专利名称：运载重组质粒的减毒沙门氏菌及其在抗肿瘤中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体为一种携带siRNA-Stat3，siRNA-Survivin及共表达siRNA-Stat3及GRIM-19质粒的减毒沙门氏菌及其制备方法及其在治疗肿瘤的中的应用。
背景技术：
肿瘤基因治疗的主要障碍之一是如何把抗肿瘤因子或其他治疗药物传递到肿瘤组织内，特别是深部肿瘤和转移瘤，而不伤害正常组织。沙门氏菌为兼性厌氧菌，具有嗜肿瘤活性，在低氧或缺氧条件下的肿瘤深部可繁殖良好并产生溶瘤效应，许多报告指出沙门氏菌在肿瘤组织中繁殖的特异性与正常组织相比可超过1000倍以上，因此以减毒沙门氏菌用于肿瘤治疗具有十分看好的应用前景。
癌基因Stat3是信号转导子与转录激活子(Signal Transducer and Activator ofTranscription，STAT)家族的重要成员，Stat3信号转导通路与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关，该通路持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化。研究表明人前列腺癌组织及前列腺癌细胞中Stat3以及其下游基因，如Survivin、cyclin D1、c-Myc、Bcl-2、Bcl-xL以及Mcl-1和VEGF等，常显示异常表达或活性增强，与前列腺癌发生发展密切相关。而Stat3的活化是这种调控异常的关键一环。阻断肿瘤细胞中癌基因Stat3信号转导通路可能起到治疗肿瘤的作用。
RNA干涉(RNA interference)是一种转录后的基因沉默，小干涉RNA(small orshort inference RNA/siRNA)能触发某种转录后监控程序，识别有同源序列的mRNA，对其产生特异性切割，从而阻断其翻译功能。但是在哺乳动物细胞中，RNAi并不能完全阻断基因的表达，尤其是异常高表达的基因。所以仍然需要寻求更好的治疗方案以加强疗效。
细胞死亡调节因子GRIM-19是Grim(gene associated with retinoid-IFN-inducedmortality)家族成员之一，其过度表达会导致细胞凋亡。GRIM-19是Stat3的负调节因子，能与Stat3的转录激活区(Transactivation Domain/TAD)结合，抑制其转录活性，因为下调Stat3下游抗凋亡基因的转录可能会进一步损伤线粒体，使位于线粒体复合物I的GRIM-19大量释放入胞浆，从而加大凋亡的反应进程。
我们的前期工作已经成功建立了一种用于治疗前列腺癌及黑色素瘤的重组质粒，并申报了专利，专利申请号CN200510017056.9；公开号CN1730658，目前以减毒沙门氏菌携带siRNA-Stat3，siRNA-Survivin及共表达siRNA-Stat3及GRIM-19的pGRIM-19-Si-Stat3重组质粒进行多种肿瘤治疗，在国内外均未见报道。
发明内容
本发明提供减毒鼠沙门氏菌作为运载体携带Stat3及Survivin的特异性siRNA，联合对Stat3呈现拮抗作用的GRIM-19基因共表达系统及其制备方法，以及其在进行基因治疗中的应用，在对多种肿瘤的治疗过程取得了显著效果，如前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、喉癌、乳腺癌及黑色素瘤等，同时探讨了以减毒沙门氏菌为共表达质粒运载体进行深部肿瘤的综合靶向治疗，同时对转移癌的发生表现出显著的预防和抑制作用。
本发明采取的技术方案是一、构建共表达siRNA-Stat3和GRIM-19基因的pGRIM-19-Si-Stat3质粒。
1.1pSH1Si-Stat3载体的构建1.1.1Stat3 siRNA模板寡核苷酸的设计根据genebank(NM 31500)人Stat3基因mRNA的已知序列，确定合适的靶位点(2143-2162)，寡核苷酸链序列为GCAGCAGCTGAACAACATG，合成编码siRNA的DNA模板正义链5’GATCCGCAGCAGCTGAACAACATGTTCAAGAGACATGTTGTTCAGCTGCTGCTTTTTTGGAAA3’反义链5’AGCTTTTCCAAAAAAGCAGCAGCTGAACAACATGTCTCTTGAACATGTTGTTCAGCTGCTGCG3′稀释寡核苷酸至终浓度1μg/μl；1.1.2Stat3 siRNA模板寡核苷酸退火1.1.3连接连接退火的Stat3 siRNA模板寡核苷酸到线性化的pSilencerTMneo 3.1-H1 siRNA表达载体。将连接产物转化入大肠杆菌。筛选阳性重组克隆。
1.1.4重组质粒的鉴定将pSilencerTMneo 3.1-H1-Stat3 siRNA质粒(以下简称pSH1Si-Stat3)用限制性内切酶(BamH I、Hind III)进行双酶切，反应条件如下质粒8μl；BamH I 1μl；HindIII 1μl；10×H Buffer 2μl；ddH2O 8μl；混合后37℃水浴2h。取5μl酶切产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，释放出目的片段的质粒为阳性重组质粒。
阳性克隆经上海生工生物工程技术服务有限公司自动测序仪进行cDNA序列测定。
1.2pcDNA3.1-GRIM-19表达载体的构建1.2.1引物设计根据Genebank AF286697号编码GRIM19全长序列由软件设计引物
P15’-GAGAATTCATGGCGGCGTCAAAGG-3’(EcoR I)P25’-GAAAGCTTCAGGGCCTACGTGTACCACAT-3’(Hind III).
