[3.2.0]杂环化合物及其类似物的应用方法

专利名称：[3.2.0]杂环化合物及其类似物的应用方法
相关专利信息
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2004年12月3日提交的第60/633,379号、2005年1月13日提交的第60/643,922号、2005年3月4日提交的第60/658,884号和2005年4月29日提交的第60/676,553号美国临时申请的优先权；上述每一临时申请的名称均为“[3.2.0]杂环化合物及其类似物的应用方法”；在此将每个申请的全部内容通过参考的方式引入。
发明领域 本发明涉及某些化合物及其制备方法和在化学和医药领域内的应用。本文所公开的本发明的实施方案涉及应用杂环化合物的方法。在一些实施方案中，所述化合物用作蛋白酶体(proteasome)抑制剂。在其它实施方案中，所述的化合物用于治疗炎症、癌症和感染性疾病。
相关技术说明 在美国，癌症是引起死亡的主要原因。尽管在发现治疗癌症的新方法方面已有了显著成就，但是主要的治疗选择仍然是外科手术、化学疗法和放射疗法，这三种治疗方法可单独使用或者联合应用。但是，外科手术和放射疗法通常仅对相当有限类型的癌症有用，而在治疗癌症已扩散的患者方面它们具有局限性。化学疗法普遍用于治疗转移癌或者诸如白血病的弥散性癌症的患者。尽管化学疗法有治疗价值，但是由于患者的癌细胞变得对化学治疗剂有耐药性，因此它经常不能治愈疾病。一部分原因可能是癌细胞变得对化学治疗剂有耐药性，这类治疗剂通常联合应用来治疗患者。
类似地，例如由细菌、真菌和原生动物引起的感染性疾病也日益变得难于治疗和治愈。比如越来越多的细菌、真菌和原生动物对当前的抗生素和化学治疗药物逐步产生耐药性。这类微生物包括杆菌(Bacillus)、利什曼原虫(Leishmania)、疟原虫(Plasmadium)和锥虫(Trypanosoma)。
此外，越来越多的疾病和医学状况划分为炎症性疾病。这类疾病包括诸如哮喘的疾病状态到心血管疾病。尽管有新的疗法和医学技术进步，但是这类疾病仍然在世界范围内影响着越来越多的人。
因此，存在对于新的化学疗法、抗菌剂以及抗炎药剂的需求，以治疗癌症、炎症性疾病以及感染性疾病。为此，不同的研究者、学院和公司在进行着持续不断的努力，以试图鉴别新的、可能有效的化疗和抗菌药剂。
海洋天然产物是新的潜在抗癌药剂和抗菌药剂的丰富来源。海洋是一个巨大复合体系，多种多样的出现在压力、盐分以及温度的极端条件环境中的微生物生活于其中。海洋微生物因此进化发展出了新陈代谢上的以及生理学上的独特特性，这些特性不仅使它们能在极端且多变的环境中生存，而且能够使它们产生出特别的代谢产物，这些代谢产物是从陆生微生物的代谢产物中观察不到的(Okami，Y.1993 JMar Biotechnol 159)。这类代谢产物的代表性结构类型包括萜、肽、多聚乙酰和混合生物合成来源的化合物。这些分子中的许多都显示出抗肿瘤、抗细菌、抗真菌、抗炎或者免疫抑制的活性(Bull，A.T.et al.2000 Microbiol Mol Biol Rev 64573；Cragg，G.M.& D.J.Newman2002 Trends Pharmacol Sci 23404；Kerr，R.G.& S.S.Kerr 1999 ExpOpin Ther Patents 91207；Moore，B.S 1999 Nat Prod Rep 16653；Faulkner，D.J.2001 Nat Prod Rep 181；Mayer，A.M.& V.K.Lehmann2001 Anticancer Res 212489)，这证明了利用这种资源(海洋天然产物资源)的实用性可以从中分离出价值无法衡量的疾病治疗药物。此外，与目前市场上销售的药物的作用机理不同的新的抗癌以及抗菌药剂的分离有助于解决耐药性的问题，其中包括对那些基于药物作用机理的耐药性，此类耐药性已经被工程化为用于生物恐怖用途的病原体。
发明概述 本文公开的实施方案通常涉及化合物，包括杂环化合物及其类似物。一些实施方案涉及化合物作为蛋白酶体抑制剂的用途。
在其它实施方案中，所述的化合物用于治疗肿瘤性疾病，例如，抑制肿瘤、癌和其它肿瘤性组织的生长。本文公开的治疗方法可用于治疗被怀疑有肿瘤生长物、癌或者良性或恶性的肿瘤性生长物的任何患者(本文所使用的“肿瘤”或“多种肿瘤”包括肿瘤，癌，扩散的肿瘤性细胞和局限的肿瘤性生长)。这类生长物的例子包括但并不局限于乳腺癌；骨肉瘤，血管肉瘤，纤维肉瘤和其它的肉瘤；白血病；静脉窦瘤；卵巢癌，输尿管癌，膀胱癌，前列腺癌和其它生殖泌尿系统的癌症；结肠癌，食道癌和胃癌以及其它胃肠道癌症；肺癌；淋巴瘤；骨髓瘤；胰腺癌；肝癌；肾癌；内分泌癌；皮肤癌；黑素瘤；血管瘤；以及脑或中枢神经系统(CNS)的癌症。一般而言，欲治疗的所述肿瘤或生长物可以是任何肿瘤或者癌症，原发的或者继发的。某些实施方案涉及治疗动物体内肿瘤性疾病的方法。这些方法可包括，例如，将有效量的化合物对需要该治疗的患者给药。其它实施方案涉及了所述化合物在制备用于治疗肿瘤性疾病的药物或药剂中的用途。
所述化合物可与诸如化学疗法、放射疗法和生物疗法的治疗联合给药或应用。在一些实施方案中，所述化合物可与化学治疗剂共同给药或使用。这类化学疗法的例子包括生物碱、烷化剂、抗生素、抗代谢物、酶、激素、铂化合物、免疫疗法(抗体、T-细胞、表位)、BRMs等等。例子包括长春新碱、长春碱、长春地辛、太平洋紫杉醇(紫杉醇)、多西紫杉醇、拓扑异构酶抑制剂鬼臼乙叉甙(依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷(VM-26))、喜树碱、氮芥(环磷酰胺)、亚硝基脲、卡莫司汀、洛莫司汀、达卡巴嗪、羟甲基三聚氰胺、塞替派和丝裂霉素C、更生霉素(放线菌素D)、蒽环类抗生素(柔红霉素、道诺霉素、红比霉素)、多柔比星(阿霉素)、伊达比星(去甲氧基柔红霉素)、蒽醌类(anthracenedione)(米托蒽醌)、博来霉素(硫酸博来霉素)、普卡霉素(光辉霉素、抗叶酸剂(甲氨喋呤(Folex，Mexate))、嘌呤抗代谢物(6-巯基嘌呤(6-MP，巯基嘌呤)和6-硫代鸟嘌呤(6-TG)。在该种类中两种主要的抗癌药物是6-巯基嘌呤和6-硫代鸟嘌呤、氯去氧腺苷和喷司他丁、喷司他丁(2’-脱氧助间型霉素)、嘧啶拮抗剂、氟嘧啶(5-氟尿嘧啶(Adrucil)、5-氟脱氧尿苷(FdUrd)(氟尿苷))、阿糖胞苷(Cytosar，ara-C)、氟达拉滨、L-门冬酰胺酶、羟基脲、糖皮质激素类、雌激素拮抗剂、他莫昔芬、非类固醇类抗雄激素物质、氟他胺、芳香酶抑制剂阿那曲唑(瑞宁得(Arirnidex))、顺铂、6-巯嘌呤和硫代鸟嘌呤、甲氨喋呤、环磷酰胺、阿糖胞苷、L-门冬酰胺酶、类固醇泼尼松和地塞米松。例如诸如硼替佐米(Bortezomib)的蛋白酶体抑制剂也可与本发明所述化合物联合应用。生物学的例子可包括诸如针对TRAIL的TRAIL抗体的试剂、诸如α-V-β-3(αVβ3)的整联蛋白和/或涉及血管生成的其它细胞因子/生长因子，VEGF、EGF、FGF和PDGF。在一些方面，所述化合物可与抗体偶联或一同输送。上述联合方法可用于治疗多种疾病状态，包括癌症和肿瘤性疾病、炎症和微生物感染。
在其它实施方案中，所述化合物用于治疗炎症性疾病状态。某些实施方案涉及治疗动物体内炎症性疾病状态的方法，这些方法包括，例如，将有效量的化合物对需要所述治疗的患者给药。其它实施方案涉及了化合物在制备用于治疗炎症的药物或药剂中的用途。
在某些实施方案中，所述化合物可用于治疗感染性疾病。感染性病原体可以是微生物，例如、细菌、真菌、原生动物及显微镜下可见的藻类或病毒。而且，所述的感染性病原体也可以是B.anthracis(炭疽)。在一些实施方案中，所述的感染性病原体是寄生虫。例如，所述的感染性病原体可以是疟原虫、利什曼原虫和锥虫。某些实施方案涉及治疗动物体内感染性病原体的方法。这些方法包括，例如，将有效量的化合物对需要所述治疗的患者给药。其它实施方案涉及了化合物在制备用于治疗感染性病原体的药物或药剂中的用途。
一些实施方案涉及了具有通式I的结构的化合物、其药物可接受的盐类及其酯类前药在癌症、炎症和感染性疾病治疗中的应用
通式I 其中虚线表示单键或双键，且其中R1可独立地选自氢、卤素以及以下残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯和包括多卤代烷基在内的卤代烷基。其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1可以相同或不同； 其中R2可选自氢、卤素以及下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基(包括，例如，环己基甲醇)、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基； 其中R3可选自卤素和下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基，氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；其中每一E1、E2、E3和E4可为取代或未取代的杂原子。
在一些实施方案中，优选R1为取代或未取代的C1-C5烷基。例如，优选甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和戊基。在一些实施方案中，R1不是取代或未取代的。直链的C6烷基。
其它实施方案涉及治疗动物体内肿瘤性疾病的方法，这些方法可包括，例如，将治疗有效剂量的选自通式I-VI的通式化合物及其药物可接受的盐类和酯类前药对患者给药。
另外的实施方案涉及包含选自通式I-V的通式化合物的药物组合物。所述药物组合物还可包含抗微生物剂。
其它实施方案还涉及抑制癌细胞生长的方法，该方法可包括，例如，使癌细胞与选自通式I-VI的通式化合物及其药物可接受的盐类和酯类前药接触。
其它实施方案涉及抑制蛋白酶体活性的方法，该方法包括使细胞与选自通式I-VI的通式化合物及其药物可接受的盐类和酯类前药接触。
其它实施方案涉及抑制核因子-κB(NF-κB)活化的方法，该方法包括使细胞与选自通式I-VI的通式化合物及其药物可接受的盐类和酯类前药接触。
一些实施方案涉及治疗炎症性疾病状态的方法，包括将有效量的选自通式I-V的通式化合物对需要所述治疗的患者给药。
其它的实施方案涉及治疗由微生物引起的疾病的方法，包括将有效量的选自通式I-V的通式化合物对需要所述治疗的患者给药。
附图简要说明 在此引入并作为说明书一部分的附图仅仅示例性说明本发明的某些优选实施方案。与说明书的其它部分一起，它们都用于向本领域技术人员解释制备本发明中某些化合物的优选方式。在附图中

图1显示Salinosporamide A的化学结构。
图2显示Salinospora的泛热带分布。“X″表示Salinospora的采集位置。
图3显示Salinospora的菌落。
图4显示Salinospora的典型的16S rDNA序列。竖条表示Salinospora的特征标记核苷酸，这种特征标记核苷酸将Salinospora与其最近的相关物种中区分。
图5显示Omuralide，一种微生物的代谢产物-乳胞素的降解产物。图5还显示用式II-16化合物，也称为Salinosporamide A。
图6显示致命性的毒素介导的巨噬细胞的细胞毒性。NPI-0052表示式II-16的化合物。
图7描述了具有结构式II-20的化合物的1H NMR图谱。
图8描述了具有结构式II-24C的化合物的1H NMR图谱。
图9描述了具有结构式II-19的化合物的1H NMR图谱。
图10描述了具有结构式II-2的化合物的1H NMR图谱。
图11描述了具有结构式II-2的化合物的质谱。
图12描述了具有结构式II-3的化合物的1H NMR图谱。
图13描述了具有结构式II-3的化合物的质谱。
图14描述了具有结构式II-4的化合物的1H NMR图谱。
图15描述了具有结构式II-4的化合物的质谱。
图16.描述了具有结构式II-5A的化合物的1H NMR图谱。
图17描述了具有结构式II-5A的化合物的质谱。
图18描述了具有结构式II-5B的化合物的1H NMR图谱。
图19描述了具有结构式II-5B的化合物的质谱。
图20描述了具有结构式IV-3C的化合物在DMSO-d6中的1H NMR图谱。
图21描述了具有结构式IV-3C的化合物在C6D6/DMSO-d6中的1HNMR图谱 图22描述了具有结构式II-13C的化合物的1H NMR图谱。
图23描述了具有结构式II-8C的化合物的1H NMR图谱。
图24描述了具有结构式II-25的化合物的1H NMR图谱。
图25描述了具有结构式II-21的化合物的1H NMR图谱。
图26描述了具有结构式II-22的化合物的1H NMR图谱。
图27显示家兔肌蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的抑制。
图28显示家兔肌蛋白酶体的PGPH和胱天蛋白酶样(Caspase-like)活性的抑制。
图29显示人红细胞蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的抑制。
图30显示II-16处理对胰凝乳蛋白酶介导的LLVY-AMC底物切割的作用。
图31显示核因子-κB(NF-κB)/萤光素酶的活性和II-16的细胞毒性特征谱。
图32显示在HEK293细胞(A)以及HEK293 NF-κB/萤光素酶报道基因克隆(B)中II-16引起的IκBα降解的减少和磷酸化的IκBα的保持。
图33显示II-16对HEK293细胞(A)以及HEK293 NF-κB/萤光素酶报道基因克隆(B)处理后，细胞周期调节蛋白，p21和p27的累积。
图34显示在Jurkat细胞中，II-16对胱天蛋白酶-3(Caspase-3)的活化。
图35显示在Jurkat细胞中，II-16对PARP的切割。
图36显示在RAW264.7细胞中，II-16对LeTx诱导的细胞毒性的抑制。
图37显示II-16处理对RPMI 8226和PC-3细胞中PARP和前胱天蛋白酶-3(Pro-Caspase-3)切割的作用。
图38显示II-16对RPMI 8226的处理导致PARP和前胱天蛋白酶-3的剂量依赖性切割。
图39显示II-16，II-17，II-18在体外对蛋白酶体的抑制。
图40显示从II-16治疗的小鼠中制备的PWBL中的蛋白酶体的活性。
图41显示在PWBL分析中，epoxomicin的治疗效果。
图42显示内部分析的比较。
图43显示在经LPS处理的小鼠中，血浆TNF水平下降。
图44描述用于说明在HEK293 NF-κB/Luc细胞中，式II-2，II-3和II-4对NF-κB介导的萤光素酶活性的作用的分析结果。
图45.描述用于说明在HEK293 NF-κB/Luc细胞中，式II-5A和II-5B对NF-κB介导的萤光素酶活性的作用的分析结果。
图46描述了用于说明式II-2，II-3和II-4对家兔20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的作用的分析结果。
图47描述了式II-5A和II-5B对家兔20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样的活性的作用。
图48描述了式II-2，II-3和II-4抗LeTx介导的细胞毒性的作用。
图49描述了具有结构式II-17的化合物的1H NMR图谱。
图50描述了具有结构式II-18的化合物的1H NMR图谱。
图51描述了式II-26的化合物在DMSO-d6中的1H NMR图谱。
图52描述了式II-26的化合物的计算机产生的ORTEP图。
图53描述了式II-27的化合物在DMSO-d6中的1H NMR图谱。
图54描述了式II-28的化合物在DMSO-d6中的1H NMR图谱。
图55描述了式II-29的化合物在DMSO-d6中的1H NMR图谱。
图56描述了式II-30的化合物在DMSO-d6中的1H NMR图谱。
图57描述了式II-44的化合物在DMSO-d6中的1H NMR图谱。
图58描述了式I-7的化合物在DMSO-d6中的1H NMR图谱。
图59描述了式II-47的化合物在DMSO-d6中的1H NMR图谱。
图60描述了式II-38的化合物在DMSO-d6中的1H NMR图谱。
图61描述了式II-50的化合物在DMSO-d6中的1H NMR图谱。
优选实施方案的详细说明 本发明引用了众多参考文献。将本发明所引用的、包括本文所引用的美国专利的每一参考文献全部内容通过参考的方式引入本说明书中。
本发明的实施方案包括，但不限于提供化合物的制备方法，所述化合物包括化合物，例如，包括本文描述的化合物及其类似物，以及提供了产生例如药物可接受的抗微生物组合物、抗癌组合物和抗炎症组合物的方法。所述方法可以相当高的收率包括所述组合物，其中所述化合物和/或其衍生物是这些组合物中的活性成分之一。其它实施方案涉及提供由目前可利用的方法无法获得的新化合物。此外，实施方案涉及治疗癌症、炎症和感染性疾病的方法，尤其是治疗那些感染人的感染性疾病的方法。在一些实施方案中，化合物组中的一种或多种通式化合物，或一个或多个化合物可被特定地排除在治疗本文所述的疾病状态的任意一种或多种方法之外。作为一个示例性例子，式II-16化合物在某些实施方案中可被排除在通常治疗癌症，例如治疗特定类型的癌症的方法之外。所述方法例如可包括将有效量的一类新化合物的成员进行给药的步骤。优选的实施方案涉及所述化合物及本发明公开的这类化合物的制备和使用方法，但是这些化合物并非在本发明的所有实施方案中都是必要的，这些目的能实现。
对于本发明描述的化合物，每一个立体的碳原子可以是R或S构型。虽然在本申请中举例说明的特定的化合物以具体的构型描述，但是也可以想到在任何给定的手性中心处有相反的立体化学或者其混合物的化合物。当本发明中的衍生物中有手性中心时，应当理解所述的化合物包含全部的可能的立体异构体。
通式I化合物 一些实施方案提供了一类化合物和制备这些化合物、及其药物可接受的盐类和酯类前药的方法，其中所述的化合物用通式I表示
通式I 在某些实施方案中，取代基R1、R2和R3可独立地包括氢、卤素和下列残基的单取代、多取代或者未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基(包括，例如，环己基甲醇)、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯和包括多卤代烷基在内的卤代烷基。此外，在某些实施方案中，每一E1、E2、E3和E4可为杂原子或取代的杂原子，例如，分别选自氮、硫和氧的杂原子。
在一些实施方案中，n可以等于1或等于2，当n等于2时，取代基可以相同或不同。此外，在一些实施方案中，R3不为氢。
在一些实施方案中，优选R1为取代的或未取代的C1-C5烷基。例如，优选甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和戊基。在一些实施方案中，R1不为取代的或未取代的、无支链的C6烷基。
在一些实施方案中，当R1取代基之一为乙基或氯乙基且R3为甲基时，R2不为环己-2-烯基甲醇。
优选地，R2为甲酰基。例如，所述化合物可具有如下结构I-1
通式I-1 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
优选地，通式I-1的结构可具有如下立体化学
R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
优选地，R2可为甲醇。例如，所述化合物可具有如下结构I-2
通式I-2 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
作为实例，通式I-2的结构可具有如下立体化学
R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
作为通式I的示例性化合物，可以是具有如下结构I-3的化合物
通式I-3 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
通式I-3的化合物可具有如下立体化学
R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
通式I的另一示例性化合物可以是具有如下结构I-4的化合物
通式I-4 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
优选地，通式I-4的化合物可具有如下立体化学
R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
通式I的另一示例性化合物是具有如下结构I-5的化合物
通式I-5 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
例如，通式I-5的化合物可具有如下立体化学
R8可以包括，例如，氢、氟、氯、溴和碘。
在一些实施方案中，通式I的R2例如可以是环己-2-烯基亚基甲基(cyclohex-2-enylidenemethyl)。例如，所述的化合物可具有如下通式I-6的结构
通式I-6 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
优选地，通式I-6的化合物可具有如下立体化学
R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
在还一实施方案中，通式I的R2例如可以是环己-2-烯基甲基。例如，化合物可具有如下通式I-7的结构
通式I-7 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
优选地，通式I-7的化合物可具有如下立体化学
R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
在其它实施方案中，R2可以是环己基烷基胺。
在其它实施方案中，R2也可以是C-环己基-亚甲基胺。在另一些实施方案中，R2可以是环己烷甲醛O-肟。
此外，在一些实施方案中，R2可以是环烷基酰基。
通式II化合物 其它实施方案提供了一类化合物和制备这些化合物、及其药物可接受的盐类和酯类前药的方法，其中所述的化合物用通式II表示
通式II 在某些实施方案中，取代基R1、R3和R4可以独立地包括氢、卤素和下列残基的单取代、多取代或者未取代的变体饱和的C1-C24的烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯和包括多卤代烷基在内的卤代烷基。此外，在某些实施方案中，每一E1、E2、E3和E4可为取代或未取代的杂原子，例如，选自氮、硫和氧的杂原子或取代的杂原子。
在一些实施方案中，n可以等于1，而在另一些实施方案中，其可以等于2。当n等于2时，取代基可以相同或不同。此外，在一些实施方案中，R3不为氢。m可以等于1或2，且当m等于2时，R4可以相同或不同。
E5例如可为OH、O、OR10、S、SR11、SO2R11、NH、NH2、NOH、NHOH、NR12以及NHOR13，其中R10-13例如可独立地包括卤素、下列任何基团的取代或未取代形式烷基，芳香基，杂芳香基等等。此外R1可为CH2CH2X，其中X例如可为H、F、Cl、Br和I。R3可以是甲基。此外，R4可包括环己基。此外，每一E1、E3和E4可为O以及E2可为NH。优选地，R1可为CH2CH2X，其中X选自H、F、Cl、Br和I；其中R4可包括环己基；其中R3可为甲基；以及其中每一E1、E3和E4可为O以及E2可为NH。
在一些实施方案中，当R1取代基之一是乙基或氯乙基，且R3是甲基时，R2不为氯环己-2-烯基甲醇。
在一些实施方案中，优选R1为取代的或未取代的C1-C5烷基。例如，优选甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和戊基。在一些实施方案中，R1不为取代的或未取代的、直链的C6烷基。
例如，通式II的示例性化合物具有以下结构II-1
通式II-1 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
示例性立体化学可如下
在优选的实施方案中，通式II化合物具有如下结构中的任一种
下列分别是具有结构II-2、II-3和II-4的化合物的示例性立体化学
在其它实施方案中，其中R4可以包括7-氧杂-二环[4.1.0]庚-2-基。通式II的示例性化合物为如下结构II-5
通式II-5 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
下列是具有通式II-5结构的化合物的实例
通式II-5A和II-5B 在另一实施方案中，至少有一个R4可包括取代或未取代的支链烷基。例如，通式II的化合物可以是如下结构II-6
通式II-6 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
下列是具有通式II-6结构的化合物的示例性立体化学
作为其它实例，通式II的化合物可以是如下结构II-7
通式II-7 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
下列是具有通式II-7结构的化合物的示例性立体化学
在其它实施方案中，至少有一个R4可以是环烷基以及E5可以是氧。通式II的示例性化合物可以是如下结构II-8
通式II-8 R8例如可以包括氢(II-8A)、氟(II-8B)、氯(II-8C)、溴(II-8D)和碘(II-8E)。
下列是具有通式II-8结构的化合物的示例性立体化学
在一些实施方案中，E5可以为生成肟的氧化胺。通式II的示例性化合物具有如下结构II-9
通式II-9 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘；R例如可以是氢、取代或未取代的烷基、芳基或杂芳基等等。
下列是具有通式II-9结构的化合物的示例性立体化学
通式II的另外的示例性化合物具有如下结构II-10
通式II-10 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
下列是具有通式II-10结构的化合物的示例性立体化学
在一些实施方案中，E5可以是NH2。通式II的示例性化合物具有如下结构II-11
通式II-11 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
下列是具有通式II-11结构的化合物的示例性立体化学
在一些实施方案中，至少有一个R4可包括环烷基以及E5可以是NH2。通式II的示例性化合物具有如下结构II-12
通式II-12 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
下列是具有通式II-12结构的化合物的示例性立体化学
通式II的另外的示例性化合物具有如下结构II-13
通式II-13 R8例如可以包括氢(II-13A)、氟(II-13B)、氯(II-13C)、溴(II-13D)和碘(II-13E)。
下列是具有通式II-13结构的化合物的示例性立体化学
通式II的另外的示例性化合物具有如下结构II-14
通式II-14 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
下列是具有通式II-14结构的化合物的示例性立体化学
在一些实施方案中，通式II的化合物例如可包括R4至少一个为环烯。此外，在一些实施方案中，所述的化合物例如可包括E5位为羟基。通式II的另一示例性化合物具有如下结构II-15
通式II-15 R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。
示例性立体化学可如下
下列分别是具有结构II-16、II-17、II-18和II-19的化合物的示例性立体化学
式II-16、II-17、II-18和II-19化合物可通过如下阐明的发酵、合成、或半合成和分离/纯化方法获得。此外，式II-16、II-17、II-18和II-19化合物可用作且可称为“起始原料”来制备本文所述的其它化合物。
在一些实施方案中，通式II化合物例如可包括甲基基团作为R1。另外的示例性化合物，式II-20，具有如下结构和立体化学
在一些实施方案中，通式II化合物，例如可包括羟乙基作为R1。另外的示例性化合物，式II-21，具有如下结构和立体化学
在一些实施方案中，式II-21的羟基可以被酯化，由此R1例如可包括丙酸乙酯。示例性化合物，式II-22，具有如下结构和立体化学
在一些实施方案中，通式II化合物例如可包括乙基基团作为R3。通式II的另一示例性化合物具有如下结构II-23
R8例如可以包括氢、氟、氯、溴和碘。示例性立体化学可如下
在一些实施方案中，通式II-23的化合物可具有由式II-24C示例性说明的如下结构和立体化学，其中R8为氯
在一些实施方案中，通式II-15的化合物可具有由式II-25的化合物示例性说明的如下立体化学，其中R8为氯
在一些实施方案中，通式II-15化合物可具有由式II-26化合物示例性说明的如下立体化学，其中R8为氯
在一些实施方案中，通式II化合物可具有由式II-27示例性说明的如下结构和立体化学，其中R1为乙基
在一些实施方案中，通式II化合物可具有由式II-28示例性说明的如下结构和立体化学，其中R1为甲基
在一些实施方案中，通式II化合物例如可包括叠氮基乙基作为R1。另一示例性化合物，式II-29，具有如下结构和立体化学
在一些实施方案中，通式II化合物例如可包括丙基作为R1。另一示例性化合物，式II-30，具有如下结构和立体化学
还一示例性化合物，式II-31和II-32，具有如下结构和立体化学
式II-31和II-32 其它示例性化合物，式II-33、II-34、II-35和II-36具有如下结构和立体化学
式II-33至II-36 在一些实施方案中，通式II化合物例如可包括氰乙基作为R1；例如，式II-37化合物具有如下结构和立体化学
在另一实施方案中，通式II化合物例如可包括硫氰酸乙酯作为R1；例如，式II-38化合物具有如下结构和立体化学
在一些实施方案中，通式II化合物例如可包括硫羟作为R1。另一示例性化合物，通式II-39，具有如下结构和立体化学，其中R＝H、烷基、芳基、或取代的烷基或芳基
在又一示例性化合物中，通式II-39化合物中的硫可被氧化为亚砜(n＝1)或砜(n＝2)，例如，如在通式II-40化合物中所示
在一些实施方案中，通式II化合物中的取代基R1可包括离去基团，例如，卤素，如在化合物II-18或II-19中所示，或另一离去基团，如磺酸酯。一个例子为式II-41的甲烷磺酸酯(甲磺酸酯(mesylate))
在一些实施方案中，通式II化合物中的取代基R1可包括电子受体。该电子受体例如可以是路易斯酸，如硼酸或其酯。示例性化合物，通式II-42，具有如下结构和立体化学，其中例如，n＝0、1、2、3、4、5或6，以及例如，R＝H或烷基
通式II-42的另一示例性化合物为式II-42A化合物，其中n＝2及R＝H，和式II-42B化合物，其中n＝1及R＝H
在一些通式II化合物中的取代基R1包括电子受体的实施方案中，该电子受体例如可以是Michael受体。示例性化合物，通式II-43具有如下结构，其中n＝0、1、2、3、4、5或6，以及其中Z为吸电子基团，例如，CHO、COR、COOR、CONH2、CN、NO2、SOR、SO2R等等
通式II-43的另一示例性化合物为式II-43A化合物，其中n＝1及Z＝CO2CH3
在一些实施方案中，化合物可以是通式II化合物的酯类或硫代酸酯类前药。例如，式II-44化合物(式II-16化合物的硫代酸酯前药)具有如下结构和立体化学
在一些实施方案中，通式II化合物例如可包括烯基基团作为R1，例如，乙烯基(ethylenyl)。另一示例性化合物，式II-46，具有如下结构和立体化学
在一些实施方案中，化合物可以是通式II化合物的酯类或硫代酸酯类前药。例如，式II47化合物(式II-17化合物的硫代酸酯前药)具有如下结构和立体化学
在一些实施方案中，化合物可以是通式II化合物的酯类或硫代酸酯类前药。例如，式II-48化合物具有如下结构和立体化学
其它示例性化合物，式II-49可具有如下结构和立体化学
在一些实施方案中，化合物可以是通式II化合物的酯类或硫代酸酯类前药。例如，式II-50化合物(式II-16化合物的酯前药)具有如下结构和立体化学结构
通式III化合物 其它实施方案提供了一类化合物和产生该类化合物、及其药物可接受的盐类和酯类前药的方法，其中所述化合物用通式III表示
通式III 在某些实施方案中，取代基R1例如可包括氢、卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯和包括多卤代烷基在内的卤代烷基。例如，n可以等于1或2。
在某些实施方案中，R4例如可以是氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或者未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基。例如，m可以等于1或2。当m等于2时，所述取代基可以相同或不同。而且，每一个E1、E2、E3、E4和E5例如可以是取代或未取代的杂原子。例如，该杂原子可以是氮、硫和氧。
在一些实施方案中，当R1取代基之一为乙基或氯乙基时，R2不为环己-2-烯基甲醇。
在一些实施方案中，优选R1为取代的或未取代的C1-C5烷基。例如，优选甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和戊基。在一些实施方案中，R1不为取代的或未取代的、直链的C6烷基。
通式IV化合物 其它实施方案提供了一类化合物和产生该类化合物、及其药物可接受的盐类和酯类前药的方法，其中所述化合物用通式IV表示
通式IV 在某些实施方案中，取代基R1、R3和R5可独立地包括氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基。而且，每一个E1、E2、E3、E4和E5可以为杂原子或取代的杂原子，例如，氮、硫和氧。在一些实施方案中，R3不为氢。n等于1或2。当n等于2时，所述取代基可以相同或不同。m也可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11。当m大于1时，所述取代基可以相同或不同。
在一些实施方案中，优选R1为取代的或未取代的C1-C5烷基。例如，优选甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和戊基。在一些实施方案中，R1不为取代的或未取代的、直链的C6烷基。
在一些实施方案中，所述取代基R5例如可产生双取代的环己烷。通式IV的示例性化合物为如下含有和不含有示例性立体化学的结构VI-1
通式IV-1 R8例如可包括氢、氟、氯、溴和碘。取代基R6和R7可独立地包括氢、卤素以及下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基。此外R6和R7可以相同或不同。
例如，通式IV的示例性化合物具有如下结构IV-2
通式IV-2 R8例如可包括氢、氟、氯、溴和碘。
示例性立体化学可为如下所示
例如，通式IV的示例性化合物具有如下结构IV-3；
通式IV-3 R8例如可包括氢(IV-3A)、氟(IV-3B)、氯(IV-3C)、溴(IV-3D)和碘(IV-3E)。
示例性结构和立体化学可为如下所示
另外的示例性结构和立体化学可为如下所示
式IV-3C 例如，通式IV的示例性化合物具有如下结构IV-4
通式IV-4 R8例如可包括氢、氟、氯、溴和碘。
示例性立体化学可为如下所示
通式V化合物 一些实施方案提供了一类化合物和产生该类化合物、及其药物可接受的盐类和酯类前药的方法，其中所述化合物用通式V表示
通式V 在某些实施方案中，取代基R1和R5可独立地包括氢、卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基。在某些实施方案中，每一个E1、E2、E3、E4和E5可以为杂原子或取代的杂原子，例如，氮、硫和氧。n等于1或2，且当n等于2时，取代基可以相同或不同。优选地，m可以为，例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11。当m大于1时，R5可以相同或不同。
在一些实施方案中，优选R1为取代的或未取代的C1-C5烷基。例如，优选甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和戊基。在一些实施方案中，R1不为取代的或未取代的、直链的C6烷基。
通式VI化合物 一些实施方案提供了一类化合物和产生该类化合物、及其药物可接受的盐类和酯类前药的方法，其中所述化合物用通式VI表示
通式VI 其中R1可独立地选自下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、苯基、环烷基酰基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、硫代、亚砜、砜硼酸酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基。n等于1或2，以及如果n等于2，则R1可相同或不同； 其中R2可选自氢、卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基(包括，例如，环己基甲醇)、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基； 其中R3可选自卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基；其中每一个E1、E2、E3和E4可以为取代或未取代的杂原子。
在一些实施方案中，当R1取代基之一为乙基或氯乙基，且R3为甲基时，R2不为环己-2-烯基甲醇。
在一些实施方案中，优选R1为取代的或未取代的C1-C5烷基。例如，优选甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和戊基。
其中R14可选自卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、硫代酸酯、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基。
在一些实施方案中，优选地，R14为烷基硫醇或取代的烷基硫醇以及E3为氧。
例如，在一些实施方案中，通式VI的一些化合物可具有如下称为通式VI-1的结构
其中R1可独立地选自下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、苯基、环烷基酰基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、硫代、亚砜、砜、硼酸酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基。n等于1或2，以及如果n等于2，则R1可相同或不同； 其中R3可选自卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基；其中每一个E1、E2、E3、E4和E5可以为取代或未取代的杂原子。
其中R5可独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、氧基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，以及如果m大于1，则R5可以相同或不同；其中所述取代基R5可形成环；其中每一个E1、E2、E3、E4和E5可以为取代或未取代的杂原子。
在一些实施方案中，优选R1为取代的或未取代的C1-C5烷基。例如，优选甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和戊基。
其中R14可选自卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、硫代酸酯、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基。
例如，所述化合物具有如下结构VI-1A
式VI-1A 示例性立体化学可为如下所示
例如，通式VI的示例性化合物具有如下结构和立体化学VI-1B
式VI-1B 另一例子，通式VI的化合物具有如下结构和立体化学VI-1C
式VI-1C 某些实施方案也提供了通式I-VI化合物的药物可接受的盐类和酯类前药，以及提供了通过本文公开的方法获得和纯化所述化合物的方法。
术语“酯类前药”，尤其当指的是通过本文公开的方法合成的通式I化合物的酯类前药时，该术语指的是所述化合物的化学衍生物，其在体内快速转化(例如在血液中或组织内水解)生成该化合物。术语“酯类前药”指的是本文公开的所述化合物的衍生物，其是通过加入多种在生理条件下被水解的形成酯或硫代酸酯的几种基团中的任意一种而形成。酯类前药基团的例子包括pivoyloxymethyl、乙酸基甲基、2-苯并[c]呋喃酮亚基、2，3-二氢化茚基和甲氧基甲基和硫代酸酯以及本领域公知的其它这类基团，包括(5-R-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基基团。可通过制备所述化合物的相应的硫代酸酯来制备其它前药，例如，通过与合适的硫醇反应来制备，例如与苯硫酚、半胱氨酸或其衍生物或丙硫醇反应。酯类前药基团的其它例子例如可在下列文献中找到T.Higuchi和V.Stella的“Pro-drugs as Novel DeliverySystems”(“作为新颖的递药系统的前药”)第14卷，A.C.S.SymposiumSeries，American Chemical Society(1975)；和“Bioreversible Carriers inDrug DesignTheory and Application”(“药物设计中生物可逆性载体原理和应用”)，E.B.Roche编辑，Pergamon PressNew York，14-21(1987)(为包含羧基基团的化合物提供了用作前药的酯类的例子)。将上述每一参考文献通过参考的方式将其全部内容引入本文。
本文使用的术语“酯类前药”也指的是在体内快速转化，例如，通过在血液中的水解生成所述化合物的该化合物的化学衍生物。
本文使用的术语“药物可接受的盐类”，且当特别指的是包括通式I-VI化合物的以及通过本发明公开的方法产生和合成的通式I-VI化合物的药物可接受的盐类时，该术语指的是该化合物的任何药物可接受的盐类，且优选指的是该化合物的酸加合盐类。优选的药物可接受的盐类的例子是碱金属盐(钠或钾)；碱土金属盐(钙或镁)；或从氨中或从药物可接受的有机胺中衍生的铵盐，例如C1-C7烷基胺、环己胺、三乙醇胺、乙二胺或三(羟甲基)氨基甲烷。对于通过此实施方案所述方法合成的碱性胺化合物，优选的药物可接受的盐类的例子为药物可接受的无机酸或有机酸的酸加合盐类，例如，氢卤酸，硫酸，磷酸或脂肪族或芳香族羧酸或磺酸，例如乙酸、琥珀酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸或萘磺酸。
本文公开的优选的药物组合物包括通过本文公开的方法获得和纯化的通式I-VI化合物的药物可接受的盐类及其酯类前药。因此，如果药物制剂的制造涉及药物赋形剂与盐形式的活性成分的充分混合，那么优选使用为非碱性的药物赋形剂，也就是酸性或中性赋形剂。
还应当理解短语“化合物和包含该化合物的组合物”或任何相似短语意为包含适于药物输送的任何适当形式的化合物，本发明另外详细讨论该化合物。例如，在某些实施方案中，所述化合物或包含该化合物的组合物可包括该化合物的药物可接受的盐。
在一实施方案中，所述的化合物可用于治疗微生物疾病、癌症和炎症。疾病广泛地解释为涵盖了感染性疾病、和自身免疫性疾病、非感染性疾病和慢性疾病状态。在优选的实施方案中，疾病是由微生物引起的，例如，细菌、真菌和原生动物。使用方法还可包括将化合物或包含该化合物的组合物向患有感染性疾病或癌症的个体给药的步骤。所述化合物或组合物可按照治疗具体的感染性疾病、癌症或炎症性疾病状态的有效剂量给药。
所述感染性疾病可以是，例如，由诸如炭疽杆菌和蜡样芽孢杆菌(B.cereus)的杆菌引起的疾病。感染性疾病可以是由原生动物引起的疾病，例如，利什曼原虫、疟原虫或锥虫。所述化合物或组合物可以与药物可接受的载体、稀释剂、赋形剂等等一同给药。
所述癌症可以是，例如，多发性骨髓瘤、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、黑素瘤等等。
所述炎症性疾病状态可以是，例如，类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化症、银屑病、中风、心肌梗塞、再灌注损伤等等。
本文所用的术语“卤素原子”是指元素周期表的第7栏中任一放射稳定性原子，即氟、氯、溴或碘，优选溴和氯。
本文所使用的术语“烷基”是指任何直链的或支链的、取代的或未取代的饱和烃，优选C1-C24，且更优选C1-C6烃，最优选甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔-丁基和戊基。在所述取代的饱和烃中，优选C1-C24，且最优选C1-C6的单卤代、二卤代和全卤代的饱和烃和氨基取代的烃。
术语“取代的”为其普通的含意，如同相关领域内的众多同时期专利中所述的含意。参见，例如，第6,509,331；6,506,787；6,500,825；5,922,683；5,886,210；5,874,443和6,350,759号美国专利，在此将其全部内容引入作为参考。特别的是，取代的定义同第6,509,331号美国专利中提供的定义一样宽泛，第6,509,331号美国专利定义的术语“取代的烷基”，使其指的是烷基，该烷基优选1到10个碳原子，具有1到5个取代基，优选1到3个的取代基，所述取代基选自烃氧基、取代的烃氧基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、酰基、酰基氨基、酰基氧基、氨基、取代的氨基、氨基酰基、氨基酰基氧基、氧基酰氨基、氰基、卤素、羟基、羧基、羧基烷基、酮基、硫酮基、硫醇、硫代烃氧基、取代的硫代烃氧基、芳基、芳基氧基、杂芳基、杂芳基氧基、杂环基、杂环基氧基、羟氨基、烃氧基氨基、硝基、--SO-烷基、--SO-取代的烷基、--SO-芳基、--SO-杂芳基、--SO2-烷基、--SO2-取代的烷基、--SO2-芳基和--SO2-杂芳基。其它上述所列的专利也提供了被本领域中的技术人员充分理解的术语“取代的”的标准定义。
术语“环烷基”指的是任何非芳香烃环，优选具有五到十二个原子构成的环。术语“酰基”指的是从酮酸中衍生出的烷基或芳基，优选乙酰基。
本文使用的术语“烯基”是指任何直链的或支链的、取代的或未取代的不饱和烃，包括多不饱和烃，优选含C1-C6直链的、单不饱和的和双不饱和的未取代的烃，且最优选单不饱和的二卤代的烃。术语“环烯基”指的是任何非芳香烃环，优选含有五到十二个原子构成的环。
本发明使用的术语“芳基”、“取代的芳基”、“杂芳基”和“取代的杂芳基”指的是芳香烃环，优选具有五个、六个或七个原子，最优选六个原子构成的环。“杂芳基”和“取代的杂芳基”指的是这样的芳烃环，在该芳烃环中至少一个如氧，硫或氮原子的杂原子与至少一个碳原子一起在该环中。术语“杂环”或“杂环的”指的是含有一种或多种杂原子的任何环状化合物。所述取代的芳基，杂环和杂芳基可以被任何取代基取代，包括如上所述的和本领域中公知的取代基。
术语“烃氧基”指的是任何直链的或支链的、取代的或未取代的、饱和的或不饱和的醚类，优选C1-C6的直链的、饱和的未取代醚类，优选甲氧基，且二甲基、二乙基、甲基-异丁基和甲基-叔丁基醚也是优选的。术语“环烃氧基”指的是任何非芳香烃环，优选具有五到十二个原子构成的环。术语“烃氧基羰基”指的是与羰基基团相连的任何直链的、支链的、环状的、饱和的、不饱和的、脂肪族的或芳香族的烃氧基。例子包括甲氧基羰基基团、乙氧基羰基基团、丙基氧基羰基基团、异丙基氧基羰基基团、丁氧基羰基基团、仲-丁氧基羰基基团、叔-丁氧基羰基基团、环戊基氧基羰基基团、环己基氧基羰基基团、苄氧基羰基基团、烯丙基氧基羰基基团、苯基氧基羰基基团、吡啶基氧基羰基基团等等。
本发明使用的术语“纯的”、“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”指的是实施方案中所述的化合物不含其它与之不同的化合物，如果该化合物以其自然状态存在，则该化合物以其自然状态与该其它与之不同的化合物相关联。在本发明的某些实施方案中化合物被描述为“纯的”、“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”，则该化合物可包含给定样品的至少0.5％、1％、5％、10％或20％的重量份，且最优选地包含至少50％或75％的重量份。
术语“衍生物”、“变体”或其它的相似术语指的是为其它化合物的类似物的化合物。
可获得并纯化通式I-VI的某些化合物，或者可由本文所提及的纯化的化合物通过半合成获得这些化合物。通常，没有对此限定的话，通式II-15的化合物，优选地，式II-16，II-17，II-18和II-19可合成获得或通过发酵获得。在下文提供示例性发酵操作。此外，通式II-15的化合物，优选地，式II-16，II-17，II-18和II-19可用作起始化合物以便获得\合成本发明描述的多种其它化合物。本文提供了示例性非限制的合成。

