专利名称：醌类化合物及其制备方法与抗肿瘤应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物化合物领域，具体涉及一类源于真菌的具有抗肿瘤活性的醌类化合物及其制备方法，以及它们在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
自从1929年从真菌中发现青霉素以来，真菌的代谢产物成为了药物的丰富来源，绝大多数临床应用的抗生素都来源于真菌和细菌，真菌的代谢产物还有其他的药用价值，如抗肿瘤，治疗心血管疾病，免疫调节剂等。由于海洋环境的特殊性，海洋微生物种类繁多，来源广泛，筛选获得率高，根据John教授在2005年《Natural Product Reports》的报道，2003年发现海洋天然产物新化合物中，海洋微生物是主要来源之一(另外包括海绵和腔肠动物)。海洋真菌能提供陆生真菌无法提供的代谢产物。
植物内生真菌(Endophytic fungi)生活在高等植物的组织中，是植物微生态系统中的天然组成成分，在进化过程中与宿主建立了和谐的共生关系，据保守的估计内生真菌的种类繁多，大约有1.5×106种，由于数量庞大，而且与其他生物之间紧密的生态关系，使这类真菌成为潜在的具有产生丰富的次级代谢产物的来源。
发明内容
本发明的目的在于提供一类新的来源于海洋真菌的具有潜在药用价值的醌类化合物。
本发明的另一个目的是提供上述醌类化合物的制备方法。
本发明的进一步目的是提供上述醌类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
发明人由南海海洋真菌Halorosellinia sp.1403(以下简称真菌1403)的发酵培养物中提取分离得到三种结构相似的化合物，该三种化合物的结构分别如下列式E、式F、式G和所示(以下分别简称为化合物E、F和G)
本发明所用的真菌1403已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉大学校内)，保藏号为CCTCC NOM201018，保藏日为2001年4月23日。
本发明化合物E、F和G可从真菌1403的发酵培养液中提取分离得到，制备方法的具体步骤如下a.真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NOM 201018的种子培养培养基按重量比为葡萄糖0.5～1.5，酵母提取物0.05～0.15，蛋白胨0.1～0.3，琼脂1～1.5，氯化钠3～5，水100，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30～35℃培养5～7天；b.真菌Halorosellinia sp.1403CCTCC NOM 201018的发酵培养发酵培养基按重量比为葡萄糖5-15，酵母提取物1～4，蛋白胨0.5～4，氯化钠3～5，水100，将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25～35℃静置1～2个月；
c.将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；d.真菌#1403培养液过滤，菌体和培养液分别收集，培养液浓缩，将发酵液加热浓缩至原液体积的1/10～1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱；e.培养液浸膏经过柱层析后，收集20％～100％的乙酸乙酯/石油醚洗脱液，30％的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液经过多次柱层析并重结晶，浓缩得红色物质，即为E；再用50％的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液，经薄层层析和硅胶柱层析多次分离，重结晶，即得到F。收集100％的乙酸乙酯洗脱液反复薄层层析和柱层析，不断重结晶得到化合物G。
本发明经试验证明，化合物E、F和G均能有效抑制肿瘤细胞株的生长，可用于制备抗肿瘤药物，可以是药物上可接受的任意一种剂型。
与现有抗肿瘤药物相比，本发明具有如下有益效果本发明的醌类化合物来源于海洋真菌，海洋真菌种类繁多、数量庞大，从真菌提取的方法简单，使得醌类化合物来源丰富、成本低廉；醌类化合物抗肿瘤活性高，应用前景广阔。
具体实施例方式
