专利名称：人乳头瘤病毒的病毒样颗粒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用纯化的不同型别人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)晚期蛋白LI自组装成的病毒样颗粒(VLPs)经过 适当比例配伍，制备HPV疫苗，用于预防HPV引起的部分疾病。
技术背景HPV是一类双链小分子DNA病毒，具有严格的种属特异性，主 要感染人的皮肤和粘膜组织，引起相应部位上皮组织的增生性病变。 根据感染部位可分为皮肤型和粘膜型两组，粘膜型HPV又根据引起 病变的性质分为两类引起粘膜上皮良性增生病变的低危型和与人类 多种器官恶性肿瘤(如宫颈癌、阴茎癌、喉及头颈癌、支气管癌、食 管癌、口腔癌等)密切相关的高危型。根据核酸序列同源性，HPV可 分为100多型，不同型别的HPV引起不同的疾病。HPVl、 2、 3、 4、 7、 10、 26-29在正常或免疫缺损个体中引起良性疣。HPV5、 8、 9、 12、 14、 15、 17、 19-25、 36、 46-50在免疫缺损个体中引起扁平状损 伤。HPV6、 11、 34、 39、 41-44、 51-55引起生殖道或呼吸道粘膜发 生非恶性湿疣。完整的HPV病毒颗粒直径约55nm，由病毒基因组DNA与衣壳 两部分组成，无包膜，衣壳呈二十面体，由72个壳粒组成，病毒颗 粒在CsCl中的浮力密度为1.34g/cm3。病毒基因组是双链环状DNA， 约8kb。基因组含至少8个开放阅读框(ORF)，各ORF间可部分或全 部重叠，基因组根据功能分为三个功能区早期区，编码6个非结构 蛋白(E1、 E2、 E4、 E5、 E6、 E7)，编码的蛋白与病毒的复制、转录和 转化作用有关晚期区，含L1、 L2两个ORF，编码主要衣壳蛋白L1 和次要衣壳蛋白L2两个结构蛋白，参与病毒粒子的组装；长控制区 (LCR)，又称非编码区或上游调控区，不编码任何蛋白，但含有复制 起点、启动子、增强子、沉默子等多种调控元件，影响病毒的复制和 转录。HPV衣壳是由L1和L2蛋白共同构成，二者比例约5: 1。单 独的Ll蛋白可以自发组装成直径与HPV成熟病毒大小相近(约55nm) 的VLPs， VLPs和天然HPV病毒的形态相似，都是二十面体结构， 只是VLP内部无病毒核酸。
疫苗防治HPV相关疾病是近几年来的研究热点。由于目前无法 通过组织培养获得大量的HPV病毒，并且考虑到HPVE6、 E7基因 的潜在致癌性，因此，不能通过减毒活疫苗或灭活疫苗等传统疫苗制 备方式获得HPV疫苗。伴随分子生物学和基因工程技术的发展，目 前HPV疫苗研究主要集中在VLPs疫苗、重组病毒疫苗、亚单位疫 苗等。VLPs疫苗主要是以HPV主衣壳蛋白Ll为首选目的蛋白， HPVL1蛋白分别在原核表达系统、酵母表达系统和杆状病毒表达系 统中得以表达，且可自组装成VLPs，其动物实验及部分临床实验结 果表明Ll蛋白装配成的VLPs具有良好的免疫原性。
最早关于HPV疫苗组份的研究主要集中于HPV6、 HPVll、 HPV16和HPV18,英国葛兰素公司在杆状病毒表达系统分别表达 HPV16和HPV18，美国默克公司在酿酒酵母表达系统中分别表达了 HPV16、 18、 6和11等型别的L1蛋白，所得蛋白能形成病毒样颗粒。 这些疫苗的配伍成分是基于欧美部分地区的流行病学调査结果，也主 要是针对当地的病毒流行株。然而全世界流行病学总体调查研究结果 表明，HPV引起恶性肿瘤的型别在世界各地不尽相同。其中HPV16 是最主要的致癌因素，其他型别在世界各地与肿瘤发生的相关性不 同，在中国及亚洲的流行病学调查结果显示，HPV58与宫颈癌的发 生高度相关，相关文献报道HPV58的感染率达到10X以上，远远超 过HPV18 (4%)，这与在欧洲、美洲及非洲的流行病调査结果不同。 发明内容本发明提供了一种能够预防人乳头瘤病毒感染的由不同型别 HPV病毒样颗粒配伍的疫苗组合物其中包括HPV 6 LlVLPs、 HPV 16LlVLPs和HPV58LlVLPs等不同型别的VLPs，其中每毫升疫苗 中各组份的含量分别为HPV6LlVLPs: 10 60吗、HPV16LlVLPs: 5 40吗和HPV58L1: VLPslO 60吗。其中所述疫苗组分可附加一 种或两种其他HPV型别的VLPs。其中附加HPV型别包括HPV1、 HPV2、 HPV3、 HPV5、 HPV8、 HPV 10、 HPV 11、 HPV 18、 HPV31、 HPV33、 HPV35、 HPV45、 HPV52、 HPV53、 HPV57和HPV59。首先获得重组VLPs，纯度大于95%，混合所得各种型别VLPs， 将VLPs混合物与佐剂混合，制备出能预防人乳头瘤病毒感染的疫苗。本发明具有如下优点l)分别分泌表达HPV6L1、 HPV16L1和 HPV58L1蛋白，所得各种L1蛋白可自组装成VLPs。 2)根据在亚洲
和中国部分地区进行的人乳头瘤病毒感染流行病学调査结果，应用HPV6、 HPV16和HPV58等型别的Ll蛋白形成的VLPs制备的疫苗 能预防60%HPV引起的感染。附加的HPV型别可以进一步提高疫苗 的预防效力。
图1示出重组HPV6、 HPV16和HPV58VLPs混合物电镜照片。
图2示出重组HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV58VLPs混合物电镜照片。
图3示出小鼠免疫中，针对单价HPV6疫苗与针对HPV6、 HPV16和 HPV58疫苗中HPV6的抗体应答的比较。
图4示出小鼠免疫中，针对单价HPV6疫苗与针对HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV58VLPs疫苗中HPV6的抗体应答的比较。
图5示出小鼠免疫中，针对单价HPVll疫苗与针对HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV58VLPs疫苗中HPV6的抗体应答的比较。
图6示出小鼠免疫中，针对单价HPV16疫苗与针对HPV6、 HPV16 和HPV58疫苗中HPV6的抗体应答的比较。
图7示出小鼠免疫中，针对单价HPV16疫苗与针对HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV58VLPs疫苗中HPV6的抗体应答的比较。 图8示出小鼠免疫中，针对单价HPV18疫苗与针对HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV58VLPs疫苗中HPV6的抗体应答的比较。 图9示出小鼠免疫中，针对单价HPV58疫苗与针对HPV6、 HPV16 和HPV58疫苗中HPV6的抗体应答的比较。