式II-16 式II-17
式II-18 式II-19 当前通过高收率的盐酵(约350-400mg/L)产生式II-16化合物，且条件的改变在发酵提取物中产生新类似物。图1显示II-16的化学结构。可通过定向生物合成产生另外的类似物。定向生物合成指的是通过向产微生物的发酵物中添加生物合成的前体类似物得到天然产物的修饰。(Lam，et al.，J Antibiot(Tokyo)44934(1991)，Lam，et al.，J Antibiot(Tokyo)541(2001)，在此通过参考的方式将其全部内容引入)。
将产生培养物暴露在乙酸、苯丙氨酸、缬氨酸、丁酸、莽草酸和卤素的类似物中，优选不包括氯，可导致新类似物的生成。产生的新类似物可通过HPLC和LC-MS在粗提取物中轻易地被检测到。例如，在处理含有不同浓度的溴化钠、溴-类似物的培养基后，在摇瓶培养物中可顺利地产生14mg/L的滴定度的式II-18。
产生新类似物的第二个途径是通过生物转化。生物转化反应是由酶或含有这些酶的全细胞催化的化学反应。参见Zaks，A.，Curr Opin ChemBiol 5130(2001)。微生物的天然产物是生物转化反应的理想的底物，因为它们是在微生物细胞内通过一系列的酶促反应合成的。参见Riva，S.，Curr Opin Chem Biol 5106(2001)。
给定所述化合物的结构，例如包括通式II-15的结构，可能的生物合成的起源是乙酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A(ethylmalonyl-CoA)、苯丙氨酸和氯。乙基丙二酰辅酶A来源于丁酰辅酶A，丁酰-辅酶A来源于缬氨酸或者丁烯酰辅酶A。参见Liu，et al.，Metab Eng 340(2001)。苯丙氨酸来源于莽草酸。
化合物式I-7、II-16、II-17、II-18、II-20、II-24C、II-26、II-27和II-28的产生 化合物式I-7、II-16、II-17、II-18、II-20、II-24C、II-26、II-27和II-28的产生可通过下述方法实现在本发明所述的条件下，优选为在浸没的有氧条件下，在适宜的营养培养基中培养菌株CNB476和菌株CNB476的天然变体菌株NPS21184，直到在发酵物中检测到大量的化合物；通过用合适的溶剂从发酵液中提取活性组分；浓缩含有所需组分的溶剂；然后将浓缩后的物质经色谱分离从也存在于该培养基中的其它代谢产物中分离出所述化合物。
图2显示培养物(CNB476)的世界范围内的一些采集位置，该培养物也称为Salinospora。图3显示Salinospora的菌落。图4显示Salinospora的典型的16S rDNA序列。条状表示将Salinospora从其最近的相关物种中分离出的特征标记核苷酸。
培养物(CNB476)于2003年6月20号被保藏在Rockville，MD的美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC)并指定为ATCC专利保藏号PTA-5275。菌株NPS21184为菌株CNB476的天然变体，其作为衍生于菌株CNB476的单一的菌落分离物。菌株NPS21184已于2005年4月27日保藏在ATCC。该ATCC保藏满足布达佩斯条约的所有要求。所述培养物也维持在并且能从10480Wateridge Circle，San Diego，CA 92121的Nereus药用菌库(Pharmaceutical Culture Collection)中获得。除了本发明描述的特定微生物外，应当理解也可以培养突变体，如通过使用化学的或包括X-射线等等物理的诱变剂产生的突变体，以及通过分子生物学技术改变其基因结构的生物体以产生起始化合物式II-16、II-17和II-18。
菌株CNB476和菌株NPS21184的发酵 在有益于生产生物体满意生长的温度下可完成化合物的产生，例如16℃至40℃，但是优选地在22℃至32℃下进行发酵。可孵育水性培养基一段时间以完成化合物的产生，这可由高压液相色谱(HPLC)来监测，例如，优选的时间段为约2天至10天，在旋转振荡器上以约50rpm至400rpm运转，优选为150rpm至250rpm。也可通过在诸如适合所述生产菌株生长的发酵罐体系的生物反应器中培养该生产菌株完成所述化合物的产生。
本领域的普通技术人员可通过使用合适的培养基完成所述的微生物的生长。概括地说，碳的来源包括葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、甘露醇和甘油、其它的糖和糖醇、淀粉和其它碳水化合物、或者诸如葡聚糖、结晶葡萄糖的碳水化合物衍生物、以及复杂的营养素例如燕麦粉，玉米面粉，谷子，玉米等。在所述培养基中使用的碳来源的确切量部分依赖于该培养基中的其它成分，但是，例如可满意地使用0.5％至25％的培养基重量比的碳水化合物量。例如，可单独使用这些碳源或在同一培养基中可联合使用多个这样的碳源。优选使用下文给出的某些碳源。
氮的来源包括氨基酸，例如甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、蛋氨酸等等，铵盐以及复杂来源，例如酵母提取液、玉米浸液、可溶的蒸馏液、大豆粉、棉花种子粉、鱼粉、蛋白胨等等。例如，可以以0.5％至25％的培养基重量比的量单独使用或者联合使用氮的多种来源。
在可加入到培养基中的营养无机盐中，常用的无机盐是能产生钠、钾、镁、钙、磷、硫、氯、碳酸盐和相似离子的无机盐。也包括微量金属例如钴、锰、铁、钼、锌、镉等等。
化合物的生物活性和应用 一些实施方案涉及癌症、炎症和感染性疾病，特别是影响人的疾病的治疗方法。所述的方法可包括，例如，将有效量的一类新化合物中的成员给药的步骤。因此，本文公开的所述化合物可用于治疗癌症、炎症和感染性疾病。
所述的化合物具有多种生物活性。例如，该化合物具有化学增敏活性、抗微生物、抗炎症、放射增敏和抗癌活性。
所述的化合物具有蛋白酶体抑制活性。蛋白酶体抑制活性可全部或部分地产生该化合物用作抗癌剂、抗炎剂和抗微生物剂的能力。
所述的蛋白酶体是多亚基蛋白酶，它通过它的胰凝乳蛋白酶样、胰蛋白酶样和肽基谷氨酰基肽水解(PGPH；也称为胱天蛋白酶样活性)活性降解细胞内的蛋白质。所述的26S蛋白酶体包含称为20S蛋白酶体的蛋白水解核心和一个或两个19S调节亚基。该20S蛋白酶体产生针对许多底物的蛋白水解活性，这些底物包括被损坏的蛋白质、转录因子NF-κB及其抑制剂IκB、信号分子、肿瘤抑制因子和细胞周期调节因子。在所述的蛋白酶体内有三种不同的蛋白酶活性1)胰凝乳蛋白酶样；2)胰蛋白酶样和3)肽基谷氨酰基肽水解(PGPH)活性。
作为例子，式II-16的化合物(EC50 2nM)比Omuralide(EC50 52nM)更有效抑制所述的家兔肌蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性且也可抑制人红细胞衍生的蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性(EC50约250pM)。图5显示乳胞素的降解产物Omuralide和式II-16化合物。相对于抑制胰凝乳蛋白酶的催化活性，式II-16化合物显示出对抑制所述蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的显著的优选性。式II-16的化合物也显示了低nM的胰蛋白酶样抑制活性(约10nM)，但是在抑制所述蛋白酶体的PGPH活性方面有较差的效果(EC50约350pM)。
另外的研究已表征了本发明描述的化合物的作用，包括式II-16对NF-κB/IκB信号途径的作用的研究。用瘤坏死因子-α(TNF-α)对HEK293细胞(人胚肾)的处理诱发IκBα的磷酸化和蛋白酶体介导的降解，随后NF-κB活化。为了确定蛋白酶体抑制，用式II-16化合物预处理HEK293细胞1个小时接着用TNF-α刺激。用式II-16化合物的处理促进磷酸化的IκBα的蓄积，这表明抑制了蛋白酶体介导的IκBα降解。
此外，产生了稳定的HEK293克隆(NF-κB/Luc 293)，它在5xNF-κB结合位点的调节下携带萤光素酶报道基因。用TNF-α对NF-κB/Luc 293的刺激增加了萤光素酶活性，这是NF-κB活化的结果，而用式II-16化合物的预处理则降低了活性。Western印迹分析显示式II-16化合物促进NF-κB/Luc 293细胞中磷酸化的IκBα的蓄积并减少总IκBα的降解。式II-16化合物也显示出增加细胞周期调节蛋白，p21和p27的水平。
肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂比正常细胞更敏感。此外，蛋白酶体抑制增加了癌细胞对抗癌剂的敏感性。通过检测对多种癌细胞系的细胞毒活性来检测本发明描述的包括式II-16在内的化合物的细胞毒活性。例如，在国立癌症研究所对60个人肿瘤细胞系进行筛查来检测式II-16化合物。式II-16化合物显示了选择性的细胞毒活性，其平均GI50值(获得50％生长抑制的浓度)小于10nM。观察到了对SK-MEL-28黑素瘤和MDA-MB-235乳腺癌细胞的最大效能[两者的LC50(具有50％细胞致死性的浓度)＜10nM]。
用Salinosporamide A处理包括人结肠直肠(HT-29和LoVo)、前列腺(PC3)、乳腺(MDA-MB-235)、肺(NCI-H292)、卵巢(OVCAR3)、急性T-细胞白血病(Jurkat)、鼠的黑素瘤(B16-F10)和正常人成纤维细胞(CCD-27sk)在内的一组细胞系48h后评价细胞毒活性。对HT-29，LoVo，PC3，MDA-MB-231，NCI-H292，OVCAR3，Jurkat，和B16-F10细胞是敏感的，EC50值分别为47、69、78、67、97、69、10和33nM。相反，对CCD-27sk细胞的EC50值是196nM。用Salinosporamide A在大约EC50浓度对Jurkat细胞的处理导致胱天蛋白酶-3活化和PARP的切割，证实诱导凋亡作用。
用体外LeTx诱导的细胞毒性分析评价所述化合物的抗炭疽活性。作为一个例子，该结果表明式II-16化合物是鼠巨噬细胞样RAW264.7细胞的LeTx诱导的细胞毒性的有效抑制剂。与LeTx单独对RAW264.7细胞的处理相比，用式II-16化合物对RAW264.7细胞的处理导致LeTx处理的细胞的存活力的10倍增长(平均EC50＜4nM)。
式II-16化合物的潜在的化学增敏作用 另外的研究已表征了本文描述的化合物对NF-κB/IκB信号途径的作用(见实施例)。在未刺激的细胞中，转录因子核因子-kappa B(NF-κB)以与抑制蛋白IκB(NF-κB的抑制剂)的非活化复合物形式位于细胞质中。多种刺激可通过IκB激酶引起IκB磷酸化，随后由蛋白酶体引起泛素化(ubiquitination)和降解作用。随着IκB的降解，NF-κB易位至核内并调节基因表达，这影响了包括抑制细胞凋亡在内的许多细胞过程。诸如CPT-11(依立替康Irinotecan)的化学治疗剂能活化包括LoVo细胞在内的人结肠癌细胞系中的NF-κB，导致这些细胞发生细胞凋亡的能力降低。Painter，R.B.Cancer Res 384445(1978)。VelcadeTM是二肽基硼酸，其抑制蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性(Lightcap，et al.，Clin Chem 46673(2000)，Adams，et al.，Cancer Res 592615(1999)，Adams，Curr Opin Oncol14628(2002))，而增加胰蛋白酶和PGPH活性。最近VelcadeTM(PS-341；Millennium Pharmaceuticals，Inc.)作为蛋白酶体抑制剂被许可，它已显示出对癌细胞的直接毒性且也提高体外的LoVo细胞中以及抑制经由蛋白酶体的IκB降解的LoVo异种移植物模型中的CPT-11的细胞毒活性。Blum，et al.，Ann Intern Med 80249(1974)。此外，发现VelcadeTM能够抑制扁平细胞癌中促血管生成(proangiogenic)趋化因子/细胞因子生长相关原癌基因-α(Growth Related Oncogene-alpha，GRO-α)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。可能是通过抑制所述NF-κB途径实现的。Dick，et al.，JBiol Chem 2717273(1996)。这些数据表明蛋白酶体抑制不仅可以减少肿瘤细胞的存活和生长，也可以减少血管生成。
抗炭疽活性 蛋白酶体抑制剂的另外的潜在应用来自于最近关于生物防御类别A物质(biodefense Category A agent)B.anthracis(炭疽)的研究。炭疽杆菌芽孢被吸入并寄宿在肺中，在那里它们被巨噬细胞摄入。在该巨噬细胞内，芽孢发芽、复制、导致该细胞被杀死。但是在杀死该细胞前，感染的巨噬细胞迁移到淋巴结中，在那里死亡时，它们释放它们的内含物，使该有机体进入血液系统中，进一步复制并分泌致死毒素。Hanna，et al.，Proc Natl Acad Sci USA 9010198(1993)。炭疽毒素是形成炭疽相关症状的原因。在炭疽的发病机理中起关键作用的两个蛋白质是保护性抗原(PA，83kDa)和致死因子(LF，90kDa)，它们共同地称为致死毒素(LeTx)。LF具有酶功能，但是需要PA来完成它的生物效应。PA和LF两者之一都不能单独引起死亡，但是，当它们组合时，当静脉注射进动物体内时，PA和LF引起死亡。Kalns，et al.，Biochem Biophys ResCommun 297506(2002)，Kalns，et al.，Biochem Biophys Res Commun 29241(2002)。
保护性抗原，炭疽毒素的受体结合组分，负责将致死因子转运至宿主细胞中。PA寡聚体化成环形的七聚体(见图6)。在细胞表面与它的受体相结合的每一个七聚体具有结合最多达三个LF分子的能力。通过受体介导的细胞内吞作用，将PA七聚体和LF之间形成的复合物摄入至细胞中。随着细胞内吞作用后，LF被释放到胞浆中，在那里它进攻多种细胞靶标。Mogridge，et al.，Biochemistry 411079(2002)，Lacy，et al.，JBiolChem 2773006(2002)，Bradley，et al.，Nature 414225(2001)。
致死因子(LF)是锌依赖的金属蛋白酶，在胞浆中它可分裂并使丝裂原活化的蛋白激酶激酶家族(MAPKK)的信号蛋白失活。Duesbery，et al.，Science 280734(1998)，Bodart，et al.，Cell Cycle 110(2002)，Vitale，et al.，J Appl Microbiol 87288(1999)，Vitale，et al.，Biochem J 352 Pt 3739(2000)。在七个不同的已知的MAPK激酶中，六个已显示出被LF切割。在细胞内，MAPK激酶途径转导参与使这些蛋白成为非常显著靶标的细胞死亡、增殖和分化的多种信号。但是，某些阻止LeTx诱导的细胞死亡的某些抑制剂不能阻止MAPKK被LF切割，这表明该抑制剂的活性不足以诱导细胞死亡。Kim，et al.，J Biol Chem 2787413(2003)，Lin，et al.，CurrMicrobiol 33224(1996)。
研究表明所述抑制蛋白酶体能阻止LeTx诱导的细胞死亡。Tang，etal.，Infect Immun 673055(1999)。数据显示蛋白酶体活性对于LeTx介导的杀死RAW264.7巨噬细胞样细胞是必需的，且蛋白酶体抑制剂保护RAW264.7免于LeTx。蛋白酶体抑制不阻断MEK1切割，这表明在这些研究中LeTx途径不是在MEK1切割的上游被阻断。另外，用LeTx处理的细胞中蛋白酶体活性没有增加。这些数据表明如同本文所述化合物，新颖的、有效的蛋白酶体抑制剂也可以阻止LeTx诱导的细胞死亡，如图6所示。
PA的受体已被鉴别且由许多细胞类型表达。Escuyer，et al，IyafectInaraun 593381(1991)。致死毒素在巨噬细胞的少数细胞培养株中有活性，在几个小时内引起细胞死亡。Hanna，et al.，Proc Natl Acad Sci USA 9010198(1993)，Kim，et al.，JBiol Chem 2787413(2003)，Lin，et al.，CurrMicrobiol 33224(1996)。LeTx能诱导经体外处理的小鼠巨噬细胞样RAW264.7和J774A.1细胞的坏死和细胞凋亡。
所述结果表明本文所述化合物是小鼠巨噬细胞样RAW264.7细胞的LeTx诱导的细胞毒性的有效抑制剂。例如，与LeTx单独处理相比较，用式II-16化合物对RAW264.7细胞的处理导致LeTx处理的细胞存活力的10倍增长(平均EC50＜4nM)，且因此为炭疽感染提供了有价值的疗法。例如，式II-16在LeTx存在下促进RAW264.7巨噬细胞样细胞的存活，这表明这个化合物及其衍生物为炭疽感染提供了有价值的临床治疗。
药物组合物 在一个实施方案中，本文公开的所述化合物用于药物组合物中。可任选地通过本发明公开的方法产生该化合物。该化合物可例如用于药物组合物中，该药物组合物包含准备用于贮存和随后给药的药物可接受的载体。实施方案也涉及在药物可接受的载体或稀释剂中含有药物有效量的上述公开的产物和化合物。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域中是公知的，并且例如在Remington′sPharmaceutical Sciences(雷明顿制药学)，18th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990))中进行描述，在此通过参考的方式将其全部内容引入。防腐剂、稳定剂、染料甚至矫味剂均可提供于该药物组合物中。例如，可加入作为防腐剂的苯甲酸钠、抗坏血酸和对羟基苯甲酸的酯。另外，可使用抗氧化剂和助悬剂。
可将所述组合物(特别是通式I-VI的组合物)进行组方且用作用于口服给药的片剂、胶囊或酏剂；用于直肠给药的栓剂；用于注射给药的无菌溶液、混悬剂；用于经皮肤给药的贴片以及皮下沉积物等等。可将注射剂制备为下列常规形式作为溶液或混悬液、适合注射前在液体中制成溶液或混悬液的固体剂型、或作为乳剂。适合的赋形剂例如是水、盐水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸钠、半胱氨酸盐酸盐等等。另外，如果需要，所述的注射用药药物组合物可包含少量的无毒性辅助物，例如湿润剂、pH缓冲剂等等。如果需要，也可使用吸收增强制剂(例如，脂质体)。
用于非经肠给药的药物制剂包括以水溶性形式存在的所述活性化合物的水溶液。另外，也可将所述活性化合物的混悬液制备为合适的油状注射悬液。适合的亲脂性溶剂或载体包括诸如芝麻油等脂肪油、或其它诸如大豆油、柚子油或杏仁油等有机油、或诸如油酸乙酯或甘油三酯等合成的脂肪酸酯，或脂质体。水性注射悬液可包含增加该悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，所述的混悬液可包含适合的稳定剂或增加所述化合物的溶解性以允许制备高浓度溶液的试剂。
可通过下述方法获得用于口服的药物制剂将所述活性化合物与固体赋形剂混合，任意地碾磨所得混合物，以及将该混合物加工成颗粒，如果需要，在加入适合的助剂后得到片剂或糖衣剂核。适合的赋形剂特别是诸如糖的填充剂，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制剂，如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要可加入崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或诸如藻酸钠的藻酸盐。对糖衣剂核进行适合的包被。为了这个目的，可使用浓缩的糖溶液，该糖溶液可任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇和/或二氧化钛、紫胶漆溶液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。为了识别或表示活性化合物剂量的不同组合的特征，可向片剂或糖衣剂包衣中加入染料或色素。为了这个目的，可使用浓缩的糖溶液，该糖溶液可任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇和/或二氧化钛、紫胶漆溶液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。为了识别或表示活性化合物剂量的不同组合的特征，可向片剂或糖衣剂包衣中加入染料或色素。可使用本领域中公知的方法制造这些制剂(见例如，美国专利号5,733,888(注射用组合物)；5,726,181(难溶于水的化合物)；5,707,641(治疗有效的蛋白质或肽)；5,667,809(亲脂性试剂)；5,576,012(增溶的聚合试剂)；5,707,615(抗病毒制剂)；5,683,676(微粒药物)；5,654,286(局部制剂)；5,688,529(口服混悬剂)；5,445,829(缓释制剂)；5,653,987(液体制剂)；5,641,515(控释制剂)和5,601,845(球形制剂))；在此将所有专利的全部内容引入作为参考。
本发明还公开了在制药领域中公知的用于包括局部、眼内、鼻内和耳内输送在内的多种药物组合物。药物制剂包括所述活性化合物的水性眼用溶液，其可以诸如滴眼剂的水溶性形式存在，或结冷胶(gellangum)形式(Shedden等人，Clin.Ter.，23(3)440-50(2001))或水凝胶形式(Mayer等人，Ophthalmologica，210(2)101-3(1996))；眼用软膏；眼用混悬剂，例如微粒、悬浮在液体载体介质中的包含药物的小聚合粒子(Joshi，A.1994 J Ocul Pharmacol 1029-45)，脂溶性制剂(Alm等人，Prog Clin.Biol.Res.，312447-58(1989))和微球(Mordenti，Toxicol.Sci.，52(1)101-6(1999))；以及眼用嵌入剂。在此将所有上述参考文献的全部内容引入作为参考。为了稳定性和舒适性，这些合适的药物制剂最经常且优选地组方成无菌的、等渗的和缓冲的。药物组合物也包括滴剂和喷雾剂，将其通常制备成在许多方面模拟鼻分泌物以确保正常纤毛作用的维持。如Remington’s Pharmaceutical Science(MackPublishing，18th Edition)(在此将其全部内容通过参考的方式引入)中所公开的和本领域的技术人员公知的，合适的制剂最经常且优选为等渗的，轻度缓冲的以维持pH5.5-6.5，且最经常且优选地包括抗菌性防腐剂和适当的药物稳定剂。用于耳内输送的药物制剂包括在耳内局部应用的混悬剂和软膏。用于这类耳用制剂的通用溶剂包括甘油和水。
当用作抗癌、抗炎或抗微生物的化合物时，例如，所述的通式I-V化合物或包括通式I-V的组合物可通过口服或非口服途径给药。当口服给药时，其可以以胶囊、片剂、颗粒剂、喷雾剂、糖浆剂或其它这类剂型给药。当非口服给药时，其可作为水性混悬液、油性制剂或类似形式给药，或作为滴剂、栓剂、油膏剂、软膏剂或类似形式给药，通过皮下、腹膜内、静脉内、肌内或类似方式注射给药。
在一实施方案中，所述的抗癌剂、抗炎剂或抗微生物剂可与另外的物质混合以加强它们效果的。在一实施方案中，所述的抗微生物剂与另外的抗微生物剂组合。在另一实施方案中，所述的抗微生物剂与对正服用抗微生物剂的患者有益的药物或药剂联合。
给药方法 在可选的实施方案中，所公开的化合物和所公开的药物组合物作为抗微生物剂通过特定的方法给药。这类方法包括但不限于(a)通过口服途径给药，该给药方式包括以胶囊、片剂、颗粒剂、喷雾剂、糖浆剂或其它这类剂型给药；(b)通过非口服途径给药，该给药方式包括作为水性悬浮液、油性制剂或类似剂型或作为滴剂、栓剂、油膏剂、软膏剂或类似剂型给药；通过皮下、腹膜内、静脉内、肌内、皮内或类似方式以注射给药；以及本领域中的技术人员认为适当的方式进行(c)局部给药，(d)经直肠给药，或(e)阴道内给药，从而使本实施方案的所述化合物与活组织接触；以及(f)通过控释制剂、储库(depot)制剂和输注泵输送给药。作为这类给药方式的另外例子和作为另外公开的给药方式，本发明公开了所述公开的化合物和药物组合物的多种给药方法，包括通过眼内的、鼻内的和耳内途径的给药方式。
作为剂量要求的包括所述化合物、包括通式I-VI化合物的组合物的药物有效剂量依赖于给药途径、被治疗动物的类型(包括人)，以及特定动物的身体特征都是要考虑的。可调整所述剂量以实现预期效果，但是依赖于下列因素例如体重、饮食、同时的药物治疗和在医药领域的技术人员公认的其它因素。
在实施所述方法的实施方案中，所述的产物或组合物可单独使用或互相联合使用，或与其它的治疗试剂或诊断试剂联合使用。这些产物可在体内应用，通常在哺乳动物体内，优选在人体内，或在体外应用。在体内应用时，所述产物或组合物可采用多种剂型以多种途径对哺乳动物给药，包括非肠道、静脉内、皮下、肌内、结肠、直肠、阴道、鼻或腹膜内给药。这些方法也可以在体内应用测试化学活性。
正如本领域的技术人员所显而易见的，用于体内给药的剂量和具体的给药方式将依赖于所治疗的哺乳动物的年龄、体重和种类，所使用的具体化合物和使用这些化合物的具体用途而变化。本领域的技术人员采用常规药理学方法实现有效剂量水平即实现预期结果所必需的剂量水平的确定。通常，以较低剂量水平开始进行产物的人体临床应用，随着剂量水平的增加直到实现所预期的效果。可选择地，采用已确定的药理学方法，使用可接受的体外研究来建立本方法鉴定的组合物的有用剂量和给药途径。
在非人动物研究中，潜在产物的应用以高剂量水平开始，随着减少剂量直到不再实现所预期的效果或不良副作用消失。依赖于所预期的效果和治疗学指征，剂量范围可较宽泛。通常，剂量可以为约10微克/公斤体重至100毫克/公斤体重，优选为约100微克/公斤体重至10毫克/公斤体重。可选择地，正如本领域的技术人员理解的，剂量可基于和按照所述患者的表面积计算。优选地以每天一次或每天两次口服给药。
各医师可根据患者的情况来选择确切的制剂、给药方式和剂量。参见例如，例如Fingl等的The Pharmacological Basis of Therapeutics(治疗学的药理学基础)，1975，在此将其全部内容引入作为参考。需要指出的是，因为毒性或器官功能紊乱，主治医师将知道如何且何时终止、中断或调整给药。相反，如果临床反应不充分(排除毒性)，该主治医师也应该知道将治疗调整到更高的水平。在控制所关注病症时采用的给药剂量量值将随待治疗的疾病状态的严重性和给药途径而变化。可例如部分通过标准预后评价法来评价所述疾病状态的严重性。此外，所述剂量和可能的剂量频率也根据个体患者的年龄、体重和反应而变化。与上述讨论方案相当的方案可用于兽医学中。
依赖于所治疗的具体疾病状态，可将这类试剂组方并全身地或局部地给药。用于组方和给药的各种技术可在“Remington’sPharmaceutical Sciences”(雷明顿制药学)，18th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)中找到，在此将其全部内容引入作为参考。适合的给药途径也包括口服、直肠、经皮肤、阴道、透膜或肠内给药；非肠道输送，包括肌内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
对于注射，可将所述实施方案的试剂组方在水性溶液中，优选在诸如Hanks′溶液、Ringer′s溶液或生理盐水缓冲液的生理相容性缓冲液中。对于这类透膜给药，在所述制剂中使用适于通透屏障的渗透剂。这类渗透剂在本领域中是广泛公知的。所述实施方案的范围包括使用药物可接受的载体将用于实施所述实施方案的本发明公开的所述化合物组方成适合全身给药的剂型。选择适合的载体和适当的制造方法，本发明公开的所述组合物，特别是组方为溶液的组合物，可经非肠道给药，例如通过静脉注射给药。利用本领域公知的药物可接受的载体可易于将所述化合物组方成适合口服给药的剂型。所述载体能够将所述实施方案中的化合物组方为片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬液等等，用于待治疗患者的口服摄取。
可采用本领域所属技术人员公知的技术将旨在细胞内给药的试剂进行给药。例如，可将这类试剂包囊进脂质体，然后按上述方法给药。在脂质体形成的时候存在于水溶液中的所有分子都被结合在水性内部中。所述脂质体的内含物不仅受到保护而不受外部微小环境的影响，且因为脂质体与细胞膜融合，所以该内含物被有效地输送至细胞质内。另外，由于小的有机分子的疏水性，它们可直接进行细胞内给药。
对有效量的确定是本领域所属技术人员的能力范围内，尤其是根据本发明提供的详细的公开内容来确定。除所述的活性成分外，这些药物组合物可包含包括赋形剂和辅助剂的适当的药物可接受的载体，其促进所述的活性化合物加工成可药用的制剂。组方成口服给药的制剂可以是片剂、糖衣片、胶囊或溶液形式。所述药物组合物可以以其自身公知的方式加工，例如，通过常规混合、溶解、制粒、制成糖衣剂、悬浮、乳化、包囊、包封(entrap)或冻干法。
应用公知的方法可对本发明公开的化合物药效和毒性进行评价。例如，可以通过在体外测定对细胞系(诸如哺乳动物的且优选人的细胞系)的毒性来建立具体化合物或共享某些化学部分的该化合物子集的毒理学。这类研究的结果通常可预测动物体内，如哺乳动物或更明确地是人体内的毒性。可选择地，可利用公知的方法测定具体化合物在诸如小鼠、家兔、狗或猴子的动物模型中的毒性。可使用多种本领域公认的方法来确定具体化合物的有效性，这些方法例如体外方法、动物模型或人体临床试验。基本上对每一类疾病状态都存在着本领域公认的体外模型，所述疾病状态包括由本发明公开的所述化合物减轻的疾病状态，包括癌症、心血管疾病和多种免疫功能紊乱及感染性疾病。相似地，可接受的动物模型可用于建立治疗所述疾病状态的化学药物的有效性。当选择模型以确定有效性时，本领域所属技术人员可在本领域的知识指导下选择合适的模型、剂量、和给药途径及方案。当然，人体临床试验也可以用于测定化合物在人体内的有效性。
当用作抗微生物剂、抗癌剂或抗炎剂时，本发明公开的所述化合物可通过口服或非口服途径给药。当口服给药时，其可以以胶囊、片剂、颗粒剂、喷雾剂、糖浆剂或其它这类剂型给药。当非口服给药时，其可以作为水性悬浮液、油性制剂或类似形式，或作为滴剂、栓剂、油膏剂、软膏剂或类似形式给药，当注射给药时，通过皮下、腹膜内、静脉内、肌内、皮内或类似形式给药。同样了考虑控释制剂、储库制剂和输注泵输送。
药物组合物中的本发明公开的组合物也可包括药物可接受的载体。可将这类组合物制备用于贮存和随后的给药。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域是公知的，且例如，在《雷明顿制药学》，Mack出版公司(A.R.Gennaro编辑1985)一书中描述。例如，可将这类组合物组方且用作用于口服给药的片剂、胶囊或溶液；用于直肠或阴道给药的栓剂；用于注射给药的灭菌溶液或混悬液。可将注射剂制备成下列常规形式作为溶液或混悬液、在注射前适合在液体中制成溶液或混悬液的固体剂型，或作为乳剂。适合的赋形剂包括但不限于盐水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸钠、半胱氨酸盐酸盐等等。另外，如果需要，所述的注射用药药物组合物可包含少量的无毒性辅助物，例如湿润剂、pH缓冲剂等等。如果需要，也可使用吸收增强制剂(例如，脂质体)。
作为剂量所要求的所述组合物的药物有效量将依赖于给药途径、被治疗的动物类型以及特定动物的身体特征都是要考虑的。可调整所述剂量来实现预期效果，但是依赖于下列因素例如体重、饮食、同时的药物治疗和在医药领域的技术人员公认的其它因素。
上述的所述实施方案的产物或组合物可单独使用或互相联合使用，或与其它的治疗试剂或诊断试剂联合使用。这些产物可在体内或体外利用。所述的有用剂量和最有用的给药模式将依赖于年龄、体重和被治疗的动物、使用的具体化合物和使用这些组合物或多种组合物的具体用途而变化。在具体病症的处理或治疗中采用的剂量量值将随待治疗的疾病状态的严重性和给药途径而变化，且依赖于所述疾病状态和它们的严重性，可将所述组合物组方并全身或局部给药。用于组方和给药的各种技术可在《雷明顿制药学》，Mack出版公司，Easton，PA(1990)一书中找到。
为了将通式I-VI的化合物组方为抗微生物剂、抗癌剂或抗炎剂，可使用公知的表面活性剂、赋形剂、光滑剂、助悬剂和药物可接受的成膜物质和包衣辅助剂等。醇类、酯类、硫酸化脂肪醇类等等可优选地用作表面活性剂；蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、结晶的纤维素、甘露醇、轻质无水硅酸盐、铝酸镁、铝酸甲基硅酸镁、合成的硅酸铝、碳酸钙、酸式碳酸钠、磷酸氢钙、羧甲基纤维素钙等等可用作赋形剂；硬脂酸镁、滑石、硬化油等等可用作光滑剂；椰子油、橄榄油、芝麻油、花生油、大豆油可用作助悬剂或润滑剂；作为诸如纤维素或糖等碳水化合物的衍生物的醋酸邻苯二甲酸纤维素，或作为聚乙烯的衍生物的乙酸甲酯-异丁烯酸共聚物可用作助悬剂；且诸如邻苯二甲酸酯等等的增塑剂可用作助悬剂。除了前述优选的成分外，可将甜味剂、芳香剂、着色剂、防腐剂等等加入到通过所述实施方案的方法产生的化合物的给药制剂中，特别是所述化合物是口服给药的。
所述化合物和组合物可按如下剂量对人类患者进行口服或非口服给药约0.001mg/kg/天至约10,000mg/kg/天所述活性成分，且更优选为约0.1mg/kg/天至约100mg/kg/天活性效成分，优选以每天一次给药，较次优选以每天超过两次至约十次给药。可选择地且也优选地，通过所述实施方案产生的所述化合物可优选地通过例如静脉滴注以一定的量连续给药。因此，对于例如体重70公斤的患者，所述活性的或抗感染成分的优选日剂量为约0.07mg/天至约700g/天，且更优选为7mg/天至约7g/天。但是，本领域所属技术人员可理解，在某些情况下可能需要给药剂量超过或甚至远远超过上述剂量范围的所述实施方案的抗癌、抗炎或抗感染化合物，以有效地且积极地治疗特定的晚期癌症或传染病。
当使用所述实施方案的方法产生的抗微生物剂作为生化测试试剂时，当将通过所述实施方案的方法产生的化合物溶于有机溶剂或含水有机溶剂中时且直接用于任何不同的培养细胞体系中时，其抑制所述疾病的进展。可用的有机溶剂包括，例如，甲醇、二甲基亚砜等。所述制剂可以是，例如，粉剂、颗粒剂或其它固体抑制剂，或使用有机溶剂或含水有机溶剂制备的液体抑制剂。尽管由所述实施方案的方法产生的化合物用作抗微生物化合物时，其优选浓度通常为约1μg/ml至约100μg/ml，但是本领域所属技术人员能够理解最适当的使用量将根据培养细胞体系的类型和使用目的而变化。在某些应用中，本领域所属技术人员可能需要或优选使用超过上述范围的剂量。
在一个实施方案中，将化合物用作抗微生物剂、抗癌剂或抗炎剂的方法涉及将有效量的任何通式I-VI化合物或这些化合物的组合物进行给药。在优选的实施方案中，所述方法包括向将通式II表示的化合物向需要抗微生物剂的患者给药，直到该需要被有效地减少或更优选地消除。
本领域所属技术人员应理解，“需要”不是绝对的术语且只含有所述患者可从使用中的所述抗微生物剂、抗癌剂或抗炎剂的治疗中受益的意思。“患者”的含意是从所述抗微生物剂、抗癌剂或抗炎剂的使用中受益的生物体。例如，患有炭疽杆菌、疟原虫、利什曼原虫、锥虫等等的任何生物体可从应用抗微生物剂、该抗微生物剂进而减少存在于患者体内的微生物量中受益。作为另一例子，患有癌症的任何生物体可从应用抗癌剂、该抗癌剂进而减少存在于所述患者体内的癌的量中受益，所述癌症例如结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤等等。此外，患有炎症性疾病状态的任何生物体可从使用抗炎剂、该抗炎剂从而减少存在于所述患者体内的与所述炎症应答相关的细胞数量中受益，所述炎症性疾病状态例如类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化症、银屑病、中风、再灌注损伤、心肌梗塞等等。在一个实施方案中，所述患者的健康状态可以不需要给药的抗微生物剂、抗癌剂或抗炎剂，但是，该患者可依然从存在于患者体内的微生物、癌细胞或炎症细胞的水平的减少获得一些益处，因而需要该抗微生物剂、抗癌剂或抗炎剂。在一个实施方案中，所述的抗微生物剂或抗癌剂在抗一种类型的微生物或癌是有效的，但是抗其它类型的微生物或癌是无效的；因此允许在所述患者的治疗中的高度选择性。在其它实施方案中，所述抗炎剂对由与所述炎症相关的不同细胞表征的炎症性疾病状态是有效的。在选择这类抗微生物剂、抗癌剂或抗炎剂中，可使用在实施例中公开的方法和结果。在可选择的实施方案中，所述的抗微生物剂对宿主生物体中的广谱微生物是有效的，优选为广谱的外来细菌，且更优选为有害细菌。在实施方案中，所述的抗癌剂和/或抗炎剂对广谱的癌症和炎症性疾病状态/细胞/物质是有效的。在另外的实施方案中，所述的抗微生物对所有的微生物，甚至是宿主天生的微生物是有效的。可以是抗微生物剂的靶的微生物例子包括但不局限于炭疽杆菌、疟原虫、利什曼原虫、锥虫等。在另外的实施方案中，所述的抗癌剂对广谱的癌症或所有癌症是有效的。所述化合物对其是有效的癌症例子包括结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤等等。所述试剂对其是有效的示例性炎症性疾病状态包括类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化症、银屑病、中风、心肌梗塞等等。
“治疗有效量”、“药物有效量”或相似的术语指导致细胞的、组织的、全身的、动物的或人的正寻求的生物或医学反应的所述药物或药用试剂的量。在优选的实施方案中，所述的医学反应是由研究人员、兽医、医学博士或其它临床医师寻求的反应。
“抗微生物剂”指的是减小微生物的存活可能性或阻断或减轻微生物的有害作用的化合物。在一个实施方案中，将所述的存活可能性确定为个体微生物的函数；因此，所述抗微生物剂将增加个体微生物死亡的可能性。在一个实施方案中，将所述的存活可能性确定为微生物群体的函数，因此所述抗微生物剂将增加所述微生物群体减少的可能性。在一个实施方案中，抗微生物剂指的是抗生素或其它相似术语。这类抗微生物剂能够阻断有害作用、破坏或抑制诸如细菌的微生物的生长或繁殖。例如，这类抗菌药物或其它抗微生物剂在“Antibiotics，Chemotherapeutics and Antibacterial Agents for Disease Control”(用于疾病控制的抗菌素，化学疗法和抗菌剂)(M.Grayson，编辑，1982)，和E.Gale等人的“The Molecular Basis of Antibiotic Action”(抗菌素作用的分子基础)，第二版(1981)书中进行了描述。在另一实施方案中，抗微生物剂不改变存活的可能性，但是改变所述微生物以某一方式对宿主有害的可能性。例如，如果所述微生物分泌对宿主有害的物质，则所述抗微生物剂可作用于该微生物使其停止分泌或中和或阻断该有害作用。在一个实施方案中，虽然抗微生物剂增加了微生物死亡的可能性，但其对周围、非微生物、细胞是最低限度地有害的。在可选择的实施方案中，所述抗微生物剂对周围、非微生物、细胞是如何地有害是不重要的，只要它减少所述微生物的存活可能性。
“抗癌剂”指的是减少癌细胞存活可能性的化合物或包含该化合物的组合物。在一个实施方案中，将所述的存活可能性确定为个体癌细胞的函数；因此，所述抗癌剂将增加该个体癌细胞死亡的可能性。在一个实施方案中，将所述的存活可能性确定为癌细胞群体的函数，因此所述抗癌将增加该癌细胞群体减少的可能性。在一实施方案中，抗癌剂意思是化学治疗剂或其它相似术语。
“化学治疗剂”是在诸如癌症的肿瘤性疾病的治疗中有用的化合物。化学治疗剂的例子包括烷化剂，如氮芥、乙烯亚胺和甲基蜜胺，烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯、叶酸拮抗物、核苷酸代谢的抗代谢物、抗生素、嘧啶类似物、5-氟尿嘧啶、顺铂、嘌呤核苷、胺、氨基酸、三唑核苷、皮质激素，天然产物，例如长春花生物碱、鬼臼乙叉甙、抗生素、酶、紫杉烷和生物反应调节剂或生物反应调节剂的抗体或其它试剂；混杂的试剂，例如铂配位络合物、蒽醌、蒽环类抗生素、取代的尿素、甲基肼衍生物、或肾上腺皮质的抑制剂；或者激素或拮抗剂，例如肾上腺皮质类固醇、黄体酮、雌激素、抗雌激素剂、雄激素、抗雄激素物质、或促性腺激素(gouadotropin)-释放激素类似物。具体的例子包括阿霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、塞替派、白消安、细胞毒素(Cytoxin)、紫杉醇、紫杉特尔(Toxotere)、甲氨喋呤、顺铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、道诺霉素、去甲基柔红霉素、氨基喋呤、放线菌素D、丝裂霉素、烯二炔类(Esperamicin)、美法仑和其它相关的氮芥。在这个定义中也包括调节或抑制肿瘤上的激素作用的激素试剂，例如它莫西芬和奥那司酮。
所述抗癌剂可直接作用于癌细胞以杀死该细胞、诱发该细胞死亡、阻止该细胞分裂等等。可选择地，所述的抗癌剂可例如通过限制供给该细胞的营养或血液间接地作用于所述癌细胞。这类抗癌剂能够破坏或抑制所述癌细胞的生长或复制的能力，该癌细胞例如结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤等等。
“肿瘤性疾病”或“肿瘤”指的是通过比正常组织更多的细胞增殖表现出异常生长的细胞或细胞的群体，包括肿瘤或组织(包括诸如骨髓细胞的悬液和诸如血或血清的流体)。肿瘤可以是良性的或恶性的。
“炎症性疾病状态”包括，例如，缺血、败血症性休克、自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、炎症性肠病、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、哮喘、骨关节炎、骨质疏松症、纤维化疾病，皮肤病、包括银屑病、异位性皮炎和紫外线照射(UV)诱发的皮肤损害、银屑病关节炎、强直性脊椎炎、组织和器官排异反应、阿耳茨海默(氏)病、中风、动脉粥样硬化、再狭窄、糖尿病、肾小球肾炎、癌、霍奇金病、恶病质，与感染和某些病毒感染相关的炎症、包括获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、成人呼吸窘迫综合征和共济失调。
在一个实施方案中，所述的化合物，优选为含有通式I-VI的化合物，包括本发明描述的化合物，如果该化合物可影响10％的所述微生物、癌细胞或炎症细胞，就认为其是有效的抗微生物剂、抗癌剂或抗炎剂。在更优选的实施方案中，如果所述化合物可影响10％-50％的所述微生物、癌细胞或炎症细胞，则该化合物是有效的。在甚至更优选的实施方案中，如果所述化合物可影响50％-80％的所述微生物、癌细胞或炎症细胞，则该化合物是有效的。在甚至更优选的实施方案中，如果所述化合物可影响80％-95％的所述微生物、癌细胞或炎症细胞，则该化合物是有效的。在甚至更优选的实施方案中，如果所述化合物可影响95％-99％的所述微生物、癌细胞或炎症细胞，则该化合物是有效的。通过每个化合物的作用机理定义“影响”。因此，例如，如果化合物阻止所述微生物的复制，则影响是测定阻止复制。同样地，如果化合物破坏微生物，则影响是测定微生物死亡。也例如，如果化合物阻止癌细胞分裂，则影响是测定阻止癌细胞分裂。另外地，例如，如果化合物阻止炎症细胞的增殖，则影响是测定阻止炎症细胞增殖。并非所有的作用机理需要相同的作用百分比。在可选择的实施方案中，如果较低的作用度被诸如该化合物的特异性等其它因素弥补，则低的作用百分比可以是合适的。因此，例如，化合物只有10％的效果，但是表现出对宿主或无害微生物或细胞无任何有害副作用，仍可以考虑该化合物的有效性。
在一个实施方案中，本发明描述的化合物可简单给药以除去微生物、癌细胞或炎症细胞，且无需向患者给药。例如，在微生物出现问题的某些情况中，例如在食品中，本发明描述的化合物可直接应用于该食品以减少微生物在该食品中的危险。可选择地，所述化合物可用于减少存在于诸如操作表面等周围环境中的微生物水平。作为另一实例，所述化合物可先体外后体内(ex vivo)地对诸如骨髓或干细胞移植等细胞样品给药，以确保只有非癌性细胞被引入受者。在所述化合物给药后，它们可任选地被除去。这在某些情况中是特别适合的，该情况是操作表面或食品可以与有被所述化合物破坏风险的其它表面或有机体接触。在可选择的实施方案中，考虑到更多的保护，可将所述化合物遗留在所述食品中或操作表面上。是否进行这种选择，则依赖于情况的相对需要以及与所述化合物相关的风险，这在下面叙述的实施例中部分确定。
下列非限制性实施例是对所述方法的优选实施方案的描述。本领域所属技术人员应确信无疑存在有具体实施方法的细节以及所获得的精确化学组合物的变体。
实施例 实施例1 采用菌株CNB476发酵产生式I-7、II-16、II-17、II-20、II-24C、II-26和II-28的化合物 将菌株CNB476生长在含有100ml营养培养基的500ml烧瓶中，该营养培养基由每升去离子水中的以下成分组成葡萄糖，4g；Bacto胰蛋白胨，3g；Bacto酪胨，5g；和合成的海盐(Instant Ocean，AquariumSystems)，30g。在28℃下，将第一种子培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育3天。将每5毫升的第一种子培养物接种在含有100ml所述营养培养基的三个500ml烧瓶中。在28℃下，将第二种子培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育2天。将每5毫升的第二种子培养物接种在含有100ml所述营养培养基的35个500ml烧瓶中。在28℃下，将第三种子培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育2天。将每5毫升的第三种子培养物接种在含有100ml生产培养基A的400个500ml烧瓶中，该生产培养基A由每升去离子水中的以下成分组成淀粉，10g；酵母提取物，4g；Hy-Soy，4g；硫酸铁，40mg；溴化钾，100mg；碳酸钙，1g；和合成的海盐(Instant Ocean，AquariumSystems)，30g。在28℃下将该生产培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育1天。将约2-3g的无菌Amberlite XAD-7树脂加入该生产培养物中。在28℃下，将该生产培养物进一步在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育5天，获得约200mg/L滴定度的化合物II-16。用乳酪布过滤该培养发酵液来回收该Amberlite XAD-7树脂。用6升的乙酸乙酯提取该树脂2次，接着用1.5升的乙酸乙酯提取1次。真空干燥该混合后的提取物。然后将含有3.8g式II-16化合物和较少量的II-20和II-24C化合物的该干燥的提取物进行处理，以回收式I-7、II-16、II-20、II-24C、II-26和II-28化合物。
实施例2 采用菌株NPS21184发酵产生式I-7、II-16、II-17、II-20、II-24C、II-26和II-28化合物 将菌株NPS21184生长在含有100ml营养培养基的500ml烧瓶中，该营养培养基由每升去离子水中的以下成分组成葡萄糖，8g；酵母提取物，6g；Hy-Soy，6g；和合成的海盐(Instant Ocean，AquariumSystems)，30g。在28℃下，将第一种子培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育3天。将5毫升的第一种子培养物接种在含有100ml所述营养培养基的500ml烧瓶中。在28℃下，将第二种子培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育2天。将每5毫升的第二种子培养物接种在含有100ml所述营养培养基的500ml烧瓶中。在28℃下，将第三种子培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育2天。将每5毫升的第三种子培养物接种在含有100ml生产培养基B的500ml烧瓶中，该生产培养基B由每升去离子水中的以下成分组成淀粉，20g；酵母提取物，4g；Hy-Soy，8g；硫酸铁，40mg；溴化钾，100mg；碳酸钙，1g；和合成的海盐(Instant Ocean，Aquarium Systems)，30g。在28℃下将该生产培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育1天。将约2-3g的无菌Amberlite XAD-7树脂加入该生产培养物中。在28℃下，将该生产培养物进一步在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育4天，获得350-400mg/L滴定度的化合物II-16。
可选择地，采用菌株NPS21184在42L发酵罐体系中完成所述化合物的产生。将菌株NPS21184生长在含有100ml营养培养基的500ml烧瓶中，该营养培养基由每升去离子水中的以下成分组成葡萄糖，8g；酵母提取物，6g；Hy-Soy，6g；和合成的海盐(Instant Ocean，AquariumSystems)，30g。在28℃下，将第一种子培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育3天。将5毫升的第一种子培养物接种在含有100ml所述营养培养基的500ml烧瓶中。在28℃下，将第二种子培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育2天。将每20毫升的第二种子培养物接种在含有400ml所述营养培养基的2.8L Fernbach烧瓶中。在28℃下，将第三种子培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育2天。将1.2L第三种子培养物接种在含有26L生产培养基A的42L发酵罐中，也可使用生产培养基B和具有下列组成的生长培养基C。生产培养基C由每升去离子水中的以下成分组成淀粉，15g；酵母提取物，6g；Hy-Soy，6g；硫酸铁，40mg；溴化钾，100mg；碳酸钙，1g；和合成的海盐(Instant Ocean，Aquarium Systems)，30g。将该发酵罐培养物在如下参数下进行操作温度，28℃；搅拌，200rpm；通气，13L/min及反压，4.5psi。在生产循环的36-44小时时，将约600g无菌Amberlite XAD-7树脂加入该培养罐发酵物中。将该生产培养物进一步在上述操作参数下进行孵育，直到生产循环的第4天。将通气速率降至8L/min。在生产循环的第5天时，该发酵罐培养物产生约300mg/L滴定度的化合物II-16。用乳酪布过滤该培养发酵液来回收该AmberliteXAD-7树脂。用4.5升的乙酸乙酯提取该树脂2次，接着用1.5升的乙酸乙酯提取1次。真空干燥该混合后的提取物。然后将干燥后的提取物进行处理，以回收式I-7、II-16、II-17、II-20、II-24C、II-26和II-28化合物。
实施例3 式I-7、II-16、II-20、II-24C、II-26和II-28化合物的纯化3A式II-16、II-20、II-24C、II-26和II-28化合物的纯化 通过快速色谱及随后的HPLC获得纯化合物II-16和式II-20、II-24C、II-26和II-28的化合物。采用Biotage Flash40i系统和Flash 40M柱(KP-Sil Silica，32-63μm，90g)，通过快速色谱处理含有3.8g化合物II-16和较少量的II-20、II-24C、II-26和II-28的8g粗提取物。该快速色谱通过如下不连续梯度进行洗脱 1.己烷(1L) 2.含有10％乙酸乙酯的己烷(1L) 3.含有20％乙酸乙酯的己烷，第一洗脱(1L) 4.含有20％乙酸乙酯的己烷，第二洗脱(1L) 5.含有20％乙酸乙酯的己烷，第三洗脱(1L) 6.含有25％乙酸乙酯的己烷(1L) 7.含有50％乙酸乙酯的己烷(1L) 8.乙酸乙酯(1L) 将经HPLC确认以大于或等于70％UV纯度含有化合物II-16的部分合并，并经过如下所述HPLC纯化，获得II-16以及II-20和II-24C，每一个均为纯化合物。
将富集化合物II-16的部分(如上所述；对于化合物II-16约70％纯)溶于丙酮中(60mg/ml)。该溶液的一部分(950μl)注入采用上述条件的正相HPLC柱上。化合物II-16通常在14分钟后洗脱，以及化合物II-24C和II-26在11分钟时作为单峰共洗脱。当对含有化合物II-17、II-20和II-28的母体样品进行处理时，在100％乙酸乙酯洗脱过程中，化合物II-17在22分钟时洗脱，而II-20和II-28在23分钟时共洗脱。基于存在的化合物的组成，将含有化合物II-16和少量类似物的部分合并，并在减压下在旋转蒸发器上蒸发。该过程产生纯化合物A，以及含有少量的化合物II-20、II-24C、II-26和II-28的分离部分，如下所述将该分离部分进一步进行纯化。
采用如下的反相制备HPLC，进一步分离从上述过程中产生的含有II-24C和II-26的样品。将含有II-24C的样品(70mg)以10mg/ml的浓度溶于乙腈中，然后将500μl溶液装载在尺寸21mm i.d.、15cm长、含有Eclipse XDB-C18载体的HPLC柱上。溶剂梯度在23分钟内以14.5ml/min流速从15％乙腈/85％水线性地增加到100％乙腈。该溶剂组合物在返回到起始溶剂混合物之前以100％乙腈维持3分钟。在这些条件下化合物II-26在17.5分钟时洗脱，而化合物II-24C在19分钟时洗脱。
采用蒸汽扩散法获得结晶II-26。将化合物II-26(15mg)溶于在1.5ml v-底HPLC管形瓶内的100μl丙酮中。然后将该管形瓶置于含有1ml戊烷的较大的密封的容器中。在4℃下，在孵育48小时后，沿着该内部管形瓶的壁和底部观察到适合X-射线晶体学实验的晶体。在UCSD晶体学实验室中，在Bruker SMART APEX CCD X-射线衍射仪(F(000)＝2656、MoKα射线，λ＝0.71073

