他给药组喂以高脂饲料20g·100g-1·d-1，给药组每天经口或注射给予相应剂量的双黄连药物，连续给药20d。
2.2.2指标的测定2.2.2.1血脂的测定于给药后20d，将动物禁食不禁水12h，心脏采血，3000rpm·min-1离心10min，取上层血清0.5ml，测定。利用美国雅培AEROSET全自动生化分析仪，分别以氧化酶法测定TG、TC含量，直接测定法测定HDLC、LDLC的含量。
2.2.2.2主动脉斑块的病变分级动物处死后，立即摘取主动脉(自心脏至髂动脉分叉处)，将其上的脂肪组织剔除，于背侧面纵行切开，用10％的甲醛溶液固定，苏丹IV染色，使斑块呈红色，铺平，照像。图像分析仪测定斑块面积及血管内膜总面积，并计算斑块/血管内膜面积比。
按以下规定进行分级0级无病变1级病变占1％-25％；2级病变占26％-50％；3级病变占51％-75％；4级病变占76％-100％。
2.2.2.3血清MDA及SOD的测定动物心脏采血，3000rpm·min-1离心10min，取上清，用生理盐水稀释5倍，混匀待测。采用MDA试剂盒测定MDA含量及SOD活性。
实验结果1.双黄连对高脂血清损伤的内皮细胞细胞存活率的影响高脂血清能显著降低内皮细胞的细胞存活率(P＜0.01)，双黄连0.004mg/ml、双黄连0.02mg/ml、双黄连组0.1mg/ml三个浓度能不同程度抑制高脂血清引起的细胞存活率的降低(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。
表.1双黄连对高脂血清损伤的内皮细胞细胞存活率的影响(x±s，n＝6)
与正常组相比*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.012.双黄连对高脂血清损伤的内皮细胞MDA和SOD含量的影响高脂血清能显著升高内皮细胞中MDA的含量(P＜0.01)，SOD含量变化不明显。双黄连能能不同程度抑制高脂血清引起的MDA含量的升高，提高血清SOD酶活性。
表.2双黄连对高脂血清损伤的内皮细胞MDA和SOD的影响(x±s，n＝4)
与正常组相比*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.013.双黄连对高脂饮食大鼠血脂的影响与正常组相比，模型组甘油三脂(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白LDLC的含量均显著升高(P＜0.01)，高密度脂蛋白(HDLC)无明显影响；与模型组相比，双黄连组和多烯康对照组TC、LDLC的含量均显著降低(P＜0.01)，对HDLC无明显影响。
表.3双黄连对高脂饮食大鼠血脂的影响(x±s，n＝4)
与正常组相比*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.014.双黄连对高脂致动脉粥样硬化大鼠主动脉斑块的病变分级的影响与模型组相比，双黄连中剂量组斑块面积/内膜面积(％)、内膜厚度(μm)、内膜厚度/中膜厚度(％)均显著降低(P＜0.05)，双黄连高剂量组和多烯康对照组斑块面积/内膜面积(％)、内膜厚度(μm)、内膜厚度/中膜厚度(％)均显著降低(P＜0.01)。
表4双黄连对高脂致动脉粥样硬化大鼠主动脉斑块面积/内膜面积(％)、内膜厚度/中膜厚度(％)的影响(x±s，n＝4)
与正常组相比*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.015.双黄连对高脂致动脉粥样硬化大鼠血清MDA、SOD的影响与正常组相比，模型组血清中MDA的含量显著升高(P＜0.01)，SOD活性显著下降；与模型组相比，AA中、高剂量组血清中MDA的含量均显著降低(P＜0.05，P＜0.05)，SOD的含量显著升高(P＜0.05)。
表5双黄连对高脂致动脉粥样硬化大鼠血清中MDA、SOD的影响(x±s，n＝4)
与正常组相比**P＜0.01；与模型组相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.01实验结论脂代谢紊乱是促使动脉粥样硬化发病的重要因素之一。高脂血症可致内皮细胞损伤和灶状脱落，导致血管壁通透性升高，血浆脂蛋白进入内膜，引起巨噬细胞的消除反应和血管平滑肌细胞的增殖，进而形成动脉斑块。本发明通过建立高胆固醇饮食诱导兔动脉粥样硬化模型，观察双黄连对动脉粥样硬化的影响。结果表明，高脂饲料喂养可使大鼠血脂水平均显著升高，表现明显的高脂血症，模型组主动脉管壁病变广泛，有大量白色脂样斑块和脂纹向管腔凸出，并连成片状。应用双黄连可使主动脉斑块面积/内膜面积、内膜厚度和内膜厚度/中膜厚度减少，有效地抑制了动脉粥样硬化的形成。同时，双黄连可显著降低大鼠血清TG、TC、LDL水平，并可延缓高脂引起的主动脉病理改变，表明双黄连在对高脂引起的动脉粥样硬化形成过程具有干预效应，通过降低与动脉粥样硬化发病呈正相关的血脂成分，从而抑制了动脉粥样硬化进程。
医学研究认为高脂血症(主要为高胆固醇血症)是AS病变最重要的原因。内皮细胞损伤(多半是功能性损伤)是AS发生的启动步骤，其功能降低主要表现在正常的抗凝、抗细胞粘附和抗氧化机能减弱。高胆固醇血症对动脉内皮的损伤是通过氧化损伤机制产生的，高胆固醇血症增加动脉壁细胞内自由基释放系统的活性，使氧自由基及其它活性氧成分释放增多，动脉壁的脂质过氧化损伤，导致大量的低密度脂蛋白被氧化；另一方面，高胆固醇血症又直接损伤动脉壁的抗氧化机能，使动脉壁内的SOD活性降低，导致脂质过氧化物清除障碍，其分解代谢产物MDA含量增加，加重局部血管内皮细胞的病理损伤和血管调节失常。本发明表明，双黄连可减少过氧化脂质的生成，提高SOD酶活性，达到保护内皮功能而表现为抗动脉粥样硬化作用。
权利要求
1.双黄连在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。
2.双黄连在制备防治PI类药物引起的动脉粥样硬化副作用的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及双黄连在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。以及双黄连在制备防治PI类药物引起的动脉粥样硬化副作用的药物中的应用。双黄连可通过调节血脂、保护内皮细胞达到抗动脉粥样硬化的作用。用双黄连制备的抗动脉粥样硬化的药物对动脉粥样硬化具有较好的疗效，可以作为抗人或动物的动脉粥样硬化及防治使用PI类药物引起的动脉粥样硬化副作用。
文档编号A61P9/00GK1813913SQ20051001987
公开日2006年8月9日 申请日期2005年11月24日 优先权日2005年11月24日
发明者丁虹, 周惠萍, 王黎, 马瑶, 陈俊 申请人:武汉思达创新医药科技有限公司