图IO示出小鼠免疫中，针对单价HPV58疫苗与针对HPV6、HPV11、 HPV16、 HPV18和HPV58VLPs疫苗中HPV6的抗体应答的比较。
具体实施方式
以下实施例是用于说明本发明，但不是限制其范围。实施例I HPV 6 LlVLPs、 HPV 16L1 VLPs和HPV 58 Ll VLPs混合VLPs疫苗的制备将纯化的HPV6L1、 HPV16L1和HPV58L1三种VLPs按40|ng: 20pg: 40pg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓 度约为lmg/ml，充分混合后，于4X:保存。实施例2 HPV 6 LlVLPs、 HPV 11LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 18LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备将纯化的HPV6L1、HPV 11L1、HPV16L1、HPV 18L1和HPV58L1 五种VLPs按40吗40吗20吗40吗40吗的比例配制成混合疫 苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4 "C保存。实施例3单价VLPs和混合VLPs疫苗免疫原性比较将制备好的单价VLPs和混合VLPs疫苗分别接种Balb/C小鼠， 小鼠随机分组，每组5只，腹腔接种，分别于O、 14、 28天接种。于 接种后28天取血用ELISA法检测抗体滴度。 实施例4 ELISA法检測小鼠血清抗体用包被缓冲液将已知抗原稀释至l)ag/ml，每孔加0.1ml， 4"C过 夜。次日洗涤3次。待检样品经2倍系列稀释，最高稀释度为1: 4096， 取稀释后的样品0.1ml加到上述已包被之反应孔中，置37X:孵育1 小时，洗涤。于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体O.lml， 37 t:孵育30-60分钟，洗涤，最后一遍用DDW洗涤。于各反应孔中加 入临时配制的TMB底物溶液O.lml， 37X:i0 30分钟。于各反应孔 中加入2M硫酸0.05ml。结果判定在ELISA检测仪上，于450nm 测OD值。以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对 照OD值的2.1倍，即为阳性。实施例5 HPV 6 LlVLPs、 HPV 16LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混 合VLPs疫苗的制备将纯化的HPV6L1、 HPV16L1和HPV58L1三种VLPs按10pg:5吗IO吗的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4i:保存。实施例6 HPV 6 LlVLPs、 HPV 16LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混 合VLPs疫苗的制备将纯化的HPV6L1 、 HPV16L1和HPV58L1三种VLPs按60pg: 25|ig: 60吗的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓 度约为lmg/ml，充分混合后，于4。C保存。实施例7 HPV 6 LlVLPs、 HPV11L1VLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 18LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备将纯化的HPV6L1、HPV 11L1、HPV16L1、HPV 18L1和HPV58L1 五种VLPs按10吗IO吗5吗IO吗10 |ig的比例配制成混合疫 苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4
x:保存。实施例8 HPV 6 LlVLPs、 HPV11L1VLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 18L1 VLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6U、 HPV 11L1、 HPV16L1、 HPV 18L1和HPV58L1 五种VLPs按60吗60略20吗60吗60吗的比例配制成混合疫 苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4 "C保存。实施例9 HPV 6 LlVLPs、 HPV 1LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 31LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV 1L1、 HPV16L1、 HPV31L1和HPV58L1五 种VLPs按60|ug: 60吗20吗60昭60叫的比例配制成混合疫苗， 同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4"C保 存。实施例10HPV6LlVLPs、 HPV1L1VLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV31LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备将纯化的HPV6L1、 HPV 1L1、 HPV16L1、 HPV31L1和HPV58L1五种VLPS按IO吗IO吗:5吗IO昭:10吗的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4-C保 存。实施例11 HPV 6 LlVLPs、 HPV 1LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV31L1 VLPs和HPV 58 LI VLPs混合VLPs疫苗的制备将纯化的HPV6L1、 HPV 1L1、 HPV16L1、 HPV31L1和HPV58L1五
