专利名称：肿瘤靶向性基因传递非病毒载体的构建与制备的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学肿瘤基因治疗用载体领域，涉及一种供外源基因靶向性导入肿瘤局部的非病毒载体的构建与制备。
背景技术：
基因载体是在基因治疗中使用的将外源基因导入机体细胞的传递系统。外源性基因进入靶细胞有3种障碍①细胞膜；②胞浆内的吞噬泡-溶酶体；③细胞核膜。为了通过这几道屏障基因载体的结构一般包括载体骨架、靶向性配体、吞噬泡释放剂和核定位信号肽。首先载体骨架用来承载并保护DNA分子；其次靶向性配体可以与细胞膜受体特异性结合，加强细胞内吞作用，形成吞噬泡，吞噬泡的pH值逐渐下降形成溶酶体，外源基因将在溶酶体中被降解，病毒来源的两性分子肽(amphipathic peptides)是目前常用的一种吞噬泡释放剂，起到帮助基因复合物逃脱吞噬泡进入胞浆，避免溶酶体降解的作用；最后核定位信号肽可帮助目的基因从胞浆转入细胞核，完成整个基因导入过程。如果是癌细胞靶向，外源基因可利用频繁的细胞分裂进入染色体，那么核定位就不重要了。
目前研究的基因载体可分为两大类病毒载体和非病毒载体。病毒载体是靠病毒对细胞的天然感染能力将外源基因整合进宿主细胞，具有较高的转染效率，容易获得对外源基因的长时表达。其缺点是生产不便，毒性尤其是免疫源性大，不宜反复使用以及对所携带的外源基因片断的大小有限制等。非病毒载体虽然在转基因效率和获得长时表达方面不如病毒载体，但不存在上述这些缺点，经过修饰改造的新型非病毒载体在安全、有效、靶向等方面均有所突破，因此成为基因治疗载体的研究热点。本项发明涉及的非病毒载体系统同时具备了以上几种特征，以求做到安全、有效、靶向几方面。
基因治疗的靶向性问题直接影响其安全性和有效性，现在解决的方法通常是对载体进行靶向性配体修饰。
肿瘤血管保持着一种不断新生的状态，其表面有与增生有关的分子标志，整个瘤体就是一个新生组织，他依赖新血管为其供应养分、维持代谢。整合素alpha(v)beta3、alpha v beta5在肿瘤的脉管系统内皮细胞过表达[ErkkiRuoslahti，Drug targeting to specific vascular sites，DDT Vol.7，No.22 November2002]，与肿瘤部位促血管新生作用有关，在某些肿瘤细胞表面也高表达，国内外许多研究者早就将它作为肿瘤的靶标进行研究。通过噬菌体展示技术人们找到的RGD肽是αv整合素配体的结合域，用含有RGD的肽作为配体修饰载体，可将基因靶向αv整合素表达的部位[Erkki Ruoslahti，Targeting tumorvasculature with homing peptides from phage display，seminars in CANCERBIOLOGY，Vol.10，2000pp.435-442]。例如在表达整合素的Mewo细胞上，用RGDC四肽修饰的PEI载体比没有修饰的PEI载体基因转染率提高1-2个数量级[Klaus Kunath，Thomas Merdanl，Oliver Hegener，Hanns H aberlein，Thomas Kissel，Integrin targeting using RGD-PEI conjugates for in vitro genetransfer，J Gene Med 2003；5588-599]。又如用RGD肽修饰的脂质体在人的支气管上皮细胞株(16HBE)的基因表达率提高10-200倍[Scott ES，Wiseman JW，Evans MJ，Colledge WH.Enhanced gene delivery to human airway epithelial cellsusing an integrin-targeting lipoplex.J Gene Med 2001 Mar-Apr；3(2)125-34]。还有研究发现，PEG化的脂质-鱼精蛋白-DNA复合物(LPD-PEG)使得LPD的基因转染率下降，估计是由于PEG链阻碍了粒子与细胞表面的接触所致，但当用RGD-4C肽(CDCRGDCFCG)修饰LPD-PEG后，对表达整合素受体的肿瘤细胞的结合率上调了5-15倍，转染率在MDA-MB-231细胞提高100倍，而对于整合素αvβ3和αvβ5均低表达的Huh7细胞株则未见转染增强。而且转染增强可被游离的RGD肽阻断[Harvie P，Dutzar B，Galbraith T，Cudmore S，O′Mahony D，Anklesaria P，Paul R.Targeting of lipid-protamine-DNA(LPD)lipopolyplexes using RGD motifs.J Liposome Res.2003Nov；13(3-4)231-47]。