专利名称：凋亡抑制因子survivin基因为靶标的反义寡核苷酸结构和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及反义寡核苷酸结构及其用途，具体地说涉及凋亡抑制因子survivin基因为靶标的反义寡核苷酸结构和用途。
背景技术：
肿瘤分子生物学研究表明，肿瘤是由于基因异常引起的疾病。致病机理包括癌基因的激活和抑癌基因的矢活以及细胞周期的异常。肿瘤发病分子机理的进一步阐明为肿瘤的基因治疗提供了可靠的理论依据。近年来肿瘤研究的热点是肿瘤的发生与细胞周期，细胞增殖，细胞凋亡有密切关系。反义技术是近十几年兴起的生物技术，用反义技术封闭和抑制特定基因的表达是基因治疗的重要组成部分。1978年Stephenson和Zamenick用互补寡聚核苷酸特异性抑制Rous肉瘤病毒的复制，首次提出了反义寡聚脱氧核糖核苷酸(ASODN)抑制基因表达的概念。ASODN是根据Watson-Crick碱基配对原理能够与mRNA的碱基对互补阻止其翻译成蛋白质的DNA。反义寡核苷酸具有定向合理设计，体内外作用高效和能人工大规模合成等药用特性，因而近年来成为治疗病毒感染，肿瘤及其它由于基因表达异常引起的疾病的一类潜在型药物，其中肿瘤相关基因可作为反义药物作用的靶标。
survivin是凋亡抑制因子，通过抑制细胞凋亡而调节组织细胞分化，促进突变发生，产生治疗抗性，促进细胞异常增殖导致肿瘤发生。survivin在胚胎发育中起重要作用，而在成熟分化组织中几乎不表达，但在多种肿瘤组织中又呈现高表达。如肺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌及50％的淋巴瘤等均可出现高表达。并且survivin的表达与癌症病人的治疗及预后呈现相关性。对于预测肿瘤病人的预后和早期癌症诊断具有重要意义，它的抑制物可抑制肿瘤生长导致凋亡。
发明内容
本发明的目的是提供一种与凋亡抑制因子基因survivin互补、能抑制其表达的长度为20个碱基的反义寡核苷酸。
具体的说，本发明是通过以下技术方案实现的根据一种肿瘤相关基因survivin基因，通过全长基因寻靶技术(Full length gene targeting，FLGT)筛选靶向survivin基因的反义寡核苷酸序列，根据筛库结果，设计15条寡核苷酸序列(见表1)。寡核苷酸序列采用PE公司产391A型DNA合成仪合成并采用硫代修饰，经Micro Pure II反向柱(Solid PhaseScience)纯化后，以此产物作为肿瘤的治疗药物。
表1 反义寡核苷酸序列及特征
在针对survivin基因的15条反义寡核苷酸中，A4、A6、A15的体外抑制细胞增殖作用最强。在0.8μM给药浓度时，对肿瘤细胞(A549)增殖抑制率高于70％。A4、A6、A15药物对人肝癌原位移植模型荷瘤裸鼠的肿瘤生长具有明显的抑制作用，抑制率可达50％左右；此三种药对裸鼠的体重及生长状态无明显影响，无肉眼可见毒性。结果表明A4、A6、A15硫代寡核苷酸体内外具有抑瘤率高，毒性低等优点。
根据本发明，发明中针对survivin基因治疗肿瘤的优选序列为A4、A6和A15三条序列。
上述反义寡核苷酸或其组合可用于制备抗肿瘤的药物。将其采用本领域所知的介导方式或与适当的载体相结合后导入肿瘤细胞内，可显著抑制survivin基因的表达，达到抑制肿瘤的目的。
图1为反义寡核苷酸在细胞水平上的增殖抑制率；图2为反义寡核苷酸在细胞水平上对靶基因survivin mRNA表达的抑制作用；图3为反义寡核苷酸在细胞水平上对靶基因survivin蛋白表达的抑制作用；图4为反义寡核苷酸对于人肝癌原位移植模型荷瘤裸鼠的肿瘤体积的抑制情况；图5为反义寡核苷酸对于人肝癌原位移植模型荷瘤裸鼠的肿瘤重量的抑制情况；图6为反义寡核苷酸对于人肝癌原位移植模型荷瘤裸鼠的抑制率。
具体实施例方式
下面结合附图，对本发明的具体实施作详细说明实施例一体外抗肿瘤活性ASODN筛选和评价材料和方法1.1反义寡核苷酸的设计本研究选取了survivin基因作为靶标进行抗肿瘤反义寡核苷酸的筛选和评价，基因序列由Genbank获得。首先，克隆靶基因survivin的全长序列，体外转录出大量的靶mRNA；将人工合成的随机寡核苷酸库与靶mRNA再进行杂交，通过从杂交液中提取与mRNA有结合活性的反义寡核苷酸得到分离；将这些结合序列扩增、克隆并测序，采用TargetFinder软件(由本实验室伯晓晨编程)将测序后的标签与靶mRNA序列进行比对分析，确定反义可接近位点。
