新型流行性感冒疫苗的制备方法

专利名称：：新型流行性感冒疫苗的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种于动物细胞内繁殖流行性感冒病毒的方法，以及由此方法制备的新型流行性感冒灭活疫苗。特别是公开了一种在动物细胞内繁殖流行性感冒病毒的方法，将流行性感冒病毒接种Vero细胞，培养、收获病毒液，经灭活、纯化制备单价原液。本发明属于疫苗制备工艺
技术领域：
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背景技术：
：流行性感冒，简称流感，是由流行性感冒病毒，简称流感病毒，引起的急性呼吸道传染病，临床表现为发热、头痛、肌痛、乏力、鼻炎、咽痛和咳嗽，可有肠胃不适。流感能加重潜在的疾病，如心肺疾患，或者引起继发细菌性肺炎或原发流感病毒性肺炎，老年人以及患有各种慢性病或者体质虚弱者患流感后容易出现严重并发症。流感病毒传播迅速、流行广泛，抗原易变异，人群的特异性免疫状况不稳定。流感病毒属正粘液病毒科,根据其各自核壳内抗原差异分为甲型、乙型和丙型三种病毒。其中甲型和乙型流感对人类威胁较大。流感流行具有一定的季节性.，我国北方地区的流行一般均发生在冬季，南方四季都有病例发生，发病高峰在夏季和冬季。甲型流感病毒在动物，包括猪、马和各种禽类以及人类中均有发现。虽然出现少数例外，但人类一般感染Hl、H2或H3和Nl或N2亚型病毒。动物亚型的流感病毒偶尔直接引起人类流感。虽然此类病毒感染人类机率不高,但病死率很高。虽然乙型流感病毒大多与低发病率和轻型流感有关，但偶尔也可引起与甲型流感病毒一样严重的流行。乙型流感病毒只感染人类，主要是儿童期的病原体。乙型流感病毒的抗原性变异程度不如甲型流感病毒。流感病毒由呼吸道分泌物传播给易感人群，主要因子是由感染者打喷嚏、咳嗽或甚至交谈产生的小颗粒气溶胶。流感是由一种极易突变的病毒引起的高传染性疾病。据WHO估计，在爆发性流行时，它可在全世界迅速传播，影响总人口的10%至20%。即使在非爆发性流行的年份，流感每年也造成300万至500万严重病例和25万至50万例死亡。上世纪发生了4次流感大流行，1918年，世界流感大流行由猪型(H1N1)流感病毒引起，被公认为人类历史上损失最严重的事件，病死率比普通的流感增加了10倍，夺去了超过4000万人的生命，死亡者主要是L5-35岁的青壮年，此次流感大流行过后，美国人的预期寿命由原来的51岁降到了39岁，足足减少了12岁。1957年2月首发于我国贵州西部的流感是由H2N2亚型流感病毒引起的，在随后短短8个月时间内席巻全球，全球发病率在15-30%，死亡人数达100万；1968年7月中旬爆发的流感是由H3N2亚型流感病毒引起的，首发于我国香港特区，年底殃及全球，在全球至少夺去了70万人的生命；1977年5月首发于我国东北地区的流感是由H1N1亚型流感病毒引起的，一年后波及全球，H1N1亚型毒株的重现，造成人流感流行史上罕见的在人群中同时流行着两个亚型(H1N1和H3N2)毒株的局面。目前唯一可行的流感预防措施是疫苗接种。流感疫苗使用以来己有50多年的历史，国内外普遍使用的是流感灭活疫苗,系将流感病毒在鸡胚中培养后经甲醛或卩丙内酯灭活制成。当前的疫苗共有3种类型①全病毒疫苗，由完整的流感病毒颗粒组成，含有表面抗原和内部抗原,具有良好的免疫原性,但反应原性也较强。病毒包膜中的类脂质属致热原，常引起发热反应。②裂解病毒疫苗，系将流感病毒用裂解剂裂解，纯化后制成。该疫苗去除了病毒核酸和大分子蛋白，但保留HA和NA蛋白以及部分基质M蛋白和核蛋白(NP)，与全病毒疫苗相比，免疫原性和安全性均较好，目前在国内外广泛使用。③亚单位疫苗，流感病毒经裂解和进一步纯化后制备的仅含HA和NA蛋白的疫苗,具有安全有效和不良反应少的特点。后两种疫苗可用于儿童。采用鸡胚培养技术生产流感疫苗安全、有效，而且涉及的病毒安全性问题少，但也存在着一定的局限性，如生产过程中细菌污染(内毒素)的问题、有待开发高生长毒株、残留卵清蛋白问题(对鸡蛋过敏者不适用)、潜在的新的禽类外源因子污染问题以及生产规模小、生产时间长、在流感大流行的情况下很难在短时间内购置生产新疫苗所需的数百万只鸡蛋等。因此，许多疫苗生产商都在研究细胞培养法，细胞培养疫苗使人们能够对一年中任何时间发生的流行病或大流行均作出快速应答，并能避免污染的鸡胚(可能影响生物负荷和疫苗内毒素含量)的危险。而且在哺乳动物细胞中生长的流感病毒比鸡胚培养分离的病毒更接近于临床样本中的病毒，因此可能生产出更有效的疫苗。