μ＝0.264mm-1、T＝100K)上收集晶体学数据，以及所使用的修正方法为在F2上的全矩阵最小二乘方。结晶数据NPI-2065C15H20ClNO4，MW＝313.77，正方晶系，空间群P4(1)2(1)2，a＝b＝11.4901(3)

c＝46.444(2)

α＝β＝γ＝90°、vol＝6131.6(3)

Z＝16、ρcalcd＝1.360g cm-3，晶体大小，0.30×0.15×0.07mm3、θ范围，1.75-26.00°，采集35367反射，6025独立反射(Rint＝0.0480)，最终R指数(I＞2σ(I))R1＝0.0369，wR2＝0.0794，GOF＝1.060。
为了从II-20中分离II-28，采用反相等强度(isocratic)法。将含有两种化合物的样品(69.2mg)溶于乙腈中至浓度为10mg/ml，每次注射将500μl装载在反相HPLC柱(ACE 5 C18-HL，15cm×21mm ID)上。27％乙腈/63％水的等强度溶剂系统以14.5ml/min的流速用于分离化合物II-28和II-20，它们分别在14分钟和16分钟后洗脱。在室温时，在减压下，将含有感兴趣的化合物的部分立即在旋转蒸发器上蒸发。然后将样品装载在小硅胶柱上，并用10ml的70％己烷/30％丙酮洗脱，以除去另外的杂质。
也可用100％EtOAc研磨由上述的制备正相HPLC方法产生的含有II-20但不含有II-28的样品，以除去少量的亲脂性杂质。
式II-16化合物UV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm。低分辨率质谱(lowRes.Mass)m/z 314(M+H)，336(M+Na)。
式II-20化合物UV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm。低分辨率质谱m/z 226(M+H)；HRMS(ESI)，m/z 266.1396(M+H)，Δcalc＝1.2ppm。图7描述了具有式II-20结构的化合物的1H NMR图谱。
式II-24C化合物UV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm。
低分辨率质谱m/z 328(M+H)，350(M+Na)；HRMS(ESI)，m/z328.1309(M+H)，Δcalc＝-2.0ppm，C16H23NO4Cl。图8描述了具有式II-24C结构的化合物的1H NMR图谱。
式II-26化合物UV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm；HRMS(ESI)，m/z314.1158(M+H)，Δcalc＝-0.4ppm，C15H21NO4Cl；图51描述了具有式II-26结构的化合物在DMSO-d6中的1H NMR图谱。图52描述了具有式II-26结构的化合物的计算机产生的ORTEP图。
式II-28化合物UV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm；HRMS(ESI)，m/z266.1388(M+H)，Δcalc＝-1.8ppm，C14H20NO4。图54描述了具有式II-28结构的化合物在DMSO-d6中的1H NMR图谱。
3B式I-7化合物的纯化 Biotage Flash 75Li系统和Flash 75L KP-Sil柱用于处理已过滤的富含化合物II-16和含有式I-7化合物的粗提取物(10.0g)。将该粗提取物溶解在丙酮中至浓度为107mg/ml，并直接装载在该柱上。然后将如下溶剂不连续梯度以235ml/min至250ml/min的流速流经该柱 1.含10％EtOAc的正庚烷(3.2L) 2.含25％EtOAc的正庚烷(16L) 3.含30％EtOAc的正庚烷(5.4L) 将富含化合物II-16的部分合并并通过旋转蒸发仪浓缩，直到剩余约5％的总的混合后的溶剂体积。将溶剂除去，留下白色固体。
然后通过将样品(4.56g)溶于1∶1丙酮∶正庚烷(910ml)中，对该固体进行结晶。使用旋转蒸发仪将溶剂缓慢地蒸发，直到溶剂减少至其最初容积的约43％为止。除去溶液(上清液)并将其浓缩(598mg)。
将该上清液溶于丙酮(80mg/ml)中。采用用于正相纯化化合物II-16、II-24C、II-26和II-28的上述条件，将等份的该溶液注射到正相HPLC柱上。式I-7化合物作为纯化合物在7.5分钟时洗脱。
式I-7化合物(图58)UV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm。低分辨率质谱m/z 298(M+H)，320(M+Na)。
实施例4 发酵产生式II-17、II-18和II-27化合物 将菌株CNB476生长在含有100ml第一营养培养基的500ml烧瓶中，该第一营养培养基由每升去离子水中的以下成分组成葡萄糖，4g；Bacto胰蛋白胨，3g；Bacto酪胨，5g；和合成的海盐(Instant Ocean，Aquarium Systems)，30g。在28℃下，将第一种子培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育3天。将5毫升的第一种子培养物接种在含有100ml第二营养培养基的500ml烧瓶中，该第二营养培养基由每升去离子水中的以下成分组成淀粉，10g；酵母提取物，4g；蛋白胨，2g；硫酸铁，40mg；溴化钾，100mg；碳酸钙，1g；和溴化钠，30g。在28℃下，将第二种子培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育7天。将约2-3g的无菌Amberlite XAD-7树脂加入第二种子培养物中。在28℃下，将第二种子培养物进一步在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育2天。将5毫升的第二种子培养物接种在含有100ml第二营养培养基的500ml烧瓶中。在28℃下，将第三种子培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育1天。将约2-3g的无菌AmberliteXAD-7树脂加入第三种子培养物中。在28℃下，将第三种子培养物进一步在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育2天。将5毫升的第三种子培养物接种在含有100ml第二营养培养基的500ml烧瓶中。在28℃下，将第四种子培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育1天。将约2-3g的无菌Amberlite XAD-7树脂加入第四种子培养物中。在28℃下，将第四种子培养物进一步在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育1天。将每5毫升的第四种子培养物接种在含有100ml第二营养培养基的十个500ml烧瓶中。在28℃下，将第五种子培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育1天。将约2-3g的无菌AmberliteXAD-7树脂加入第五种子培养物中。在28℃下，将第五种子培养物进一步在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育3天。将每4毫升的第五种子培养物接种在含有100ml的同第二营养培养基相同组成的生产培养基的150个500ml烧瓶中。也将约2-3g的无菌Amberlite XAD-7树脂加入该生产培养物中。在28℃下，将该生产培养物在以250rpm运转的旋转振荡器中孵育6天。用乳酪布过滤该培养发酵液来回收该Amberlite XAD-7树脂。用3升乙酸乙酯提取该树脂2次，接着用1升的乙酸乙酯提取1次。真空干燥该混合后的提取物。然后将干燥后的含有0.42g式II-17化合物和0.16g式II-18化合物的提取物进行处理，以回收所述化合物。
实施例5 式II-17、II-18和II-27化合物的纯化 由如下描述的反相HPLC获得纯化合物II-17和II-18 将粗提取物(100mg)溶于15ml的乙腈中。将该溶液的一部分(900μl)注入反相HPLC色谱柱中，采用上述条件。化合物II-17和II-18分别在7.5分钟和9分钟时被洗脱。首先采用氮气浓缩含有所述纯化合物的部分来除去有机溶剂。然后将该剩余溶液冷冻和冻干至干燥。
开发了可选择的用于将化合物II-17和II-18纯化的方法以用于较大规模的纯化，该方法涉及在正相VLC柱上分离粗提取物。在这些条件下，对包括化合物II-27在内的足够量的多种次要代谢产物进行鉴别。将所述粗提取物(2.4g)溶于丙酮(10ml)中，并通过真空下干燥将该溶液吸附在硅胶(10cc)上。将所吸附的粗萃取物装载在正相硅胶VLC柱上(250cc硅胶、柱尺寸，直径2.5cm及长度15cm)，用己烷/EtOAc的不连续梯度进行冲洗，以5％的梯度增加己烷的百分比(每梯度100ml溶剂)。大多数化合物II-16在60％己烷/40％EtOAc冲洗中洗脱，而大多数化合物II-17在50％己烷/50％EtOAc冲洗中洗脱。采用由35％ACN/65％H2O组成的恒溶剂系统，采用C18 HPLC色谱仪(ACE5μC 18-HL，150mm×21mm ID)，完成所述化合物的最后分离。在这些条件下，化合物II-27在11分钟时洗脱，化合物II-17在12.00分钟时洗脱，痕量的化合物II-16在23.5分钟时洗脱，以及化合物II-18在25.5分钟时洗脱。不用加热，在真空中将所得到的样品干燥，以除去含水溶剂混合物。发现化合物II-16和化合物II-18的这些样品的光谱数据与由先前的纯化方法制备的样品的光谱数据一致。发现化合物II-18的样品含有8％的内酯水解产物，并通过冲洗正相硅石填料(直径1cm，高度2cm)并采用20％EtOAc/80％己烷(25ml)的溶剂混合物洗脱进行进一步纯化。发现所得到的样品含有纯化合物II-18。
采用以4ml/min的流速经20分钟从100％己烷增加至100％EtOAc的溶剂梯度，采用正相半制备HPLC(Phenomenex Luna Si 10μ，100

250×10mm id)，进一步纯化上述的含有化合物II-27的部分。化合物II-27作为纯化合物在11.5分钟后被洗脱(0.8mg，基于干提取物重量的分离收率为0.03％)。
起始化合物II-17UV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm。高分辨率质谱(APCI)m/z 280.156(M+H)，Δcalc＝2.2ppm，C15H22NO4。图49描述了具有式II-17结构的化合物的1H NMR图谱。
化合物II-18UV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm。高分辨率质谱(APCI)m/z 358.065(M+H)，Δcalc＝-1.9ppm，C15H21NO4Br。图50描述了具有式II-18结构的化合物在DMSO-d6中的1H NMR图谱。
化合物II-27UV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm；MS(HR-ESI)，m/z280.1556(M+H)Δcalc＝2.7ppm(C15H22NO4)；1H NMR(DMSO-d6)参见图53。
实施例6 由II-16制备式II-19化合物 将化合物II-16的样品(250mg)加入碘化钠的丙酮溶液(10ml含1.5g)中且将所得到的混合物搅拌6天。然后将所述溶液用0.45微米注射器式滤器过滤并将0.95ml份的溶液直接注射到正相硅胶HPLC色谱柱上(Phenomenex Luna 10u Silica，25cm×21.2mm)。从未反应的II-16中分离式II-19化合物的HPLC条件采用由24％乙酸乙酯和76％己烷组成的等强度洗脱HPLC方法，在该方法中大部分的化合物II-19在化合物II-16之前2.5分钟洗脱。将10次注射的每一次注射中对等的部分合并，生成35mg化合物II-19。化合物II-19UV(乙腈/水)225(sh)，255(sh)nm；ESMS，m/z 406.0(M+H)；HRMS(ESI)，m/z406.0513[M+H]+，Δcalc＝-0.5ppm，C15H21NO4I；在DMSO-d6中的1HNMR(参见图9)。

实施例7 式II-2、II-3和II-4化合物的合成 可通过催化氢化分别由式II-16、II-17和II-18化合物合成式II-2、II-3和II-4化合物。
合成的示例性说明
II-16R＝Cl II-2R＝ClII-17R＝H II-3R＝HII-18R＝Br II-4；R＝Br 实施例7A式II-16化合物的催化氢化 将式II-16化合物(10mg)溶于闪烁管(20mL)中的丙酮(5mL)中，向管中加入10％(w/w)Pd/C(1-2mg)和磁力搅拌子。在室温下在氢气氛中搅拌该反应混合物约15小时。用3cc硅胶柱过滤该反应混合物，并用丙酮洗涤。再用0.2μm Gelman Acrodisc过滤该滤液以除去任何痕量的催化剂。在减压下蒸除该滤液中的溶剂，生成纯的白色粉末状的式II-2化合物。UV(乙腈/水)225(sh)，255(sh)nm。图10描述了式II-2化合物在DMSO-d6中的NMR图谱。图11描述了式II-2化合物的低分辨率质谱m/z 316(M+H)、338(M+Na)。
实施例7B式II-17化合物的催化氢化 将式II-17化合物(5mg)溶于闪烁管(20mL)内的丙酮(3ml)中，向管中加入10％(w/w)Pd/C(约1mg)和磁力搅拌子。在室温下在氢气氛中搅拌该反应混合物约15小时。用0.2μm Gelman Acrodisc过滤该反应混合物以除去催化剂。蒸除该滤液中的溶剂，生成白色粉末状的式II-3化合物，该化合物采用如下条件通过正相HPLC进行纯化 色谱柱Phenomenex Luna 10μ Silica 尺寸 25cm×21.2mm ID 流速 14.5ml/min 检测器ELSD 溶剂 19分钟内5％到60％EtOAc/己烷；1分钟内60％到 100％EtOAc；然后100％EtOAc，持续4分钟 式II-3化合物在22.5分钟时作为纯化合物被洗脱。UV(乙腈/水)225(sh)，255(sh)nm。图12描述了式II-3化合物在DMSO-d6中的NMR图谱。图13描述了式II-3化合物的低分辨率质谱m/z 282(M+H)、304(M+Na)。
实施例7C式II-18化合物的催化氢化 将3.2mg式II-18化合物溶于闪烁管(20mL)内的丙酮(3ml)中，向管中加入10％(w/w)Pd/C(约1mg)和磁力搅拌子。在室温下在氢气氛中搅拌该反应混合物约15小时。用0.2μm Gelman Acrodisc过滤该反应混合物以除去催化剂。蒸除该滤液中的溶剂，生成白色粉末状的式II-4化合物，该化合物通过正相HPLC采用如下条件进行纯化 色谱柱 Phenomenex Luna 10μ Silica 尺寸25cm×21.2mm ID 流速14.5ml/min 检测器 ELSD 溶剂19分钟内5％到80％EtOAc/己烷；1分钟内80％到100％EtOAc；然后100％EtOAc，持续4分钟 式II-4化合物在16.5分钟时作为纯化合物被洗脱。UV(乙腈/水)225(sh)，255(sh)nm。图14描述了式II-4化合物在DMSO-d6中的NMR图谱。图15描述了式II-4化合物的低分辨率质谱m/z 360(M+H)、382(M+Na)。
另外，获得了化合物II-2、II-3和II-4的高分辨率质谱数据。化合物II-2HRMS(ESI)，m/z 316.1305[M+H]+，Δcalc＝-3.5ppm，C15H23NO4Cl。化合物II-3HRMS(ESI)，m/z 282.1706[M+H]+，Δcalc＝-0.3ppm，C15H24NO4。化合物II-4HRMS(ESI)，m/z 360.0798[M+H]+，Δcalc＝-3.4ppm，C15H23NO4Br。
实施例8 式II-5A和II-5B化合物的合成 可通过采用mCPBA的环氧化，由式II-16化合物合成式II-5A和II-5B化合物。
将式II-16化合物(101mg，0.32毫摩尔)溶于100ml圆底烧瓶内的二氯甲烷(30mL)中，向该烧瓶中加入79mg(0.46毫摩尔)的间氯过苯甲酸(mCPBA)和磁力搅拌子。在室温下搅拌所述反应混合物约18小时。将该反应混合物倾倒在20cc硅胶闪柱中并用120ml二氯甲烷、75ml的1∶1乙酸乙酯/己烷、最后用40ml的100％的乙酸乙酯洗脱。该1∶1乙酸乙酯/己烷部分产生环氧衍生物式II-5A和式II-5B的非对映体的混合物，II-5A和式II-5B通过正相HPLC采用如下条件进行分离 化合物式II-5A(主产物)和II-5B(次产物)分别在21.5和19分钟时作为纯化合物被洗脱。将化合物II-5B进一步在3cc硅胶闪柱上进行色谱分离以除去痕量的氯苯甲酸试剂。
化学结构
结构鉴定 式II-5AUV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm。低分辨率质谱m/z 330(M+H)，352(M+Na)；HRMS(ESI)，m/z 330.1099[M+H]+，Δcalc＝-2.9ppm，C15H21NO5Cl。图16-17分别描述了式II-5A的1H NMR图谱和式II-5A的质谱。
式II-5BUV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm。低分辨率质谱m/z 330(M+H)，352(M+Na)；HRMS(ESI)，m/z 330.1105[M+H]+，Δcalc＝-0.9ppm，C15H21NO5Cl。图18-19分别描述了II-5B的1H NMR图谱和II-5B的质谱。
实施例9 式IV-1、IV-2、IV-3和IV-4化合物的合成 二元醇衍生物的合成(式IV-2) 可使用AD mix-α和AD mix-β，通过Sharpless二羟基化合成二元醇AD mix-α是四个试剂的预混合物K2OsO2(OH)4、K2CO3、K3Fe(CN)6、(DHQ)2-PHAL[1，4-双(9-O-二氢化奎宁)酞嗪]；AD mix-β是K2OsO2(OH)4、K2CO3、K3Fe(CN)6、(DHQD)2-PHAL[1，4-双(9-O-二氢化奎尼定)酞嗪]的预混合物，所述试剂从Aldrich商业获得。也可通过环氧化合物(式II-5A和II-5B)的酸性或碱性水解合成二元醇，该方法获得的产物与在Sharpless二羟基化中获得的产物相比在具有羟基的碳原子处的立体化学是不同的。
化合物II-16、II-17和II-18的Sharpless二羟基化 式II-16，II-17和II-18化合物中的任何一种都可以用作起始化合物。在下面的实施例中，使用式II-16化合物。将所述起始化合物溶于圆底烧瓶内的叔丁醇/水中，向瓶中加入AD mix-α或AD mix-β和磁力搅拌子。通过硅胶TLC及质谱仪监测该反应。通过常规后处理且通过快速色谱法或HPLC进行纯化，获得纯的二元醇。通过核磁共振波谱学和质谱分析确定该结构。在该方法中两个羟基是在相同的一侧。

环氧化合物(II-5)的亲核开环 用诸如NaCN、NaN3、NaOAc、HBr、HCl等等的多种亲核试剂将所述环氧环开环，以产生在该环己烷环上的多种取代基，包括羟基取代基。
例如
式II-5 式IV-1 用HCl将所述环氧开环，生成式IV-3
式II-5 式IV-3 将式II-5A化合物(3.3mg)溶于1打兰的管形瓶内的乙腈(0.5ml)中，向瓶中加入5％HCl(500μl)和磁力搅拌子。在室温下搅拌所述反应混合物约1小时。通过质谱分析监测该反应。不经任何后处理直接将该反应混合物注入正相HPLC中以获得式IV-3C的纯化合物。用于纯化的HPLC条件如下Phenomenex Luna 10μ Silica柱(25cm×21.2mm ID)，19min内25％到80％EtOAc/己烷；1min内80％到100％EtOAc；然后100％EtOAc停留5min的溶剂梯度，14.5ml/min的流速。用ELSD监测该纯化过程。式IV-3C化合物在约18分钟时洗脱(2.2mg)。式IV-3C化合物UV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm；ESMS，m/z366(M+H)，388(M+Na)；HRMS(ESI)，m/z 366.0875[M+H]+，Δcalc＝0.0ppm，C15H22NO5Cl2。在DMSO-d6中的1H NMR(图20)。根据1∶1C6D6/DMSO-d6中在环己烷环上观察到的耦合常数确定式IV-3C化合物的立体化学(图21)。

环氧化物(II-5)的还原性开环用诸如BH3-THF络合物的金属氢化物处理该式化合物，产生式IV-4的化合物。

式II-5 式IV-4 实施例10 式II-13C和II-8C化合物的合成 将化合物II-16(30mg)溶于闪烁管(20ml)内的CH2Cl2(6ml)中，向该管中加Dess-Martin Periodinane(122mg)和磁力搅拌子。在室温下搅拌所述反应混合物约2小时。用TLC(己烷∶EtOAc，6∶4)和分析HPLC监测该反应的进程。在该反应混合物中，将溶剂体积减少到三分之一，吸附在硅胶上，倾倒在20cc硅胶闪柱上并采用从10％到100％的己烷/乙酸乙酯的梯度以20ml的部分进行洗脱。用含30％EtOAc的己烷洗脱的部分含有比例为1.5∶8.5的式II-13C的旋转异构体的混合物。使用如下条件通过正相HPLC进一步纯化该混合物PhenomenexLuna 10μSilica柱(25cm×21.2mm ID)，19min内25％到80％EtOAc/己烷；1min内80％到100％EtOAc；100％EtOAc停留5min的溶剂梯度，14.5ml/min的流速。用ELSD监测该纯化过程。式II-13C化合物以比例为1.5∶8.5的旋转异构体的混合物在13.0和13.2分钟时洗脱(7mg)。式II-13CUV(乙腈/水)λmax 226(sh)& 330(sh)nm；ESMS，m/z 312(M+H)+，334(M+Na)+；HRMS(ESI)，m/z 312.1017[M+H]+，Δcalc＝4.5ppm，C15H19NO4Cl；在DMSO-d6中的1H NMR(见图22)。
将式II-13C的旋转异构体混合物(4mg)溶于闪烁管(20ml)内的丙酮(1ml)中，向该管中加入催化量(0.5mg)的10％(w/w)Pd/C和磁力搅拌子。在室温下在氢气气氛中搅拌所述反应混合物约15小时。用0.2μmGelman Acrodisc过滤该反应混合物以除去该催化剂。将溶剂从该滤液中蒸除，生成无色胶状的式II-8C化合物，采用如下条件通过正相HPLC将该化合物进一步纯化Phenomenex Luna 10μSilica柱(25cm×21.2mm ID)，19min内25％到80％EtOAc/己烷；1min内80％到100％EtOAc；100％EtOAc停留5min的溶剂梯度，14.5ml/min的流速。用ELSD监测该纯化过程。式II-8C化合物(1mg)在13.5分钟时作为纯化合物被洗脱。式II-8CUV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm；ESMS，m/z314(M+H)+，336(M+Na)+；HRMS(ESI)，m/z 314.1149[M+H]+，Δcalc＝3.3ppm，C15H21NO4Cl；在DMSO-d6中的1H NMR(见图23)。

实施例11 由式II-13C合成式II-25化合物 将式II-13C的旋转异构体混合物(5mg)溶于闪烁管(20ml)内的二甲氧基乙烷(monoglyme；1.5ml)中，向该管中加入水(15μl(终溶液浓度为1％))和磁力搅拌子。将上述溶液在干冰-丙酮浴中冷却到-78℃，并逐滴加入硼氢化钠溶液(含3.7mg NaBH4的0.5ml二甲氧基乙烷(考虑到缓慢加入而制备))。在-78℃下搅拌所述反应混合物约14分钟。用2ml的4％HCl水溶液酸化该反应混合物并用CH2Cl2提取。蒸发该有机层，生成比例为9.5∶0.5的白色固体状的式II-25和II-16化合物的混合物，采用Phenomenex Luna 10μSilica柱(25cm×21.2mm ID)，通过正相HPLC进一步纯化该混合物。流动相为19min内保持等强度的24％EtOAc/76％己烷，接着1min内24％到100％EtOAc的线性梯度和100％EtOAc持续3min；流速是25ml/min。用ELSD监测该纯化过程。式II-25化合物(1.5mg)在11.64分钟时作为纯化合物被洗脱。式II-25化合物UV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm；ESMS，m/z 314(M+H)+，336(M+Na)+；HRMS(ESI)，m/z 314.1154[M+H]+，Δcalc＝-0.6ppm，C15H21NO4Cl；在DMSO-d6中的1H NMR(见图24)。

实施例12 由II-13C合成式II-31、II-32和II-49化合物；以及由II-31和II-32合成式II-33、II-34、II-35和II-36化合物 将式II-13C化合物的旋转异构体混合物(5mg)溶于闪烁管(20ml)内的丙酮(4ml)中，向该管中加入催化量(3mg)的10％(w/w)Pd/C和磁力搅拌子。在室温下搅拌所述反应混合物约15小时。用0.2μm GelmanAcrodisc过滤该反应混合物以除去该催化剂。将溶剂从该滤液中蒸除，产生式II-31和II-32的羟基衍生物的非对映异构体混合物(1∶1)及次要化合物II-49，采用如下条件通过反相HPLC将其进行分离Ace 5u C18柱(150cm×22mm ID)，15min内90％到30％H2O/乙腈，5min内70％到100％乙腈，100％乙腈停留4min的溶剂梯度，14.5ml/min的流速。用二极管阵列检测器检测该纯化过程。化合物II-31(2mg)、II-32(2mg)和II-49(0.2mg)分别在10.6分钟、10.8分钟和11.54分钟时作为纯化合物被洗脱。II-31UV(乙腈/水)λmax 250(sh)nm；ESMS，m/z328.1(M+H)+&350.0(M+Na)+。II-32UV(乙腈/水)λmax 250(sh)nm；ESMS，m/z 328.1(M+H)+&350.0(M+Na)+。II-49UV(乙腈/水)λmax 250(sh)和320nm；ESMS，m/z 326.0(M+H)+、343.1(M+H2O)+&348.0(M+Na)+。
在可选择的方法中，采用如下条件通过正相HPLC分离化合物II-31、II-32和II-49Phenomenex Luna 10μSilica柱(25cm×21.2mmID)，24min内10％到100％己烷/EtOAc；100％EtOAc持续3min的溶剂梯度，流速14.5ml/min。用ELSD检测该纯化过程。
在0℃至-10℃下，在二甲氧基乙烷溶剂中可通过使用硼氢化钠将式II-31和II-32的酮化合物还原约14分钟。可用4％HCl水溶液酸化反应混合物，并用CH2Cl2提取。将有机层蒸发，生成可通过色谱方法分离的式II-33、II-34、II-35和II-36化合物的混合物。

实施例13 由式II-19合成式II-21化合物 将丙酮(7.5ml)与5 N NaOH(3ml)剧烈地混合，并将所得混合物在真空下蒸发至最小体积。将该溶液的100μl样品与在丙酮(1ml)中的式II-19化合物(6.2mg)混合，将所得到的双相混合物漩涡搅拌2分钟。立即将该反应溶液经过制备的C18 HPLC。用于纯化的条件包括17分钟内从10％乙腈/90％水到90％乙腈/10％水的线性梯度和使用尺寸22mm id 150mm长的Ace 5μ C18 HPLC柱。在这些条件下式II-21化合物在9.1分钟时洗脱，产生0.55mg化合物。式II-21化合物UV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm；ESMS，m/z 296.1(M+H)；在DMSO-d6中的1HNMR图谱(见图25)。

实施例14 由式II-19合成式II-22化合物 将60mg丙酸钠样品加入式II-19化合物(5.3mg)的DMSO(1ml)溶液中，并且声波振荡该混合物5分钟，虽然丙酸钠不能完全溶解。在45分钟后，用0.45μ的注射器式滤器过滤该溶液，并用HPLC直接进行纯化。用于该纯化的条件包括17分钟内从10％乙腈/90％水到90％乙腈/10％水的线性梯度和使用尺寸22mm id 150mm长的Ace 5μ C18HPLC柱。在这些条件下式II-22化合物在12.3分钟时洗脱，生成0.7mg化合物(15％的分离收率)。UV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm；ESMS，m/z352.2(M+H)；HRMS(ESI)，m/z 352.1762[M+H]+，Δcalc＝0.6ppm；C18H26NO6；在DMSO-d6中的1H NMR(见图26)。

实施例15 由II-19合成式II-29化合物 将NaN3(80mg)样品溶于DMSO(1ml)中，并转移至含有化合物II-19(6.2mg)的管形瓶中，化合物II-19混有约10％的污染物化合物II-16。将该溶液在室温下孵育1小时，然后采用17分钟内由10％乙腈/90％H2O至90％乙腈/10％H2O的溶剂梯度，在C18 HPLC(ACE 5μC18-HL，150mm×21mm ID)上进行纯化。采用此方法，所要的叠氮基衍生物II-29在12.5分钟时于化合物II-16共洗脱。由35％乙腈/65％H2O组成的等强度溶剂梯度，用另外的C18 HPLC色谱(ACE 5μ C18-HL，150mm×21mm ID))进一步纯化2.4mg部分的化合物II-29。在这些条件下，化合物II-29在20分钟后洗脱，而化合物II-16在21.5分钟后洗脱。由1.1mg化合物II-29组成的所得到的样品用于生物分析中的表征鉴定。
化合物II-29UV(乙腈/水)λmax 225(sh)nm，ESMS，m/z321.1(M+H)；在DMSO-d6中的1H NMR(见图55)。

实施例16 由II-19合成式II-37和II-38化合物 可分别通过氰基-脱卤化或氰硫基-脱卤化由式II-19化合物制备式II-37和II-38的化合物。可用NaCN或KCN处理化合物II-19，获得化合物II-37。可选择地，可用NaSCN或KSCN处理化合物II-19，获得化合物II-38。
从II-19中合成式II-38化合物 将式II-19化合物(10.6mg，.02616mmol)溶于闪烁管(20ml)内的1.5ml丙酮中，向该管中加入硫氰酸钠(10.0mg，0.1234mmol)、三乙胺(5μl，.03597mmol)和磁力搅拌子。在室温下搅拌所述反应混合物约72小时。在真空下将该反应混合物浓缩，产生化合物II-38。采用如下条件通过正相HPLC纯化该化合物II-38Phenomenex Luna 10μSilica柱(25cm×21.2mm ID)，21分钟内从0％至95％H2O/乙腈的溶剂梯度，流速14.5ml/min。用二极管阵列检测器监测该纯化过程。化合物II-38(3.0mg，收率34％)在18.0分钟时作为纯化物洗脱。II-38UV(乙腈/水)λmax 203(sh)nm；ESMS，m/z 337.1(M+H)+& 359.1(M+Na)+。

实施例17 由II-19合成通式II-39化合物 可通过式II-19化合物的脱卤化，形成通式II-39的硫醇和硫醚。例如，可通过用NaSH处理化合物II-19形成硫醇(R＝H)，然而可通过用硫醇的盐处理化合物II-19形成硫醚(R＝烷基)，或者可选择地，通过在DBU存在下在苯中进行反应，通过用硫醇自身处理以形成该硫醚。

实施例18 由II-39合成通式II-40化合物 可例如采用过氧化氢或其它氧化试剂，通过通式II-39的硫醚的氧化形成通式II-40的亚砜(n＝1)和砜(n＝2)。

实施例19 由II-21合成式II-41化合物 式II-41化合物可通过在吡啶中用甲磺酰氯(甲磺酰基氯)处理式II-21化合物(或II-21的被保护衍生物，其中例如C-5位的醇或内酰胺的NH被保护)来制备，或者例如通过在三乙胺(triethylaminde)存在时用甲磺酰基氯处理来制备。可类似地制备其它磺酸酯。

实施例20 由II-19或II-41合成式II-46化合物 可通过式II-19化合物的脱碘化氢，或通过式II-41化合物的消除氢-甲磺酰基氧基制备式II-46的烯烃，例如通过用碱处理来实现。

实施例21 合成式II-42A化合物 可通过下面的逆合成方案中略述的方法完成硼酸或其酯(例如式II-42A化合物)的合成。式II-46中的烯烃的硼氢化反应产生相应的烷基硼烷，该烷基硼烷可转化为相应的硼酸或酯，例如，式II-42A化合物。

实施例22 式II-43A化合物的合成 式II-43A化合物可通过如下方法制备用三苯基膦处理式II-19化合物，产生磷叶立德，该磷叶立德可用诸如乙醛酸甲酯的多种醛处理，获得式II-43A。