肿瘤鼠在体实验也表明合成肽CDCRGDCFC可抑制由整合素alpha v beta 5和alpha v beta3介导的细胞黏附，抑制效果较其只有一条硫化物骨架结构的类似肽至少强20倍，较完全线性的RGD肽抑制效果强近200倍，该合成肽有靶向肿瘤新生血管及肿瘤的作用[Koivunen E，Wang B，Ruoslahti E Phage libraries displaying cyclic peptides with different ring sizesligand specificities of the RGD-directed integrins.Biotechnology(N Y).1995Mar；13(3)265-70]。
在众多血管新生因子中，血管内皮生长因子(VEGF)在肿瘤血管新生中起了至关重要的作用[Napoleone Ferrara.Vascular endothelial growth facor.Trends Cardiovasc Med 1993；3244-50]，VEGF主要由肿瘤细胞表达，与血管新生和肿瘤转移有关[Erika Hatva，Arta Kaipainen，Panu Mentula et al.Expression of endothelial cell specific receptor tyrosine kinases and growthfactors in human brain tumors，American Journal of Pathology.1995；146(2)368-78]，有研究表明，在许多实体瘤中，伴随肿瘤细胞VEGF表达的上调，肿瘤血管内皮细胞中VEGF受体的表达也相应上调[Kunio Suzuki，NorioHayashi，Yasuhide Miyamoto et al.Expression of vascular permeabilityfactor/vascular endothelial growth factor in human hepatocellular carcinoma，Cancer Res 1996；563004-9]，VEGF受体在某些扩散了的癌细胞中有表达[Christine A Boocock，D Stepjen Charnock-Jones，Andrew M Sharkey et al.Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors flt and KDR inovarian carcinoma.J Nat Cancer Inst 1995；87506-16.]。而在正常组织中，血管生成处于静止状态，VEGF受体不表达或极低水平表达[Adrian L Harris，Huatang zhang，Amir Moghaddam et al.Breast cancer angiogenesis-newapproaches to therapy via antigiogenesis，hypoxic activated drugs and vasculartargeting，Breast Cancer Reasearch and Treament.1996；3897-108.]，因此人们可以将VEGF受体作为肿瘤靶点，将治疗基因靶向性传递到肿瘤血管内皮细胞或某些表达VEGF受体的肿瘤细胞，而不影响正常细胞的生长。由上海肿瘤所国家癌基因及相关基因研究室的研究人员李运民等人按照公认的VEGF-VEGF受体的结合域，加之计算机同源模建设计并合成了两条寡肽GV1和GV2。
GV1(CHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSPVPLMRP)GV2(PVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCE)希望可以将基因靶向传递到肿瘤血管内皮细胞。实验中将GV1或GV2与吞噬泡释放剂HA20连接到多聚赖氨酸或鱼精蛋白这些可以通过静电吸附作用结合DNA的阳离子骨架上，用pSV2-galactosidase(半乳糖苷酶)作为报告基因，体外试验证实外源报告基因转染到牛主动脉弓来源的内皮细胞(ABAE)和人恶性黑色素瘤细胞(A375)后有表达，体内试验显示，外源基因在肿瘤血管内皮细胞以及皮下移植肿瘤细胞的裸鼠的肿瘤细胞有表达，移植物包括人结肠癌细胞(LOVO)、人恶性黑色素瘤细胞(A375)和人肝癌细胞。说明靶向VEGF受体的配体短肽GV1、GV2成功地将外源基因复合物靶向传递到肿瘤血管内皮细胞和多种实体瘤细胞并表达。
