专利名称：威灵仙总皂苷及其对类风湿性关节炎的治疗作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及从中药威灵仙中提取的威灵仙总皂苷，并经动物试验证明对类风湿性关节炎具有显著的治疗作用。
背景技术：
威灵仙是中医临床上传统的祛风湿要药，来源为毛茛科植物威灵仙Clematis chinensisOsbeck、棉团铁线莲Clematis hexapetala Pall.或东北铁线莲Clematis manshurica Rupr.的干燥根及根茎。性温，味辛、咸，功能祛风除湿，用于治疗“痹症”的历史悠久，唐朝嵩阳子周君巢作《威灵仙传》记载威灵仙去众风，通十二经脉，朝服暮效，疏宣五脏冷脓宿水变满，微利不泻人，服此四肢轻健，手足微暖，并得清凉。先时商州有人病手足不遂，不履地数十年，良医殚技莫能疗，所亲置之道旁，以求救者，遇一新罗僧见之，告曰此疾一药可活，但不知此土有否？因为之人入山求采，果得，乃威灵仙也，使服之，数日能步履。其后邓思齐知之，遂传某事。现代研究表明，威灵仙具有显著的抗炎镇痛作用。但对其祛风除湿、抗炎镇痛的物质基础尚未见报道。类风湿性关节炎是一种以关节病变为主的慢性全身性的自身免疫性疾病，其病程长期反复，致残率高。临床上应用的化学合成药主要有糖皮质激素和非甾体抗炎药，但尚不能确切根治本病，且不良反应较多。因此世界各国致力于对传统医药进行深入研究，从中提取分离有效成分和有效部位，寻找疗效好，副作用少的抗炎新药。
发明内容
本发明的目的是从传统抗风湿中药威灵仙中提取出治疗实验性类风湿性关节炎的有效成分，以便进一步研制出安全、有效、可控的中药抗风湿新药。精制的提取物用于制备各种剂型的药物具有检测方便、服用剂量小、服用方便、疗效高的优点，本发明中制备威灵仙总皂苷的大孔吸附树脂方法具有操作简单、工艺流程短、生产成本低的优点，具有广阔的市场前景。
本发明应用大孔吸附树脂分离纯化技术从威灵仙中提取出有效部位总皂苷，为三萜皂苷类化学成分，主要含以下化学成分，其化学结构式如下
R1R2威灵仙皂苷CP1OH 3-O-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP2H3-O-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP2bH3-O-β-D-木糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP3bOH 3-O-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP3H3-O-β-D-木糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP4H3-O-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP5OH 3-O-β-D-木糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP6OH 3-O-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP7H3-O-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP8OH 3-O-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP9H3-O-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP10OH 3-O-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖经动物试验，发现上述威灵仙总皂苷对实验性类风湿性关节炎具有显著治疗作用，试验方法与结果如下1实验材料1.1实验动物昆明种小鼠，雄性(热板试验中为雌性)，体重18～22g，购自安徽省实验动物管理中心动物房，合格证号皖医实动准字第01号。Wistar大鼠，雄性，体重180～220g，购自安徽省实验动物管理中心动物房，合格证号皖医实动准字第03号。空调控制室温20-25℃，湿度40-70％，自由饮水，摄食。
1.2药品与试剂威灵仙总皂苷(Total Saponins of Clematis)，用时以纯化水配制成所需浓度的混悬液。确定小鼠低、中、高剂量分别为37.5mg/kg、75mg/kg、150mg/kg。大鼠低、中、高剂量分别为25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg。雷公藤多苷片浙江得恩德制药有限公司，批号0311116。确定小鼠剂量为15mg/kg，大鼠剂量为10mg/kg。伊文思蓝、醋酸、二甲苯等均为分析纯；鸡蛋市售。弗氏完全佐剂，中国科学院上海生物化学研究所，批号020605。