实施例23 由II-19合成式II-30化合物 将一份CuI(100mg)置于25ml梨形瓶中，并用Ar气吹洗30分钟。Ar气流在该反应过程中始终保持通过该烧瓶。在加入干燥的THF(5ml)之前将该容器冷却至-78℃，随后在剧烈搅拌下立即逐滴加入甲基锂的干燥THF溶液(5.0ml，1.6M)。向透明的二烷基铜酸盐溶液中缓慢加入化合物II-19的干燥THF溶液(12mg化合物II-19，1ml THF)，在-78℃下搅拌所得到的混合物1小时。通过使所述THF溶液流过硅胶柱(直径1cm，长2cm)以及进一步用50％EtOAc/50％己烷溶液(50ml)洗涤，终止该反应。将混合的硅胶洗脱液在真空下干燥，并采用由35％ACN/65％H2O组成的等强度溶剂梯度，经2次注入在C18 HPLC(ACE5μ C18-HL，150mm×21mm ID)上进行进一步纯化。在这些条件下，化合物II-30在23.5分钟时洗脱，并产生经分析HPLC测定90.8％纯度的2.4mg物质(分离收率27％)。可选择的正相纯化方法可采用Phenomenex Luna 10μSilica柱(25cm×21.2mm ID)，使用20分钟内从100％己烷/乙酸乙酯到0％己烷组成的溶剂梯度。在这些条件下化合物II-30在16.5分钟时洗脱，并产生经分析HPLC测定的97.1％纯度的3.0mg物质(分离收率41％)。
化合物II-30UV(乙腈/水)225(sh)，ESMS，m/z 294.1(M+H)；HRMS(ESI)，m/z 294.1696[M+H]+，Δcalc＝-3.2ppm；C16H24NO4；在DMSO-d6中的1H NMR(见图56)。

实施例24 由II-16合成式II-44和VI-1A化合物 将式II-16化合物(30mg，0.096mmol)溶于闪烁管(20ml)内的CH2Cl2(9ml)中，向该管中加入三乙胺(40μl，0.29mmol)、3-巯基丙酸甲酯(硫醇，250μl)和磁力搅拌子。在室温下搅拌所述反应混合物约4小时。从该反应混合物中蒸除溶剂，产生式II-44和VI-1A化合物的混合物(19∶1)，采用如下条件通过反相HPLC分离该混合物Ace 5u C18柱(150mm×22mm ID)；17分钟内35％至90％H2O/乙腈，1分钟内90％至100％乙腈，100％乙腈持续1分钟的溶剂梯度；14.5ml/min流速。用二极管阵列检测器监测该纯化过程。化合物II-44(20mg)和VI-IA(1mg)分别在11.68分钟和10.88分钟时作为纯化合物被洗脱。化合物II-44UV(乙腈/水)λmax 240(sh)nm；ESMS，m/z 434.0(M+H)+&456.0(M+Na)+。化合物VI-1AUV(乙腈/水)λmax 220(sh)nm；ESMS，m/z 398.0(M+H)+&420.0(M+Na)+。

实施例25 式II-16、II-17和II-18化合物中的仲羟基的氧化以及与羟基胺或甲氧基胺的反应 式II-16、II-17和II-18化合物中的任一化合物可用作起始化合物。用以下试剂的任意一种试剂氧化所述起始化合物中的仲羟基吡啶重铬酸盐(PDC)，氯铬酸吡啶(PCC)，Dess-Martin periodinane或草酰氯(Swern氧化)(参考文献Organic Syntheses，collective volumesI-VIII)。优选地，Dess-Martin periodinane可用作用于该反应的试剂(参考文献Fenteany G.et al.Science，1995，268，726-73)。用羟基胺或甲氧基胺处理所得的酮化合物以生成肟。
实施例
实施例26 酮衍生物的还原胺化 在多种碱的存在下用氰基硼氢化钠(NaBH3CN)处理诸如式II-8和II-13的酮衍生物产生所述起始化合物的胺衍生物，该衍生物随后被10％Pd/C，H2氢化来还原环己烯环中的双键。

实施例27 环己烯开环 式II-16、II-17和II-18中的任一种化合物可用作起始化合物。可例如在醇和/或在内酰胺中氮的位置处保护该起始化合物，并在THF-H2O溶液中用OsO4和NaIO4处理生成二醛衍生物，用NaBH4将该二醛衍生物还原成醇。可在该反应顺序中的适当阶段除去所述保护基，以产生II-7或II-6。
实施例
实施例28 在内酯-内酰胺的环接合处的醇脱水接着形成醛 例如通过在碱存在时用甲磺酰氯处理，或者例如通过用Burgess试剂或其它脱水试剂的处理，将任意式II-16、II-17或II-18所示的起始化合物脱水。所得到的脱水化合物用OsO4、随后用NaIO4进行处理，或者可选择地通过臭氧分解生成在内酯-内酰胺的环接合处的醛基。

实施例29 环己烯环的氧化以产生环己二烯或苯环 用Pd/C处理诸如式II-13C的酮的起始化合物，产生环己二烯衍生物。新的双键可以在环己烯环中的任何位置。可例如用硼氢化钠还原所述的酮以得到相应的仲醇。或者，可例如用DDQ进一步处理该环己二烯衍生物，以将该环芳化成苯基。类似地，可例如用硼氢化钠还原该酮得到相应的仲醇。

作为可选择的方法，可例如用TMSC1处理诸如式II-49化合物的起始化合物，产生环己二烯衍生物。可例如用DDQ进一步处理该环己二烯衍生物，以将该环芳化成苯基。可例如用酸或碱除去该苯基上的OTMS。类似地，可例如用硼氢化钠还原所述的酮得到相应的仲醇。

实施例30 在醛衍生物I-1上的多种反应 使用多种磷叶立德[例如(triphenylphosphoranylidene)乙烷]在醛基上进行Wittig反应以生成烯烃。在该侧链中的双键被催化氢化还原。
例子
使用多种碱(例如NH3)和氰基硼氢化钠进行在所述醛基上的还原胺化，生成胺衍生物。可选择地，用NaBH4该醛还原以形成在该侧链中的醇。
例子
可对所述的醛羰基进行有机金属加成反应以生成多种取代的仲醇。例如
实施例31 由II-17合成式II-47化合物 将式II-17化合物(25mg，0.0896mmol)溶于闪烁管(20ml)内的CH2Cl2(9ml)中，向该管中加入三乙胺(38μl，0.27mmol)、3-巯基丙酸甲酯(硫醇，250μl)和磁力搅拌子。在室温下搅拌所述反应混合物约4小时。从该反应混合物中蒸除溶剂，产生式II-47化合物，采用如下条件通过正相HPLC进一步纯化该化合物Phenomenex Luna 10uSilica柱(25cm×21.2mm ID)；24分钟内10％至100％己烷/EtOAc，100％EtOAc持续3分钟的溶剂梯度；14.5ml/min流速。用ELSD监测该纯化过程。化合物II-47(15mg)在10.98分钟时作为纯化合物被洗脱。化合物II-47UV(乙腈/水)λmax 240(sh)nm；ESMS，m/z 400.1(M+H)+&422.1(M+Na)+。

实施例32 由II-16合成式II-48和VI-1B化合物 将式II-16化合物(15mg，0.048mmol)溶于闪烁管(20ml)内的1∶1的ACN/DMSO(8ml)中，向该管中加入三乙胺(40μl，0.29mmol)、谷胱甘肽(44.2mg，0.144mmol)和磁力搅拌子。在室温下搅拌所述反应混合物约3小时。从该反应混合物中蒸除溶剂，产生式II-48化合物，采用如下条件通过反相HPLC纯化该化合物Ace 5u C18柱(150mm×22mm ID)；15分钟内10％至70％H2O/乙腈，5分钟内70％至100％乙腈，100％乙腈持续4分钟的溶剂梯度；流速14.5ml/min。用二极管阵列检测器监测该纯化过程。化合物II-48(10mg)在8.255分钟时作为纯化合物被洗脱。化合物II-48UV(乙腈/水)λmax 235(sh)nm；ESMS，m/z621.0(M+H)+。化合物II-48在溶液中不稳定，并转化为化合物VI-1B，以7∶3的比例作为II-48和VI-1B的混合物存在。化合物VI-1BUV(乙腈/水)λmax 235(sh)nm；ESMS，m/z 585.2(M+H)+。

实施例33 由II-16合成式II-50和VI-1C化合物 将式II-16化合物(10mg，0.032mmol)溶于闪烁管(20ml)内的CH2Cl2(9ml)中，向该管中加入三乙胺(26.5μl，0.192mmol)、N-乙酰基-L-半胱氨酸甲酯(17mg，0.096mmol)和磁力搅拌子。在室温下搅拌所述反应混合物约4小时。从该反应混合物中蒸除溶剂，产生式II-50和VI-1C化合物的混合物，采用如下条件通过正相HPLC进一步纯化该混合物Phenomenex Luna 10uSilica柱(25cm×21.2mm ID)；24分钟内10％至100％己烷/EtOAc，100％EtOAc持续3分钟的溶剂梯度；流速14.5ml/min。用ELSD监测该纯化过程。化合物II-50(2mg)和VI-IC(0.2mg)分别在10.39分钟和10.57时作为纯化合物被洗脱。化合物II-50UV(乙腈/水)λmax 230(sh)nm；ESMS，m/z 491.1(M+H)+&513.0(M+Na)+。化合物VI-1CUV(乙腈/水)λmax 215(sh)nm；ESMS，m/z 455.1(M+H)+&577.0(M+Na)+。

实施例34 体外生物学 也称为Salinosporamide A的式II-16化合物的初期研究使用由60株人肿瘤细胞系组成的国立癌症研究所(NCI)筛查组，该肿瘤细胞系代表白血病、黑素瘤以及肺癌、结肠癌、脑癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和肾癌。该筛查操作的详细说明可在超文本传送方案中找到(http://)“dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.html.” 简而言之，将每一种所述60株的人肿瘤细胞系生长在补加有5％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养液中。将细胞以其合适的密度接种在96-孔的微滴定板中并在37℃，5％CO2，95％空气和100％相对湿度中进行孵育。24小时后，将100μL的、Salinosporamide A的多种10倍系列稀释液加入到含有100μL细胞的恰当的孔中，导致最终Salinosporamide A浓度为10nM到100μM。又将细胞另外孵育48小时并用sulforhodamine B蛋白分析评价细胞的存活力或生长。
如下计算三种剂量反应参数 GI50表示抑制50％生长的浓度 TGI表示抑制全部生长的浓度 LC50表示50％细胞致死的浓度 在所述NCI的筛查中评价Salinosporamide A的研究的实例显示于下面的表1中。
数据表明Salinosporamide A的平均GI50值小于10nM。对于最敏感和最耐受的肿瘤细胞系观察到平均TGI值和平均LC50值的范围较宽(＞1000倍的差异)，这表明Salinosporamide A表现出良好的选择性并且不显示一般毒性。此外，平均TGI数据表明Salinosporamide A对黑素瘤和乳腺癌细胞系显示优选的特异性。重复该分析并显示相似的结果。
NCI肿瘤筛查的结果显示Salinosporamide A(1)其是有效的化合物，平均GI50值小于10nM，且(2)其在最敏感和最耐受的肿瘤细胞系之间的平均TGI值和平均LC50值方面显示出大于1000倍差异的良好的肿瘤选择性。
表1NCI 60株人肿瘤细胞系对Salinosporamide A的相对敏感性
实施例35 肿瘤细胞系的生长抑制 将B16-F10(ATCC；CRL-6475)，DU 145(ATCC；HTB-81)，HEK293(ATCC；CRL-1573)，HT-29(ATCC；HTB-38)，LoVo(ATCC；CCL-229)，MDA-MB-231(ATCC；HTB-26)，MIA PaCa-2(ATCC；CRL-1420)，NCI-H292(ATCC；CRL-1848)，OVCAR-3(ATCC，HTB-161)，PANC-1(ATCC；CRL-1469)，PC-3(ATCC；CRL-1435)，RPMI 8226(ATCC；CCL-155)以及U266(ATCC；TIB-196)维持在适当的培养基中。将所述细胞在37℃下、在含5％CO2和95％潮湿空气的培养箱中进行培养。
对于细胞生长抑制分析，将B16-F10，DU 145，HEK293，HT-29，LoVo，MDA-MB-231，MIA PaCa-2，NCI-H292，OVCAR-3，PANC-1，PC-3，RPMI8226和U266细胞分别以1.25×103，5×103，1.5×104，5×103，5×103，1×104，2×103，4×103，1×104，7.5×103，5×103，2×104，2.5×104细胞/孔接种在Corning3904黑色壁，透明底的组织培养板内的90μl完全培养基中。在100％的DMSO中配制式II-16化合物的20mM储备溶液，分成等份并贮存在-80℃中。连续稀释式II-16化合物并加入到测试孔中，一式三份，导致终浓度为20μM到0.2pM。将该培养板放回到该培养箱中培养48小时。在全部样品中DMSO终浓度为0.25％。
药物暴露48小时后，向每个孔中加入10μl含0.2mg/ml刃天青(resazurin)(从Sigma-Aldrich化学公司获得)的无Mg2+、Ca2+的磷酸盐缓冲盐水，并将所述培养板放回到该培养箱中培养3-6个小时。因为活细胞代谢刃天青，应用Fusion微量培养板荧光计(PackardBioscience)，使用λex＝535nm和λem＝590nm的滤光片测定刃天青的还原产物的荧光。不含细胞的培养基中的刃天青染料用于确定背景，将其从所有实验孔的数据中扣除。将该数据标准化为用培养基+0.25％DMSO处理的细胞(100％细胞生长)的平均荧光度，并且用标准的S形剂量反应曲线拟合法则(该法则通过XLfit 3.0，ID Business SolutionsLtd或Prism 3.0，GraphPad Software Inc产生)确定EC50值(观察到50％的最大生长抑制的药物浓度)。
表2中的数据概述式II-16对包括12种人和一种小鼠在内的不同肿瘤细胞系的生长抑制效果。
表2 式II-16对多种肿瘤细胞系的平均EC50值 *n(独立实验次数)＝2时，显示的是平均值 所述EC50值表明式II-16对B16-F10，DU 145，HEK293，HT-29，LoVo，MDA-MB-231，MIA PaCa-2，NCI-H292，OVCAR-3，PANC-1，PC-3，RPMI8226和U266细胞有细胞毒性。
实施例36 在体外式I-7，II-2，II-3，II-4，II-5A，II-5B，II-8C，II-13C，II-16，II-17，II-18，II-19，II-20，II-21，II-22，II-24C，II-25，II-26，II-27，II-28，II-29，II-30，II-31，II-32，II-38，IV-3C，II-44，VI-1A和II-47化合物对蛋白酶体活性的抑制 在DMSO中将所有所述化合物制备为20mM储备溶液，且以小的等份贮存在-80℃中。从CalBiochem或Boston Biochem中获得纯化的家兔肌20S蛋白酶体。为了增强该蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性，将分析缓冲液(20mM HEPES、pH7.3、0.5mM EDTA和0.05％Triton×100)补加有SDS，使最终SDS浓度为0.035％。使用的底物是suc-LLVY-AMC，一种被所述蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性特异切割的荧光肽底物。在96孔Costar微量滴定板中，在200μl终容积内以1μg/ml的蛋白酶浓度进行分析。式II-2、II-4、II-16、II-17、II-18、II-19、II-21、II-22和II-44以8点剂量效应曲线，以500nM至158pM的终浓度进行测试。式I-7、II-5A、II-5B、II-20、II-29、II-30和II-38以1μM至0.32nM的浓度进行测试。式II-3和VI-1A以八点剂量效应曲线以10μM至3.2nM的终浓度进行测试。式II-47以5μM至1.6nM的浓度进行测试，而式II-8C、II-13C、II-24C、II-25、II-26、II-27、II-28、II-31、II-32和IV-3C以20μM至6.3nM的终浓度测试。在37℃下将所述样品在控温的Fluoroskan Ascent 96孔微量培养板读数器中(Thermo Electron，Waltham，MA)孵育5分钟。在该预孵育步骤过程中，将该底物在含有SDS的分析缓冲液中稀释25倍。在该预孵育期后，通过加入10μl的该稀释的底物引发所述反应，并将该培养板放回到该培养板读数器中。在该反应中底物的终浓度为20μM。在λex＝390nm和λem＝460nm下测定切割的肽底物的荧光。所有数据每5分钟被采集一次，持续超过1.5小时，并且将该数据按照三次数据点的平均值绘图。采用S形剂量反应、可变的斜面模型，通过Prism(GraphPad软件)计算EC50值(抑制50％的最大相对荧光的药物浓度)。为了评价所述化合物对该20S蛋白酶体的胱天蛋白酶样活性的作用，除了Z-LLE-AMC被用作肽底物外，如上所述进行反应。式II-3、II-4、II-5A、II-5B、II-8C、II-13C、II-17、II-18、II-20、II-21、II-22、II-24C、II-25、II-26、II-27、II-28、II-29、II-30、IV-3C、II-44和VI-1A以20μM至6.3nM的浓度进行测试。式II-2以10μM至3.2nM的浓度进行测试，而式II-16和II-19以5μM至1.58nM的浓度进行测试。为了评价所述化合物对所述蛋白酶体的胰蛋白酶样活性的作用，从所述分析缓冲液中省略SDS，并且将Boc-LRR-AMC用作肽底物。式II-20以5μM至1.6nM的浓度进行测试。式II-3、II-8C、II-13C、II-17、II-21、II-22、II-24C、II-25、II-26、II-27、II-28、II-29、II-30、IV-3C和VI-1A以20μM至6.3nM的浓度进行测试。对于式II-2和II-5B，测试浓度为10μM至3.2nM，而式II-4、II-5A、II-16、II-18和II-19以1μM至0.32nM的浓度进行测试。式II-44以2μM至632pM的浓度进行测试。
结果(EC50值)显示在表3中并表明在所测试的化合物中，式II-5A、II-16、II-18、II-19、II-20、II-21、II-22、II-29、II-38和II-44是所述的20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的最有效的抑制剂，其EC50值为2.2nM至11nM。式I-7、II-2、II-4、II-5B、II-17、II-30和II-47抑制该蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性，其EC50值为13nM至88nM，而式II-3、II-26和VI-1A的EC50值为207nM至964nM。式II-13C、II-24C、II-27、II-28和IV-3C抑制该胰凝乳蛋白酶样活性，其EC50值为1.4μM至10.6μM。式II-8C、II-25、II-31和II-32的EC50值大于20μM。在所述的测试条件下，式II-2、II-3、II-4、II-5A、II-5B、II-13C、II-16、II-17、II-18、II-19、II-20、II-21、II-22、II-24C、II-26、II-29、II-30、II-44和VI-1A能够抑制所述的20S蛋白酶体的胰蛋白酶样活性。式II-4、II-5A、II-16、II-18、II-19和II-29抑制胱天蛋白酶样活性，其EC50值为213nM至850nM，而式II-2、II-5B、II-17、II-20、II-21、II-22、II-30、II-44和VI-1A具有956nM至8.7μM的EC50值。
表3 式I-7、II-2、II-3、II-4、II-5A、II-5B、II-8C、II-13C、II-16、II-17、II-18、II-19、II-20、II-21、II-22、II-24C、II-25、II-26、II-27、II-28、II-29、II-30、II-31、II-32、II-38、IV-3C、II-44、VI-1A和II-47对纯化的家兔20S蛋白酶体的多种酶活性的作用