NG2是可调节的跨膜硫酸软骨素糖蛋白，是鼠人同源的黑色素瘤糖蛋白，也称为高分子量黑色素瘤相关抗原。人类黑色素瘤糖蛋白HMP(humanmelanoma proteoglycan)与之同源。NG2广泛地表达在新生血管的周皮细胞，属于血管基质部分，包括正常发育组织中的新生血管，修复中的粗糙伤口和肿瘤基质中新生血管基质，静止的血管则没有发现。在成年动物，NG2仅局限性地表达在肿瘤细胞和新生肿瘤血管基质部位，而且NG2/HMP广泛的表达在多种不同肿瘤，包括胶质胚细胞瘤、软骨肉瘤、黑色素瘤和某些白血病的细胞上。Michael A等人于1999年通过噬菌体展示技术找到两个有靶向NG2作用的短肽分子，TAASGVRSMH(TAA)和LTLRWVGLMS(LTL)，两肽均能靶向异种移植黑色素瘤小鼠NG2阳性的肿瘤血管基质部位[Michael A.Burg，Renata Pasqualini，Wadih Arap，Erkki Ruoslahti，and William B.Stallcup，NG2 Proteoglycan-binding Peptides Target Tumor Neovasculature，CANCERRESEARCH 59，2869-2874，June 15，1999]。目前人们认为周皮细胞是通过调节内皮细胞的增生、微血管发生以及稳定毛细血管壁来影响血管发生的。我们认为NG2既表达在多种肿瘤细胞又表达在肿瘤血管周皮细胞，而且只有在肿瘤新生血管内皮细胞间隙变大时，周皮细胞才得以暴露，因此NG2的配体短肽可同时靶向肿瘤细胞和肿瘤新生血管基质，且靶向性较靶向新生血管内皮的配体来说更为特异。
EGFR是具有内源洛氨酸激酶活性的受体超家族的成员之一，它广泛的分布在许多细胞类型，包括表皮和间叶来源的细胞，在某些肿瘤细胞过表达。EGFR的激活可增加细胞增殖能力，和运动能力。HA20(GLFEAIAEFIEGGWEGLEG)是一段与流感病毒衣壳蛋白血凝素区N-端同源的两性肽，被合成作为吞噬泡释放寡肽endosome-releasing oligopeptide(EROP)，它对靶向和穿膜过程没有意义，其作用在于对通过形成吞噬小体进入细胞的外源物质进行及时地释放，避免被逐渐形成的溶酶体所降解，起到保护外源基因的作用[Masayuki Murata，Satoshi Kagiwada，Sho Takahashi et al.Membrane Fusion induced by mutual interaction of the two charge-reversedamphiphilic peptides at neutral pH.J Biol Chem 1991；266(22)14353-8.]。刘翔等人通过计算机软件设计了靶向到EGFR的EGF结合域短肽GE7(NPVVGYIGERPQYRDL)，通过化学方法用两肽GE7和HA20分别修饰多聚赖氨酸，然后将修饰过的多聚赖氨酸作为骨架与一定量的DNA混合，通过静电吸附作用形成复合物GE7-PLL/DNA/HA20-PLL，DNA为质粒p21WAF-1/pGM-CSF，建立鼠的肝细胞瘤移植模型，复合物于瘤周注射给药每周一次，持续一个月，实验证实三部分联合比两部分效果好[Xiang Liu，Jianren Gu，Enhanced antitumor effect of EGF R-targeted p21WAF-1 andGM-CSF gene transfer in the established murine hepatoma by peritumoralinjection，Cancer Gene Therapy(2002)9，100-108]。
穿膜肽(cell-penetrating peptides)是近年来研究发现的一些富含碱性氨基酸残基并参与核转运及细胞粘附的短肽，可以通过一种无耗能、无受体介导的方式穿过真核细胞的质膜。有十多种来源于Tat的短肽显示出可穿过不同细胞质膜的功能，并且内在化过程仅在数分钟内完成，温度降低至4℃时，该过程无明显变化[王莉，穿膜肽研究展望，免疫学杂志，第17卷，第3期2001年6月]。以下是几种已经证实了的穿膜肽序列Tat fragment(48-60)GRKKRRQRRRPPQTat fragment(49-57)RKKRRQRRR(Tat肽中具穿膜效应的最短片断)Signal-sequence-basedpeptides IGALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKVSignal-sequence-based peptides IIAAVALLPAVLLALLAP来源于鱼精蛋白的鱼精蛋白简短型，是一段含有28个氨基酸的小肽，它富含正电荷，可与质粒DNA高亲和力结合[Li S，et al Characterization ofcationic lipid-protamine-DNA(LPD)complexes for intravenous gene deliveryGene Ther. 1998；5(7)930-7.]