实施例1 化合物E、F与G的分离制备方法a.真菌Halorosellinia sp.1403CCTCC NOM 201018的种子培养培养基按重量比为葡萄糖0.5～1.5，酵母提取物0.05～0.15，蛋白胨0.1～0.3，琼脂1～1.5，氯化钠3～5，水100，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30～35℃培养5～7天；b.真菌Halorosellinia sp.1403CCTCC NOM 201018的发酵培养发酵培养基按重量比为葡萄糖5～15，酵母提取物1～4，蛋白胨0.5～4，氯化钠3～5，水100，将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，在室温25～35℃静置1～2个月；c.将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；d.真菌#1403培养液过滤，菌体和培养液分别收集，培养液浓缩，将发酵液加热浓缩至原液体积的1/10～1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱。
e.培养液浸膏经过柱层析后，收集20％～100％的乙酸乙酯/石油醚洗脱液，30％的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液经过多次柱层析并重结晶，浓缩得红色物质，即为E；再用50％的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液，经薄层层析和硅胶柱层析多次分离，重结晶，即得到E、F与G。浸泡的菌体得到的浸膏经过柱层析；收集100％的乙酸乙酯洗脱液反复薄层层析和柱层析，不断重结晶得到化合物H。
化合物E的试验数据红色粒状晶体，mp 222-225℃。FABMS m/z 321[M+1]+。1H NMR(DMSO-d6，500MHz)dH13.20(1H，s)，12.67(1H，s)，6.43(1H，s)，4.71(1H，dd，2.5，5.0)，4.38(1H，d，2.5)，3.92(3H，s)，3.62(1H，m)，1.19(3H，s)；13C NMR(DMSO-d6，125MHz)dc 184.3(C)，183.0(C)，175.9(C)，161.7(C)，160.3(C)，138.8(C)，136.4(C)，109.4(CH)，109.0(C)，106.8(C)，70.1(CH)，68.8(C)，56.8(CH3)，35.5(CH2)，29.9(CH2)，25.2(CH3)。
化合物F的试验数据橙红色固体，mp 249-253℃，FABMS m/z 301[M+1]+。1H NMR(DMSO-d6，500MHz)dH13.39(1H，s)，13.37(1H，s)，11.01(1H，s)，7.87(1H，s)，7.48(1H，s)，6.76(1H，s)，3.92(3H，s)，2.20(3H，s)；13C NMR(DMSO-d6，125MHz)dc185.8(C)，184.0(C)，162.0(C)，159.9(C)，157.5(C)，149.2(C)，133.6(C)，131.8(C)，129.5(CH)，124.4(C)，111.6(C)，110.9(CH)，106.4(CH)，105.5(C)，56.1(CH3)，16.1(CH3)。
化合物G的试验数据灰色粉末.mp235-237℃.1H NMR(DMSO，300MHz)dH12.351(s，1H，5-OH)，8.448(S，1H，8-OH)，6.486，(S，1H，6-CH)，5.000(d，1H，J＝5.7Hz，9-OH)，4.73(brd，1H，J＝5.7，12.0Hz，9-CH)，4.002(s，1H，2-OH)，3.87(s，3H，15-CH3)，3.82(Brd，j＝2.1，8.4，10Hz，4-CH)，3.0(dd，1H，J＝8.4，5.7Hz，3-CH)，2.74(1H，dd，J＝12，10Hz，14-CH)，2.11，(brd，J＝12，12Hz，13-CH)，1.70(1H，t，J＝13.0Hz，1-CHa)，1.53(1H，dd，J＝13.0，3.6Hz，1-CHb)，1.17(S，3H，16-CH3)；13C NMR(DMSO，300MHz)dc205.80(C-10)，157.85(C-5)，155.85(C-12)，135.69(C-7)，129.29(C-12)，107.40C-11)，98.86(C-6)，78.10(C-3)，70.57(C-4)，70.39(C-2)，61.77(C-9)，55.98(C-15)，47.13(C-14)，37.05(C-1)，27.100(C-16)。
化合物E的试验数据