发明内容本发明提供了一种新型流行性感冒疫苗的制备方法，以解决目前存在的以鸡胚为培养基质制造流感疫苗的安全性、培养基质来源等问题。将流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型分别按1:10"1:10々单独接种于含如下成分病毒培养液的已长至单层的Vem细胞:MEM培养液；0.011%牛血清白蛋白；2ng/ml20pg/ml胰蛋白酶或TPCK处理的胰蛋白酶；使用HEPES或5%8%碳酸氢钠溶液调整溶液pH值至7.08.0;20吗/ml50(Hig/ml的新霉素。于33。C35'C条件下培养至细胞病变0^￡)达到++++++++时，收获含流行性感冒病毒的病毒液，病毒液以1:10001:10000甲醛溶液或l:1000l:10000卩-丙内酯灭活；采用DEAEStreamline和/或DEAES印haroseFF和/或Sepharose4FF层析方法进行纯化，获得病毒原液；层析条件DEAEStreamline和/或DEAESepharoseFF的基础缓冲液pH6.8-8.0、0.001-0.2Moi/lPBS缓冲液或Tris缓冲液，洗脱用氯化钠浓度为0.01-lMol/l;S印harose4FF洗脱缓冲液为pH6.8-8.0、0.001-0.2Mol/lPBS缓冲液、含0.1-0.15Mo1/1氯化钠；用SRID法检测病毒抗原含量，标准抗原及标准抗血清由NIBSC提供，调节原液的抗原含量，制备流行性感冒病毒Al、A3.亚型及B型单价或三价混合半成品；将半成品进行分装，检定合格后即为成品流行性感冒疫苗。本发明的优点是本发明提供了一种用哺乳动物细胞生产流行性感冒疫苗的生产工艺方法，和按照此方法生产的产品，该产品动物免疫原性试验结果表明15微克血凝素可使所有的实验动物血清阳转,HI抗体滴度均在1:40以上。具体实施方式实施例11)分别将流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型经病毒培养液稀释后以1:10'4单独接种已长至单层的Vero细胞，于35。C条件下培养至细胞病变(€￡)达至1》+++++++时，分别收获含流行性感冒病毒的病毒液；其中病毒培养液的成份是MEM培养液；1%牛血清白蛋白；5ng/ml胰蛋白酶；使用HEPES调整溶液pH值至7.0;200pg/ml的新霉素。2)将O中收获的病毒液中的流行性感冒病毒以1:1000甲醛溶液灭活，已灭活的病毒抗原采用层析方法进行分别纯化，采用DEAEStreamlin层析方法进行纯化，层析条件DEAEStreamline基础缓冲液pH6.8、0.01Mol/LPBS缓冲液，洗脱用氯化钠浓度为0.01Mol/L;获得病毒原液；3)用SRID法检测各病毒原液的抗原含量；4)分别调节流行性感冒病毒Al、A3亚型及B型病毒原液的抗原含量，制备流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型单价灭活疫苗半成品；将半成品进行分装，检定合格后即为成品流行性感冒灭活疫苗。实施例21)分别将流行性感冒病毒Al、A3亚型及B型经病毒培养液稀释后以1:10^单独接种已长至单层的Vero细胞，于33。C条件下培养至细胞病变^￡)达到+++++++十时，分别收获含流行性感冒病毒的病毒液；其中病毒培养液的成份是MEM培养液；0.01%牛血清白蛋白；2(Hig/ml胰蛋白酶；使用5%碳酸氢钠溶液调整溶液pH值至7.5;20pg/ml的新霉素。2)将1)中收获的病毒液中的流行性感冒病毒以1:1000P-丙内酯溶液灭活，已灭活的病毒抗原采用层析方法进行分别纯化，釆用DEAESepharoseFF层析方法进行纯化，层析条件DEAESepharoseFF的基础缓冲液pH8.0、0.2Mol/LTris缓冲液，洗脱用氯化钠浓度为1Moi/L;获得病毒原液；，3)用SRID法检测各病毒原液的抗原含量；4)分别调节流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型病毒原液的抗原含量，制备流行性感冒病毒Al、A3亚型及B型单价灭活疫苗半成品；将半成品进行分装，检定合格后即为成品流行性感冒灭活疫苗。实施例31)分别将流行性感冒病毒Al、A3亚型及B型经病毒培养液稀释后以1:10"单独接种已长至单层的Vero细胞，于34^条件下培养至细胞病变(€￡)达到++++++++时，分别收获含流行性感冒病毒的病毒液；其中病毒培养液的成份是-MEM培养液；0.1%牛血清白蛋白；2pg/ml胰蛋白酶；使用6%碳酸氢钠溶液调整溶液pH值至8.0;500pg/ml的新霉素。2)将1)中收获的病毒液中的流行性感冒病毒以1:10000甲醛溶液灭活，已灭活的病毒抗原采用层析方法进行分别纯化，采用Sepharose4FF层析方法进行纯化，层析条件Sepharose4FF洗脱缓冲液为pH7.5、0.1Mol/LPBS缓冲液、含0.1Mol/L氯化钠；获得病毒原液；3)用SRID法检测各病毒原液的抗原含量；4)分别调节流行性感冒病毒Al、A3亚型及B型病毒原液的抗原含量，制备流行性感冒病毒Al、A3亚型及B型单价灭活疫苗半成品；将半成品进行分装，检定合格后即为成品流行性感冒灭活疫苗。