禾中VLPs按40^g: 40|Ig: 20 ng: 40pg: 40 pg的比例酉己伟lj成'混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4t:保 存。实施例12HPV6LlVLPs、 HPV33LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 45LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV 33Ll、 HPV16L1、 HPV 45L1和HPV58U五种VLPS按40吗40昭:20昭:40吗:40 |Llg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4 。C保存。实施例13HPV6LlVLPs、 HPV33LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV45LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备将纯化的HPV6L1、 HPV33L1、 HPV16L1、 HPV 45L1和HPV58L1五种VLPS按10吗10, 5)Llg: IO吗:IO吗的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4 "C保存。实施例14HPV6LlVLPs、 HPV33LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV45LlVLPs和HPV 58 Ll VLPs混合VLPs疫苗的制备将纯化的HPV6L1、 HPV33L1、 HPV16L1、 HPV 45L1和HPV58L1五种VLPs按60吗60吗:25略60吗:60(Ig的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4'C保存。实施例15HPV6LlVLPs、 HPV33LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV45LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV33 Ll、 HPV16L1、 HPV 45L1和HPV58L1 五种VLPs按60吗60昭25昭60|ug: 60 pg的比例配制成混合疫 苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4 。C保存。实施例16 HPV 6 LlVLPs、 HPV2LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 52LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV2L1、 HPV16L1、 HPV 52L1和HPV58L1五 种VLPs按60吗:60吗:25 , 60, 60吗的比例配制成混合疫苗， 同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4"C保 存。实施例17 HPV 6 LlVLPs、 HPV 2LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 52LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV2L1、 HPV16L1、 HPV52L1和HPV58L1五种VLPs按10吗:IO吗:5吗10|Ig: 10吗的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4"C保 存。实施例18HPV6LlVLPs、 HPV2LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 52LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV2L1、 HPV16L1、 HPV52L1和HPV58U五 种VLPs按鄉g: 40吗:20吸40險40 |ig的比例配制成混合疫苗， 同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4'C保 存。实施例19 HPV 6 LlVLPs、 HPV3LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 53LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV3L1、 HPV16L1、 HPV 53L1和HPV58L1五 种VLPs按40, 40, 20 [ig: 40, 40吗的比例配制成混合疫苗， 同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4t:保 存。实施例20HPV 6 LlVLPs、 HPV 3LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 53LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV3L1、 HPV16L1、 HPV53L1禾B HPV58L1五 种VLPS按10吗10|Llg: 5吗IO吗:10吗的比例配制成混合疫苗， 同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4"C保 存。实施例21HPV 6 LlVLPs、 HPV 3LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 53LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV3L1、 HPV16L1、 HPV53L1和HPV58L1五 种VLPs按60吗:60, 25吗60吗:60吗的比例配制成混合疫苗， 同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4"C保 存。实施例22HPV 6 LlVLPs、 HPV SLlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 35LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV5L1、 HPV16L1、 HPV35L1和HPV58L1五