*显示一次或两次独立实验的EC50值。当n≥3，显示平均EC50值±标准差，**n＝3，不适用标准差。
ND＝未测定 评价式II-2、式II-3和式II-4的代表性试验的结果显示于图46中并表明式II-2和式II-4抑制蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性，EC50值分别为18.5nM和15nM。式II-3在此分析中具有活性，EC50值分别890nM。从独立实验中得到相似的结果。
评价式II-5A和式II-5B的代表性试验的结果显示于图47中并表明式II-5A和式II-5B抑制蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性，EC50值分别为6nM和88nM。从独立实验中得到相似的结果。
实施例37 Salinosporamide A(II-16)抑制家兔肌20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性 利用从Calbiochem(目录号539158)商业获得的试剂盒检测Salinosporamide A(II-16)对蛋白酶体的作用，该试剂盒用荧光的肽底物测定家兔肌20S蛋白酶体的活性(Calbiochem 20S Proteasome Kit)。该肽底物对所述蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性是特异的。
在DMSO中制备10mM的Omuralide储备溶液，并且以5μl的等份贮存在-80℃中。在DMSO中制备25.5mM的Salinosporamide A溶液并以等份贮存在-80℃中。该分析测定Suc-LLVY-AMC水解成Suc-LLVY和AMC。通过用λex＝390nm和λem＝460nm荧光测定所释放的香豆素(AMC)。该分析是在微滴定板(Corning 3904)中实施的，并随后动态地每五分钟测定一次。使用的仪器是Thermo Lab Systems Fluoroskan，并将孵育室设定在37℃。该分析依照制造商的方案进行，并有如下改变。所述蛋白酶体如描述地用SDS活化，并在进行该分析之前保持在冰中。在分析缓冲液中连续地稀释Salinosporamide A和Omuralide以制备8点剂量效应曲线。向所述分析板中加入10μl的每一剂量，一式三份，并且加入190μl活化的蛋白酶体并混合。在37℃下将所述样品在所述的Fluoroskan中预孵育5分钟。加入底物，随后检测AMC的动力学，并持续1小时。采集所有的数据并以三次数据点的平均值绘图。将该数据标准化成在不存在Salinosporamide A时进行的反应数据，并以S形的剂量反应，可变的斜面在Prism中进行模建。
与体外的细胞毒性中获得结果相似(表2)，参见Feling，et al.，SngewChem I7lt Ed Engl 42355(2003)，在所述的20S蛋白酶体分析中的EC50值显示Salinosporamide A比Omuralide更有效，其作用大约是40倍，平均值分别是1.3nM对49nM(图27)。重复该实验并且在两次的分析中平均EC50确定为Salinosporamide A是2nM和Omuralide是52nM。
Salinosporamide A是蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的有效抑制剂。细胞毒性的EC50值在10-200nM范围内，表明Salinosporamide A在诱发细胞死亡方面的能力至少大部分归因于对蛋白酶体的抑制。该数据表明Salinosporamide A是蛋白酶体的有效的小分子抑制剂。
实施例38 Salinosporamide A(II-16)对家兔肌20S蛋白酶体的PGPH活性的抑制 Omuralide可抑制蛋白酶体的PGPH(也称为胱天蛋白酶样)活性；因此评价Salinosporamide A抑制纯化的家兔肌20S蛋白酶体的PGPH活性的能力。使用对PGPH活性特异的商业可得的荧光底物来代替上述的蛋白酶分析试剂盒中供给的胰凝乳蛋白酶底物。
在DMSO中制备Salinosporamide A(II-16)的20mM溶液并且以小的等份贮存在-80℃中。在DMSO中制备底物Z-LLE-AMC的20mM储备溶液并贮存在-20℃中。所述蛋白酶体的来源是Calbiochem(Cat.#539158)商业可得的试剂盒。因为用所述的胰凝乳蛋白酶底物，蛋白酶体可将Z-LLE-AMC切割成Z-LLE和游离的AMC。然后通过测定所释放的AMC的荧光确定该活性(λex＝390nm和λem＝460nm)。用SDS活化该蛋白酶体，并且按照制造商的建议保持在冰上。在DMSO中将Salinosporamide A稀释以产生400倍浓缩的8点稀释系列。用分析缓冲液将该系列稀释20倍并且用所述的用于检测胰凝乳蛋白酶样活性的蛋白酶体进行预孵育。在加入底物后，在37℃下孵育所述样品，并且在荧光计中监测荧光的AMC的释放。收集所有数据并且按照三次点的平均值绘图。在这些实验中，按照标准化的活性将该EC50在Prism中进行模建，其中，在不存在Salinosporamide A时释放的AMC的量表示100％的活性。如以前一样，选择的模型是S形的剂量反应和可变的斜面。
数据显示Salinosporamide A抑制家兔肌20S蛋白酶体中的PGPH活性，其EC50是350nM(图28)。进行重复性实验，产生预测EC50为610nM。这些结果显示Salinosporamide A确实体外阻断纯化的家兔肌20S蛋白酶的PGPH活性，虽然具有比所观察到的对胰凝乳蛋白酶样活性的抑制更低的有效性。
实施例39 人红细胞20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的抑制 体外评价Salinosporamide A(II-16)抑制人红细胞20S蛋白酶的胰凝乳蛋白酶样活性的能力。计算的EC50值约3nM(图29)。这些数据显示Salinosporamide A的抑制作用不局限于家兔骨骼肌蛋白酶体。
在DMSO中制备Salinosporamide A的20mM溶液并以小的等份贮存在-80℃下。在DMSO中制备所述底物suc-LLVY-AMC的20mM溶液并在-20℃中贮存。从BIOMOL(Cat.#SE-221)获得人红细胞20S蛋白酶。该蛋白酶可切割suc-LLVY-AMC成suc-LLVY和游离的AMC并且通过测定所释放的AMC的荧光确定该活性(λex＝390nm和λem＝460nm)。如同采用家兔肌蛋白酶体的实验一样，用SDS活化该蛋白酶体并且贮存在冰上。在DMSO中稀释Salinosporamide A以产生400倍浓缩的8点稀释系列。然后用分析缓冲液将该系列稀释20倍并在37℃下用蛋白酶体预孵育。用底物引发反应并且随后在Fluoroskan微培养板荧光计中测定AMC的释放。收集数据并且按照三点的平均值绘图。动态地收集数据并持续3小时，并且表明这些反应在该时间段内显示线性的动力学。将这些数据标准化成在不存在Salinosporamide A时进行的反应，并且以S形剂量效应、可变的斜面在Prism中进行模建。
利用不同类型的人红细胞蛋白酶进行重复实验，产生EC50值约4nM。这些结果表明体外的人红细胞20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性对Salinosporamide A是敏感的。
式II-16还表现出抑制人红细胞蛋白酶体的胰蛋白酶样和胱天蛋白酶样活性。对于胰蛋白酶样，研究显示EC50值约9nM，以及对于胱天蛋白酶样，EC50约390nM。另外关于人红细胞的胰凝乳蛋白酶样活性的研究显示EC50约250pM。此外，研究显示式II-16对蛋白酶体具有特异性，对其它蛋白水解酶表现出很少的作用或无作用。例如，当分别测试式II-16对胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶B和凝血酶的抑制，式II-16的EC50值分别为18,000nM、＞200,000nm和＞200,000Nm。
实施例40 Salinosporamide A(II-16)的特异性 Salinosporamide A抑制蛋白酶体的可能的机理是通过Salinosporamide A的β-内酯官能团与该蛋白酶体的活性位点苏氨酸的反应。该蛋白酶体的共价修饰将阻断该活性位点，因为该残基对该蛋白酶体的催化活性是必需的。Fenteany，et al.，J Biol Chem 2738545(1998)。结构上相关的化合物乳胞素，也显示出抑制组织蛋白酶A(Ostrowska，et al.，Int J Biochem Cell Biol 32747(2000)，Kozlowski，et al.，Tumour Biol 22211(2001)，Ostrowska，et al.，Biochem Biophys Res Cornrraun 234729(1997))和TPPII(Geier，et al.，Science 283978(1999))但是不抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、番木瓜蛋白酶、钙蛋白酶，(Fenteany，et al.，Science 268726(1995))，凝血酶和纤溶酶原活化因子(Omura，et al.，JAntibiot(Tokyo)44113(1991))。类似的研究通过评价Salinosporamide A抑制原型(prototypical)丝氨酸蛋白酶，胰凝乳蛋白酶的催化活性的能力，开始探索Salinosporamide A对蛋白酶体的特异性。
在DMSO中制备Salinosporamide A的20mM溶液并以小的等份贮存在-80℃下。在DMSO中配制所述底物suc-LLVY-AMC的20mM溶液并在-20℃下进行贮存。通过蛋白酶或胰凝乳蛋白酶对该底物的蛋白水解释放所述的荧光产物AMC，在荧光计中监测该AMC(λex＝390nm和λem＝460nm)。从Sigma(Cat.# C-4129)中获得牛胰脏的胰凝乳蛋白酶，并且每天在分析缓冲液(10mM HEPES，0.5mM EDTA，0.05％Triton X-100，pH7.5)中配制为5mg/ml溶液。在分析前，在缓冲分析液中立即将胰凝乳蛋白酶稀释到1μg/ml(0.2μg/孔)并保持在冰上。在DMSO中稀释Salinosporamide A以产生8点剂量效应曲线。获得完全抑制胰凝乳蛋白酶所需的Salinosporamide A的高终浓度需要将稀释的酶直接加入到化合物稀释系列中。在该反应中所涉及的1％DMSO(在所述测试孔中的溶剂的终浓度)在胰凝乳蛋白酶对该底物的活性方面没有显著的影响。在37℃下预孵育该反应物5分钟并且通过加入底物引发该反应。在37℃下在Fluoroskan中动态地收集数据1小时并且按照三次数据点的平均值绘图。将所述数据标准化为在不存在Salinosporamide A时进行的反应，并且以S形剂量效应，可变的斜面在Prism中进行模建。在同一张图中包括来自Salinosporamide A抑制家兔20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的标准化数据。
在使用Salinosporamide A对胰凝乳蛋白酶进行预处理的两次实验中观察到的平均抑制为17.5μM(图30显示代表性实验)。该数据表明Salinosporamide A介导的对蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的体外抑制优先于对胰凝乳蛋白酶的催化活性的抑制。
因此，Salinosporamide A抑制蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样和PGPH活性。初步的研究表明Salinosporamide A还抑制蛋白酶体的胰蛋白酶样活性，其EC50值为约10nM(不显示数据)。
实施例41 式II-2、II-3、II-4、II-5A、II-5B、II-8C、II-13C、II-16、II-17、II-18、II-19、II-20、II-21、II-22、II-24C、II-25、II-26、II-27、II-28、II-29、II-30、II-44、VI-1A和IV-3C对NF-κB介导的萤光素酶活性的抑制；HEK293 NF-κB/萤光素酶报道细胞系 HEK293 NF-κB/萤光素酶报道细胞系是人胚肾细胞系(ATCC；CRL-1573)的衍生物并且携带被5X NF-κB结合位点调节的萤光素酶报道基因。将所述报道细胞系常规地维持在补加有250μg/ml G418的完全DMEM培养基中(DMEM+10％(v/v)胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES和分别为100IU/ml和100μg/ml的青霉素/链霉素)。当进行所述萤光素酶分析时，用无酚红的DMEM基础培养基代替该DMEM基础培养基并省略该G418。在37℃下，在含有5％CO2和95％潮湿空气的培养箱中培养所述细胞。
为了进行NF-κB介导的萤光素酶分析，将HEK293 NF-κB/萤光素酶细胞以1.5×104细胞/孔接种在Corning 3917白色不透光底的组织培养板内的90μl无酚红的DMEM完全培养基中。对于式II-2、II-4、II-5A和II-18，在100％DMSO中配制400μM的起始稀释物，并且该稀释物用于产生8点半对数稀释系列。将该稀释系列在合适的培养基中进一步稀释40倍，并将10μl的等份加入到该测试孔中，一式三份，导致最终测试浓度为1μM至320pM。对于式II-3、II-5B、II-8C、II-13C、II-17、II-21、II-22、II-24C、II-25、II-26、II-27、II-28、II-29、II-30、VI-1A和IV-3C，在100％DMSO中配制8mM的起始稀释物，并且随后进行上述的相同操作，导致最终测试浓度为20μM至6.3nM。对于式II-16、II-19和II-44，在100％DMSO中配制127μM的起始稀释物，并且最终测试浓度为317nM至0.1nM。对于式II-20，在100％DMSO中配制2.5mM或8mM的起始溶液，并且最终测试浓度分别为6.3μM至2.0nM或20μM至6.3nM。将所述培养板放回到培养箱中培养1小时。在1小时预处理后，加入在无酚红的DMEM培养基中制备的10μl的50ng/ml TNF-α溶液，并且将该培养板又另外孵育6小时。在所有的样品中DMSO的终浓度为0.25％。
在结束TNF-α刺激后，将100μl的Steady Lite HTS萤光素酶试剂(Packard Bioscience)加入到每一个孔中，并且在测量该萤光素酶活性前将所述培养板在室温下未受干扰地放置10分钟。通过使用Fusion微量培养板荧光计(Packard Bioscience)测量相对萤光素酶单位(RLU)。采用S形剂量效应、可变的斜面模型在Prism(GraphPad软件)中计算EC50值(抑制50％的最大相对萤光素酶活性的药物浓度)。
式II-2、II-3、II-4、II-5A、II-5B、II-8C、II-13C、II-16、II-17、II-18、II-19、II-20、II-21、II-22、II-24C、II-25、II-26、II-27、II-28、II-29、II-30、II-44、VI-1A和IV-3C对NF-κB活化的抑制 NF-κB调节大量的在炎症、细胞凋亡、肿瘤发生和自身免疫性疾病中发挥重要作用的基因的表达。因此，例如，能够调节或影响NF-κB活性的化合物用于治疗与炎症、癌症或自身免疫性疾病相关的疾病。在它的失活形式中，在胞浆中NF-κB与IκB复合，并且刺激时，IκB磷酸化、泛素化并随后被蛋白酶体降解。IκB的降解导致NF-κB的活化及其易位至细胞核。通过评估TNF-α刺激时在HEK293 NF-κB/Luc细胞中NF-κB介导的萤光素酶活性来评价式II-2、II-3、II-4、II-5A、II-5B、II-8C、II-13C、II-16、II-17、II-18、II-19、II-20、II-21、II-22、II-24C、II-25、II-26、II-27、II-28、II-29、II-30、II-44、VI-1A和IV-3C对NF-κB活化的作用。
用式II-2、II-4、II-5A、II-5B、II-16、II-17、II-18、II-19、II-20、II-21、II-22、II-24C、II-26、II-29、II-30和II-44对NF-κB/Luc 293细胞的预处理导致TNF-α刺激时萤光素酶活性的剂量依赖性降低。抑制NF-κB介导的萤光素酶活性的EC50值显示于表4中，并表示在此基于细胞的分析中式II-2、II-4、II-5A、II-5B、II-16、II-17、II-18、II-19、II-20、II-21、II-22、II-24C、II-26、II-29、II-30和II-44化合物抑制NF-κB活性。
表4 来自NF-κB介导的萤光素酶报道基因分析的式II-2、II-3、II-4、II-5A、II-5B、II-8C、II-13C、II-16、II-17、II-18、II-19、II-20、II-21、II-22、II-24C、II-25、II-26、II-27、II-28、II-29、II-30、II-44、VI-1A和IV-3C的EC50值 *显示了两次独立实验的EC50值。当n≥3，显示了平均EC50值±标准差。**也用化合物II-20进行了该分析，结果EC50值为154nM，该值不被包括在平均EC50值的计算之内。
评价式II-2、式II-3和式II-4的代表性实验的结果(图44)显示用II-2和II-4预处理导致TNF-α刺激时，NF-κB/Luc 293细胞中萤光素酶活性的剂量依赖性降低。在此实验中，抑制NF-κB可诱导的萤光素酶活性的计算的EC50为对于式II-2为73nM，而式II-4的EC50值为67nM。在重复实验中观察到相似的数据。
评价式II-5A和式II-5B的代表性试验的结果显示于图45中并表明式II-5A和式II-5B抑制NF-κB可诱导的萤光素酶活性，EC50值分别为30nM和261nM。在重复实验中得到相似的结果。
实施例42 Salinosporamide A对NF-κB信号传导途径的作用 进行了研究Salinosporamide A对NF-κB信号传导途径的作用的实验。产生携带被5X NF-κB结合位点调节的萤光素酶报道基因的稳定的HEK293克隆(NF-κB/Luc 293)。用TNF-α刺激的该细胞系导致因NF-κB活化而引起萤光素酶活性增强。
用Salinosporamide A的8点半对数系列稀释物(从1μM到317pM)预处理NF-κB/Luc 293细胞1小时，随后用TNF-α(10ng/mL)刺激6小时。在第6小时时测试NF-κB可诱导的萤光素酶活性。如前所述，用Salinosporamide A处理24小时后，通过加入刃天青染料评价NF-κB/Luc293细胞的存活力。
用Salinosporamide A对NF-κB/Luc 293细胞的预处理导致TNF-α刺激时萤光素酶活性的剂量依赖性降低(图31，右侧y轴)。对于NF-κB/萤光素酶活性的抑制，计算的EC50为约7nM。同时实施细胞毒性分析并且显示出该浓度的Salinosporamide A不影响细胞存活力(图31，左侧y轴)。这些代表性数据表明通过Salinosporamide A处理，所观察到的萤光素酶活性的降低主要归因于NF-κB介导的信号传导事件而不是细胞的死亡。
实施例40 除NF-κB萤光素酶报道基因分析之外，通过Western印迹法评价Salinosporamide A对磷酸化的IκBα和总IκBα水平的作用。在HEK293细胞和所述的NF-κB/Luc 293报道基因克隆中评价内源性蛋白质水平。
用Salinosporamide A在指示浓度下预处理细胞1小时，接着用10ng/mL的TNF-α刺激30分钟。抗IκBα的完全形式和磷酸化形式的抗体用于测定每一蛋白质的内源性水平，并且抗微管蛋白抗体用于确定蛋白的等量上样。
如图32所示，用50nM和500nM的Salinosporamide A对两种细胞系进行处理，当用TNF-α刺激时这种处理不仅减少总IκBα的降解，而且保持磷酸-IκBα的水平。这些结果坚定地支持Salinosporamide A作为蛋白酶体抑制剂的作用机理，它防止TNF-α刺激时磷酸化的IκBα的降解。
实施例41 Salinosporamide A对细胞周期调节蛋白的作用 泛素-蛋白酶体途径通过调节细胞周期蛋白的降解和诸如p21和p27的细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)抑制剂，是参与细胞周期控制的必要的蛋白水解体系。Pagano，et al.，Science 269682(1995)，Kisselev，et al.，Chem Viol 8739(2001)，King，et al.，Science 2741652(1996)。此外，p21和p27蛋白水平在蛋白酶抑制剂的存在时增加。Fukuchi，et al.，BiochimBiophys Acta 1451206(1999)，Takeuchi，et al.，Jpn J Cancer Res 93774(2002)。因此，采用HEK293细胞和所述HEK293NF-κB/萤光素酶报道基因克隆，实施western印迹分析以评价Salinosporamide A处理对p21和p27的内源性水平的作用。
图33所示的Western印迹是利用抗p21和p27的抗体进行探测来确定每一个蛋白的内源性水平，并且抗微管蛋白抗体用于确定蛋白的等量上样。
如图33A和33B所示，初步的结果表明当用多种浓度的Salinosporamide A处理两种细胞系时，p21和p27的蛋白水平提高。数据显示Salinosporamide A通过抑制蛋白酶体活性，从而阻止TNF-α诱导的NF-κB活化来起作用。另外，该蛋白酶体的抑制导致所述Cdk抑制剂，p21和p27的蓄积，这已在致敏细胞的细胞凋亡中进行了报道。Pagano，etal.，supra(1995)，King，et al.，supra(1996)。
实施例42 Salinosporamide A(II-16)对胱天蛋白酶-3的活化 为了验证Salinosporamide A是否诱发细胞凋亡，使用Jurkat细胞(美国模式培养物保藏所(ATCC)TIB-152，人急性T细胞白血病)评价Salinosporamide A对诱导胱天蛋白酶-3活性的作用。
将Jurkat细胞以2×106细胞/3mL/孔接种在6孔培养板中并且在37℃，5％(v/v)CO2和95％(v/v)湿度中进行孵育。在DMSO中分别以20mM和40mM的浓度配制Salinosporamide A和盐酸米托蒽醌(Sigma，St.Louis，MO.Cat # M6545)的储备溶液。盐酸米托蒽醌是化疗药物，其通过抑制DNA合成和修复在分裂和不分裂的细胞中诱发细胞凋亡，并且作为阳性对照被包括在内。Bhalla，et al.，Blood 823133(1993)。在评定胱天蛋白酶-3活性前用EC50浓度处理(表5)细胞并且孵育19小时。用0.25％DMSO处理的细胞用作阴性对照。通过离心分离并去除培养基来收集所述细胞。，将细胞沉淀物进行处理以便如制造商的方案中所述的进行胱天蛋白酶-3活性分析(来自Molecular Probes的EnzChek胱天蛋白酶-3分析试剂盒(E-13183；见附件G，它是该申请书的一部分并可以在世界网络“probes.com/media/pis/mpl3183.pdf”上的超文本传送方案中获得)。简而言之，将细胞沉淀物在冰上进行裂解，在96孔平板中与EnzChek胱天蛋白酶-3组分混合，然后在黑暗中孵育30分钟，最后应用Packard Fusion，使用λex＝485nm和λem＝530nm滤光器读出切割的苄氧羰基-DEVD-AMC的荧光。用BCA蛋白分析试剂盒(Pierce)测定裂解物的蛋白浓度，并且将这些数值用于标准化。
代表性实验中的数据表明Salinosporamide A对Jurkat细胞的处理导致细胞毒性和胱天蛋白酶-3的活化(表5，图34) 表5Salinosporamide A和盐酸米托蒽醌对Jurkat细胞的细胞毒性和EC50值
实施例43 在Jurkat细胞中Salinosporamide A引起PARP切割 为了评价Salinosporamide A在Jurkat细胞中诱导细胞凋亡的能力，监测聚(ADP-核糖)多聚酶(PARP)的切割。PARP是116kDa核蛋白，它是胱天蛋白酶-3的主要细胞内靶标之一。Decker，et al.，J Biol Chem 2759043(2000)，Nicholson，D.W，Nat Biotechnol 14297(1996)。PARP的切割产生稳定的89kDa产物，并且该过程可通过western印迹法进行监测。胱天蛋白酶对PARP的切割是细胞凋亡的标志，同样可用作该过程的良好标记。
在进行实验之前，将Jurkat细胞以低密度(每毫升2×105细胞)维持在补加有10％胎牛血清(FBS)的RPMI中。通过离心采集细胞并将其再混悬于培养液中至每3毫升1×105细胞。用100nM的Salinosporamide A(在-80℃下贮存的20mM的DMSO储备溶液)处理20毫升的该细胞混悬液，并且取出3毫升份放置在冰上为T0样品。将加Salinosporamide A的3毫升等份的细胞混悬液置于6孔板中并放回培养箱中。作为PARP切割的阳性对照，用350nM的十字孢碱(Staurosporine)，一种已知的细胞凋亡引发剂(Sigma S5921，在-20℃下贮存的700μM的DMSO储备溶液)处理完全相同的细胞混悬液。在Salinosporamide A处理的细胞情况下，在第2，4，6，8和24小时时取出样品，并且在4小时时用于十字孢碱对照。对于每一个时间点，通过简单离心回收细胞，用400μL的PBS洗涤该细胞，并再次沉淀该细胞。移除PBS后，在SDS PAGE之前，将该沉淀物贮存在-20℃下。将每一细胞沉淀物再混悬于100μl的NuPAGE样品缓冲液(Invitrogen 46-5030)中，并且将10μl的每一样品在10％NuPAGEBIS-Tris凝胶(Invitrogen NB302)上进行分离。在电转移至硝化纤维素后，用抗PARP的家兔多克隆抗体(Cell Signaling 9542)探测薄膜，随后用山羊抗家兔的碱性磷酸酶偶联的第二抗体进行探测(Jackson 11-055-045)。用BCIP/NBT(Roche 1681451)比色分析法检测结合的抗体。
图35中显现的western印迹表明在所述Jurkat细胞内PARP以时间依赖性形式被切割。暴露于Salinosporamide A后2至4小时之间在处理的细胞中出现该切割的形式(用星号*表示)，而大多数的余下的PARP在24小时之前被切割。十字孢碱处理的细胞(St)显示PARP的快速裂解，大多数蛋白在4小时内被切割。这些数据强烈地表明Salinosporamide A可在Jurkat细胞中诱导细胞凋亡。
实施例44 抗炭疽活性 为了分析Salinosporamide A或其它化合物阻止因LeTx暴露引起的细胞死亡的能力，如下所述，RAW264.7巨噬细胞样细胞和重组LF和PA致死毒素组分用作分析细胞毒性的体外模型系统。
在37℃下、在含有潮湿的5％CO2的培养箱中，将RAW264.7细胞(ATCC # TIB-71)适应并维持在补加有10％胎牛血清(ADMEM，Mediatech，Herndon，VA)的高级Dulbecco’s改进的Eagle培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。在37℃下，在含潮湿的5％CO2的培养箱中将细胞以50000细胞/孔的浓度接种在96孔板内的补加有5％FBS的ADMEM中，过夜。可选择地，也可使用在补加有10％胎牛血清的DMEM中培养的细胞并发现该细胞适用于此分析。在第二天早晨移除培养基并用无血清的ADMEM取代，该ADMEM含有或不含有剂量范围从1μM至0.5nM的用于8点剂量效应的Salinosporamide A或Omuralide。从1mg/mL的DMSO储备溶液中配制所述化合物并在ADMEM中稀释到终浓度。15分钟预孵育后，将200ng/mL LF或400ng/mL PA单独或联合地(LeTx)加入细胞中。从List生物学实验室获得重组LF和PA并按照制造商所述的，在-80℃下以1mg/mL储备溶液贮存在含有1mg/ml BSA的无菌水中。在37℃下孵育细胞6小时，接着如先前所述加入刃天青。在通过测量荧光来评价细胞存活力之前再将培养板另外孵育6小时。所述数据是三次实验，每次实验重复3到6次的总结并将数据表达为存活百分比，应用如下公式，用DMSO对照(阴性的)和LeTx对照(阳性的)将该数据标准化存活力％＝100×(观察到的OD-阳性对照)/(阴性对照-阳性对照)。