1.2.2扩增人GRIM-19全长序列以正常人胎盘组织为模板进行PCR，扩增人GRIM-19全长序列反应循环条件为94℃预变性5min；94℃30Sec，62℃45Sec，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。
PCR产物电泳，用QIAquick Gel Extration Kit进行回收。
1.2.3pMD18-T-GRIM-19重组质粒制备于0.5ml Ep管中，加入下述试剂回收DNA片段4.5μl；pMD18-T vector 0.5μl(片段量∶载体量＝3～8∶1)；solution I 5μl；将其混匀后，于16℃水浴过夜。转化，鉴定并测序。
1.2.4连接反应用KpnI和EcoRI分别酶切pMD18-T-GRIM-19重组质粒及pcDNA3.1载体，进行连接，构建pcDNA3.1-GRIM-19重组质粒(以下略称为pGRIM-19)。将连接产物转化大肠杆菌JM109，用含有Amp的培养板筛选阳性克隆。
1.2.5重组质粒的鉴定从培养板中挑取单一菌落，提取质粒。用KpnI和EcoRI进行双酶切鉴定。
1.3共表达siRNA-Stat3及GRIM-19基因p GRIM-19-Si-Stat3真核重组质粒的构建1.3.1引物设计依据引物设计原则，参照pcDNA3.1图谱设计引物P3和P4，并在其上下游分别引入Bgl II和Nru I酶切位点长度为213bp。
P35′CGAGATCTGAATTCATATTTGCATGTCGCTATG3’P45′TCGCGAAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC 3′1.3.2扩增H1启动子及siRNA-Stat3序列以pSH1Si-Stat3载体为模板进行PCR，扩增H1启动子及siRNA-Stat3序列反应循环条件为94℃预变性5min；94℃30Sec，55℃45Sec，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物电泳，特异带QIAquick Gel Extration Kit回收。与pMD18-T载体进行连接，转化并测序。
1.3.3连接反应用Bgl II和Nru I分别酶切pMD18-T-H1 Si-Stat3重组质粒，pcDNA3.1质粒及pcDNA3.1-GRIM-19重组质粒，并进行连接，构建pcDNA3.1-H1Si-Stat3重组质粒(以下略称为pH1Si-Stat3)及pcDNA3.1-H1-Stat3-GRIM-19(以下略称为pGRIM-19-Si-Stat3)重组质粒。将连接产物转化大肠杆菌JM109，用含有Amp的培养板筛选阳性克隆。
1.3.4鉴定从培养板中挑取单一菌落，提取质粒。
①用Bgl II和Nru I进行双酶切鉴定。
②用Kpn I和EcoR I进行双酶切鉴定。
二.将该重组质粒电转化入减毒沙门氏菌2.1电转化感受态的制备用枪头挑取单克隆减毒沙门氏菌菌落，投入盛有5ml LB液体培养基的50ml离心管中。(同时做培养基和枪头的空白对照)37℃，220rpm，培养14-16个小时。第二天，以1∶100的比例将这5ml菌液倒入500ml LB液体培养基中，37℃，220rpm，振摇2-3h，每半小时测一次OD值，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到100ml预冷的离心管中，4℃，4200rpm离心10min。弃上清，离心管中加入1mmol/L冰预冷的HEPES(pH7.0)1ml，使沉淀重悬后，再加入1mmol/L冰预冷的HEPES(pH7.0)49ml，4℃，4200rpm离心10min。重复2次。弃上清，往离心杯中加入少量10％甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10％甘油，4℃，4200rpm，离心10min。弃上清，每个离心管中加入500μl 10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液在冰上以300μl/管分装于1.5ml的离心管中，投入液氮1min，-80℃保存。
2.2电转化步骤取1μl纯化后的重组质粒于1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。将100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.5kV，25μF，200Ω。将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。37℃，250rpm复苏1h。取20ul转化产物加160μl LB涂板，7℃过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液加1∶1的30％的甘油后混匀-80℃保存。
本发明技术方案主要创新点1，本研究成功构建pH1Si-Stat3，pGRIM-19及可同时表达GRIM-19和siRNA-Stat3的共表达的pGRIM-19-Si-Stat3重组质粒。
2.体内实验证明GRIM-19和siRNA-Stat3的共表达可以起到很好的协同作用抑制肿瘤的生长及转移。
3.减毒沙门氏菌具有噬肿瘤特性，在肿瘤组织中繁殖的特异性与正常组织相比可超过1000倍以上，1以减毒沙门氏菌携带可表达siRNA-Stat3，GRIM19可运载效应质粒到达深部肿瘤并可起到显著抑制肿瘤生长和转移的作用，并且能够明显延长小鼠的生存时间。
本发明优点及有益效果是癌基因Stat3是转录信号转导子与激活子家族的重要成员，在很多人及鼠的恶性肿瘤中如头颈部鳞状细胞癌、多发性黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌以及肺癌等有Stat3的过度激活及表达，活化的Stat3对肿瘤细胞的形成、生长、凋亡抑制等过程起着重要的调控作用，提示其调控异常与肿瘤发生发展密切相关。因此阻断肿瘤细胞中癌基因Stat3信号转导通路可能起到治疗肿瘤的作用。
我们的前期工作表明，虽然siRNA-Stat3可以显著下调Stat3基因的表达，通过诱导细胞凋亡促进对肿瘤细胞的抑制效果，但是在哺乳动物细胞中，RNAi并不能完全阻断基因的表达，尤其是异常高表达的基因。为进一步寻找最佳肿瘤治疗模式，我们选择联合基因治疗手段，即在对Stat3进行RNA沉默的基础上，增加了GRIM-19基因的联合表达。
GRIM-19基因(gene associated with retinoid-IFN-induced mortality 19)是Grim家族成员之一，它是一种由IFN-β联合RA(Retinoic acid/维甲酸)诱导表达的新的细胞死亡调节因子。GRIM-19是一种16-kDa的蛋白，分布在细胞核和胞浆中，广泛表达于大多数组织，Zhang等采用酵母双杂交文库筛选法证实了GRIM-19可结合于原癌基因Stat3并阻抑依赖Stat3的基因表达，推测Stat3的TAD可能是GRIM-19结合的直接位点，与Stat3绑定，形成点状密集结构共定位于核周，从而抑制Stat3的转录活性，因此GRIM-19是Stat3的活性抑制物，有人将GRIM-19列入为抗癌基因系列。GRIM-19与Stat3结合，并下调这些抗凋亡蛋白与其它前凋亡调节子的结合可能会进一步损伤线粒体，导致氧化磷酸化的中断，从而加大凋亡的反应进程。研究证实在某些肿瘤组织中GRIM-19表达抑制或表达缺失，而在相邻的正常组织中GRIM-19表达却正常。显示GRIM-19可能为维持正常组织或抑制癌症发生所必须。本研究应用共表达si-Stat3及GRIM-19基因真核重组质粒，既以RNAi下调Stat3表达，同时提供外源性GRIM-19，以期增强抑制前列腺癌的治疗目的。