种VLPs按60吗:60吗:25吗60jxg: 60 pg的比例配制成混合疫苗， 同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4"C保 存。实施例23HPV 6 LlVLPs、 HPV 5LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 35LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV5L1、 HPV16L1、 HPV35L1和HPV58L1五种VLPS按10吗IO吗5吗10|Ig: 10吗的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4"C保 存。实施例24HPV 6 LlVLPs、 HPV 5LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 35LlVLPs和HPV 58 LI VLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV5L1、 HPV16L1、 HPV 35L1和HPV58L1五 种VLPs按40吗:40吗:20 JIg: 40吗:40 |Hg的比例配制成混合疫苗， 同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4'C保 存。实施例25HPV 6 LlVLPs、 HPV 8LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 57LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV8L1、 HPV16L1、 HPV 57L1和HPV58L1五 种VLPs按40吗40吗20昭40昭40吗的比例配制成混合疫苗， 同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4"C保 存。实施例26HPV 6 LlVLPs、 HPV 8LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 57LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV8L1、 HPV16L1、 HPV57L1和HPV58L1五 种VLPS按10吗IO吗:5吗IO吗:10 |lg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4i:保 存。实施例27HPV 6 LlVLPs、 HPV 8LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 57LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV8L1、 HPV16L1、 HPV57L1禾H HPV58L1五种VLPS按60吗:60吗:25 (Ig: 60|Ig: 60 |Llg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4t:保 存。实施例28HPV 6 LlVLPs、 HPV10LlVLPs、 HPV16LlVLPs、 HPV 59LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV10L1、 HPV16L1、 HPV597L1和HPV58L1 五种VLPs按60pg: 60吗25吗60昭60吗的比例配制成混合疫 苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4 r保存。实施例29HPV6LlVLPs、 HPV10LlVLPs、 HPV16LlVLPs、 HPV 59LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV10L1、 HPV16L1、 HPV 597L1和HPV58L1 五种VLPs按40|Hg: 40吗:20吗:40吗:40吗的比例配制成混合疫 苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4 x:保存。实施例30HPV6LlVLPs、 HPV 10LlVLPs、 HPV 16LlVLPs、 HPV 59LlVLPs和HPV 58 LlVLPs混合VLPs疫苗的制备 将纯化的HPV6L1、 HPV10L1、 HPV16L1、 HPV 597L1和HPV58L1五种VLPS按10吗10|Ig: 5吗IO吗10吗的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为lmg/ml，充分混合后，于4 "C保存。
权利要求
1、一种人乳头瘤病毒的病毒样颗粒疫苗，其特征在于每毫升疫苗中各组份的含量分别为HPV6L1VLPs10～60μg、HPV16L1VLPs5～40μg和HPV58L1VLPs10～60μg。
2、 一种如权利要求1所述的人乳头瘤病毒的病毒样颗粒疫苗， 其中所述疫苗组分可附加其他HPV型别的VLPs，其中附加HPV型 别包括一种或两种如下型别的VLPs: HPV1: 10 60^ig、HPV2: 10 60ng、 HPV3: 10 60|ag、 HPV 5: 10 60(ig、 HPV 8: 10 60|ng、 HPV 10: 10 60吗、HPV 11: 10 60|ig、 HPV 18: 10 60>ig、 HPV 31: 10 60|ig、 HPV33: 10 60|ig、 HPV35: 10 60pig、 HPV45: 10 60^ig、 HPV 52: 10 60吗、HPV 53: 10 60|ig、 HPV 57: 10 60(ig和HPV59: 10 60|ig。
3、 如权利要求1所述的人乳头瘤病毒的病毒样颗粒疫苗，其中 还包括一种疫苗佐剂。
4、 如权利要求3所述的人乳头瘤病毒的病毒样颗粒疫苗，疫苗 佐剂为氢氧化铝。
全文摘要
本发明涉及一种人乳头瘤病毒的病毒样颗粒疫苗，属于生物技术领域。每毫升疫苗中各组份的含量分别为HPV6L1VLPs10～60μg、HPV16L1VLPs5～40μg和HPV58L1VLPs10～60μg。本发明具有如下优点分别分泌表达HPV6L1、HPV16L1和HPV58L1蛋白，所得各种L1蛋白可自组装成VLPs。根据在亚洲和中国部分地区进行的人乳头瘤病毒感染流行病学调查结果，应用HPV6、HPV16和HPV58等型别的L1蛋白形成的VLPs制备的疫苗能预防60％HPV引起的感染。附加的HPV型别可以进一步提高疫苗的预防效力。
文档编号A61P35/00GK101116745SQ20061001707
公开日2008年2月6日 申请日期2006年8月4日 优先权日2006年8月4日
发明者刘大维, 维 孔 申请人:长春百克生物科技有限公司