1.3主要仪器设备8543E紫外-可见分光光度计；美国安捷伦公司；BP211D十万分之一电子天平；德国Sartorius公司；HH-S型恒温水浴箱河南英峪予华仪器厂；秒表深圳惠波科工贸公司；大鼠足容积测定器本室自制。高速离心机，上海手术器械厂；8543E紫外-可见分光光度计，美国安捷伦公司。
2.方法与结果2.1醋酸致小鼠血管通透性增加试验小鼠50只，随机分为正常对照组、威灵仙总皂苷38、75、150mg/kg组和阳性对照组(雷公藤多苷片)，每组10只。每天灌胃给药一次，连续3天，末次给药后1h小鼠尾静脉注射0.5％伊文思蓝5ml/kg，5min后腹腔注射0.5％醋酸10ml/kg，30min后小鼠脱臼处死。用生理盐水反复洗出腹腔内伊文思蓝液，稀释为10ml，纯水调零，于分光光度计上590nm处比色测吸光度。试验数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验。结果见表1。
表1 对小鼠腹腔染料渗出的影响(x±s，n＝10)
(与对照组比较，*示P＜0.05，**示P＜0.01，下同)表1显示威灵仙总皂苷能明显减少小鼠腹腔伊文思蓝渗出量，与对照组比较，高、中剂量组均有非常显著性差异(p＜0.01)，表明威灵仙总皂苷能抑制醋酸致小鼠血管通透性增加。
2.2二甲苯诱导小鼠耳肿胀试验小鼠50只，分组及给药同2.2.1，于末次给药后1h于小鼠右耳前后两面涂抹二甲苯0.02ml，左耳作对照，2h后将小鼠脱臼处死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径8mm的打孔器分别在同一部位打下圆耳片，称重，以左右耳片重量之差为肿胀度。试验数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验。结果见表2。
表2 对小鼠耳肿胀度的影响(x±s，n＝10)
表2显示威灵仙总皂苷能减轻小鼠耳肿胀程度，与对照组比较，低、高剂量组均有显著差异(p＜0.05)，中剂量组有非常显著性差异(p＜0.01)，表明威灵仙总皂苷能抑制小鼠急性炎症。
2.3蛋清诱导大鼠足肿胀试验大鼠30只，随机分为正常对照组、威灵仙总皂苷25、50、100mg/kg组和阳性对照组(雷公藤多苷片)，每组6只。灌胃给药，每天一次，连续3天，末次给药后1h每鼠右足趾皮下注射1％蛋清0.1ml致炎，分别在致炎前和致炎后0.5h，测量致炎侧足容积，以各鼠致炎前、后容积的差值为肿胀度。试验数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验。结果见表3。
表3 对大鼠足肿胀度的影响(x±s，n＝6)
表3显示威灵仙总皂苷能减轻大鼠足肿胀程度，与对照组比较，高、中、低剂量组均有显著差异(p＜0.05)，表明威灵仙总皂苷能抑制大鼠急性炎症。
2.4棉球诱导的大鼠肉芽肿模型大鼠30只，随机分为5组，分组与给药同上，乙醚浅麻醉，在无菌条件下操作，将棉球(每个重50mg±1mg，高压灭菌后每个棉球加氨苄西林1mg·0.1mL-1，50℃烘干)分别植入大鼠两侧腹股沟皮下，手术当天开始ig给药，连续7d，d8颈椎脱臼致死，取出棉球，置60℃烤箱烤至恒重，减去原棉球重量，即为肉芽肿净重。比较各组肉芽肿重量。试验数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验。结果见表4。
表4 对大鼠棉球肉芽肿重量的影响(x±s，n＝6)
表4显示威灵仙总皂苷对棉球诱导的大鼠肉芽肿有显著的抑制作用，与对照组比较，高剂量组有显著性差异(p＜0.05)，中剂量组有非常显著性差异(p＜0.01)，表明威灵仙总皂苷能抑制大鼠慢性炎症反应。
2.5小鼠热板法镇痛试验预选痛阈合格小鼠50只随机分为正常对照组、威灵仙总皂苷38、75、150mg·kg-1组和阳性对照组(雷公藤多苷片)，每组10只。连续灌胃给药3天，末次给药后1h小鼠按热板法测定舔足时间。试验数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验。结果见表5。
表5 对小鼠舔足时间的影响(x±s，n＝10)
表5显示威灵仙总皂苷能明显延长小鼠舔足时间，与对照组比较，高剂量组有显著性差异(p＜0.05)，中剂量组有非常显著性差异(p＜0.01)，说明威灵仙总皂苷有明显镇痛作用。
2.6小鼠扭体法镇痛试验小鼠50只，分组及给药同2.5。末次给药后0.5h小鼠腹腔注射0.6％醋酸溶液，观察并记录15分钟内小鼠扭体反应次数。试验数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验。结果见表6。
表6 对小鼠扭体次数的影响(x±s，n＝10)
表6显示威灵仙总皂苷能明显减少小鼠扭体次数，与对照组比较，中剂量组有显著性差异(p＜0.05)，高剂量组有非常显著性差异(p＜0.01)，说明威灵仙总皂苷有明显镇痛作用。