图36中所示数据表明用Salinosporamide A进行的处理可在体外阻止LeTx诱导的巨噬细胞样RAW264.7细胞的细胞死亡。单独用LF或PA或单独用Salinosporamide A处理的RAW细胞很少降低细胞存活力，然而用LeTx进行的处理与对照相比导致大约0.27％的细胞存活力。Salinosporamide A可能通过抑制特异蛋白的降解和减少细胞因子的合成来增强巨噬细胞的存活率，这最终导致体内抑制炭疽毒素的致死作用。
虽然Salinosporamide A在100nM及其以上的浓度时的单独处理产生非常适度的细胞毒性，但是用较低的、相对无毒性水平进行的处理显示在LeTx处理的细胞中，RAW 264.7细胞存活力有显著的增加(图36)。例如，当用12nM Salinosporamide A预处理时，Salinosporamide A+LeTx处理组显示82％的细胞成活力，该浓度为用Salinosporamide A单独处理时显示96％存活力的浓度。在这些研究中Salinosporamide A的平均EC50为3.6nM。相反，Omuralide对细胞存活力显示相对很少的作用直到其达到1μM浓度为止。即使Omuralide在高浓度的情况下，观察到只有37％存活力，这表明Salinosporamide A是抑制LeTx诱导的RAW264.7细胞死亡的更有效的抑制剂。与这些数据一致，Tang et.al.，Infect Immun 673055(1999)发现在所述LeTx分析中，MG132和乳胞素(Omuralide的前体)的EC50浓度为3μM。综上所述，这些数据进一步表明与目前描述的任何其它化合物相比，Salinosporamide A是抑制LeTx诱导的细胞毒性的更有效的抑制剂。
在LeTx的存在时，Salinosporamide A促进RAW264.7细胞的存活，这表明该化合物或其衍生物是对炭疽的有价值的临床治疗剂。另外，值得注意的是Salinosporamide A对RAW 264.7细胞比对许多肿瘤细胞更具有较低的细胞毒性。
实施例45 Salinosporamide A对多发性骨髓瘤和前列腺癌细胞系的活性 NF-κB在多发性骨髓瘤中对肿瘤生长及抗细胞凋亡是至关重要的并且已报导了它还在多种前列腺癌细胞系中有组成型活性(Hideshima T etal.2002，Shimada K et al.2002 and Palayoor ST et al.1999)。通过其抑制剂IκBα的蛋白酶体降解来调节NF-κB的活性。因为Salinosporamide A已显示出体外抑制蛋白酶体并且干扰NF-κB的信号传导途径，因此评价Salinosporamide A对多发性骨髓瘤细胞系RPMI 8226和前列腺癌细胞系PC-3和DU 145的活性。
在标准生长抑制分析中，利用刃天青染料和48小时的药物暴露确定EC50值。2-5次独立实验的结果(表6)显示Salinosporamide A对RPMI 8226和前列腺癌细胞系的EC50值范围为10-37nM。
表6Salinosporamide IA(II-16)对多发性骨髓瘤和前列腺肿瘤细胞系的EC50值

应用western印迹分析，通过监测PARP和前胱天蛋白酶3的切割评价Salinosporamide A在RPMI 8226和PC-3细胞中诱发细胞凋亡的能力。简单说，用100nM Salinosporamide A(2345R01)处理PC-3和RPMI 8226细胞0，8或24小时。制备总蛋白裂解物并且在还原/变性条件下溶解20μg的该裂解物，然后转印在硝化纤维素上。然后用抗PARP或胱天蛋白酶3的抗体探测该印迹，接着用抗肌动蛋白的抗体解吸并再探测。
这些实验的结果表明Salinosporamide A对RPMI 8226细胞的处理导致PARP和前胱天蛋白酶3以时间依赖性方式的切割(图37)。RPMI 8226细胞与PC-3细胞相比似乎对Salinosporamide A更敏感，因为在第8小时时可观察到诱导PARP切割并在24小时前完成。相反，在PC-3细胞中在24小时时观察到PARP的切割，然而在该实验中未检测出前胱天蛋白酶3的切割(图37)。
RPMI 8226细胞用于评价用多种浓度的Salinosporamide A处理细胞8小时的作用。简单说，用多种浓度的Salinosporamide A(2345R01)处理RPMI 8226细胞8小时并制成蛋白裂解物。在还原/变性条件下将25μg的该裂解物溶解并转印在硝化纤维素上。然后用抗PARP或抗胱天蛋白酶3的抗体探测该印迹，接着用抗肌动蛋白的抗体解吸并再探测。图38证明Salinosporamide A均诱发PARP和前-胱天蛋白酶3的剂量依赖性切割。
实施例46 式I-7、II-2、II-3、II-4、II-5A、II-5B、II-8C、II-13C、II-16、II-17、II-18、II-19、II-20、II-21、II-22、II-24C、II-25、II-26、II-28、II-29、II-30、II-31、II-32、II-38、IV-3C、II-44、VI-1A、II-47和II-50对人多发性骨髓瘤RPMI 8226和U266细胞的生长抑制 将将人多发性骨髓瘤细胞系PRMI 8226(ATCC；CCL-155)和U266(ATCC；TIB-196)维持在适当的培养基中。在37℃下，在含5％CO2和95％潮湿空气的培养箱中培养该细胞。
为了进行细胞生长抑制分析，将RPMI 8226和U266细胞分别以2×104和2.5×104细胞/孔接种在Corning 3904黑色壁、透明底的组织培养板内的96μl完全培养基中。在100％DMSO中配制所述化合物的20mM储备溶液，并分成等份且贮存在-80℃中。将该化合物连续地稀释并加入到测试孔中，一式三份。式I-7、II-3、II-8C、II-5B、II-13C、II-17、II-20、II-21、II-22、II-24C、II-25、II-26、II-28、II-29、II-30、II-31、II-32、II-38、IV-3C、VI-1A、和II-47的终浓度为20μM至6.32nM。式II-16、II-18、II-19、II-44和II-50的终浓度为632nM至200pM。式II-2、II-4和II-5A的终浓度为2μM至632pM。在全部样品中DMSO终浓度为0.25％。
药物暴露48小时后，在每个孔中加入10μl含0.2mg/ml刃天青(从Sigma-Aldrich化学公司获得)的无Mg2+、Ca2+的磷酸盐缓冲盐水，并将所述培养板放回到该培养箱中培养3-6个小时。因为活细胞代谢刃天青，应用Fusion微量培养板荧光计(Packard Bioscience)，使用λex＝535nm和λem＝590nm的滤光器测定刃天青的还原产物的荧光。不含细胞的培养基中的刃天青染料用于确定背景，将其从所有实验孔的数据中扣除。将该数据标准化为用培养基+0.25％DMSO处理的细胞(100％细胞生长)的平均荧光度，并且用标准的S形剂量效应曲线拟合法则(由XLfit 3.0或XLfit 4.0产生，ID Business Solutions Ltd)确定EC50值(观察到50％的最大生长抑制的药物浓度)。数据总结于表12和表13中。
实施例47 Salinosporamide A(II-16)对耐药细胞系保留活性 确定Salinosporamide A对人子宫肉瘤MES-SA细胞系及其多重耐药性衍生物MES-SA/Dx5的EC50值，以便评价Salinosporamide A对过分表达P-糖蛋白流出泵的细胞系是否保留活性。包括作为对照的、P-糖蛋白泵的公知底物的太平洋紫杉醇(Paclitaxel)。
表7Salinosporamide A对MES-SA和耐药性衍生物MES-SA/Dx5的EC50值
这些生长抑制分析中的结果(表7)显示，正如预期的，Paclitaxel对MES-SA/Dx5细胞不保留其活性，这也通过EC50值的408倍的增长反映出。Salinosporamide A对MES-SA和对MES-SA/Dx5的EC50值相似。这表明Salinosporamide A能抑制多重耐药性细胞系MES-SA/Dx5的生长，这表示Salinosporamide A似乎不是P-糖蛋白流出泵的底物。
另外，还评价Salinosporamide A对HL-60/MX2，人白血病细胞系HL-60的耐药衍生物的能力，其中HL-60/MX2具有减少的拓扑异构酶II活性的特征并被认为具有非典型的多重耐药性。确定Salinosporamide A对HL-60和HL-60/MX2的生长抑制的EC50值。包括作为对照的DNA的结合剂盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone)，因为据报导HL-60/MX2细胞对该化疗剂有耐药性(Harker W.G.et al.1989)。
表8Salinosporamide A对HL-60和耐药衍生物HL-60/MX2的EC50值
在表8中的数据显示相对于HL-60细胞，Salinosporamide A对HL-60/MX2细胞能保留其活性，这表明Salinosporamide A在表达减少的拓扑异构酶II活性的细胞中是有效的。相反，盐酸米托蒽醌对HL-60/MX2细胞具有约29分之一活性。
Salinosporamide A还表现出对耐药性多发性骨髓瘤细胞系具有活性。例如，Salinosporamide A对耐MM.1R和多柔比星的Dox-40细胞系具有活性。此外，Salinosporamide A对之前用地塞米松、硼替佐米和沙立度胺的多种疗法治疗后复发的人多发性骨髓瘤患者中获得的细胞系具有活性。因此，Salinosporamide A对耐药性多发性骨髓瘤有活性，该耐药性多发性骨髓瘤包括对多柔比星、地塞米松、硼替佐米和沙立度胺显示耐药性的多发性骨髓瘤。相似地，本文公开的其它化合物对包括对多柔比星、地塞米松、硼替佐米和沙立度胺显示耐药性的多发性骨髓瘤在内的耐药性多发性骨髓瘤有活性。
实施例48 Salinosporamide A及其几个类似物构效关系 为了确定Salinosporamide A的初期的构效关系(SAR)，评价一系列的Salinosporamide A类似物对多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226的能力。在标准化的生长抑制分析中，用刃天青染料和48小时的药物暴露确定EC50值。
SAR的初期系列的结果(表9)显示将卤素基团添加到乙基中似乎增加了细胞毒性。
表9Salinosporamide A的初期SAR系列

当n＞2，确定平均值±标准偏差 实施例49 体内生物学 最大耐受剂量(MTD)的确定 体内研究设计为当向雌性BALB/c小鼠静脉内给药SalinosporamideA时确定Salinosporamide A的MTD。
称重BALB/c系小鼠并且将多种浓度的Salinosporamide A(从0.01mg/kg到0.5mg/kg)以单次剂量静脉内给药(qdx1)或每天静脉内给药连续5天(qdx5)。每天观察动物的临床迹象并且每周单独地称重动物两次直到实验结束(在给药的最后一天后最多为14天)。结果显示于表10中并表明Salinosporamide A的单次静脉给药的剂量一直到0.25mg/kg是耐受的。当每天给药连续5天时，Salinosporamide A的浓度一直到0.1mg/kg是良好耐受的。在实验过程中没有注意到习性变化。
表10 Salinosporamide A在雌性BALB/c系小鼠中的MTD的测定

实施例50 Salinosporamide A的吸收、分布、代谢和消除(ADME)特征的初步评价 实施研究以初步评价Salinosporamide A的ADME特征。这些研究由溶解度评价，LogD7.4确定和检测细胞色素P450酶抑制作用的初步筛查组成。这些研究的结果显示Salinosporamide A在PBS(pH 7.4)中的估计的溶解度为9.6μM(3g/ml)并且LogD7.4值为2.4。该LogD7.4值是在与药物开发相容的可接受限度内(LogD7.4＜5.0)并且表明有口服利用度。初步的P450抑制筛查结果显示Salinosporamide A，当以10μM测试时，对所有的P450同工型显示没有或低的抑制CYP1A2，CYP2C9和CYP3A4分别抑制3％，6％和6％，而CYP2D6和CYP2C19分别抑制19％和22％。
实施例51 Salinosporamide A及其在体内对全血蛋白酶体活性的作用 Salinosporamide A先前已表明在体外是蛋白酶体的有效和特异的抑制剂，对纯化的20S蛋白酶的胰凝乳蛋白酶样活性的IC50值为2nM。为了监测Salinosporamide A在体内的活性，开发了快速并可重复的分析(改编自Lightcap et al.2000)以评价在全血中的蛋白酶体活性。
简而言之，为了通过低渗休克裂解所述细胞，用冷冻的全血样品在冰中解冻一小时并再混悬于700μl的冰冷的5Mm的EDTA，pH8.0中。这表示压积的全血细胞的容积大约为2-3倍。允许裂解1小时，并且通过以14,000 Xg离心10分钟去除细胞碎片。将上清液(Packed Whole BloodLysate(压积的全血裂解物)，PWBL)转移到干净的试管中，并且弃去片状沉淀物。用BSA作为标准，通过BCA分析(Pierce)确定该PWBL的蛋白浓度。大约80％的样品具有800到1200μg/mL之间的总蛋白浓度。
通过测量对蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性特异的荧光底物(suc-LLVY-AMC，Bachem Cat.1-1395)的水解确定蛋白酶体的活性。对照实验表明在这些提取物中＞98％的该蛋白的水解是由蛋白酶体介导的。通过将来自动物体内的5μl的PWBL与185μl的分析缓冲液(20mM HEPES、0.5mM EDTA、0.05％Triton X-100、0.05％SDS、pH7.3)在Costar 3904平板中进行混合建立分析。滴定法实验显示如果在该分析中蛋白浓度在200μg到1000μg之间，则在蛋白浓度和水解速率之间有线性关系。通过加入10μl的0.4mM suc-LLVY-AMC(通过用分析缓冲液以1∶25的比例稀释10mM的该肽的DMSO溶液而制备)引发所述反应，并且在37℃下，在荧光计(Labsystems Fluoroskan)中进行孵育。底物的水解导致游离的AMC的释放，通过使用λex＝390nm和λem＝460nm荧光测定该AMC。在该体系中水解速率至少在1小时内是线性的。然后将每一样品的水解速率标准化成每毫克蛋白的相对荧光单位RFU/mg)。
为了探索Salinosporamide A的体内活性，用多种浓度的Salinosporamide A处理雄性Swiss-Webster小鼠(每组5只，体重为20-25g)。将Salinosporamide A静脉给药并且假定它的LogD7.4值为2.4，暗示口服利用度。还将Salinosporamide A口服给药。在给药之前，通过用10％solutol稀释Salinosporamide A储备溶液(100％DMSO)，导致终浓度为2％DMSO来即刻产生Salinosporamide A的给药溶液。介质对照由10％solutol中含2％DMSO组成。为了确定蛋白酶体活性的基线，对一组动物均不给予介质和Salinosporamide A。将Salinosporamide A或者介质以10mL/kg进行给药，并且在给药后90分钟将该动物麻醉并通过心脏穿刺提取血液。通过离心收集压积的全血细胞，用PBS洗涤并再次离心分离。在评价蛋白酶体活性前将所有的样品贮存在-80℃下。
为了确定在这些实验中观察到的底物的水解只归因于所述蛋白酶体的活性，使用高特异性蛋白酶体抑制剂Epoxomicin进行关于所述提取物的剂量效应实验。将PWBL裂解物以1∶40的比例用分析缓冲液稀释，并且将180μl的该溶液加入到Costar 3904平板中。在DMSO中连续地稀释Epoxomicin(Calbochem Cat.324800)以产生8点剂量效应曲线，在分析缓冲液中以1∶50的比例进行稀释，并且将10μl的该溶液加入到稀释的PWBL中，一式三份。在37℃下将所述样品预孵育5分钟，并且用上述的底物引发反应。采用S形的剂量效应，并以可变的斜面为模型在Prism中分析该剂量效应曲线。
图40为散点图，这显示在来源于个别小鼠(每组5只小鼠)的PWBL中的标准化的蛋白酶体活性。在每一组中，水平线表示平均的标准化的活性。这些数据显示Salinosporamide A在PWBL中引起蛋白酶体活性的显著降低，并且该抑制作用是剂量依赖性的。另外，这些数据显示Salinosporamide A在口服给药时是有效的。
通过检测公知的蛋白酶体抑制剂Epoxomicin对所述肽底物的水解的作用显示了该分析的特异性。Epoxomicin是肽环氧化物，对所述蛋白酶体显示出高的特异性，对其它已知的蛋白酶没有抑制活性(Meng et al.，1999)。用多种浓度的Epoxomicin孵育来自介质对照的裂解物和来自用0.1mg/kg Salinosporamide A静脉注射(i.v.)处理的动物的裂解物，并且确定IC50值Palayoor et al.，Oncogene 187389-94(1999)。正如图.41中显示的，Epoxomicin在所述蛋白酶体底物的水解中引起剂量依赖性抑制作用。在这些实验中获得的IC50值与在体外使用纯化的20S蛋白酶体所观察到的10nM值(没有显示)良好相配。这些数据也表明对用0.1mg/kgSalinosporamide A处理的动物中制备的这些裂解物中的所述底物保留活性，这归因于所述蛋白酶体，而不是一些其它蛋白酶。用高剂量的Epoxomicin处理的提取物中看到的剩余活性小于2％的全部信号，这表明用suc-LLVY-AMC作为底物所观察到的超过98％的活性只归因于存在于PWBL中的所述蛋白酶体的活性。
还评价了基线活性中的内在变化与Salinosporamide A抑制蛋白酶体活性的能力之间的比较。在图42中，显示了分开运转几周的单独分析的结果，Qureshi，et al.，J.Immunol.171(3)1515-25(2003)。为了清楚，只显示介质对照和匹配的剂量结果。虽然对照组中来源于个别动物的PWBL中的蛋白酶体活性存在一些变化，但是两组之间的全部平均值是非常相似的。用Salinosporamide A(0.1mg/kg i.v.)处理的动物还显示了非常相似的剩余活性和平均抑制作用。这表明在分析之间的结果可以与置信度相比较。
实施例52 Salinosporamide A在体内抑制LPS诱导的TNF 研究表明蛋白酶体在许多信号分子的活化方面起作用，包括通过蛋白性降解NF-κB的抑制剂(IκBα)在转录因子NF-κB的活化方面起作用。LPS信号通过TLR4受体激活NF-κB和其它转录调节器，导致许多诸如TNF、IL-6和IL-1β的促炎基因表达。促炎细胞因子的连续表达已在许多疾病中被鉴定为主要因素。TNF和IL-1β的抑制剂在许多炎症模型中显示有效性，包括LPS小鼠模型以及类风湿性关节炎及炎性肠病的动物模型。最近的研究表明抑制蛋白酶体可阻止LPS-诱导的TNF分泌(Qureshi et al.，2003)。这些数据显示Salinosporamide A，新颖有效的蛋白酶体抑制剂，可在高剂量LPS鼠模型中体内阻止TNF的分泌。
为了评价Salinosporamide A体内抑制小鼠的LPS诱导的血浆TNF水平的能力，在BolderBioPATH，Inc.in Boulder，CO.开始进行体内研究。下列方法概括了为这些研究设计的实验方案。
用LPS(2mg/kg)通过腹腔内途径注射雄性的Swiss Webster小鼠(12只为一组，体重为20-25g)。三十分钟后，在热灯下大约5分钟后，用Salinosporamide A以2.5mg/kg剂量对小鼠静脉注射(尾静脉)。在LPS注射后九十分钟，将该小鼠用异氟烷麻醉，并通过心脏穿刺流血获取血浆。然后将剩余的血沉淀物再混悬于500μl PBS中以洗去残留的血清蛋白并再次离心。移除上清液并且冷冻血沉淀物，以便分析压积的全血裂解物中的蛋白酶体抑制。
表11时间 用10mg/mL的Salinosporamide A的100％DMSO储备溶液制备给药溶液。通过用无内毒素的水以w/w进行稀释来制备10％solutol溶液，并且用10mg/ml的Salinosporamide A原液制成1∶160的稀释液。以4ml/kg的剂量对动物静脉注射给药。还通过在10％的solutol溶液内配制相同的100％DMSO的1∶160稀释液，使终浓度为水中含9.375％的solutol和DMSO为0.625％来制备介质对照溶液。根据制造商的技术说明书，用Biosource mTNF Cytoset试剂盒(Biosource Intl.，Camarillo，CA；目录号#CMC3014)实施血浆TNF水平的测量。将样品稀释1∶60以用于该分析。
用每组至少有10只可重复动物进行的两次独立实验中获得的数据表明用0.125或0.25mg/kg的Salinosporamide A进行的处理体内降低LPS诱导的TNF分泌。代表性实验显示于图43中。这些数据显示注射2mg/kg LPS后三十分钟，再用0.25mg/kg Salinosporamide A对动物进行的处理导致血清TNF水平的显著降低。还分析了压积的全血样品的先体外后体内的蛋白酶体抑制，显示用0.125mg/kg Salinosporamide A处理的动物有70±3％的抑制和用0.25mg/kg Salinosporamide A处理的动物有94±3％的抑制。在用或没有用LPS处理的动物中没有看到关于蛋白酶体抑制的显著差异。当LPS处理后三十分钟，以0.125或0.25mg/kg的剂量向小鼠静脉注射给药时，Salinosporamide A降低了约65％的LPS诱导的血浆TNF水平。
实施例53 Salinosporamide A体外的化学增敏效应 诸如CPT-11(依立替康)的化学治疗剂可活化包括LoVo细胞在内的人结肠癌细胞系中的转录因子核因子-kappa B(NF-κB)，导致这些细胞忍受细胞凋亡的能力的降低，Cusack，et al.，Cancer Res 613535(2001)。在未刺激的细胞中，NF-κB以与抑制性蛋白IκB(NF-κB的抑制剂)的惰性复合物形式位于细胞质中。多种刺激可通过IκB激酶引起IκB磷酸化，接着IκB遍在蛋白化并通过蛋白酶体降解IκB。IκB降解后，NF-κB易位至细胞核并且调节基因表达，影响许多细胞进程，包括存活基因的上调从而抑制细胞凋亡。
最近公认的蛋白酶体抑制剂，VelcadeTM(PS-341；Millennium制药公司)对癌细胞有直接毒性，并且还可以通过抑制蛋白酶体诱导的IκB降解来增强CPT-11对体外和LoVo异种移植物嫁接模型中的LoVo细胞的细胞毒性，Adams，J.，Eur J Haematol 70265(2003)。此外，发现VelcadeTM抑制扁平细胞癌中前血管源性的(proangiogenic)趋化因子/细胞因子GRO-α和VEGF的表达，大概是通过抑制NF-κB途径实现，Sunwoo，et al.，Clin Cancer Res 71419(2001)。该数据表明蛋白酶体的抑制不仅减少肿瘤细胞的存活率和生长，而且减少血管生成。
实施例54 结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤和黑素瘤的生长抑制 人结肠腺癌(HT-29；HTB-38)、前列腺癌(PC-3；CRL-1435)、乳腺癌(MDA-MB-231；HTB-26)、非小细胞肺癌(NCI-H292；CRL-1848)卵巢腺癌(OVCAR-3；HTB-161)、多发性骨髓瘤(RPMI 8226；CCL-155)、多发性骨髓瘤(U266；TDB-196)和鼠黑素瘤(B16-F10；CRL-6475)细胞均购自ATCC并维持在适当的培养基中。在37℃下、在含5％CO2和95％潮湿空气的培养箱中培养所述细胞。
为了进行细胞生长抑制分析，将HT-29、PC-3、MDA-MB-231、NCI-H292、OVCAR-3和B16-F10细胞分别以5×103、5×103、1×104、4×103、1×104和1.25×103细胞/孔接种在96孔(Corning 3904)黑色壁、透明底的组织培养板内的90μl完全培养基中，并将该培养板孵育过夜以使细胞建立并进入对数生长期。将RPMI 8226和U266细胞在进行分析当天分别以2×104和2.5×104细胞/孔接种在96孔板内的96μl完全培养基中。在100％DMSO中配制所述化合物的20mM储备溶液，并贮存在-80℃中。将该化合物连续地稀释并加入到测试孔中，一式三份。II-2和II-4的测试浓度为6.32μM至632pM。II-3和II-17以20μM至6.32nM的浓度进行测试。式II-18和II-19以2μM至200pM的浓度进行测试。式II-5A和式II-5B分别以2μM至632pM的终浓度和20μM至6.32nM的终浓度进行测试。将该培养板放回到该培养箱中培养48小时。在全部样品中DMSO终浓度为0.25％。
药物暴露48小时后，在每个孔中加入10μl含0.2mg/ml刃天青(从Sigma-Aldrich化学公司获得)的无Mg2+、Ca2+的磷酸盐缓冲盐水，并将所述培养板放回到该培养箱中培养3-6个小时。因为活细胞代谢刃天青，应用Fusion微量培养板荧光计(Packard Bioscience)，使用λex＝535nm和λem＝590nm的滤光器测定刃天青的还原产物的荧光。不含细胞的培养基中的刃天青染料用于确定背景，将其从所有实验孔的数据中扣除。将该数据标准化为用培养基+0.25％DMSO处理的细胞(100％细胞生长)的平均荧光度，并且用标准的S形剂量效应曲线拟合法则(XLfit 3.0，ID Business Solutions Ltd)确定EC50值(观察到50％的最大生长抑制的药物浓度)。其中细胞生长的最大抑制小于50％时， 则没有确定定EC50值。
表12中的数据总结了式II-2、II-3、II-4、II-5A、II-5B、II-17、II-18和II-19对人结肠直肠癌，HT-29、人前列腺癌，PC-3、人乳腺癌，MDA-MB-231、人非小细胞肺癌，NCI-H292、人卵巢癌，OVCAR-3、人多发性骨髓瘤，RPMI 8226和U266以及鼠黑素瘤B16-F10细胞系的生长抑制作用。
表12 式II-2、II-3、II-4、II-5A、II-5B、II-17、II-18和II-19对多种肿瘤细胞系的EC50值
*其中n＝3，显示了平均值±标准差 所述EC50值表明式II-2、II-4、II-5A、II-5B、II-18和II-19对HT-29、PC-3、MDA-MB-231、NCI-H292、RPMI 8226、U266和B16-F10肿瘤细胞系有细胞毒性。II-2、II-5A、II-5B和II-19还对OVCAR-3肿瘤细胞有细胞毒性。式II-17对MDA-MB-231、RPMI 8226、U266和B16-F10肿瘤细胞系有细胞毒性。
表13中的数据总结了式I-7、II-2、II-3、II-4、II-5A、II-5B、II-8C、II-13C、II-16、II-17、II-18、II-19、II-20、II-21、II-22、II-24C、II-25、II-26、II-28、II-29、II-30、II-31、II-32、II-38、IV-3C、II-44、VI-1A、II-47和II-50对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI 8226和U266的生长抑制作用。
表13 式I-7、II-2、II-3、II-4、II-5A、II-5B、II-8C、II-13C、II-16、II-17、II-18、II-19、II-20、II-21、II-22、II-24C、II-25、II-26、II-28、II-29、II-30、II-31、II-32、II-38、IV-3C、II-44、VI-1A、II-47和II-50对RPMI8226和U266细胞的EC50值