，因此可作为基因的载体骨架成分。糖基化磷脂酰肌醇(GPI)，是对蛋白质进行翻译后修饰的一种脂性结构，蛋白质可通过GPI结构锚定于细胞膜表面，而不跨越其磷脂膜双层结构[Cimino AM，et alCancer vaccine developmentprotein transfer of membrane-anchored cytokinesand immunostimulatory molecules.Immunol Res.2004；29(1-3)231-40]。我们设想将肿瘤靶向复合靶向分子的基因与鱼精蛋白简短型的基因融合，然后通过GPI结构将融合基因锚锭表达在细胞膜上，破碎细胞，分离得到细胞膜，由于细胞膜本身含有丰富的磷脂和胆固醇等脂性材料，在一定的缓冲条件下能够自组装形成脂质颗粒[Westerman LE，Jensen PE.Liposomes composed ofreconstituted membranes for induction of tumor-specific immunity.MethodsEnzymol.2003；373118-27]，因此该细胞膜来源的脂质颗粒同时具有肿瘤细胞内靶向性、与质粒DNA静电吸附性以及脂质自身重组性，是一种具有肿瘤靶向性的非病毒基因细胞内传递载体。
发明内容
本发明的目的是设计并合成一种新型的具有肿瘤靶向性的非病毒基因载体，在肿瘤靶向性方面，本发明提出将多个具有肿瘤局部靶向性的短肽序列，以及穿膜肽和吞噬泡释放剂的基因序列融合到一起，形成一个复合靶向分子，通过计算机辅助设计各短肽柔性连接臂，使复合靶向融合肽中各短肽构象不变，从而保证了复合靶向分子中各短肽的功能。希望在增加肿瘤靶向的适用范围的同时，通过增加外源基因向靶细胞内传递，避免其降解，提高外源基因向肿瘤局部细胞内传递的效果。
本发明所说的多个具有肿瘤局部靶向性的短肽序列，包括所有靶向到肿瘤内皮和肿瘤细胞表面某些整合素的含RGD的配体短肽、靶向到肿瘤细胞和新生血管内皮细胞VEGF受体的配体短肽、靶向到新生血管的周皮细胞表面NG2的短肽和靶向到多种肿瘤细胞EGF受体的配体短肽。
本发明所说的穿膜肽包括具有穿膜作用的所有适合本系统的短肽序列。
本发明所说的吞噬泡释放剂包括具有吞噬泡释放作用的所有适合本系统的短肽序列。
本发明将上述复合靶向分子的基因与鱼精蛋白简短型的基因融合，然后通过GPI结构将融合基因锚锭表达在真核细胞膜上，通过一定工艺获取细胞膜，在一定条件下该膜自行组装成脂质颗粒。该细胞膜来源的脂质颗粒同时具有肿瘤细胞内靶向性、与质粒DNA静电吸附性以及脂质自身重组性，是一种具有肿瘤靶向性的非病毒基因细胞内传递载体。
本发明所说的鱼精蛋白简短型基因包括所有由鱼精蛋白分子衍生出来的带正电性可以与核酸静电结合的短肽序列。
本发明所说的一定工艺分离提取细胞膜包括所有适用的实验室分离提取细胞膜的方法。
本发明作为基因传递的载体将靶向性、正电性和脂质形式巧妙融为一体，拥有良好的基因传递载体的功能。其中靶向性又集靶向肿瘤新生血管和多种肿瘤细胞于一身，同时通过穿膜肽、吞噬泡释放剂使该载体具有增加外源基因向肿瘤细胞内转运，避免外源基因在溶酶体中被降解的作用。同时，本发明在工艺上巧妙避开了常规生物技术药物所不可避免的蛋白质纯化等复杂昂贵的工艺，有利于进行产业化开发和应用。
图1为单独L1的立体结构图2为单独L2的立体结构图3为单独L3的立体结构图4为单独L4的立体结构图5为单独P的立体结构图6为单独R的立体结构图7为模拟融合分子的立体结构图8为P6的合成鉴定1.P1 2.P2 3.P3 4.P45.P5 6.P6 7.DL2000图9为pCI-P6-pr+-GPI双酶切鉴定1.DL2000 2.pCI-P6-pr+-GPI双酶切 3.pCI-P6-pr+-GPI具体实施方式
本发明提出的肿瘤靶向性基因传递非病毒载体的构建与制备实施方式如下首先，通过计算机辅助设计柔性短肽连接臂，将多个具有肿瘤局部靶向性的短肽序列，以及穿膜肽和吞噬泡释放剂的基因序列融合到一起，形成一个复合靶向分子，并保证各个短肽在复合靶向融合肽中的构象与其天然构象一致。
然后，将上述复合靶向分子的基因与鱼精蛋白简短型的基因融合，利用锚锭蛋白GPI将融合基因锚锭表达在真核细胞膜上，通过一定工艺获取细胞膜，在一定条件下该膜自行组装成脂质颗粒。
本发明更详细的实施方法可参见实施例，本实施例是用于解释、而不是以任何方式限制本发明。