目前，肿瘤基因治疗的主要障碍之一是如何把抗肿瘤因子或其他治疗药物传递到肿瘤组织内，特别是深部肿瘤和转移瘤，而不伤害正常组织。许多报告指出沙门氏菌能在肿瘤组织中繁殖的特异性与正常组织相比可超过1000-10000倍以上，因此以减毒沙门氏菌用于肿瘤治疗具有十分看好的应用前景。以减毒沙门氏菌直接用于肿瘤治疗，以其为运载体运载抗肿瘤药物或肿瘤拮抗因子的研究不断增多，但至今没有以沙门氏菌运载特异性siRNA表达载体，并以肿瘤为靶向进行RNA沉默的研究报导。我们首次以减毒鼠伤寒沙门氏菌为siRNA-Stat3运载体，并联合Stat3拮抗基因GRIM-19，以期实现特异性肿瘤的综合靶向治疗。
本发明通过前列腺癌原位组织块移植模型等多种肿瘤模型，模拟了从原发灶产生，到转移灶形成的完整的前列腺癌转移的病理生理过程，并且采用了减毒鼠沙门氏菌作为运载体进行基因治疗，对前列腺癌的治疗取得了显著效果。经组织细菌克隆形成试验和荧光显微镜观察，减毒鼠沙门氏菌表现出优先在肿瘤组织中聚集和复制的特性。以下一些因素可能对减毒沙门氏菌优先在肿瘤组织中复制给予解释(1)低氧环境不仅允许兼性厌氧菌生长，而且可以侵入并最后杀伤巨噬细胞和中性粒细胞，同时进入到巨噬细胞内的伤寒菌又更容易随巨噬细胞侵入到肿瘤组织内繁殖；(2)肿瘤细胞内营养丰富，快速生长的肿瘤组织内容易形成低氧区和肿瘤坏死区，使肿瘤组织内环境与正常组织不同；(3)最近研究发现在肿瘤细胞表面存在补体抑制因子，此外，不规则的血管分布和肿瘤内的压力阻止抗体和裂解沙门氏菌的补体渗透，肿瘤组织中很少发现有中性粒细胞，这主要是因为肿瘤细胞和基质细胞分泌肿瘤坏死因子β(TNFβ)或其他免疫抑制因子，从而使中性粒细胞的激活和浸润受到抑制，因此沙门氏菌在肿瘤组织中找到一个安全的定居所；(4)由于沙门氏菌的兼性厌氧特性使其既能在有一定氧含量的小转移性瘤细胞内定居，也能在较大瘤组织内深度缺氧的中心进行定居，并呈现出溶解与杀伤肿瘤组织的功能；(5)有报告指出，敲除沙门氏菌基因组中的致病岛2(SPI2)可使细菌丧失抗肿瘤的活性，已知SPI2是沙门氏菌在宿主内生长、在巨噬细胞和上皮细胞内存活所必需；(6)有报告指出当沙门氏菌侵袭巨噬细胞以后本身亦能诱导细胞凋亡，这可能是使所携带外源基因释放的机制之一。
本发明首次应用减毒沙门氏菌携带Stat3或Survivin特异性siRNA，联合对Stat3呈现拮抗作用的GRIM-19基因共表达系统，进行了抗多种肿瘤的体内外研究。以肿瘤局部注射或小鼠尾静脉注射Stat3序列特异性siRNA与GRIM-19联合表达载体系统有明显的协调治疗作用。结果表明减毒沙门氏菌具有噬肿瘤特性，在肿瘤组织中繁殖的特异性与正常组织相比可超过1000倍以上，15天后在正常组织中表达量明显降低，并且该系统对实验性肿瘤具有显著的治疗效果，可以延长小鼠的生存时间。
图1共表达质粒pGRIM-19-Si-Stat3构建过程；
图2(A)pSH1Si-Stat3表达质粒酶切鉴定结果；图2(B)以pCXN2mycAGRIM-19表达质粒为模板扩增GRIM-19全长；图2(C)KpnI和EcoRI双酶切鉴定pMD18-T-GRIM-19质粒；图2(D)KpnI和EcoRI双酶切鉴定pGRIM-19重组质粒；图2(E)以pH1Si-Stat3质粒为模板扩增H1启动子和Si-Stat3片断；图2(F)Bgl II和NruI双酶切鉴定pMD18-T-H1Si-Stat3质粒；图2(G)pH1Si-Stat3重组质粒及pGRIM-19-Si-Stat3重组质粒的鉴定图3(A)细胞免疫化学染色显示pGRIM-19-Si-Stat3组GRIM-19表达增强；图3(B)细胞免疫化学染色显示Stat3表达减弱。
图4MTT实验检测各组质粒对肿瘤细胞增殖的抑制图5Annexin V-CY3凋亡试剂盒检测共表达pGRIM-19-Si-Stat3质粒可以诱导肿瘤细胞凋亡；图6细菌在小鼠体内的分布分析(A)Amp平板计数，肿瘤组织细菌分布与其余脏器相比具有统计学意义(B)荧光显微镜下观察冰冻切片，肿瘤组织内有大量的绿色荧光颗粒；其余脏器仅见极少的绿色荧光图7.共表达质粒对裸鼠前列腺癌肿瘤具有生长抑制作用图8共表达质粒对裸鼠喉癌肿瘤具有生长抑制作用图9共表达质粒对裸鼠乳腺癌肿瘤具有生长抑制作用图10共表达质粒对裸鼠肺癌肿瘤具有生长抑制作用图11.裸鼠前列腺癌肿瘤生长曲线图12减毒沙门氏菌携带重组质粒对小鼠原位肿瘤具有生长抑制作用图13减毒沙门氏菌携带重组质粒对小鼠前列腺癌原位肿瘤具有生长抑制作用图14前列腺癌原位肿瘤转移部位图15酶谱分析表明共表达质粒组MMP-2的表达量降低图16转染后肿瘤组织Stat3和GRIM-19基因表达分析图17转染后肿瘤组织Stat3和GRIM-19蛋白表达分析图18转染后肿瘤组织Stat3下游基因转录表达分析图19TUNEL试剂盒检测肿瘤组织凋亡具体实施方式
一、材料1.主要试剂T4DNA连接酶购自美国Promega公司；BamH I，Hind III，Nru I，Kpn I等内切酶购自大连宝生物工程公司；DNA purification system Wizard plus SVMinipreps购自美国Promega公司；胰化蛋白胨及酵母提取物购自OXOID公司；琼脂糖及琼脂粉购自大连宝生物工程公司；DNA凝胶回收试剂盒购自大连宝生物工程公司；DNA Marker DL2000，1Kb Ladder DNA marker均为Takara公司产品。引物合成及测序由上海生工生物工程技术服务公司完成。溴化乙锭、琼脂糖、SDS、TEMED、丙烯酰胺、N，N-二甲基双丙烯酰胺、MTT、DTT、DMSO、PI、PMSF购自美国Sigma公司；氨苄青霉素、卡那霉素购自北京鼎国公司；DEPC购自德国Merk公司；高保真Taq DNA聚合酶、DAB、Triton X-100、dNTP、MMV逆转录酶及质粒提取和纯化试剂盒购自Promega公司；RNA酶及蛋白酶K购于美国Ambion公司。Transwell细胞培养小室及matrigel为美国BD生物科学公司产品；Lipofetion2000及Trizol为美国Invitrogen公司产品；胰酶、IMDM培养基为美国Hyclone公司产品；新生牛血清购自杭州四季青公司；Annexin V-CY3凋亡试剂盒购自SIGMA公司；其它常规化学试剂均为分析纯产品。