其中n≥3，显示了平均值±标准差；*n＝3，不适用标准差；ND＝未测定 所述EC50值表明式II-2、II-4、II-5A、II-5B、II-16、II-17、II-18、II-19、II-20、II-22、II-24C、II-26、II-29和II-30对RPMI 8226和U266细胞有细胞毒性。式I-7、II-38、II-44、VI-1A、II-47和II-50对RPMI8226细胞有细胞毒性。式II-21和IV-3C对U266细胞有细胞毒性。
实施例55 对MES-SA、MES-SA/Dx5、HL-60和HL-60/MX2肿瘤细胞系的生长抑制 人子宫肉瘤(MES-SA；CRL-1976)、其多重耐药性衍生物(MES-SA/Dx5；CRL-1977)、人急性前髓细胞性白血病细胞(HL-60；CCL-240)和其多重耐药性衍生物(HL-60/MX2；CRL-2257)购自ATCC并维持在适当的培养基中。在37℃下、在含5％CO2和95％潮湿空气的培养箱中培养该细胞。
为了进行细胞生长抑制分析，将MES-SA和MES-SA/Dx5细胞都以3×103细胞/孔接种在96孔(Corning；3904)黑色壁、透明底的组织培养板内的90μl完全培养基中，并且将该培养板孵育过夜以使细胞建立并进入对数生长期。HL-60和HL-60/MX2细胞在添加化合物当天都以5×104细胞/孔接种在96孔培养板内的90μl完全培养基中。在100％DMSO中配制所述化合物的20mM储备溶液并在-80℃中贮存。将所述化合物连续地稀释并加入到该测试孔中，一式三份。II-2和II-4的测试浓度为6.32μM至2nM。II-3和II-17在20μM至6.32nM浓度下进行测试。化合物II-18在2μM至632pM浓度下进行测试。将所述培养板又放回到该培养箱中培养48小时。在全部的样品中DMSO的终浓度为0.25％。
药物暴露48小时后，向每一个孔中加入10μl的含0.2mg/ml刃天青(从Sigma-Aldrich Chemical Co.获得)的无Mg2+，Ca2+的磷酸盐缓冲盐水，并且将所述培养板放回到所述培养箱中培养3-6小时。因为活细胞代谢刃天青，应用Fusion微量培养板的荧光计(PackardBioscience)，使用λex＝535nm和λem＝590nm的滤光器测量刃天青的还原产物的荧光。不含细胞的培养基中的刃天青染料用于确定背景，将其从所有实验孔的数据中扣除。将该数据标准化成用培养基+0.25％DMSO处理的细胞(100％细胞生长)的平均荧光度，并且用标准的S形剂量效应曲线拟合法则(XLfit 3.0，ID Business Solutions Ltd)确定EC50值(观察到50％的最大生长抑制的药物浓度)。其中细胞生长的最大抑制小于50％，则没有确定EC50值。
所述多重耐药性MES-SA/Dx5肿瘤细胞系源于人子宫肉瘤MES-SA肿瘤细胞系并表达升高的P-糖蛋白(P-gp)，ATP依赖性外流泵。在表14中的数据概述了式II-2、II-3、II-4、II-17和II-18对MES-SA及其多重耐药性衍生物MES-SA/Dx5的生长抑制作用。包括作为对照的、P-gp泵的公知底物的太平洋紫杉醇(Paclitaxel)。
表14 式II-2、II-3、II-4、II-17和II-18对MES-SA和MES-SA/Dx5肿瘤细胞系的EC50值
*变化倍数＝EC50值的比(MES-SA/Dx5MES-SA) EC50值表明II-2、II-4、II-17和II-18均对MES-SA和MES-SA/Dx5肿瘤细胞系有细胞毒活性。通过观察到太平洋紫杉醇对耐药的MES-SA/Dx5细胞具有降低约800倍的活性确定了所述的多重耐药性表型。
HL-60/MX2是源于人早幼粒细胞白血病细胞系HL-60的多重耐药性肿瘤细胞系并且表达为减少的拓扑异构酶II活性。在表15中显示的数据概述了式II-2、II-3、II-4、II-17和II-18化合物对HL-60及其多重耐药性衍生物HL-60/MX2的生长抑制作用。包括作为对照的、拓扑异构酶II靶向试剂的米托蒽醌。
表15 式II-2、II-3、II-4、II-17和II-18对HL-60和HL-60/MX2肿瘤细胞系的EC50值
*变化倍数＝EC50值的比(HL-60/MX2HL-60) 所述的EC50值表明II-2、II-4和II-18对HL-60和HL-60/MX2肿瘤细胞系均保留细胞毒活性。通过观察到米托蒽醌对耐药的HL-60/MX2细胞具有降低约30倍的活性确定了该多重耐药性表型。
实施例56 式II-16、式II-17、式II-20和Omuralide对PRMI 8226细胞中20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的作用 在37℃下，在5％CO2和95％潮湿的空气中，将人多发性骨髓瘤细胞系RPMI 8226(ATCC，CCL-155)培养在RPMI 1640培养基中，该培养基补加有2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1mM丙酮酸钠和10％热灭活的胎牛血清。为了评价对所述20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的抑制作用，将在DMSO中配制的测试化合物在培养基中适当地稀释，并加入到2.5×105/ml的RMPI 8226细胞中。对于式II-16，最终测试浓度为1nM至100nM。对于式II-17、II-20和Omuralide(Calbiochem，San Diego，CA)，最终测试浓度为1nM至10μM。DMSO以0.1％的终浓度用作介质对照。在用所述化合物孵育RMPI 8226细胞1小时后，在室温下，通过以2,000rpm离心10秒使细胞沉淀，并用冰冷的1X Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS，Mediatech，Herndon，VA)洗涤该细胞3次。将DPBS洗涤的细胞在补加有蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)的裂解缓冲液(20mM HEPES，0.5mM EDTA，0.05％Triton X-100，pH7.3)中在冰上裂解15分钟。在4℃下，通过以14,000rpm离心10分钟使细胞碎片沉淀，并将上清液(＝细胞裂解物)转移至新试管中。用BCA蛋白分析试剂盒(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)测定蛋白浓度。在含有终浓度为0.035％SDS的蛋白酶体分析缓冲液(20mM HEPES，0.5mMEDTA，pH8.0)中，通过使用Suc-LLVY-AMC荧光肽底物(BostonBiochem，Cambridge，MA)测定所述的20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性。通过将10μl的0.4mM Suc-LLVY-AMC(通过用分析缓冲液以1∶25的比例稀释10mM的该肽的DMSO溶液而制备)加入到190μl的该细胞裂解液中引发反应，并在37℃下，在Thermo Lab SystemsFluoroskan培养板读数器中进行孵育。通过使用λex＝390nm和λem＝460nm荧光测量释放的香豆素(AMC)。在微量滴定板(Corning 3904)中实施所述分析，随后动态地每五分钟测量一次，持续2小时。用于每次分析的蛋白的总量为20μg。Suc-LLVY-AMC和DMSO的终浓度分别为20μM和0.2％。结果显示为相对于DMSO对照对该20S蛋白酶体胰凝乳蛋白酶样活性的抑制百分比。
表16中的结果显示将RPMI 8226细胞暴露于式II-16、式II-17、式II-20和Omuralide导致所述20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的抑制。在它们当中，式II-16在5nM时抑制了85±7％的20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性。在100nM时，式II-16能够完全抑制20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性。在100nM时，式II-17、式II-20和Omuralide只能够分别抑制30±4％、66±3％和32±8％的该胰凝乳蛋白酶样活性。
表16 测定来自用式II-16、式II-17、式II-20和Omuralide处理的RMPI 8226细胞的20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性 对RMPI 8226细胞裂解物中20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的抑制％化合物(平均值+SD，n＝3)10,000nM 1,000nM 500nM 100nM50nM 10nM 5nM 1nM II-16NDND ND 98±197±094±385±730±7 II-1765±5 46±439±3 30±426±56±6 10±56±6 II-2087±4 73±271±2 66±364±337±331±93±10 Omuralide93±1 80±868±11 32±817±11 4±9 8±9 5±9 ND未测定 实施例57 式II-16、式II-17、式II-20和Omuralide对PC-3细胞中20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的作用 在37℃下，在5％CO2和95％潮湿的空气中，将人前列腺癌细胞系PC-3(ATCC，CRL-1435)培养在F12K培养基中，该培养基补加有2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％热灭活的胎牛血清。为了评价对所述的20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的抑制作用，将在DMSO中配制的测试化合物在培养基中适当地稀释，并加入到1.25×105/ml的PC-3细胞中。对于式II-16，最终测试浓度为1nM至50nM。对于式II-17、II-20和Omuralide(Calbiochem，SanDiego，CA)，最终测试浓度为1nM至10μM。DMSO以0.1％的终浓度用作介质对照。在用所述化合物孵育PC-3细胞1小时后，用冰冷的1X Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS，Mediatech，Herndon，VA)洗涤该细胞3次。将DPBS洗涤的细胞在补加有蛋白酶抑制剂混合物(RocheDiagnostics，Indianapolis，IN)的裂解缓冲液(20mM HEPES，0.5mMEDTA，0.05％Triton X-100，pH7.3)中在冰上裂解15分钟。在4℃下，通过以14,000rpm离心10分钟使细胞碎片沉淀，并将上清液(＝细胞裂解物)转移至新试管中。用BCA蛋白分析试剂盒(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)测定蛋白浓度。在含有终浓度为0.035％的SDS的蛋白酶体分析缓冲液(20mM HEPES，0.5mM EDTA，pH8.0)中，通过使用Suc-LLVY-AMC荧光肽底物(Boston Biochem，Cambridge，MA)测定所述的20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性。通过将10μl的0.4mMSuc-LLVY-AMC(通过用分析缓冲液以1∶25的比例稀释10mM的该肽的DMSO溶液而制备)加入到190μl的该细胞裂解物中引发反应，并在37℃下，在Thermo Lab Systems Fluoroskan培养板读数器中进行孵育。通过使用λex＝390nm和λem＝460nm荧光测量释放的香豆素(AMC)。在微量滴定板(Corning 3904)中实施所述分析，随后动态地每五分钟测量一次，持续2小时。用于每次分析的蛋白的总量为20μg。Suc-LLVY-AMC和DMSO的终浓度分别为20μM和0.2％。结果显示为相对于DMSO对照对该20S蛋白酶体胰凝乳蛋白酶样活性的抑制百分比。
表17中的结果显示将PC-3细胞暴露于式II-16、式II-17、式II-20和Omuralide引起20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的抑制，与基于RPMI 8226细胞的实验中得到的结果相似。式II-16在5nM时抑制了69％的20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性。在50nM时，式II-16能够完全抑制20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性。在100nM时，式II-17、式II-20和Omuralide分别抑制了26％、57％和36％的该胰凝乳蛋白酶样活性。
表17 测定来源于用式II-16、式II-17、式II-20和Omuralide处理的PC-3细胞的20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性 在PC-3细胞裂解物中20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的抑制％ 化合物10,0001,000 100nM 50nM 10nM 5nM 1nMnMnM II-16NDND ND 98ND6919 II-177949 26 ND16NDND II-209071 57 ND38NDND Omuralide9080 36 ND18NDND ND未测定 实施例58 在含1％或10％血清的培养基中人多发性骨髓瘤PRMI 8226、人结肠腺癌HT-29和鼠黑素瘤B16-F10细胞的生长抑制 在1％或10％胎牛血清(FBS)存在时，测定了式II-16、II-17和II-18对人多发性骨髓瘤RPMI 8226、人结肠腺癌HT-29和鼠黑素瘤B16-F10细胞的生长抑制活性。
RPMI 8226(CCL-155)、HT-29(HTB-38)和B16-F10(CRL-6475)细胞购自ATCC。将RPMI 8226细胞维持在PRMI 1640培养基中，该培养基补加有10％(v/v)FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和分别为100IU/ml和100μg/ml的青霉素/链霉素。将HT-29细胞维持在McCoys 5A中，该McCoys 5A补加有10％(v/v)FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1％(v/v)非必需的氨基酸、10mM HEPES和分别为100IU/ml和100μg/ml的青霉素/链霉素。将B16-F10细胞维持在DMEM中，该DMEM补加有10％(v/v)FBS、2mM L-谷氨酰胺、10mMHEPES和分别为100IU/ml和100μg/ml的青霉素/链霉素。在37℃下，将所述细胞在含有5％CO2和95％潮湿空气的培养箱中培养。
为了进行细胞生长抑制分析，将HT-29和B16-F10分别以5×103和1.25×103细胞/孔接种在96孔(Corning；3904)的黑色壁、透明底的组织培养板内的含10％(v/v)FBS或1％(v/v)FBS的90μl培养基中。将该培养板孵育过夜以使细胞建立并进入对数期生长。将RPMI 8226细胞以2×104细胞/孔接种在96孔(Corning；3904)的黑色壁、透明底的组织培养板内的含10％(v/v)FBS或1％(v/v)FBS的90μl培养基中。在100％DMSO中配制式II-16、II-17和II-18的20mM储备溶液，分成等份并贮存在-80℃中。将式II-16、II-17和II-18在含1％或10％FBS的培养基中连续地稀释，并将其加入到测试孔中，一式三份。式II-16的终浓度为2μM至200pM。式II-17的终浓度为20μM至6.3nM。式II-18的终浓度为2μM至630pM。将该培养板放回到所述培养箱中培养48小时。在全部样品中DMSO的终浓度为0.25％。
药物暴露48小时后，在每个孔中加入10μl含0.2mg/ml刃天青(从Sigma-Aldrich化学公司获得)的无Mg2+、Ca2+的磷酸盐缓冲盐水，并将所述培养板放回到培养箱中培养3-6个小时。因为活细胞代谢刃天青，应用Fusion微量培养板荧光计(Packard Bioscience)，使用λex＝535nm和λem＝590nm的滤光器测定刃天青的还原产物的荧光。不含细胞的培养基中的刃天青染料用于确定背景，将其从所有实验孔的数据中扣除。将该数据标准化为用培养基+0.25％DMSO处理的细胞(100％细胞生长)的平均荧光度，并且用标准的S形剂量效应曲线拟合法则(由XLfit 3.0产生，ID Business Solutions Ltd)确定EC50值(观察到50％的最大生长抑制的药物浓度)。
表17中的数据概述了式II-16、II-17和II-18对含1％或10％FBS的培养基中的人多发性骨髓瘤细胞系RPMI 8226的生长抑制作用。
表17 式II-16、II-17和II-18对含1％或10％FBS的培养基中的RPMI8226细胞的EC50值 化合物 1％FBS，EC50(nM) 10％FBS，EC50(nM) II-166.2 126.8 9.6 平均值6.5 11 II-171100 30001300 2300 平均值1200 2700 II-1815201320 平均值1420 所述EC50值表明式II-16、II-17和II-18对含1％或10％FBS的培养基中的RPMI 8226细胞有细胞毒性。相对于含1％FBS的培养基中，在含有10％FBS的培养基中进行测试时，式II-16、II-17和II-18的平均EC50值存在小于3倍的减低。
表18中的数据概述了式II-16对含1％或10％FBS的培养基中的人结肠腺癌HT-29和鼠黑素瘤B16-F19细胞系的生长抑制作用。
表18 式II-16对含1％或10％FBS的培养基中的HT-29和B16-F19细胞的平均EC50值 化合物HT-29，EC50(nM)平均值±SD B16-F19，EC50(nM)平均值±SD 1％FBS 10％FBS 1％FBS 1％FBS II-16 16±5 23±10 18±913±1 平均值EC50值表明式II-16对含1％或10％FBS的培养基中的HT-29和B16-F10细胞有细胞毒性。相对于含1％FBS的培养基中，在含有10％FBS的培养基中进行测试时，式II-16的平均EC50值存在小于2倍的减低。综上所述，这些数据显示关于对肿瘤细胞系的体外细胞毒活性，在1％或10％FBS存在时式II-16、II-17和II-18保持相似的生物活性。
实施例59 抑制炭疽致死毒素 炭疽毒素是形成炭疽相关症状的原因。在该疾病中，炭疽杆菌芽孢被吸入并寄宿在肺中，在那里它们被巨噬细胞摄入。在该巨噬细胞内，芽孢发芽、复制、导致该细胞被杀死。但是在杀死该细胞前，感染的巨噬细胞迁移到淋巴结中，在那里死亡时，它们释放它们的内含物，使该有机体进入血液系统中，进一步复制并分泌致死毒素。
被称为保护抗原(PA 83kDa)和致死因子(LF，90kDa)的两种蛋白在炭疽的发病机理中起重要作用。这些蛋白共同地被称为致死毒素(LeTx)。当它们组合时，当静脉注射进动物体内时，PA和LF引起死亡。致死毒素在巨噬细胞的少数细胞培养系中也有活性，在几个小时内引起细胞死亡。体外处理时LeTx可在小鼠巨噬细胞样RAW264.7细胞中诱发坏死和细胞凋亡。
致死毒素介导的细胞毒性的抑制剂的体外基于细胞的分析 在37℃下、在含有潮湿的5％CO2的培养箱中，将RAW264.7细胞(从美国典型培养物保藏中心获得)适应并维持在补加有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基(完全培养基)中。为了进行所述分析，将细胞以50,000细胞/孔的浓度接种在96孔板中的完全培养基中，过夜。在第二天除去培养基并用无血清的完全培养基取代，该完全培养基含有或不含有以330nM为起始浓度并为8点剂量效应而以1/2对数间隔进行稀释的不同浓度的式II-2、II-3、II-4、II-5A、II-5B、II-13C、II-17、II-18和IV-3C。45分钟预孵育后，将1μg/ml LF和1μg/ml PA单独或联合地(LFPA，也称为致死毒素(LeTx))加入细胞中。从List生物学实验室获得重组LF和PA。包括作为对照的、未加入LeTx的另外的培养板。然后将细胞孵育6小时，接着加入在无Mg++，Ca++的PBS(Mediatech，Herndon，VA)中配制的0.02mg/ml刃天青染料(Molecular Probes，Eugene，OR)。在评估细胞存活力之前，将培养板又另外孵育1.5小时。因为活细胞代谢刃天青，通过使用530激发和590发射的滤光器测量荧光来评价细胞毒性或细胞存活力。应用如下公式，将数据表达为与DMSO单独对照(高)和LeTx单独对照(低)作比较的存活百分比存活百分比＝100*(测量的OD-低对照)/(高对照-低对照)。
抑制RAW 264.7细胞中炭疽致死毒素介导的细胞毒性 图48中的数据概述式II-2、式II-3和式II-4对RAW 264.7鼠巨噬细胞样细胞系的LeTx介导的细胞毒性的作用。用式II-2和式II-4对RAW 264.7细胞的处理导致经LeTx处理的细胞的存活力增加，其EC50值为14nM(图48)。在测试的浓度下没有确定式II-3对LeTx防护的EC50值(EC50＞330nM，评价的最大浓度)。在表19中的数据显示式II-5A、II-5B、II-13C、II-17、II-18和IV-3C对RAW 264.7鼠巨噬细胞样细胞系的LeTx介导的细胞毒性的作用。用式II-5A和II-18对RAW264.7细胞的处理显示了经LeTx处理的RAW 264.7细胞的存活力增加，其EC50值分别为3nM和4nM。用式II-17和式II-5B的处理导致经LeTx处理的细胞的存活力增加，其EC50值分别为42nM和45nM。在测试的浓度下无法确定式II-13C和IV-3C对LeTx防护的EC50值(EC50＞330nM，评价的最大浓度)。
表19对由炭疽致死毒素介导的RAW 264.7细胞细胞毒性的抑制的EC50值 实施例60 R1侧链的构效关系 通过分析具有如下通式的多种化合物的相对活性，推断所公开的化合物且特别是通式(I)、(II)、(III)、(IV)和(V)化合物的R1侧链的构效关系
分析这些化合物对RPMI细胞的细胞毒性，以及对NF-κB和20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样、胰蛋白酶样和胱天蛋白酶样活性的抑制。6个代表性化合物的结果显示于表20中 表20具有不同R1基团的化合物的EC50值 可将上述分析的结果解释为表明R1基团为氯乙基、溴乙基或碘乙基的化合物是有效的蛋白酶体抑制剂并表现出非常有效的细胞毒性。相反，R1基团为甲基、乙基或羟乙基的化合物表现出相对较低的细胞毒性(效价减少了3个对数)、较低的NF-κB抑制(效价减少了3个对数)和较低的胱天蛋白酶样(效价降低了2至10倍)和胰蛋白酶样(效价降低了20至50倍)蛋白酶体抑制。
不受任何特别理论束缚，申请人注意到上述结果支持了如下假设在R1基团中含有Cl、Br或I的化合物活性的增加是由于卤素为良好的离去基团的特性。观察到的化合物II-16的内酯环开环以通过亲核取代形成环状醚的事实也支持了这个假设，其中根据如下反应氯被置换
可推测的是，在诸如化合物II-16、II-18和II-19等在R1侧链中具有良好离去基团的化合物中，所述蛋白酶体以相似于上述反应的方式亲核加成至β-内酯环上形成环状醚。猜测该环状醚有利地与该蛋白酶体相互作用。
不受任何特殊理论束缚，申请人注意到上述结果也支持了另一假设在所述蛋白酶体上的另一亲核基团置换了所述离去基团，因此在所述化合物与所述酶之间形成2-点共价加合物。无论如何，在R1侧链上的离去基团官能团促进该化合物和该酶之间的相互作用增加，因而促进活性增加。因此，可预期在R1侧链上具有其它离去基团的化合物表现高活性。
不受任何特殊理论束缚，申请人注意到上述结果也支持单点离去基团的假设。作为一个例子，在R1侧链中卤素或其它离去基团的存在促进所述化合物向其靶的输送，如细胞内的靶或其它生物靶，从而增强治疗作用。在下图中示例性说明了单点离去基团的例子。