实施例一、计算机辅助设计各配体短肽连接臂通过计算机辅助设计短肽连接臂，使各配体短肽的构象在融合肽中保持不变，从而保证其功能。
复合靶向分子P65’-XhoI-靶向整合素的配体短肽基因(L1)-靶向VEGF受体的配体短肽基因(L2)-靶向NG2的配体短肽基因(L3)-靶向EGF受体的配体短肽基因(L4)-穿膜肽Tat(48-60)的基因(P)-吞噬泡释放剂(HA20)的基因(R)-EcoRV-3’L1CDCRGDCFCL2PVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCEL3TAASGVRSMHL4NPVVGYIGERPQYRDLPGRKKRRQRRRPPQRGLFEAIAEFIEGGWEGLEGL1---GGGGS---L2---GGGSAAA---L3---GSPT---L4---GGGSA---P---GGGSGA---R从图7可以看出通过计算机辅助设计出来的这五条连接臂，可以达到使六条短肽保持其原有构象的目的。融合分子的空间构象舒展，六条短肽的立体结构得到充分展现。
实施例2全合成复合靶向分子P62.1用哺乳动物偏爱密码子将多肽序列翻译成基因序列Code and PeptideC D C R G D C F C G G G G S P V P T E E STGC GAC TGT CGC GGC GAC TGT TTC TGC GGC GGA GGC GGG AGC CCT GTG CCC ACC GAG GAA TCC
N I T M Q I M R I K P H Q G Q H I G E M SAAC ATC ACC ATG CAG ATC ATG AGG ATC AAG CCC CAC CAG GGC CAG CAC ATT GGC GAG ATG AGCF L Q H N K C E G G G S A A A T A A S G VTTC CTG CAG CAC AAC AAG TGC GAG GGC GGG GGA TCC GCT GCC GCA ACA GCC GCT AGC GGC GTGR S M H G S P T N P V V G Y I G E R P Q YCGC TCC ATG CAC GGC AGC CCA ACA AAC CCC GTC GTG GGC TAC ATC GGC GAG CGG CCC CAG TACR D L G G G S A G R K K R R Q R R R P P QAGG GAC CTG GGG GGC GGA TCC GCT GGC CGC AAG AAA CGC AGG CAG AGG CGG CGC CCA CCT CAGG G G S G A G L F E A I A E F I E G G W EGGA GGC GGC AGC GGC GCT GGC CTG TTC GAG GCC ATC GCC GAG TTC ATT GAG GGA GGG TGG GAGG L E GGGC CTG GAG GGCP6的基因序列TGC GAC TGT CGC GGC GAC TGT TTC TGC GGC GGA GGC GGG AGC CCT GTG CCCACC GAG GAA TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATC ATG AGG ATC AAG CCC CAC CAGGGC CAG CAC ATT GGC GAG ATG AGC TTC CTG CAG CAC AAC AAG TGC GAG GGCGGG GGA TCC GCT GCC GCA ACA GCC GCT AGC GGC GTG CGC TCC ATG CAC GGCAGC CCA ACA AAC CCC GTC GTG GGC TAC ATC GGC GAG CGG CCC CAG TAC AGGGAC CTG GGG GGC GGA TCC GCT GGC CGC AAG AAA CGC AGG CAG AGG CGGCGC CCA CCT CAG GGA GGC GGC AGC GGC GCT GGC CTG TTC GAG GCC ATC GCCGAG TTC ATT GAG GGA GGG TGG GAG GGC CTG GAG GGC2.2用中心模办法设计12条引物，请博亚公司合成。