2.主要仪器PCR扩增仪(GeneAmp，美国)；超净工作台(YZ-875苏州净化设备厂)；自动高压蒸气消毒器(SONY，日本)；低温冰箱(-80℃SANYO，日本)；恒温水浴箱(江苏常州国华仪器厂)；高速低温离心机(TOMY GRX-220，日本)；电热鼓风干燥箱(上海实验仪器总厂)；电子天平(OHAUS，美国)；电泳仪(Bio-rad，美国)；凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；相差显微镜(OLYMPUS，日本)；全自动显微镜数码摄像系统(OLYMPUS，日本)；酶标仪(TAKARA，日本)；荧光显微镜(OLYMPUS，日本)；流式细胞仪(COμLTER，美国)；去离子水装置(日本)；PCR扩增仪(GeneAmp，美国)；可见、紫外分光光度计及分析工作站(岛津Shimadazi，日本)；加样器(JECONS，芬兰)；自动CO2恒温培养箱(SANYO，日本)；蛋白质电泳装置及转移系统(Bio-rad，美国)。
3.质粒和菌株pSilencerTMneo 3.1-H1 siRNA表达载体购自Ambion公司。带有U6启动子及GFP的质粒pGCsilencerTMU6/Neo/GFP购自上海吉凯化学公司。减毒沙门氏菌购自美国Bema生物公司。PMD-18T vector购自宝泰克公司。pcDNA3.1表达载体及大肠杆菌JM109购自美国Invitrogen公司。
4.细胞株人激素非依赖性高转移前列腺癌PC-3M细胞株，人乳腺癌MCF-7细胞株，人喉癌HEP-2细胞株，人肺癌A549细胞株，人黑色素瘤A375细胞株，人肝癌Bel-7402细胞株，购自美国ATCC公司。小鼠前列腺癌RM-1细胞株，购自上海细胞所。各细胞株用含10％新生牛血清的IMDM培养液在37℃、5％CO2的孵箱内培养，以0.25％胰酶消化传代。
5.实验动物实验动物均购自中国医学科学院实验动物研究所。BALB/C nu/nu雄性裸鼠，150只，4～6周龄，体重18～20g，饲养于恒定温度(22-25℃)、恒定湿度(40％-50％)的SPF层流室中，经高压灭菌的标准饲料和水供动物自由食用。C57BL6雄性近交系小鼠50只，鼠龄8周，体重18～20g，饲养环境恒温、恒湿、清洁、无特殊病原体，定期更换垫料，清洁饮用水及饲料供小鼠自由摄入。
二、方法一、构建共表达siRNA-Stat3和GRIM-19基因的pGRIM-19-Si-Stat3质粒。
1.1pSH1Si-Stat3载体的构建1.1.1Stat3 siRNA模板寡核苷酸的设计根据genebank(NM 31500)人Stat3基因mRNA的已知序列，根据本研究室前期工作，确定合适的靶位点(2143-2162)，寡核苷酸链序列为GCAGCAGCTGAACAACATG，合成编码siRNA的DNA模板正义链5’GATCCGCAGCAGCTGAACAACATGTTCAAGAGACATGTTGTTCAGCTGCTGCTTTTTTGGAAA3’反义链5’AGCTTTTCCAAAAAAGCAGCAGCTGAACAACATGTCTCTTGAACATGTTGTTCAGCTGCTGCG3′稀释寡核苷酸至终浓度1μg/μl。
1.1.2Stat3 siRNA模板寡核苷酸退火2μl正义siRNA模板寡核苷酸，2μl反义siRNA模板寡核苷酸，46μl 1×DNA退火溶液；加热混合物至90℃3分钟，冷却至37℃，孵化1小时。
1.1.3连接连接退火的Stat3 siRNA模板寡核苷酸到线性化的pSilenceTMneo 3.1-H1siRNA表达载体。用45μl去核酸酶水稀释5μl退火的Stat3 siRNA模板寡核苷酸，终浓度为8μg/μl；建立10μl连接反应体系设1个阴性对照，4℃过夜。反应体系如下稀释退火的siRNA模板寡核苷酸1μl；去核酸酶水6μl；10×T4DNA连接酶缓冲液1μl；pSilencerTMneo 3.1-H1siRNA载体1μl；T4DNA连接酶(5U/μl)1μl。
1.1.4连接产物转化大肠杆菌1.1.4.1大肠杆菌JM109感受态细胞的制备将宿主菌JM109接种于LB固体培养基上，培养过夜。次日，从LB平板上挑取单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1∶50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600达0.45-0.55。冰浴菌液10分钟，4000g离心10min收集50ml菌体。10ml冰预冷0.1M CaCl2重悬。2ml冰预冷0.1M CaCl2重悬沉淀，置于4℃，16h后取100μl用于转化试验，或加入甘油至终浓度10％，-70℃保存备用。
1.1.4.2重组质粒的转化100μl感受态细胞加入连接反应物1μl，混匀后冰浴30min。42℃水浴90s，然后迅速移入冰浴中放置2min。向管中加入LB液体培养基800μl，37℃温和震荡培养1h。用无菌弯头玻璃铺菌器将200μl菌液铺于含Amp的LB平板(50μg/mL)表面，待表面液体吸收后，倒置平皿37℃培养16-20h。
1.1.5阳性重组克隆的筛选(碱裂解法)挑取生长于选择培养板的单菌落，加到含氨苄青霉素(100μg/mL)的5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。碱裂解法小量制备质粒，过程如下将1.5ml培养物倒入Ep管中，7000g离心数秒，吸去培养液，重复前一步骤，使细菌沉淀尽可能干燥。将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液solution I(50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris.Cl pH 8.0、10mmol/L EDTA pH8.0)中，剧烈震荡，室温放置5min。加200μl新配制的溶液solution II(0.2mol/L NaOH、1％SDS)，盖紧管口，快速颠倒离心管数次，以混合内容物，然后将离心管放置于冰上5min。加冰预冷的溶液solutionIII(5mol/L乙酸钾，11.5ml冰乙酸，28.5ml ddH2O)，盖紧管口，颠倒离心管20sec，将管置于冰上5min。12000g离心10min，将上清转移至另一Ep管中，加等量酚∶氯仿(25∶24)，振荡混匀，4℃12，000g离心2min，将上清转移至另一Ep管中。加两倍体积的乙醇，振荡混合，于室温放置2min。离心15min，弃上清，再加70％乙醇1ml以洗涤双链DNA，离心10min，弃上清，室温干燥沉淀，然后加含RNA酶的ddH2O(20μg/ml)30μl重新溶解核酸沉淀。
1.1.6重组质粒的鉴定将pSilencerTMneo 3.1-H1-Stat3 siRNA质粒(以下简称pSH1Si-Stat3)用限制性内切酶(BamH I、Hind III)进行双酶切，反应条件如下质粒8μl；BamH I 1μl；HindIII 1μl；10×H Buffer 2μl；ddH2O 8μl；混合后37℃水浴2h。取5μl酶切产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，释放出目的片段的质粒为阳性重组质粒。
阳性克隆经上海生工生物工程技术服务有限公司自动测序仪进行cDNA序列测定。
1.2pcDNA3.1-GRIM-19表达载体的构建1.2.1引物设计根据Genebank AF286697号编码GRIM19全长序列由软件设计引物P15’-GAGAATTCATGGCGGCGTCAAAGG-3’(EcoR I)P25’-GAAAGCTTCAGGGCCTACGTGTACCACAT-3’(Hind III).