2.7对免疫性关节炎模型大鼠的影响2.7.1大鼠佐剂性关节炎模型的模型制备于每鼠左后足趾皮内注射弗氏完全佐剂0.1ml致炎。
2.7.2药物对原发性病变影响大鼠48只，随机分为空白组、模型组、TSC组(高、中、低剂量)用药组和阳性对照组(雷公藤多苷)，每组8只，致炎前3d ig给药，分别于致炎前、后3h，6h及24h，检测致炎前、后大鼠致炎侧足肿胀，以观察AA大鼠原发性病变(见表7)。
表7 TSC对大鼠佐剂性关节炎原发性病变的影响(x±s)
注vs.空白组，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；vs.模型组，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001，下同表7结果表明与模型组比较，TSC高、中、低各剂量组均有显著性差异，表明TSC各剂量组对大鼠佐剂性关节炎原发性病变均有显著性差异。
2.7.3药物对继发性病变影响致炎后第4d开始ig给药，每天一次，于第7、11天分别检测非致炎侧足容积。同时采用关节评分(0-4)(0无红肿，1足小趾关节红肿，2趾关节红肿、足跖均红肿，3踝关节以下均红肿，4包括踝关节，全部红肿；除致炎侧外，三足的积分之和为关节总积分，最高为12分)，采用Ridit值法对AA大鼠多发性关节炎症状进行评估，以观察AA大鼠继发性病变(见表2、3)。
TSC对大鼠佐剂性关节炎继发性病变的影响表8 大鼠关节评分
表8结果表明TSC能有效改善关节炎症状。
表9 TSC对大鼠佐剂性关节炎继发性病变的影响(x±s)
表9结果表明与模型组比较，TSC中、高剂量组对大鼠佐剂性关节炎继发性病变均有显著性差异(p＜0.05)，表明TSC对大鼠佐剂性关节炎继发性病变有显著性作用。
结论本实验结果表明，本发明的威灵仙总皂苷对各种炎症模型均有显著的抗炎作用，对佐剂性关节炎大鼠原发性病变和继发性病变有不同程度的防治作用，同时还具有显著镇痛作用。说明威灵仙总皂苷用于临床治疗类风湿性关节炎有重要的治疗价值。可见，用威灵仙总皂苷可制成对类风湿性关节炎具有治疗作用的药品。
本发明中，威灵仙总皂苷的提取方法如下以中药威灵仙为原料，粉碎后用70％乙醇回流提取2-3次，合并提取液，减压回收乙醇，得浓缩浸膏。浸膏以适量水稀释，上D101大孔吸附树脂柱吸附，先用水洗去水溶性杂质，再以50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，浓缩干燥得含多种皂苷成分的威灵仙总皂苷。
权利要求
1.一种以中药威灵仙为原料提取的有效部位威灵仙总皂苷，其特征在于具有以下化学结构 R1R2威灵仙皂苷CP1OH3-O-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP2H 3-O-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP2bH 3-O-β-D-木糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP3bOH3-O-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP3H 3-O-β-D-木糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP4H 3-O-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP5OH3-O-β-D-木糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP6OH3-O-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP7H 3-O-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP8OH3-O-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP9H 3-O-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威灵仙皂苷CP10OH3-O-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖
2.根据权利要求1所述的威灵仙总皂苷，其特征在于用它制成对类风湿性关节炎具有治疗作用的药品。
全文摘要
一种以中药威灵仙为原料提取的有效部位威灵仙总皂苷，含有威灵仙皂苷CP
文档编号A61K31/704GK1927878SQ200510094339
公开日2007年3月14日 申请日期2005年9月9日 优先权日2005年9月9日
发明者徐先祥, 夏伦祝, 邵旭 申请人:徐先祥, 夏伦祝, 邵旭