(1)GGAGGTTCTGCTGCCGCAACAGCAGCTTCTGGAGTCAGGAGTATGCACG(2)CCAATATATCCGACAACGGGGTTGGTAGGGCTCCCGTGCATACTCCTGA(3)GATGTCATTCCTGCAGCACAACAAGTGCGAGGGAGGAGGTTCTGCTGCC(4)TCCGCCACCGAGGTCCCTGTACTGCGGCCTCTCTCCAATATATCCGACA(5)GCATCAAGCCCCATCAAGGACAGCACATTGGCGAGATGTCATTCCTGCA(6)GTCTCCTTTGCCTTCTTTTCTTACGCCCGGCAGATCCGCCACCGAGGTC(7)ACCGAAGAGTCAAACATCACCATGCAGATCATGCGCATCAAGCCCCATC(8)AGTCCAGCACCACTACCTCCGCCTTGAGGTGGTCGTCTCCTTTGCCTTC(9)TTGCTTCTGTGGTGGCGGTGGGTCTCCAGTGCCTACCGAAGAGTCAAAC(10)GCCTCCCTCAATAAACTCGGCAATGGCTTCGAACAGTCCAGCACCACTA(11)GCCTCGAGTGCGACTGTAGAGGAGATTGCTTCTGTGGTGG(12)GCGATATCGCCCTCCAACCCTTCCCAGCCTCCCTCAATAA
2.3通过六轮重叠延伸PCR获得P6基因，克隆到pMD 18-T载体测序正确。
2.3.1合成P6基因在GeneAmp PCR System 2400型PCR以上进行如下反应第一轮PCR合成P1反应体系50μl10×PCR buffer(without MgCL2)5μl，MgCL2(25mmol/L)5μl，dNTPs(10mmol/L)4μl，引物(1)(20μmol/L)1μl，引物(2)(20μmol/L)1μl，Taq DNA Polymerase(2.5U/μl)1μl，灭菌蒸馏水33μl(Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTPs均购自于Tacara生物技术有限公司)。
反应条件95℃1分钟(95℃1分钟，56℃1分钟，72℃30秒)循环5次，72℃5分钟，4℃∞第二轮PCR合成P2反应体系50μl10×PCR buffer(without MgCL2)5μl，MgCL2(25mmol/L)5μl，dNTPs(10mmol/L)4μl，引物(3)(20μmol/L)1μl，引物(4)(20μmol/L)1μl，Taq DNA Polymerase(2.5U/μl)1μl，模板(P1稀释10倍)1μl，灭菌蒸馏水32μl反应条件95℃1分钟(95℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟)循环32次，72℃10分钟，4℃∞第三轮至第六轮PCR反应分别合成P3、P4、P5、P6反应体系除了引物分别改用(5，6)(7，8)(9，10)(11，12)以外，其他与第二轮相同。
反应条件与第二轮相同。
产物鉴定
见图82.3.2纯化P6取5μl P6跑1.2％琼脂糖凝胶电泳作分子量鉴定，之后将全部剩余P6跑1.2％琼脂糖凝胶制备电泳，切胶，用博大泰克公司的PCR产物胶回收试剂盒，回收P6。步骤紫外灯下切下P6亮带，放入1.5ml离心管，加入溶胶液700μl/100μg胶，12000rpm离心30s，重复离心一次，加入500μl washing buffer，12000rpm离心30s，重复空离心一次，加入35μl灭菌蒸馏水，37℃放置5分钟，12000rpm离心，既得纯化后的P6溶液。
2.3.3插入连接pMD 18-T载体取灭菌PCR管加入Ligation Solution I 5μl，灭菌双蒸水3μl，纯化后的P61μl，pMD 18-T载体1μl，放16℃过夜。
2.3.4转化无菌取100μl感受态细胞(DH5α菌株按《分子克隆》—科学出版社，第二版的CaCl2方法制备)，至于冰浴中，加入连接产物10μl，轻轻旋转以混匀内容物，在冰浴中放置30分钟，立即转移到42℃水浴中静置2分钟，然后每管加入0.5ml不加抗生素的LB培养基，37℃水浴15分钟后，37℃摇床轻摇45分钟；取200μl转化菌体，均匀涂布于含有100mg/ml氨苄的琼脂平板培养基上，在超净工作台吹干约10分钟，37℃倒置培养过夜。从平板中挑取菌落约10个，分别接种于含100mg/ml氨苄LB培养基中(5ml/管)，37℃摇床培养过夜。
2.3.5菌落PCR初步鉴定P6取0.5μl过夜培养菌10倍稀释液用PCR法进行初步鉴定，引物选用P6两端序列1.1和1.2。用PCR仪进行PCR扩增，扩增体系为10×PCR Buffer(without MgCL2)2.5μl，MgCL2(25mmol/L)2.5μl，1.1、1.2(均为20μmol/L)各0.5μl，dNTPs(2.5mM)2μl，Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl，加水至25μl。(Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTPs均购自于Tacara生物技术有限公司)。扩增条件95℃1分钟(95℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟)循环30次，72℃10分钟，4℃∞2.3.6挑两个菌测序挑取2号和6号菌去三博公司测序，结果两者均含有正确的复合靶向分子的基因。