1.2.2扩增人GRIM-19全长序列以正常人胎盘组织为模板进行PCR，扩增人GRIM-19全长序列反应循环条件为94℃预变性5min；94℃30Sec，62℃45Sec，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。
PCR产物电泳，用QIAquick Gel Extration Kit进行回收用手术刀片从琼脂糖凝胶中切下含DNA片段的凝胶，放入Ep管中，将其捣碎；向管内加入相当于凝胶体积三倍的溶胶液，50℃水浴10min，其间轻弹Ep管壁数次，使凝胶完全溶化；将融化了的胶加入回收柱中，13000rpm离心，1min；向柱中再次加入750μl溶胶液，13000rpm离心1min，弃溶胶液；向柱中加入500μl PE溶液，13000rpm离心1min，弃去PE；再次13000rpm离心1min，弃去残余的PE，室温干燥10min；向柱中加入30μl无菌水，室温放置10min，充分溶解DNA；13000rpm离心1min，得到30μl DNA溶液；取一部分回收的DNA在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，以验证回收效率。
1.2.3pMD18-T-GRIM-19重组质粒制备于0.5ml Ep管中，加入下述试剂回收DNA片段4.5μl；pMD18-T vector 0.5μl(片段量∶载体量＝3～8∶1)；solution I 5μl；将其混匀后，于16℃水浴过夜。转化，鉴定并测序。
1.2.4连接反应用KpnI和EcoRI分别酶切pMD18-T-GRIM-19重组质粒及pcDNA3.1载体，进行连接，构建pcDNA3.1-GRIM-19重组质粒(以下略称为pGRIM-19)。将连接产物转化大肠杆菌JM109，用含有Amp的培养板筛选阳性克隆。
1.2.5重组质粒的鉴定从培养板中挑取单一菌落，提取质粒。用KpnI和EcoRI进行双酶切鉴定。1.3共表达siRNA-Stat3及GRIM-19基因真核重组质粒的构建1.3.1引物设计依据引物设计原则，参照pcDNA3.1图谱设计引物P3和P4，并在其上下游分别引入Bgl II和Nru I酶切位点长度为213bp。
P35′CGAGATCTGAATTCATATTTGCATGTCGCTATG3’P45′TCGCGAAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC 3′1.3.2扩增H1启动子及siRNA-Stat3序列以pH1Si-Stat3载体为模板进行PCR，扩增H1启动子及siRNA-Stat3序列反应循环条件为94℃预变性5min；94℃30Sec，55℃45Sec，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物电泳，特异带QIAquick Gel Extration Kit回收。与pMD18-T载体进行连接，转化并测序。
1.3.3连接反应用Bgl II和Nru I分别酶切pMD18-T-H1Si-Stat3重组质粒，pcDNA3.1质粒及pcDNA3.1-GRIM-19重组质粒，并进行连接，构建pcDNA3.1-H1Si-Stat3重组质粒(以下略称为pH1Si-Stat3)及pcDNA3.1-H1-Stat3-GRIM-19(以下略称为pGRIM-19-Si-Stat3)重组质粒。将连接产物转化大肠杆菌JM109，用含有Amp的培养板筛选阳性克隆。
1.3.4鉴定从培养板中挑取单一菌落，提取质粒。
①用Bgl II和Nru I进行双酶切鉴定。
②用Kpn I和EcoR I进行双酶切鉴定。
二.将重组质粒电转化入减毒沙门氏菌2.1电转化感受态的制备用枪头挑取单克隆减毒沙门氏菌菌落，投入盛有5ml LB液体培养基的50ml离心管中。(同时做培养基和枪头的空白对照)37℃，220rpm，培养14-16个小时。第二天，以1∶100的比例将这5ml菌液倒入500ml LB液体培养基中，37℃，220rpm，振摇2-3h，每半小时测一次OD值，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到100ml预冷的离心管中，4℃，4200rpm离心10min。弃上清，离心管中加入1mmol/L冰预冷的HEPES(pH7.0)1ml，使沉淀重悬后，再加入1mmol/L冰预冷的HEPES(pH7.0)49ml，4℃，4200rpm离心10min。重复2次。弃上清，往离心杯中加入少量10％甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10％甘油，4℃，4200rpm，离心10min。弃上清，每个离心管中加入500μl 10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液在冰上以300μl/管分装于1.5ml的离心管中，投入液氮1min，-80℃保存。
2.2电转化步骤取1μl纯化后的重组质粒于1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。将100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.5kV，25μF，200Ω。将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。37℃，250rpm复苏1h。取20ul转化产物加160μl LB涂板，7℃过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液加1∶1的30％的甘油后混匀-80℃保存。
3.体外研究应用真核细胞转染技术转染PC-3M，RM-1细胞株，MCF-7细胞株，HEP-2细胞株，A549细胞株，Bel-7402细胞株，A375细胞株；应用半定量RT-PCR，免疫细胞化学染色和Western blot检测重组质粒及相关基因的基因及蛋白水平的表达；应用流式细胞术检测细胞周期及凋亡峰；应用Annexin V-CY3凋亡试剂盒检测细胞早期凋亡；建立稳定转染pGC-Si-Stat3质粒的细胞系，应用酶谱分析检测细胞MMP-2的表达；应用Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力。
4.体内实验复制裸鼠移植前列腺癌模型，乳腺癌模型，喉癌模型，肝癌模型，肺癌模型及黑色素瘤模型并应用显微外科技术建立小鼠前列腺癌原位组织块移植模型，应用减毒沙门氏菌局部注射或尾静脉注射将重组质粒带入瘤体内观察抑瘤作用；应用TUNEL试剂盒检测肿瘤细胞凋亡；应用Northen blot和Western blot检测相关基因的基因与蛋白水平的表达；应用免疫组织化学技术检测Stat3、GRIM-19及Ki-67的表达；应用酶谱分析检测组织MMP-2的表达。