1.2反义寡核苷酸的芯片筛选根据已确定的15个反义可接近位点，设计合成15个反义结合位点(A1-15)的寡核苷酸探针，制备芯片；同位素标记的靶mRNA与芯片杂交，观察杂交信号强弱；进一步用同位素标记的靶mRNA与芯片杂交后RNase H原位切割，观察其切割活性。
1.3反义寡核苷酸的合成根据已确定的15个反义可接近位点，合成15条(A1-A15)反义序列(具体序列见表1)。反义硫代寡聚核苷酸为无色粉末状，合成后浓氨水55℃脱保护15小时，然后用反向柱(购自solid phase science公司)层析纯化。体外实验用无双抗的1640培养基配制，体内实验用生理盐水配制，保存于-20℃。
1.4细胞培养、脂质体转染及细胞增殖抑制活性测定人肺癌细胞株(A549)由军事医学科学院提供。用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的1640培养液，于37℃、5％ CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将A549细胞悬液接种在96孔培养板中，每孔接种培养液100μL，含4×103细胞。待40-60％的细胞融合后，吸去培养液，用无血清无双抗的1640培养基洗2次，在无血清状态下，采用脂质体Lipofectin(GIBCO，1mg/ml)试剂并参照说明书操作进行硫代反义寡核苷酸的转染。每条反义寡核苷酸设置0.2μM、0.4μM、0.8μM三个浓度，每个浓度重复3个孔，并设细胞和脂质体对照。转染6小时后，换含10％胎牛血清的1640培养液继续培养48h，每孔加20μl MTS(CellTiter96 Aqueous one solution cell proliferation assay，Promega)并继续避光培养90min，在多标记酶联免疫检测仪(VICTORTM Wallac 1420 Multilabel Counter，Wallac)上测定490nm处吸光值A，计算细胞增殖抑制率。
1.5反义寡核苷酸在体外对靶基因mRNA表达的影响选取细胞水平抑制效果较好的A2、A4、A6、A15硫代反义寡核苷酸，检测其对靶mRNA表达的抑制作用。A549细胞培养条件同上。将A549细胞悬液接种在6孔培养板中，每孔接种培养液2mL，含1.5×105细胞。待40-60％的细胞融合后，吸去培养液，进行硫代反义寡核苷酸的转染(操作过程同上)。反义寡核苷酸的浓度分别为0.2μM、0.4μM、0.8μM，并设细胞对照和脂质体对照。转染6h，换含10％胎牛血清的1640培养液继续培养48h后，TRIZOL法(Gibco)提细胞总RNA，紫外定量并将各组提取物调至相同浓度。采用Reverse transcription system(Promega)进行反转录，及PCR扩增靶基因survivin。以看家基因β-2M作为内标进行双重PCR，设不加模板的空白对照。β-2M扩增片段317bp，靶基因survivin扩增片段200bp。扩增产物用2％琼脂糖胶(Sigma)电泳检查，利用ImageQuant软件读取各电泳条带信号值，计算抑制率。
1.6反义寡核苷酸在体外对靶基因蛋白表达的影响选取RT-PCR实验中，抑制效果较好的硫代反义寡核苷酸A4、A6、A9、A15，检测其对靶蛋白表达的抑制作用，进一步筛选有效序列。A549细胞培养条件同上。将A549细胞悬液接种在6孔培养板中，每孔接种培养液2mL，含1.5×105细胞。硫代反义寡核苷酸的转染(操作过程同上)。反义寡核苷酸的浓度为0.4μM，设细胞对照和脂质体对照。转染6h后，换含10％胎牛血清的1640培养基继续培养48h，RIPA-PICT(Pharmacia)提细胞总蛋白，蛋白定量后将各提取物调至相同浓度。每孔50μg总蛋白，12％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，并进行Western bloting观察靶基因蛋白表达情况。
实验结果2.1反义寡核苷酸作用靶位的筛选通过人工合成的随机寡核苷酸库与靶mRNA的杂交筛选和TargetFinder软件的比对分析，并经过芯片筛选，最后确定15条反义可接近位点，反义序列A1-A15(序列见表1)。图1所示，A1、A5、A14以及随机序列R对肿瘤细胞没有明显的抑制作用，而其余12条序列(A2-A4、A6-A11、A15)对细胞的生长均有不同程度的抑制作用，0.8μM给药时，对肿瘤细胞增殖的抑制率高于70％。其中A2、A4、A9的IC50值与阳性对照(P)相当。因此选择A2、A4、A6、A15进行进一步的分子水平分析。