2.3.7用碱变性法提取测序正确的质粒pMD 18-T-P6按照博大泰克公司质粒快速提取试剂盒的说明操作(1)收集菌液于1.5ml灭菌Eppendorf管中，12000rpm离心，去掉上清；(2)加入150μl溶液I，振荡至彻底悬浮；(3)加入150μl溶液II，立即轻柔颠倒数次，使菌体裂解，室温放置1-2分钟；(4)加入300μl溶液III，立即轻柔颠倒数次，室温放置5分钟，12000rpm离心12分钟；(5)向离心吸附柱中预先加入400μl结合缓冲液，然后加入上步离心的上清，混匀，12000rpm离心30秒，废液弃去；(6)加入750μl离心漂洗液于离心吸附柱中，12000rpm离心30秒，废液弃去；(7)重复一次第6步，然后空离心2分钟，彻底去除漂洗液；(8)小心取出离心吸附柱，将其放入备好的1.5ml灭菌Eppendorf管中，加入35μl灭菌蒸馏水，37℃放置2-5分钟，12000rpm离心30秒，取掉吸附柱，获取的质粒溶液于-20℃保存。
实施例3构建肿瘤靶向性真核细胞锚锭表达载体pCI-P6-pr+-GPI我室在pCI-neo真核表达载体基础上构建了pCI-pr+-GPI通用载体，是在真核表达质粒pCI-neo原多克隆位点NheI和XhoI之间插入信号肽(sig)序列，在EcoRV和EcoRI之间插入5’-GGGSSGGG-鱼精蛋白简短型-3’的基因序列，在EcoRI和XbaI之间插入5’-IgGFc-GPI-3’锚锭蛋白及相关基因序列。因此，只要在XhoI和EcoRV之间插入复合靶向分子P6的基因序列，就可以获得肿瘤靶向性真核细胞锚锭表达载体pCI-P6-pr+-GPI。
双酶切上述用碱变性法提取的质粒pMD 18-T-P6和我室构建的pCI-pr+-GPI通用载体质粒，分别用XhoI和EcoRV双酶切。酶切体系5μl的10×NEBbuffer3，10u/μl的XhoI 2μl，10u/μl的EcoRV 2μl，100×BSA0.5μl，质粒30μl，加水至总体积50μl，37℃水浴8小时。酶切后产物割胶回收目的片段，具体方法同上参见2.3.2醇化P6一项。
插入连接取灭菌PCR管加入双酶切纯化后的质粒pCI-pr+-GPI片段和P6基因片段各1μl，10×T4DNA连接缓冲液1μl，T4DNA连接酶(12u/μl)1μl，加灭菌双蒸水至10μl，16℃过夜。
转化具体步骤同上参见2.3.4转化鉴定具体步骤同上参见2.3.5菌落PCR，和2.3.6双酶切鉴定用上述碱变性法提取的质粒pCI-P6-pr+-GPI，用XhoI和EcoRV双酶切。酶切体系2μl的10×NEBbuffer3，20u/μI的XhoI 1μl，20u/μl的EcoRV 1μl，10×BSA 2μI，质粒14μl，总体积20μl，37℃水浴6小时。产物取15μl进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图9所示。
基因测序鉴定基因测序证明有正确的P6基因插入pCI-pr+-GPI通用载体中，至此，获得了正确的pCI-P6-pr+-GPI。用promega公司的质粒提取试剂盒WizardPureFection Plasmid DNA Purification System提取转染级质粒pCI-P6-pr+-GPI。
实施例4获得稳定表达靶向复合分子的肿瘤细胞株
Renca细胞为Balb/c小鼠来源的肾癌细胞系。用上述载体pCI-P6-pr+-GPI转染肿瘤细胞，筛选获得稳定表达靶向复合分子的肿瘤细胞株。Renca细胞转染前传代，接种于六孔板上，使次日细胞能铺满孔底面地80％，转染步骤按Invitrogen公司的Lipofectamine2000Reagent说明书进行。分别取1μg质粒，用无双抗DMEM培养基稀释到250μl，为A液；另取7μl Lipofectamine2000用无双抗DMEM培养基稀释到250μl，为B液，将B液室温放置5分钟后，立即将A液B液轻轻混匀，为C液，室温放置20分钟。取出六孔板用新鲜培养基洗一次后，每孔加入2.5ml新鲜培养基。将C液分别加入到各孔中，混匀，置CO2培养箱培养。转染48小时后，至细胞密度达到50-70％融合时，弃培养液，换用含有G-418(400μg/ml)培养基进行抗性筛选，同时用未转染的细胞作对照。当对照细胞几乎全部死亡时，G-418的浓度降至200μg/ml以维持筛选作用。待2wk左右出现阳性细胞克隆时，扩大培养进行后续实验。