实施例2 MTT还原法检测化合物E、F和G抗肿瘤活性试验1.材料1.1四脞盐(MTT)用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT(3-(4，5-dimethythiazol-z-yl)2，5-diphenyltetrazolium bromide，SIGMA)终浓度5mg/mL，过滤除菌，分装后4℃避光保存。
1.2靶细胞的制备HepG2细胞的复苏与培养a.从液氮罐中取出人肝癌细胞株HepG2细胞的冻存管，迅速置入37℃水浴中，不停摇动使之迅速溶化，无菌操作移入离心管中；b.加全培养液至10mL，1000rmp离心5s，弃上清；c.重复以上操作一次；d.以全培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中，5％CO2，37℃培养；e.观察细胞生长情况，及时更换培养液，分瓶。
1.3细胞计数a.选取对数生长期细胞，胰酶消化，全培养终止，移入离心管中，加全培至10mL；b.取一滴滴入计数板一侧凹槽中，显微镜下计数四大格的细胞总数、除以4，乘104，即为每毫升培养液所含细胞数；c.调整细胞数至1×105/mL；1.4化合物E、F和G的配制分别取一定量的化合物E、F和G加入到全培中，调整浓度为500μg/mL，超声乳化，过滤除菌，4℃保存。
2.试验方法a.96孔板各孔加入HepG2细胞100μL(1×105/mL)，5％CO2，37℃培养4hr。
b.加入不同浓度受试对象100μL，对照加全培100μL，继续培养48hr。
c.加入MTT(5mg/mL)各10μL，继续培养4hr。
d.去除培养液。每孔加入DMSO100μL，轻轻振荡5-10min，使颗粒溶解。
e.酶联免疫仪570nm下测定每孔OD值。
f.计算抑制率肿瘤细胞杀伤率％＝[(对照组测定的平均OD值-加药组测定的平均OD值)/对照组测定的平均OD值]×100％g.以抑制率对药物浓度的对数作图，求得IC50值以lgc为横坐标，抑制率为纵坐标，求得IC50值3.试验结果试验结果显示化合物E、F和G均能有效抑制HepG2细胞株生长。其中，E和F的IC50值分别为10.5μg/ml和3.5μg/ml。
权利要求
1.下述结构式E、F和G的醌类化合物
2.权利要求1所述醌类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NOM 201018的种子培养培养基按重量比为葡萄糖0.5～1.5，酵母提取物0.05～0.15，蛋白胨0.1～0.3，琼脂1～1.5，氯化钠3～5，水100，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30～35℃培养5～7天；(2)真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NOM 201018的发酵培养发酵培养基按重量比为葡萄糖5～15，酵母提取物1～4，蛋白胨0.5～4，氯化钠3～5，水100，将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25～35℃静置1～2个月；(3)将上述培养好的发酵液过滤除去菌体；(4)真菌#1403培养液过滤，菌体和培养液分别收集，培养液浓缩，将发酵液加热浓缩至原液体积的1/10～1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱；(5)培养液浸膏经过柱层析后，收集20％～100％的乙酸乙酯/石油醚洗脱液，30％的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液经过多次柱层析并重结晶，浓缩得红色物质，即为E；再用50％的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液，经薄层层析和硅胶柱层析多次分离，重结晶，即得到F；收集100％的乙酸乙酯洗脱液反复薄层层析和柱层析，多次重结晶得到化合物G。
3.权利要求1所述醌类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了醌类化合物及其制备方法与抗肿瘤应用。本发明发现了一类新的来源于海洋真菌的具有潜在药用价值的醌类化合物。海洋真菌种类繁多、数量庞大，从真菌提取的方法简单，使得醌类化合物来源丰富、成本低廉；醌类化合物抗肿瘤活性高，应用前景广阔。
文档编号A61P35/00GK1762961SQ200510037139
公开日2006年4月26日 申请日期2005年9月13日 优先权日2005年9月13日
发明者佘志刚, 林永成, 黄华容, 夏雪奎, 蔡小玲, 周世宁, 关利平 申请人:中山大学