2.2反义寡核苷酸对靶基因转录及翻译水平的影响反义药物是通过抑制其靶基因的表达来实现药效作用，同时观察靶基因的表达情况也是评价和衡量反义药物作用特异性的一个重要指标。由图2可以看出，候选反义寡核苷酸A4、A6、A9、A15以及阳性对照P给药后均能对靶基因mRNA的表达起到较好的抑制作用，且量效关系明显。而A2抑制率很低，脂质体对照(L)无显著抑制效应。
据此进一步选取在转录水平抑制效果较好的4条序列(A4、A6、A9、A15)，以P作为阳性对照，观察候选反义寡核苷酸对靶基因蛋白表达的影响。由图3可见，阳性对照P及A4、A15均可显著抑制靶基因蛋白的表达，其中以A4抑制效果最好，而A6、A9较差。
实施例二动物体内抗肿瘤活性ASODN的评价材料和方法1.1裸鼠的饲养，人肝细胞癌裸鼠原位移植模型HCM-Y89建立和给药处理BALB/C-nu/nu裸鼠18-22g，雌雄各半，由中国医学科学院协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院动物室提供。将BALB/C-nu/nu裸鼠饲养于恒温(25℃-27℃)，恒湿(45-60％)，新鲜空气除尘除菌，无特定病原菌(SPF)环境下(在中国人民解放军第二零二医院医学实验动物室)饲养，灭菌处理的水和饲料供动物自由摄入。人肝细胞癌裸鼠原位移植瘤株HCM-Y89(HepatocellularCarcinoma Models，建株时间1989年)由中国人民解放军第二零二医院人类消化系恶性肿瘤裸鼠原位移植瘤株库提供。取人肝癌裸鼠原位移植瘤组织，剪切成1mm×1mm×1mm组织小块，供移植用。裸鼠在0.5％硫喷妥钠(30mg/kg)静脉注射麻醉下，取腹正中切口，暴露肝脏，切开肝左叶被膜，将2粒瘤组织小块移植在肝实质内，0/10无损伤缝合线缝合肝被膜，0/7丝线缝合腹膜，0/5丝线缝皮。整个手术过程在SPF条件手术室内操作完成。术后不用抗菌素，精心饲养和观察，自由进食。原位移植后第三天将荷瘤动物随机分成六组模型对照组(生理盐水)，5-氟尿嘧啶10mg/kg/次阳性对照组，针对survivin反义寡核苷酸A4、A6、A15、P(阳性对照)各组(50mg/kg/次)，各组动物数均为8只。采用静脉注射给药，注射药物容量为每20克体重0.3ml。每天给药一次，5天一个疗程，间隔1天，共计5个疗程25次。停药3天后处死荷瘤动物，系统解剖，取出肿瘤，用游标卡尺测量肿瘤体积，肿瘤体积的计算按下列公式进行V＝(L×S1×S2)/2，L＝肿瘤的长径(mm)，S1＝肿瘤的短径1(mm)，S2＝肿瘤的短径2(mm)。称量瘤块重量并计算抑制率。
2实验结果2.1反义寡核苷酸对人肝细胞癌裸鼠原位移植模型肿瘤生长的抑制情况经反义寡核苷酸治疗后，给药治疗组肿瘤体积明显小于荷瘤裸鼠溶剂对照组(见图4)。从图5中可见溶剂对照组瘤块体积在886.63±144.80mm3，反义治疗组A4、A6、A15的瘤块体积分别为689.25±110.39mm3、624.38±166.53mm3、667.00±81.74mm3，作t检验分析表明各给药组与溶剂对照组比较P＜0.01，有显著性差异。从瘤块重量观察，溶剂对照组瘤块重量为1.39±0.22g，反义治疗组A4、A6、A15的瘤块重量分别为0.74±0.15g、0.68±0.05g、0.69±0.08g，作t检验分析表明各给药组与溶剂对照组比较P＜0.01(见图6)。各组瘤块重量与溶剂对照组相比，反义治疗组A4、A6、A15抑制率分别达46.76％、51.08％、50.36％，阳性对照P和5-Fu的抑制率分别为52.52、41.73％(见图7)，但阳性对照P在实验中观察到药物毒性比5-Fu还大，动物黄疸严重，消瘦，8只动物有4只死亡，故抑制率仅作参考。
核苷酸序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所<120>凋亡抑制因子survivin基因为靶标的反义寡核苷酸结构和用途<160>15<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1CAGGGGGCAA CGTGGGGGCA 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2GGCCAGTTCT TGAATGTAGA 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3CGCAGTTTCC TCAAATTCTT 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4CAGAGGCCTC AATCCATGGC 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5CACCAGGGAA TAAACCCTGG 20