单点共价药物-酶加合物 具有分子内Cl置换的单2-点共价药物-酶加合物 点共价药物-酶加合物 本发明所用的“离去基团”是指在化学反应中能够被另一原子或部分置换的任何原子或部分。更特别地，在一些实施方案中，“离去基团”指在亲核取代反应中被置换的原子或基团。在一些实施方案中，“离去基团”指作为强酸的共轭碱的任何原子或部分。离去基团的非限制性特征和例子可参见，例如，Organic Chemistry，2d ed.，FrancisCarey(1992)，第328-331页；Introduction to Organic Chemistry，2d ed.，Andrew Streitwieser和Clayton Heathcock(1981)，第169-171页；和Organic Chemistry，5th ed.，John McMurry(2000)，第398和408页；在此将其全部内容引入作为参考。
实施例61 构效关系 上文所列的表中阐明的数据示例性说明许多优选的实施方案。关于通式II，在R1具有卤化取代基的化合物是优选的，且这类化合物通常在上述分析中是等效的。最优选在R1具有n-卤代乙基。
此外，最优选在E5位具有羟基基团的化合物，且相连接的碳为S构型(例如，具有化合物II-18的立体化学结构的化合物)。羟基向酮的氧化是较次优选的。
在一个优选的实施方案中，在R4位优选的取代基是环己烯。在另一优选的实施方案中，该环己烯被氧化成环氧化物。较次优选环己烯取代基的双键被氢化的化合物。
此外在一些实施方案中，优选地，R3为甲基，较次优选乙基。
实施例62 血管生成的抑制 血管生成是重要的生理过程，没有血管生成则不会发生胚胎发育和创伤愈合。但是，过度的和不适当的血管生成与多种疾病、疾病状态和不利的治疗结果相关。与过度血管生成的疾病类型和疾病状态的例子包括炎症性疾病，如免疫和非免疫性炎症、类风湿性关节炎、慢性关节风湿病和牛皮癣；与不适当的或不适时的血管入侵相关的病症例如为糖尿病性视网膜病、新生血管性青光眼、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、晶状体后纤维组织增生症、虹膜发红、动脉粥样硬化斑块中的毛细血管增生和骨质疏松症；以及与癌相关的病症，例如包括实体瘤、瘤转移、如白血病的血源性肿瘤、血管纤维瘤、卡波西肉瘤、如血管瘤的良性肿瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和脓性肉芽肿，以及其它需要新血管形成以维持肿瘤生长的癌。血管生成-依赖性疾病的另外例子包括，例如，Osler-Webber综合征；心肌的血管生成；斑点性新血管形成；毛细血管扩张；血友病性关节和伤口肉芽形成。此外，过多的血管生成也与作为生物学和机械移植物(组织/器官移植物、支架等等)一部分的临床问题相关。本发明所述组合物可用于抑制血管生成，因此可用于治疗这类疾病状态。血管生成起作用的并且可采用本发明所述化合物和组合物的其它疾病为本领域技术人员所公知。
关于如癌症、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病、年龄相关的黄斑变性、子宫内膜异位和肥胖症等病生理学疾病状态中的血管生成的特别讨论可参见Folkman J.(1985)Tumor angiogenesis(肿瘤血管生成).Adv Cancer Res.1985；43175-203.；Folkman，J.(2001).Angiogenesis-dependent diseases(血管生成-依赖性疾病).Semin Oncol，28，536-42.；Grosios，K.，Wood，J.，Esser，R.，Raychaudhuri，A.&Dawson，J.(2004).Angiogenesis inhibition by the novel VEGF receptortyrosine kinase inhibitor，PTK787/ZK222584，causes significantanti-arthritic effects in models of rheumatoid arthritis(新的VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂PTK787/ZK222584对血管生成的抑制在类风湿性关节炎模型中引起显著的抗关节炎作用).Inflamm Res，53，133-42；Hull，M.L.，Charnock-Jones，D.S.，Chan，C.L.，Bruner-Tran，K.L.，Osteen，K.G.，Tom，B.D.，Fan，T.P.& Smith，S.K.(2003)；Antiangiogenic agents areeffective inhibitors of endometriosis(抗血管生成剂是子宫内膜异位的有效抑制剂).J Clin Endocrinol Metab，88，2889-99；Liu，L.& Meydani，M.(2003)；Angiogenesis inhibitors may regulate adiposity(血管生成抑制剂可调节肥胖症).Nutr Rev，61，384-7；Mousa，S.A.& Mousa，A.S.(2004)；Angiogenesis inhibitorscurrent & future directions(血管生成抑制剂当前的和未来的方向).Curr Pharm Des，10，1-9。在此将上述的每一参考文献的全部内容引入作为参考。
本发明公开的化合物抑制血管生成。这例如由式II-16化合物所证实，该化合物在跨孔(transwell)迁移分析中阻断血管内皮生长因子(VEGF)诱导的多发性骨髓瘤细胞迁移。本发明公开的其它化合物在跨孔迁移分析中被测试，并抑制迁移。
本发明公开的化合物在多种其它血管生成测试和分析(包括如下的一种或多种)的任意一种中表现出血管生成抑制活性。
本发明公开的化合物在多种其它体外和体内分析中表现出抗血管生成活性。一些例子包括评价抗血管生成化合物的体外分析包括，1)改良的Boyden室分析，其评估响应前血管生成因子(pro-angiogenicfactor)的内皮细胞迁移(Alessandri G，Raju K，Gullino PM.(1983)“Mobilization of capillary endothelium in vitro induced by effectors ofangiogenesis in vivo”(“由体内的血管生成效应子诱导的体外毛细血管内皮的移动”)Cancer Res.43(4)1790-7.)，2)分化分析，例如Matrigel分析，其中分析内皮细胞附着、迁移和分化为小管(Lawley TJ，Kubota Y.(1989).Induction of morphologic differentiation of endothelial cells inculture(诱导培养物中内皮细胞的形态学分化).J Invest Dermatol.Aug；93(2 Suppl)59S-61S)和3)器官培养分析，其中监测内皮细胞(和其它细胞)的生长(Nicosia RF，Ottinetti A.(1990).Growth of microvessels inserum-free matrix culture of rat aorta(在大鼠主动脉的无血清基质培养物中的微血管生长).A quantitative assay of angiogenesis in vitro(血管生成的体外定量分析).Lab Invest.Jul；63(1)115-22。)。评价血管生成抑制剂的一些体内分析为1)海绵植入分析，在该分析中将含有细胞和/或血管生成因子的海绵和测试物质皮下植入到用于体内研究血管生成的动物体内(Plunkett ML，Hailey JA.(1990)。An in vivo quantitativeangiogenesis model using tumor cells entrapped in alginate(使用包埋在藻酸盐中的肿瘤细胞的体内定量血管生成模型).Lab Invest.1990Apr；62(4)510-7)，2)小鸡的绒膜尿囊膜分析，在该分析中将测试化合物插入穿过窗口，插入蛋壳。7-8天龄鸡胚中成熟免疫系统的缺乏允许研究肿瘤诱发的血管生成(Folkman J.(1985)Tumor angiogenesis(肿瘤血管生成).Adv Cancer Res.1985；43175-203.)和3)多种肿瘤模型，在该模型中特异的组织学分析可用于检查对血管的作用，如血管密度(CD31/CD34染色)、血流量和伴生性肿瘤坏死/细胞凋亡(TUNEL染色)。体外分析的例子包括内皮细胞测试(HUVEC(人脐静脉内皮细胞)、主动脉、毛细血管)；内皮细胞增殖分析；内皮细胞DNA合成分析；内皮细胞生长物分析(主动脉环)；内皮细胞迁移分析(上述的；化学激活现象(胶态金)、趋化现象(Boyden室))；内皮细胞管形成分析；内皮细胞凋亡分析；内皮细胞存活力分析(锥虫蓝)；血管生成因子-转染的内皮细胞系；和在内皮细胞上的磁化微珠。在此将这段中的每个参考文献的全部内容引入作为参考。
体内分析的例子包括透明室测试(例如，家兔耳朵、仓鼠颊、颅窗和背侧皮肤)；基质植入物(例如，使用藻酸钠的皮下注射、皮下圆盘(聚乙烯泡沫植入物)、大鼠背侧肺泡、海绵植入物)；例如在家兔和其它啮齿类动物中的角膜微晶格(cornea micropocket)分析；前眼/虹膜房室植入分析、小鼠和敲除分析；在猪和狗体内的ameroid缢缩作用(心脏)；家兔后肢局部缺血测试；组织内的血管化作用(皮内接种、含有植入物腹膜腔/的网膜；肿瘤植入物，例如在家兔、小鼠或大鼠体内。
此外，使用公开的化合物实施先体外后体内分析。例子包括CAM(小鸡绒膜尿囊膜分析)和利用聚合物凝胶的垂直CAM。免疫分析例如为血清分析、尿分析、脑脊液分析和组织免疫组织化学分析。
在以下论文中描述了上述分析中的一些分析，在此将每一论文的全部内容引入作为参考。Grant等人，In Vitro Cell Dev.Biol.27A327-336(1991)；Min等人，Cancer Res.562428-2433(1996)；Schnaper等人，J.Cell.Physiol.165107-118(1995)；Schnaper等人，J.Cell.Physiol.165107-118(1995)；Oikawa等人，Cancer Lett.5957-66(1991)。
实施方案涉及了本发明所述的化合物和组合物单独地或与其它试剂联合应用，以抑制血管生成和治疗或缓解与过度或不适当的血管生成相关的疾病和疾病状态。优选地，抑制与血管化作用有关，而该血管化作用与和血管生成相关的疾病有关，该疾病例如为癌症或上述其它疾病和那些本领域内技术人员所公知的疾病中的任一种。可将所述化合物和组合物以适当的抑制量进行输送。抑制量是指当对组织、动物或个体给药时，使新血管形成的程度、数量或速度方面减弱所需要的化合物或组合物的量。治疗上有效所需的化合物或组合物的剂量依赖于，例如，待治疗的血管生成依赖性疾病、给药途径和形式、被给药的分子的效力和大的活性半衰期(big-active half-life)、组织、动物或个体的重量和状态以及之前的或协同的疗法。本领域的技术人员可采用本发明提供的指导测定所述方法的适当的应用量。例如，可从上述的体外或体内血管生成分析推知所述的量。本领域的技术人员公认在治疗的过程中需要自始至终地监测患者的状态，从而可调整给药的组合物的量。
本发明所述化合物和组合物可以是并且也可与其它血管生成抑制剂结合使用。血管生成抑制剂是本领域内公知的，并可通过公知的方法制备。例如，血管生成抑制剂包括整联蛋白抑制化合物，如α-V-β-3([αVβ3]整联蛋白抑制抗体，细胞粘附蛋白或其包含细胞粘附结合序列的功能片段。另外的血管生成抑制剂包括，例如，血管抑素(angiostatin)、血管抑素的功能片段、内皮抑制素、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂、FGF受体抑制剂、VEGF抑制剂、VEGF受体抑制剂、血管通透性因子(VPF)抑制剂、VPF受体抑制剂、血小板反应蛋白、血小板因子4、干扰素-α、干扰素-γ、干扰素诱导蛋白10、白细胞介素12、gro-β和催乳素的16kDa N-末端片段、沙利度胺和抑制血管生成的其它机制。
因此，所述方法可包括将化合物或组合物向患有与过度血管生成相关的疾病状态的动物给药的步骤。所述方法还可包括将本发明的化合物或组合物与另一抗血管生成药物或用于被治疗的疾病状态的其它疗法(例如，以化学疗法或免疫疗法治疗癌症)一同给药。
所述化合物或组合物可可以任何适于疾病和/或患者的方式进行输送。例子包括，静脉内、口服、肌内、眼内、鼻内、腹膜内等方式输送。
以下参考文献提供了关于用于血管生成抑制的使用、给药和分析方法的另外的教科书J.Clifford Murray的Angiogenesis Protocols(血管生成治疗方案)(Methods in Molecular Medicine)(分子医学方法)，Humana Press(2001年3月15日)ISBN0896036987；R.J.Bicknell.Claire E.Lewis，Napoleone Fe的umour Angiogenesis(肿瘤血管生成)，Oxford University Press(1997年9月1日)ISBN0198549377；和GaborM.Rubanvi的Angiogenesis in Health and DiseaseBasic Mechanismsand Clinical Applications(健康和疾病中的血管生成基本机理和临床应用)，Marcel Dekker(1999年11月1日)ISBN0824781023。在此将每本书的全部内容引入作为参考。尤其是在此引入治疗方案和方法。
实施例63 用于口服给药或其类似形式的制剂 将通过所述实施方案的方法获得并纯化的1g化合物、98g乳糖和1g羟丙基纤维素充分混合成混合物，通过常规方法将该混合物制成颗粒。将该颗粒彻底干燥并筛分以获得适于装瓶或热封的颗粒制剂。依赖于症状，如在治疗人体内癌性肿瘤领域中普通技术人员认为的合适剂量，将所得的颗粒制剂以约100ml/天至约1000ml/天口服给药。
实施例64 治疗对Gleevec敏感的和耐Gleevec

的肿瘤 慢性粒细胞白血病(CML)细胞与急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞在大多数情况下共享在正常细胞中未发现的染色体异常。称为t(9；22)的该异常是染色体9和22之间的相互易位。该易位导致染色体9比正常的染色体更长以及染色体22比正常的染色体更短。染色体22的断裂发生在称为BCR的基因中间。所得到的染色体22，即费城染色体(Ph1)具有与大部分的称为c-ABL的原癌基因融合的BCR部分。该融合的片段形成异常的“bcr-abl”癌基因，其编码持续活化的异常的酪氨酸激酶，刺激细胞分裂和抗细胞凋亡。
Gleevec

(STI-571，信号转导抑制剂571，或甲磺酸伊马替尼)是BCR-ABL酪氨酸激酶的选择性抑制剂，该BCR-ABL酪氨酸激酶是CML的成因性突变。Gleevec

还是干细胞因子(SCF)、c-KIT的受体酪氨酸激酶的抑制剂，并抑制血小板衍生的生长因子(PGDF)受体和SCF-介导的细胞组织学变化。在临床研究中，Gleevec

在60％的被治疗患者中表现出减小胃肠道间质瘤(GIST)。已在CML中看到类似的显著的效应。但是，通过多种提出的机制在所有的患者中均产生对Gleevec

的耐药性。不受任何特定理论的束缚，对Gleevec

的可能的耐药机制可能是因bcr-abl的过表达、Gleevec

结合的abl-激酶结构域中的突变、或者其它致癌途径的激活引起的。
本文公开的化合物用于治疗对Gleevec

敏感的和耐Gleevec

的肿瘤。这由例如式II-16化合物所证实，该化合物已被证实在CML、费城染色体-阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL；包括从患者新分离的Ph+ALL细胞)和急性粒细胞白血病(AML)细胞系中诱导细胞凋亡。式II-16化合物可作为单独的试剂使用或与Gleevec

联合使用。特别地，式II-16化合物在治疗敏感的或耐药的费城染色体-阳性白血病中可作为单独的试剂使用或与Gleevec

联合使用。
式II-16化合物或包括式I、II、III、IV、V和VI化合物在内的任何其它化合物可用于治疗对Gleevec

敏感的肿瘤和耐Gleevec

的肿瘤。
上述给出的实施例仅为了帮助理解所述实施方案。因此，本领域所属技术人员应理解，所述方法也可提供化合物的衍生物。
本领域所属的技术人员容易理解，本发明很好地适合实现所述目的并且达到所述目标和优势，以及其它内在固有特性。本发明描述的方法和操作仅是代表优选实施方案，并且是示例性的，不能理解为对本发明范围的限制。本领域所属技术人员能够对本发明的作出改变和其它应用，这均包含在本发明的精神中。
对本领域所属技术人员显而易见的是在不偏离本发明的范围和精神下，可对本发明公开的所述实施方案作出不同的替换和修改。
本说明书中提到的所有专利和出版物预示着本发明所属技术领域的技术人员的水平。在此将所有的专利和出版物引入作为参考，如同每一个单独的专利明确地并单独地指出被引入作为参考。
本文示例性描述的本发明可适于在本发明没有特别公开的任何要素或各种要素、任何限制或各种限制不存在时实施。所用术语和表达方式均用于说明目的而非限制目的，并且没有意向表明使用该术语和表达方式意味着排除所显示的或所描述的特征或其部分的等价物。公认的是在本发明的范围内可进行各种修改。因此，应理解虽然本发明通过优选的实施方案和任选的特征进行特定地公开，但是本领域的技术人员可采用本发明公开的概念的修饰和变换，并且这种修饰和变换应认为是属于本发明的范围内。
权利要求
1.化合物及其药物可接受的盐类和酯类前药在制备用于处理耐药细胞的药物中的用途，其中所述化合物具有通式I结构
通式I
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素以及以下残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R2选自氢、卤素以及下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R3选自卤素和下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基，氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中每一E1、E2、E3和E4为取代或未取代的杂原子；以及
其中所述耐药细胞为选自白血病、卵巢癌、输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、肝癌、肾癌、内分泌癌、肉瘤、皮肤癌、血管瘤和脑癌的癌细胞。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述化合物为通式II结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素以及以下残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R3独立地选自氢、卤素以及下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R4独立地选自氢、卤素和下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基，氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于1或2，且如果m等于2，则R4能够相同或不同；以及
其中每一E1、E2、E3、E4和E5为取代或未取代的杂原子。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述化合物为通式III结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R4独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或者未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于1或2，且如果m等于2，则R4能够相同或不同；以及
其中每一个E1、E2、E3、E4和E5是取代或未取代的杂原子。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述化合物为通式IV结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R3独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R5独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，且如果m大于1，则R5能够相同或不同；以及
其中每一个E1、E2、E3、E4和E5为取代的或未取代的杂原子。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述化合物为通式V结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R5独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，且如果m大于1，则R5能够相同或不同；以及
其中每一个E1、E2、E3、E4和E5为取代的或未取代的杂原子。
6.如权利要求1所述的用途，其中所述化合物为通式VI结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
通式VI
其中R1能够独立地选自下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、苯基、环烷基酰基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、硫代、亚砜、砜硼酸酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基，n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R2能够选自氢、卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基(包括，例如，环己基甲醇)、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R3能够选自卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基；其中每一个E1、E2、E3和E4能够是取代或未取代的杂原子。
7.如权利要求1-6中任一权利要求所述的用途，其中所述化合物为
其中R8选自H、F、Cl、Br和I。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述化合物为式II-16的结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
9.如权利要求1-8中任一权利要求所述的用途，其中所述耐药细胞为慢性粒细胞白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性粒细胞白血病(AML)、肉瘤或多发性骨髓瘤。
10.如权利要求1-9中任一权利要求所述的用途，其中所述耐药细胞为MES-SA/Dx5、HL-60/MX2、MM.1R多发性骨髓瘤或耐多柔比星Dox-40多发性骨髓瘤。
11.如权利要求1-10中任一权利要求所述的用途，其中所述细胞对其耐药的药物为硼替佐米、
盐酸米托蒽醌、多柔比星、柔红霉素、放线菌素D、长春新碱、紫杉醇、秋水仙碱、丝裂霉素C、利妥昔单抗、地塞米松、沙利度胺、太平洋紫杉醇或美法伦。
12.抑制耐药细胞生长的方法，包括使所述细胞与具有通式I结构的化合物及其药物可接受的盐类和酯类前药接触
通式I
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素以及以下残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R2选自氢、卤素以及下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R3选自卤素和下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基，氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中每一E1、E2、E3和E4为取代或未取代的杂原子，
其中所述癌症为白血病、卵巢癌、输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、肝癌、肾癌、内分泌癌、肉瘤、皮肤癌、血管瘤或脑癌。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述化合物为通式II结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素以及以下残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R3独立地选自氢、卤素以及下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R4独立地选自氢、卤素和下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基，氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于1或2，且如果m等于2，则R4能够相同或不同；以及
其中每一E1、E2、E3、E4和E5为取代或未取代的杂原子。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述化合物为通式III结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R4独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或者未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于1或2，且如果m等于2，则R4能够相同或不同；以及
其中每一个E1、E2、E3、E4和E5是取代或未取代的杂原子。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述化合物为通式IV结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R3独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R5独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，且如果m大于1，则R5能够相同或不同；以及
其中每一个E1、E2、E3、E4和E5为取代的或未取代的杂原子。
16.如权利要求12所述的方法，其中所述化合物为通式V结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R5独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，且如果m大于1，则R5能够相同或不同；以及
其中每一个E1、E2、E3、E4和E5为取代的或未取代的杂原子。
17.如权利要求12所述的方法，其中所述化合物为通式VI结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
通式VI
其中R1能够独立地选自下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、苯基、环烷基酰基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、硫代、亚砜、砜硼酸酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基，n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R2能够选自氢、卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基(包括，例如，环己基甲醇)、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R3能够选自卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基；其中每一个E1、E2、E3和E4能够为取代或未取代的杂原子。
18.如权利要求12-17中任一权利要求所述的方法，其中所述化合物为
其中R8选自H、F、Cl、Br和I。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述化合物为式II-16的结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
20.如权利要求12-19中任一权利要求所述的方法，其中所述耐药细胞为慢性粒细胞白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性粒细胞白血病(AML)、肉瘤或多发性骨髓瘤。
21.如权利要求12-20中任一权利要求所述的方法，其中所述耐药细胞为MES-SA/Dx5、HL-60/MX2、MM.1R多发性骨髓瘤或耐多柔比星Dox-40多发性骨髓瘤。
22.如权利要求12-21中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞对其耐药的药物为硼替佐米、
盐酸米托蒽醌、多柔比星、放线菌素D、柔红霉素、长春新碱、紫杉醇、秋水仙碱、丝裂霉素C、利妥昔单抗、地塞米松、沙利度胺、太平洋紫杉醇或美法伦。
23.化合物及其药物可接受的盐类及其酯类前药在制备用于治疗具有过度或不适当的血管生成特征的疾病的药物中的用途，其中所述化合物具有通式I结构
通式I
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素以及以下残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R2选自氢、卤素以及下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R3选自卤素和下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基，氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中每一E1、E2、E3和E4为取代或未取代的杂原子；以及
其中所述癌症为白血病、卵巢癌、输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、肝癌、肾癌、内分泌癌、肉瘤、皮肤癌、血管瘤或脑癌。
24.如权利要求23所述的用途，其中所述化合物为通式II结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素以及以下残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R3独立地选自氢、卤素以及下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R4独立地选自氢、卤素和下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基，氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于1或2，且如果m等于2，则R4能够相同或不同；以及
其中每一E1、E2、E3、E4和E5为取代或未取代的杂原子。
25.如权利要求23所述的用途，其中所述化合物为通式III结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R4独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或者未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于1或2，且如果m等于2，则R4能够相同或不同；以及
其中每一个E1、E2、E3、E4和E5是取代或未取代的杂原子。
26.如权利要求23所述的用途，其中所述化合物为通式IV结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R3独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R5独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，且如果m大于1，则R5能够相同或不同；以及
其中每一个E1、E2、E3、E4和E5为取代或未取代的杂原子。
27.如权利要求23所述的用途，其中所述化合物为通式V结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R5独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，且如果m大于1，则R5能够相同或不同；以及
其中每一个E1、E2、E3、E4和E5为取代或未取代的杂原子。
28.如权利要求23所述的用途，其中所述化合物为通式VI结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
通式VI
其中R1能够独立地选自下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、苯基、环烷基酰基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、硫代、亚砜、砜硼酸酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基，n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R2能够选自氢、卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基(包括，例如，环己基甲醇)、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R3能够选自卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基；其中每一个E1、E2、E3和E4能够为取代或未取代的杂原子。
29.如权利要求23-28中任一权利要求所述的用途，其中所述化合物为
其中R8选自H、F、Cl、Br和I。
30.如权利要求29所述的用途，其中所述化合物为式II-16的结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
31.如权利要求23-30中任一权利要求所述的用途，其中所述疾病为炎性疾病状态。
32.如权利要求31所述的用途，其中所述炎性疾病状态为免疫和非免疫性炎症、类风湿性关节炎、慢性关节风湿病和银屑病。
33.如权利要求23-32中任一权利要求所述的用途，其中所述疾病具有不适当或不适时的血管入侵的特征。
34.如权利要求33所述的用途，其中所述疾病为糖尿病性视网膜病、新生血管性青光眼、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、晶状体后纤维组织增生症、红变、动脉粥样硬化斑块中的毛细血管增生、骨质疏松症、白血病、血管纤维瘤、卡波西肉瘤、血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和脓性肉芽肿。
35.如权利要求23-34中任一权利要求所述的用途，还包括抗血管生成剂的使用。
36.如权利要求35所述的用途，其中所述抗血管生成剂为α-V-β-3(αVβ3)整联蛋白抑制抗体、细胞粘附蛋白、包含细胞粘附结合序列的细胞粘附蛋白的功能片段、血管抑素、血管抑素的功能片段、内皮抑制素、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂、FGF受体抑制剂、VEGF抑制剂、VEGF受体抑制剂、血管通透性因子(VPF)抑制剂、VPF受体抑制剂、血小板反应蛋白、血小板因子4、干扰素-α、干扰素-γ、干扰素诱导的蛋白10、白介素12、gro-β和催乳素的16kDa N-末端片段和沙利度胺。
37.如权利要求23-36中任一权利要求所述的用途，其中所述动物为哺乳动物。
38.如权利要求23-36中任一权利要求所述的用途，其中所述动物为人。
39.如权利要求23-36中任一权利要求所述的用途，其中所述动物为啮齿动物。
40.如权利要求23-36中任一权利要求所述的用途，还包括如下步骤
鉴别会从抑制血管生成的试剂的给药中受益的个体；
对所述个体实施所述方法。
41.抑制血管生成的方法，包括将具有通式I结构的化合物及其药物可接受的盐类和酯类前药对动物给药
通式I
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素以及以下残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R2选自氢、卤素以及下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R3选自卤素和下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基，氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中每一E1、E2、E3和E4为取代或未取代的杂原子；以及
其中所述癌症为白血病、卵巢癌、输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、肝癌、肾癌、内分泌癌、肉瘤、皮肤癌、血管瘤或脑癌。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述化合物为通式II结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素以及以下残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R3独立地选自氢、卤素以及下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R4独立地选自氢、卤素和下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基，氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于1或2，且如果m等于2，则R4能够相同或不同；以及
其中每一E1、E2、E3、E4和E5为取代或未取代的杂原子。
43.如权利要求41所述的方法，其中所述化合物为通式III结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R4独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或者未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于1或2，且如果m等于2，则R4能够相同或不同；以及
其中每一个E1、E2、E3、E4和E5是取代或未取代的杂原子。
44.如权利要求41所述的方法，其中所述化合物为通式IV结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R3独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R5独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，且如果m大于1，则R5能够相同或不同；以及
其中每一个E1、E2、E3、E4和E5为取代或未取代的杂原子。
45.如权利要求41所述的方法，其中所述化合物为通式V结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R5独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，且如果m大于1，则R5能够相同或不同；以及
其中每一个E1、E2、E3、E4和E5为取代或未取代的杂原子。
46.如权利要求41所述的方法，其中所述化合物为通式VI结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
通式VI
其中R1能够独立地选自下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、苯基、环烷基酰基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、硫代、亚砜、砜硼酸酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基，n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R2能够选自氢、卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基(包括，例如，环己基甲醇)、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R3能够选自卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基；其中每一个E1、E2、E3和E4为取代或未取代的杂原子。
47.如权利要求41-46中任一权利要求所述的方法，其中所述化合物为
其中R8选自H、F、Cl、Br和I。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述化合物为式II-16的结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
49.如权利要求41-48中任一权利要求所述的方法，其中所述动物患有疾病，其中所述疾病为炎性疾病状态。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述炎性疾病状态为免疫和非免疫性炎症、类风湿性关节炎、慢性关节风湿病和银屑病。
51.如权利要求49-50所述的方法，其中所述疾病具有不适当或不适时的血管入侵的特征。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述疾病为糖尿病性视网膜病、新生血管性青光眼、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、晶状体后纤维组织增生症、红变、动脉粥样硬化斑块中的毛细血管增生、骨质疏松症、白血病、血管纤维瘤、卡波西肉瘤、血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和脓性肉芽肿。
53.如权利要求41-52中任一权利要求所述的方法，还包括抗血管生成剂的使用。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述抗血管生成剂为α-V-β-3(αVβ3)整联蛋白抑制抗体、细胞粘附蛋白、包含细胞粘附结合序列的细胞粘附蛋白的功能片段、血管抑素、血管抑素的功能片段、内皮抑制素、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂、FGF受体抑制剂、VEGF抑制剂、VEGF受体抑制剂、血管通透性因子(VPF)抑制剂、VPF受体抑制剂、血小板反应蛋白、血小板因子4、干扰素-α、干扰素-γ、干扰素诱导的蛋白10、白介素12、gro-β和催乳素的16kDa N-末端片段和沙利度胺。
55.如权利要求41-54中任一权利要求所述的方法，其中所述动物为哺乳动物。
56.如权利要求41-55中任一权利要求所述的方法，其中所述动物为人。
57.如权利要求41-56中任一权利要求所述的方法，其中所述动物为啮齿动物。
58.如权利要求41-58中任一权利要求所述的方法，还包括如下步骤
鉴别会从抑制血管生成的试剂的给药中受益的个体；
对所述个体实施所述方法。
59.治疗对
敏感或耐
的癌症的方法，包括将具有通式I结构的化合物及其药物可接受的盐类和酯类前药对动物给药
通式I
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素以及以下残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R2选自氢、卤素以及下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R3选自卤素和下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基，氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中每一E1、E2、E3和E4为取代或未取代的杂原子；以及
其中所述癌症为白血病、卵巢癌、输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、肝癌、肾癌、内分泌癌、肉瘤、皮肤癌、血管瘤或脑癌。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述化合物为通式II结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素以及以下残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R3独立地选自氢、卤素以及下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R4独立地选自氢、卤素和下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基，氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于1或2，且如果m等于2，则R4能够相同或不同；以及
其中每一E1、E2、E3、E4和E5为取代或未取代的杂原子。
61.如权利要求59所述的方法，其中所述化合物为通式III结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R4独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或者未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于1或2，且如果m等于2，则R4能够相同或不同；以及
其中每一个E1、E2、E3、E4和E5是取代或未取代的杂原子。
62.如权利要求59所述的方法，其中所述化合物为通式IV结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R3独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R5独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，且如果m大于1，则R5能够相同或不同；以及
其中每一个E1、E2、E3、E4和E5为取代或未取代的杂原子。
63.如权利要求59所述的方法，其中所述化合物为通式V结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
其中虚线表示单键或双键，其中R1独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R5独立地选自氢、卤素、下列残基的单取代，多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基，叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基和包括多卤代烷基在内的卤代烷基，其中m等于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，且如果m大于1，则R5能够相同或不同；以及
其中每一个E1、E2、E3、E4和E5为取代或未取代的杂原子。
64.如权利要求59所述的方法，其中所述化合物为通式VI结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
通式VI
其中R1能够独立地选自下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、苯基、环烷基酰基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、硫代、亚砜、砜硼酸酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基，n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R2能够选自氢、卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基(包括，例如，环己基甲醇)、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R3能够选自卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基；其中每一个E1、E2、E3和E4能够为取代或未取代的杂原子。
65.如权利要求59-64中任一权利要求所述的方法，其中所述化合物为
其中R8选自H、F、Cl、Br和I。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述化合物为式II-16的结构，以及其药物可接受的盐类和酯类前药
67.如权利要求59-66中任一权利要求所述的方法，其中所述癌症为慢性粒细胞白血病、费城染色体-阳性急性淋巴细胞白血病和急性粒细胞白血病。
68.如权利要求59-66中任一权利要求所述的方法，还包括
的使用。
69.如权利要求59-66中任一权利要求所述的方法，其中所述动物为哺乳动物。
70.如权利要求59-66中任一权利要求所述的方法，其中所述动物为人。
71.如权利要求59-66中任一权利要求所述的方法，其中所述动物为啮齿动物。
72.治疗癌症的方法，包括将具有通式VI结构的化合物及其药物可接受的盐类和酯类前药对动物给药
通式VI
其中R1能够独立地选自下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、苯基、环烷基酰基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、硫代、亚砜、砜硼酸酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基，n等于1或2，且如果n等于2，则R1能够相同或不同；
其中R2能够选自氢、卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基(包括，例如，环己基甲醇)、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基；
其中R3能够选自卤素、下列残基的单取代、多取代或未取代的变体饱和的C1-C24烷基、不饱和的C2-C24烯基或者C2-C24炔基、酰基、酰基氧基、烃氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、环烷基、环烯基、烃氧基、环烃氧基、芳基、杂芳基、芳基烃氧基羰基、烃氧基羰基酰基、氨基、氨基羰基、氨基羰基氧基、硝基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、羟基、烷硫基、芳硫基、氧基磺酰基、羧基、氰基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰硫基、硼酸及其酯以及包括多卤代烷基在内的卤代烷基；其中每一个E1、E2、E3和E4能够为取代或未取代的杂原子。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述癌症为多发性骨髓瘤。
74.如权利要求72所述的方法，其中所述癌症为前列腺癌。
75.如权利要求72所述的方法，其中所述癌症为卵巢癌。
76.如权利要求72所述的方法，其中所述癌症为胰腺癌。
77.如权利要求72所述的方法，还包括化学治疗剂的使用。
78.如权利要求72-77中任一权利要求所述的方法，其中所述化学治疗剂为阿霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、塞替派、白消安、细胞毒素、紫杉醇、紫杉特尔、甲氨喋呤、顺铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、柔红霉素、洋红霉素、氨基喋呤、放线菌素D、丝裂霉素类、烯二炔类、美法仑、它莫西芬或奥那司酮。
79.如权利要求72所述的方法，其中所述癌症为耐药的癌症。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述耐药的癌症为肉瘤、多发性骨髓瘤或白血病。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述耐药的癌症表现如下情况的至少一种P-糖蛋白外流泵的水平提高、由MRP1编码的多重耐药性相关蛋白1的表达增加、药物吸收减少、药物靶标的改变或对药物诱导的DNA损伤的修复增强、细胞凋亡途径的改变以及细胞色素P450酶的活化。
82.如权利要求72所述的方法，其中所述动物为哺乳动物。
83.如权利要求72所述的方法，其中所述动物为人。
84.如权利要求72所述的方法，其中所述动物为啮齿动物。
85.如权利要求72所述的方法，还包括如下步骤
鉴别会从抗癌剂的给药中受益的个体；
对所述个体实施所述方法。
全文摘要
公开了治疗动物的癌症、炎性疾病状态和/或感染性疾病的方法，该方法包括将治疗有效量的杂环化合物对该动物给药。该动物是哺乳动物，优选人或啮齿动物。
文档编号A61K31/407GK101208087SQ200580047746
公开日2008年6月25日 申请日期2005年12月2日 优先权日2004年12月3日
发明者迈克尔·帕拉迪诺, 芭芭拉·克里斯蒂娜·波茨, 文卡塔·拉米·雷迪·马舍拉, 萨斯基亚·狄奥多拉·科尔内利亚·内特博姆 申请人:尼瑞斯药品公司