4.1裸鼠肿瘤移植瘤模型的建立将肿瘤细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液，经离心，将细胞团块用IMDM培养液吹散，经台盼蓝实验证实细胞活力≥95％，最终细胞浓度为2×107个/ml，取瘤细胞2×106个(0.1ml)接种于裸鼠左侧背部近前肢皮下组织内。隔天用游标卡尺进行测量，待移植瘤长至直径5mm时将裸鼠随机分组进行实验。
4.1.1治疗过程每组5只裸鼠，分为5组，分组如下mock组，pH1Si-Scramble组，pH1Si-Stat3组，pGRIM-19组，pGRIM-19-Si-Stat3组。每组肿瘤局部注射携带相应组质粒的减毒沙门氏菌，分2点注射，每点50μl，细菌浓度为109cfu/100μl。
4.1.2治疗效果观察指标4.1.2.1全身情况观察实验动物的活动、进食和体重。
4.1.2.2肿瘤体积的变化治疗后隔天一次用精密卡尺测量肿瘤最大长径和短径，计算肿瘤体积。体积＝0.52×长径×短径2。
4.1.2.3病理学检查接种后当对照组肿瘤长至足够大时统一拉颈处死所有小鼠切除肿块称重，分别行病理学检查(10％甲醛固定后，HE染色)。Stat3、GRIM-19、Ki67免疫组织化学染色。结果判定以在肿瘤细胞胞浆或细胞间质内出现棕黄色颗粒，且着色强度高于背景非特异性染色者判定为阳性。
4.1.3肿瘤细胞凋亡检测(TUNEL检测)4.1.4肿瘤组织基因及蛋白质水平检测提取肿瘤组织RNA及蛋白，半定量PCR分析Stat3、GRIM-19在基因水平的表达，Western blotting分析Stat3、GRIM-19在蛋白水平的表达。
4.2原位移植瘤建立4.2.1小鼠背部皮下移植瘤模型的建立C57BL6近交系小鼠10只，用强力碘消毒小鼠背部，取鼠源性肿瘤细胞溶液接种于小鼠背部皮下，接种细胞浓度为2×107个/ml，每只接种100μl。隔日观察肿瘤生长情况。
4.2.2小鼠前列腺癌原位移植瘤模型及肝癌原位移植瘤模型的建立用于外科原位移植(SOI)的肿瘤组织来源于上述鼠背皮下肿瘤模型。状态较好的肿瘤组织靠近外周，色白有光泽，质韧有弹性，不易破碎。将取出的瘤块置于低温、无菌的0.9％生理盐水中，在10倍显微镜下切割成直径1.5mm大小的肿瘤块。C57BL6近交系小鼠用戊巴比妥钠(60mg/Kg)麻醉，取仰卧位，强力碘常规消毒，铺无菌洞巾。下腹部正中切口长约1.5-2.0cm，显露腹腔。将膀胱向上提起，并用无菌棉签抵住膀胱腹侧壁，暴露腹侧前列腺。镜下剥离前列腺腹侧筋膜，用尖刀分离两腹侧叶，将肿瘤块置于两腹侧叶间形成的缝隙中，用9-0可吸收线缝合两腹侧叶及其表面筋膜，使肿瘤块被严密包埋。恢复脏器原来的解剖位置，用5-0肠线全层连续缝合关腹，待鼠苏醒后回笼。术中操作要求轻柔、准确，避免损伤正常组织和肿瘤组织。
4.2.3实验动物分组每种肿瘤共有40只C57BL6小鼠进行原位移植。分组同上。
4.2.4肿瘤生长和转移的评价C57BL6小鼠濒死或处死时采用过量麻醉方法处死，手术显微镜下观察原位移植的肿瘤生长情况和淋巴结转移情况，取肝、肺、脾、肾、椎体、淋巴结和可疑的骨骼进行福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色后光镜下观察有无转移灶。
细胞数目。
结果
1.经测序及酶切鉴定，成功构建了共表达siRNA-Stat3和GRIM-19基因的pGRIM-19-Si-Stat3质粒。
1.1pSH1Si-Stat3载体的构建用BamH I和Hind III双酶切pSH1Si-Stat3表达质粒，1.5％琼脂糖凝胶电泳显示分别出现66bp和4.3kb的酶切片断，结果见图1。DNA测序结果证实Si-Stat3和Si-Scramble片段与pSilencerTMneo 3.1-H1 siRNA表达载体连接反应正确，结果见图2(A)。
1.2pGRIM-19表达载体的构建如图2(B)，以pCXN2mycA GRIM-19质粒为模板作PCR，得到GRIM-19的全长，为435bp。如2(C)所示，将重组质粒用KpnI和EcoRI作双酶切，可得到两个片段，大片段为载体片段，大小为2692bp；小片段为GRIM-19片段，大小为435bp。测序结果与Genebank(NM_015965)序列完全一致，同时两端已成功地加入了限制性酶切位点。
将重组质粒用KpnI和EcoRI作双酶切，可得到两个片段，大片段为载体片段，大小为5428bp；小片段为GRIM-19片段，大小为435bp，结果见图2(D)。
1.3pH1Si-Stat3表达载体的构建以pH1Si-Stat3质粒为模板扩增H1启动子和Si-Stat3片断，所得产物大小为204bp，结果见图2(E)。将重组质粒用Bgl II和Nru I双酶切，大片段为载体片段，大小为2692bp；小片段为H1Si-Stat3片段，大小为204bp，结果见图2(F)。DNA测序结果证实H1Si-Stat3片段与pcDNA3.1表达载体连接反应正确。
1.4pH1Si-Stat3重组质粒及pGRIM-19-Si-Stat3重组质粒的鉴定如图2(G)所示，将重组质粒用Bgl II和Nru I双酶切，大片段为载体片段，大小分别为5428bp和5860bp；小片段为H1Si-Stat3片段，大小为204bp。将pGRIM-19-Si-Stat3重组质粒用KpnI和EcoRI作双酶切，可得到两个片段，大片段为载体片段，大小为5428bp；小片段为GRIM-19片段，大小为435bp。
2.体外实验证明重组质粒对肿瘤细胞具有增殖抑制及促进凋亡的作用。
2.1PC-3M细胞免疫化学染色细胞免疫化学染色结果如图3显示，pGRIM-19-Si-Stat3组GRIM-19表达增强，细胞浆、胞核中均可见颗粒样分布的深浅不一的棕黄色物质；pGRIM-19-Si-Stat3组Stat3 mRNA表达减弱。
2.2重组质粒转染对PC-3M细胞的生长抑制作用2.2.1相差显微镜下观察对照组细胞贴壁生长，状况良好，多为梭形，大小适中，核仁清晰，可见核分裂相，细胞折光性好，细胞增殖旺盛；pH1Si-Stat3组和pGRIM-19组随转染时间的延长细胞生长缓慢，形态不规则，细胞皱缩，颗粒增多，细胞碎片增加；pGRIM-19-Si-Stat3组可见细胞内颗粒物质增加，失去原有形态，细胞核固缩，裂解成质膜包绕的碎片，细胞数目较对照组明显减少，部分细胞漂浮在培养液中。
2.2.2MTT实验检测各组质粒对PC-3M细胞增殖的抑制如图4所示，三组重组质粒均能显著性的抑制PC-3M细胞增殖，抑制率分别为51.7％，42.3％和20.9％，与对照组相比，差异有显著性(P＜0.01)；而脂质体对照组和pH1Si-Scramble对照组细胞体外增殖活性无明显差异(P＞0.05)；共表达siRNA-Stat3及GRIM-19基因真核重组质粒与单用相比抑制作用明显增强(P＜0.05)。