收集pCI-P6-pr+-GPI和空载体pCI-neo转染的Renca细胞，用4oC预冷的PBS(含20ml/L小牛血清)洗涤3次，加入荧光标记的鼠抗人IgG(1∶1000稀释)，于冰浴中震荡孵育45min，再用PBS洗3次。加5g/L多聚甲醛固定后，于荧光显微镜下观察并照相，结果证明转染成功P6-pr+p被GPI很好地展示在宿主细胞膜上。
实施例5细胞膜成分的提取和复合膜脂颗粒的形成收集复合靶向分子修饰的Renca细胞共108个，用含有蛋白酶抑制剂的低渗buffer(25mmol/L Tris-HCl.PH7.4)裂解细胞，用27号针头(4.5号)抽吸3次以上，混匀2,300rpm(2,000g)离心10min，取上清(含有膜成分)。25,400rpm(22,000g)离心30min，取沉淀。
用溶液I(0.15mol/LNaCl，10mmol/L Tris，pH8.0)洗两次，用溶液II(0.14mol/L NaCl，25mmol/L Tris-HCl，pH7.4，其中含有2％1-S-OctylBeta-D-thioglucopyranoside)溶解，达到浓度相当108个/mL，4℃震荡30min。离心取上清，用透析液(0.14mol/L NaCl，25mmol/L Tris-HCl，pH7.4)透吸过夜，更换三次透析液，收集形成的膜脂颗粒，即为肿瘤靶向性基因传递非病毒载体，可以通过复合物中的阳离子肽结合核酸成分，进行肿瘤靶向基因治疗生物技术药物的研发。
权利要求
1.一种用于肿瘤靶向性基因传递的非病毒载体，其特征在于由肿瘤靶向复合体和细胞膜嵌和膜脂共同形成的膜脂颗粒，可作为肿瘤靶向基因治疗的载体。
2.按照权利要求1肿瘤靶向复合体是指将肿瘤靶向性短肽、穿膜肽、吞噬泡释放剂、阳离子蛋白依次连接得到的复合物，通过GPI结构嵌和到细胞膜上。
3.按照权利要求2依次连接靶向性短肽、穿膜肽、吞噬泡释放剂、阳离子蛋白得到的复合物是通过计算机辅助设计每一个连接臂，使得每一成分在复合物中的空间立体构象和本身构象一致，从而保证其功能。
4.按照权利要求2在肿瘤靶向复合体中起靶向到肿瘤局部和肿瘤细胞作用的短肽包括靶向到某些整合素的含RGD的配体短肽、靶向到肿瘤细胞和新生血管内皮细胞VEGF受体的配体短肽、靶向到新生血管的周皮细胞表面NG2的短肽和靶向到多种肿瘤细胞EGF受体的配体短肽。
5.按照权利要求2在肿瘤靶向复合体中起穿膜肽作用的包括多种具有无需耗能无需受体分子介导就可将多肽、蛋白质分子、DNA片断导入多种哺乳动物细胞功能的多肽。
6.按照权利要求2在肿瘤靶向复合体中起吞噬泡释放剂作用的包括多种具有将进入细胞吞噬小体的DNA片断释放出来，进入细胞浆，避免溶酶体的降解作用的多肽。
7.按照权利要求2在肿瘤靶向复合体中的阳离子蛋白包括多种带有正电，可以通过静电作用结合质粒的阳离子多肽。
8.按照权利要求1肿瘤靶向性基因传递非病毒载体的制备方法，其特征在于1)通过计算机辅助设计，依次连接靶向性短肽、穿膜肽、吞噬泡释放剂、阳离子蛋白，获得肿瘤靶向复合体P6，并将蛋白分子序列转换为基因序列。2)通过全基因合成的方法，获得完整的肿瘤靶向复合体基因。3)将肿瘤靶向复合体基因插入到pCI-pr+-GPI载体中，构建锚定真核表达载体pCI-P6-pr+-GPI。4)转染相应的肿瘤细胞株，并鉴定肿瘤靶向复合体分子的细胞膜表面的锚定表达情况。5)收获上述细胞，将细胞膜裂解，在一定的缓冲条件下通过脂质的重组性自组装形成膜脂颗粒。该膜脂颗粒同时具有肿瘤靶向性与核酸结合性，是新型的肿瘤靶向性非病毒基因传递载体。
全文摘要
本发明属于分子生物学肿瘤基因治疗用载体领域，涉及一种供外源基因靶向性导入肿瘤局部的非病毒载体的构建与制备，该载体的特征在于同时具有多种肿瘤局部靶向性、核酸结合性和脂质自发重组性。通过构建真核细胞锚定表达载体，将靶向肽、阳离子肽等多种成分锚定表达在肿瘤细胞表面，裂解并提取细胞膜，获得具有核酸结合性和脂质自发重组性的非病毒基因靶向传递载体。本发明的特点在于，该载体除了具有通过肿瘤新生血管和多种肿瘤细胞靶向性配体将外源基因靶向到肿瘤局部组织的作用，同时通过穿膜肽、吞噬泡释放剂使该载体具有增加外源基因向肿瘤细胞内转运和避免降解的作用。
文档编号A61P35/00GK1927402SQ200510095888
公开日2007年3月14日 申请日期2005年9月7日 优先权日2005年9月7日
发明者于继云, 黄悦, 刘荷中, 阎瑾琦, 修冰水, 陈兴, 宋晓国, 刘颖 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所