<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6TCCTAAGACA TTGCTAAGGG 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7GAAACATCTA ATTTGAAAAT 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8AGCTCTAGCA AAAGGGACAC 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9GTCATGCATC TACCAAAAAA 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10CAAACAAAAT AAGAAAGCCA 20<210>11<211>20<212>DNA
<213>人工序列<400>11AGGAGTATCT GCCAGACGCT 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>12CCTGTCTAAT CACACAGCAG 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>13CCATCATCTT ACGCCAGACT 20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14TGACAGGGAG GAGGGCGAAT 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>15GTAACAATCC ACCCTGCAGC 20
权利要求
1.一种与凋亡抑制因子基因survivin互补、能抑制其表达的长度为20个碱基的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸具有的序列选自下列之一，序列为5’到3’1)CAGGGGGCAACGTGGGGGCA；2)GGCCAGTTCTTGAATGTAGA；3)CGCAGTTTCCTCAAATTCTT；4)CAGAGGCCTCAATCCATGGC；5)CACCAGGGAATAAACCCTGG；6)TCCTAAGACATTGCTAAGGG；7)GAAACATCTAATTTGAAAAT；8)AGCTCTAGCAAAAGGGACAC；9)GTCATGCATCTACCAAAAAA；10)CAAACAAAATAAGAAAGCCA；11)AGGAGTATCTGCCAGACGCT；12)CCTGTCTAATCACACAGCAG；13)CCATCATCTTACGCCAGACT；14)TGACAGGGAGGAGGGCGAAT；15)GTAACAATCCACCCTGCAGC。
2.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其序列选自下列之一，序列为5’到3’1)CAGAGGCCTCAATCCATGGC；2)TCCTAAGACATTGCTAAGGG；3)GTAACAATCCACCCTGCAGC。3.权利要求1所述的寡核苷酸或其组合在制备抗肿瘤药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及反义寡核苷酸的结构和用途，具体地说是根据凋亡抑制因子肿瘤相关基因(survivin)设计并制备的反义寡核苷酸。采用人肺癌(A549)细胞株及人肝细胞癌裸鼠原位移植模型，对所设计、制备的15条反义寡核苷酸进行筛选及评价。体外实验可有效抑制人肺癌细胞生长，并阻断该基因表达；在人肝细胞癌裸鼠原位移植模型中亦有效抑制肿瘤的生长。本发明是针对肿瘤的反义寡核苷酸结构及其作为治疗肿瘤、减少肿瘤及其相关性疾病危害性的新型药物。
文档编号A61P35/00GK1869042SQ200510071569
公开日2006年11月29日 申请日期2005年5月26日 优先权日2005年5月26日
发明者王升启, 孙玉宁, 林汝仙, 王丹, 梁乾德 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所