2.3重组质粒可诱导PC-3M细胞凋亡2.3.1应用流式细胞术检测PC-3M细胞凋亡峰重组质粒转染组PC-3M细胞于转染后72h较对照组出现了明显的细胞凋亡，(P＜0.01)(表1)，在G1期前出现的亚二倍峰即为凋亡峰。
表1共表达pGRIM-19-Si-Stat3质粒诱导肿瘤细胞凋亡及对细胞周期的影响(#P＜0.05versus pH1Si-Scramble；*P＜0.05versus pH1Si-Scramble)
2.3.2Annexin V-CY3凋亡试剂盒检测细胞凋亡如图5所示，通过激光共聚焦显微镜可见脂质体对照组及pH1Si-Scramble组PC-3M细胞呈均一绿色，表明转染重组质粒的PC-3M细胞发生早期凋亡。pGRIM-19，pH1Si-Stat3，pGRIM-19-Si-Stat3转染组呈不同程度的annexin V阳性表达，凋亡细胞被AnnCy3与6-CF红绿两种荧光标记而呈现黄色。
3.体外实验证明减毒沙门氏菌能够携带重组质粒进入深部肿瘤组织，并对肿瘤细胞具有增殖抑制及促进凋亡的作用。
3.1细菌在小鼠体内的分布无菌状态下取肿瘤、脾脏、肝脏和肺脏各100mg，研磨，以冷的PBS 5倍稀释后，接种到含Amp的LB平皿，37℃过夜，次日计算形成的单个克隆数(图6A)。肿瘤组织形成单个克隆数1890±98.2个；脾脏组织形成10±3.5个；肝脏组织形成8±4.3个；肺脏组织形成2±0.3个。肿瘤与其余脏器相比具有统计学意义(P＜0.01)。
取各脏器制成冰冻切片，荧光显微镜下观察，肿瘤组织内有大量的绿色荧光颗粒，代表细菌的分布；其余脏器仅见极少的绿色荧光(图6B)。
3.2重组质粒对裸鼠肿瘤及小鼠原位肿瘤生长的抑制用PC-3M细胞接种裸鼠，第12天全部出瘤，平均体积为97.5±11.36mm3，分组治疗后，裸鼠平均体重，平均肿瘤重量和体积见表2，肿瘤生长抑制见图7，肿瘤生长曲线见图11。共表达质粒组与对照组及单独应用组明显缩小，具有统计学意义(P＜0.01)。平均体重未见统计学差异(P＞0.05)。喉癌(图8)，乳腺癌(图9)，肺癌(图10)裸鼠皮下移植瘤模型均证明pGRIM-19-Si-Stat3重组质粒具有协同作用，与对照组相比平均肿瘤重量和体积均降低。
表2各组裸鼠平均体重，平均肿瘤重量和体积比较(#P＜0.05versus pH1Si-Scramble；*P＜0.05versus pH1Si-Scramble)
成功建立小鼠前列腺癌原位组织块移植瘤模型及肝癌模型，并用尾静脉注射减毒沙门氏菌携带重组质粒到达深部肿瘤进行治疗(图12，13，表3)，模型组可以发生各种脏器的转移，很好的模拟了晚期癌症的进展与转移(图14)。肿瘤细胞发生凋亡，转移部位低于对照组，具有统计学差异(表4)。
表3各组小鼠平均体重，平均肿瘤重量和体积比较(*P＜0.01versus pH1Si-Scramble)
表4各组小鼠肿瘤转移部位比较
3.3转染后肿瘤组织MMP-2的表达分析由酶谱分析表明(图15)，脂质体对照组和pH1Si-Scramble对照组肿瘤组织MMP-2的活性明显高于pGRIM-19，pH1Si-Stat3及pGRIM-19-Si-Stat3转染组，P＜0.05。并且脂质体对照组和pH1Si-Scramble对照组病理学检查可见肌肉浸润及淋巴结转移，转染组未见转移。
3.4转染后肿瘤组织Stat3和GRIM-19基因表达分析RT-PCR结果显示，pGRIM-19组和pGRIM-19-Si-Stat3组GRIM-19mRNA表达增强(图16)；pH1Si-Stat3组和pGRIM-19-Si-Stat3组Stat3 mRNA表达减弱(图17)。
3.5转染后肿瘤组织Stat3和GRIM-19蛋白表达分析图26显示Western blot分析结果，pGRIM-19组和pGRIM-19-Si-Stat3组GRIM-19蛋白表达增强；pH1Si-Stat3组和pGRIM-19-Si-Stat3组Stat3蛋白表达减弱。
3.6转染后肿瘤组织相关因子蛋白表达分析Western blot分析结果显示(图18)，pGRIM-19组，pGRIM-19-Si-Stat3组和pGRIM-19-Si-Stat3组Bcl-2，cyclin D1，c-Myc，VEGF蛋白表达减弱，其中pGRIM-19-Si-Stat3组减弱更明显。
3.7转染后肿瘤组织细胞凋亡的检测用苏木素-伊红(HE)染色普通光镜下观察pGRIM-19，pH1Si-Stat3及pGRIM-19-Si-Stat3转染组肿瘤组织细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色(凋亡细胞)，正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。原位细胞凋亡检测可见pGRIM-19，pH1Si-Stat3及pGRIM-19-Si-Stat3转染组肿瘤组织细胞核中有棕黄色颗粒，提示有凋亡细胞(图19)。
实施例将本发明与PDS配制成3×108/ml的溶液，装入1ml安瓶中。使用时，每人皮下或肌肉注射1ml。
权利要求
1.一种运载重组质粒的减毒沙门氏菌，它是由下列步骤得到的一、构建共表达siRNA-Stat3和GRIM-19基因的pGRIM-19-Si-Stat3质粒1.1pSH1Si-Stat3载体的构建1.1.1Stat3 siRNA模板寡核苷酸的设计根据genebank(NM 31500)人Stat3基因mRNA的已知序列，确定合适的靶位点(2143-2162)，寡核苷酸链序列为GCAGCAGCTGAACAACATG，合成编码siRNA的DNA模板正义链5’GATCCGCAGCAGCTGAACAACATGTTCAAGAGACATGTTGTTCAGCTGCTGCTTTTTTGGAAA3’反义链5’AGCTTTTCCAAAAAAGCAGCAGCTGAACAACATGTCTCTTGAACATGTTGTTCAGCTGCTGCG3′稀释寡核苷酸至终浓度1μg/μl；1.1.2Stat3 siRNA模板寡核苷酸退火1.1.3连接连接退火的Stat3 siRNA模板寡核苷酸到线性化的pSilencerTMneo 3.1-H1 siRNA表达载体，将连接产物转化入大肠杆菌，筛选阳性重组克隆；1.1.4重组质粒的鉴定将pSilencerTMneo 3.1-H1-Stat3 siRNA质粒，简称pSH1Si-Stat3，用限制性内切酶BamH I、Hind III进行双酶切，反应条件如下质粒8μl；BamH I 1μl；Hind III 1μl；10×H Buffer 2μl；ddH2O 8μl；混合后37℃水浴2h。取5μl酶切产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，释放出目的片段的质粒为阳性重组质粒；阳性克隆经自动测序仪进行cDNA序列测定；1.2pcDNA3.1-GRIM-19表达载体的构建1.2.1引物设计根据Genebank AF286697号编码GRIM19全长序列由软件设计引物P15’-GAGAATTCATGGCGGCGTCAAAGG-3’(EcoR I)P25’-GAAAGCTT CAGGGCCTACGTGTACCACAT-3’(Hind III)1.2.2扩增人GRIM-19全长序列以正常人胎盘组织为模板进行PCR，扩增人GRIM-19全长序列反应循环条件为94℃预变性5min；94℃30Sec，62℃45Sec，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min；PCR产物电泳，用QIAquick Gel Extration Kit进行回收；1.2.3pMD18-T-GRIM-19重组质粒制备于0.5ml Ep管中，加入下述试剂回收DNA片段4.5μl；pMD18-T vector 0.5μl(片段量∶载体量＝3～8∶1)；solution I 5μl；将其混匀后，于16℃水浴过夜，转化，鉴定并测序；1.2.4连接反应用KpnI和EcoRI分别酶切pMD18-T-GRIM-19重组质粒及pcDNA3.1载体，进行连接，构建pcDNA3.1-GRIM-19重组质粒(以下略称为pGRIM-19)，将连接产物转化大肠杆菌JM109，用含有Amp的培养板筛选阳性克隆；1.2.5重组质粒的鉴定从培养板中挑取单一菌落，提取质粒。用KpnI和EcoRI进行双酶切鉴定；1.3共表达siRNA-Stat3及GRIM-19基因p GRIM-19-Si-Stat3真核重组质粒的构建1.3.1引物设计依据引物设计原则，参照pcDNA3.1图谱设计引物P3和P4，并在其上下游分别引入Bgl II和Nru I酶切位点长度为213bp；P35′CGAGATCTGAATTCATATTTGCATGTCGCTATG3’P45′TCGCGAAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC3′1.3.2扩增H1启动子及siRNA-Stat3序列以pSH1Si-Stat3载体为模板进行PCR，扩增H1启动子及siRNA-Stat3序列反应循环条件为94℃预变性5min；94℃30Sec，55℃45Sec，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物电泳，特异带QIAquick Gel Extration Kit回收，与pMD18-T载体进行连接，转化并测序；1.3.3连接反应用Bgl II和Nru I分别酶切pMD18-T-H1 Si-Stat3重组质粒，pcDNA3.1质粒及pcDNA3.1-GRIM-19重组质粒，并进行连接，构建pcDNA3.1-H1 Si-Stat3重组质粒(以下略称为pH1Si-Stat3)及pcDNA3.1-H1-Stat3-GRIM-19(以下略称为pGRIM-19-Si-Stat3)重组质粒。将连接产物转化大肠杆菌JM109，用含有Amp的培养板筛选阳性克隆；1.3.4鉴定从培养板中挑取单一菌落，提取质粒；①用BglII和Nru I进行双酶切鉴定；②用Kpn I和EcoR I进行双酶切鉴定；二.将重组质粒电转化入减毒沙门氏菌2.1电转化感受态的制备用枪头挑取单克隆减毒沙门氏菌菌落，投入盛有5ml LB液体培养基的50ml离心管中；(同时做培养基和枪头的空白对照)37℃，220rpm，培养14-16个小时；第二天，以1∶100的比例将这5ml菌液倒入500ml LB液体培养基中，37℃，220rpm，振摇2-3h，每半小时测一次OD值，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到100ml预冷的离心管中，4℃，4200rpm离心10min。弃上清，离心管中加入1mmol/L冰预冷的HEPES(pH7.0)1ml，使沉淀重悬后，再加入1mmol/L冰预冷的HEPES(pH7.0)49ml，4℃，4200rpm离心10min；重复2次；弃上清，往离心杯中加入少量10％甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10％甘油，4℃，4200rpm，离心10min。弃上清，每个离心管中加入500μl 10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液在冰上以300μl/管分装于1.5ml的离心管中，投入液氮1min，-80℃保存；2.2电转化步骤取1μl纯化后的重组质粒于1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷；将100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置10min；打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.5kV，25μF，200Ω；将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。37℃，250rpm复苏1h；取20ul转化产物加160μl LB涂板，7℃过夜培养，次日查看转化结果；其余菌液加1∶1的30％的甘油后混匀-80℃保存。
2.如权利要求1所述的运载重组质粒的减毒沙门氏菌的制备方法。
3.如权利要求1所述的运载重组质粒的减毒沙门氏菌在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的运载重组质粒的减毒沙门氏菌，治疗的肿瘤包括人前列腺癌细胞、肺癌、胃癌、喉癌、乳腺癌、肝癌、黑色素瘤。
全文摘要
本发明涉及一种运载重组质粒的减毒沙门氏菌及其在抗肿瘤中的应用，本发明属于生物技术领域。本发明构建pH1Si－Stat3，pGRIM－19及可同时表达GRIM－19和siRNA－Stat3的共表达的pGRIM－19－Si－Stat3重组质粒。将重组质粒电转化入减毒沙门氏菌。体内实验证明GRIM－19和siRNA－Stat3的共表达可以起到很好的协同作用抑制肿瘤的生长及转移。减毒沙门氏菌具有噬肿瘤特性，在肿瘤组织中繁殖的特异性与正常组织相比可超过1000倍以上，以减毒沙门氏菌携带可表达siRNA－Stat3，GRIM19可运载效应质粒到达深部肿瘤并可起到显著抑制肿瘤生长和转移的作用，并且能够明显延长小鼠的生存时间。
文档编号A61P35/00GK1974759SQ20061001704
公开日2007年6月6日 申请日期2006年7月26日 优先权日2006年7月26日
发明者张灵, 赵雪俭, 徐德启, 高丽芳 申请人:吉林大学