实施例41)分别将流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型经病毒培养液稀释后以1:10_4单独接种已长至单层的Vero细胞，于35。C条件下培养至细胞病变(0￡)达到++++++++时，分别收获含流行性感冒病毒的病毒液；其中病毒培养液的成份是MEM培养液；1%牛血清白蛋白；5ng/mlTPCK处理的胰蛋白酶；使用HEPES调整溶液pH值至7.0;200ng/ml的新霉素。2)将1)中收获的病毒液中的流行性感冒病毒以1:5000甲醛溶液灭活，已灭活的病毒抗原采用层析方法进行分别纯化，釆用DEAEStreamlin层析方法进行纯化，层析条件DEAEStreamline基础缓冲液pH7.5、0.1Mol/LPBS缓冲液，洗脱用氯化钠浓度为0.05Mol/L;获得病毒原液；3)用SRID法检测各病毒原液的抗原含量；4)调节原液的抗原含量，混合流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型病毒原液，制备三价流行性感冒灭活疫苗半成品，其中A1、A3亚型及B型的比例为1:1:1。将半成品进行分装，检定合格后即为成品流行性感冒灭活疫苗。实施例51)分别将流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型经病毒培养液稀释后以1:10—7单独接种已长至单层的Vero细胞，于33'C条件下培养至细胞病变^￡)达到++++++++时，分别收获含流行性感冒病毒的病毒液；其中病毒培养液的成份是MEM培养液；0.01%牛血清白蛋白；20ng/ml胰蛋白酶；使用8%碳酸氢钠溶液调整溶液pH值至7.5;20ng/ml的新霉素。.2)将1)中收获的病毒液中的流行性感冒病毒以1:5000e-丙内酯溶液灭活，已灭活的病毒抗原采用层析方法进行分别纯化，采用DEAES印haroseFF层析方法进行纯化，层析条件DEAESepharoseFF的基础缓冲液pH6.8、0.01Mol/LTris缓冲液，洗脱用氯化钠浓度为0.05Mol/L;获得病毒原液；3)用SRID法检测各病毒原液的抗原含量；4)调节原液的抗原含量，混合流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型病毒原液，制备三价流行性感冒灭活疫苗半成品，其中A1、A3亚型及B型的比例为1:1:1。将半成品进行分装，检定合格后即为成品流行性感冒灭活疫苗。实施例61)分别将流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型经病毒培养液稀释后以1:10"单独接种己长至单层的Vero细胞，于34"C条件下培养至细胞病变(0￡)达到++++++++时，分别收获含流行性感冒病毒的病毒液；其中病毒培养液的成份是MEM培养液；，0.1%牛血清白蛋白；1(Hig/ml胰蛋白酶；使用7%碳酸氢钠溶液调整溶液pH值至7.5;200pg/ml的新霉素。2)将1)中收获的病毒液中的流行性感冒病毒以1:10000P-丙内酯溶液灭活，已灭活的病毒抗原采用层析方法进行分别纯化，采用Sepharose4FF层析方法进行纯化，层析条件S印harose4FF洗脱缓冲液为pH6.8、0.001Mol/LPBS缓冲液、含0.15Mol/L氯化钠；获得病毒原液；3)用SRID法检测各病毒原液的抗原含量；4)调节原液的抗原含量，混合流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型病毒原液，制备三价流行性感冒灭活疫苗半成品，其中A1、A3亚型及B型的比例为1:1:1。将半成品进行分装，检定合格后即为成品流行性感冒灭活疫苗。实施例7采用DEAEStreamlin层析方法进行纯化，层析条件DEAEStreamline基础缓冲液pH8.0、0.2Mol/LPBS缓冲液，洗脱用氯化钠浓度为IMol/L;其余同实施例1。实施例8采用DEAES印haroseFF层析方法进行纯化，层析条件DEAESepharoseFF的基础缓冲液pH7.5、0.1Mol/LTris缓冲液，洗脱用氯化钠浓度为0.05Mol/L;其余同实施例2。实施例9采用S印harose4FF层析方法进行纯化，层析条件Sepharose4FF洗脱缓冲液为pH8.0、0.2Mol/LPBS缓冲液、含0.12Mol/L氯化钠；其余同实施例3。实验例1流行性感冒灭活疫苗的动物免疫原性试验方法分别取流感病毒Al、A3亚型及B型疫苗原液，用稀释液按血凝素含量30^ig/ml稀释至所需液量，每组接种10只11-13g小白鼠，颈背部皮下注射0.5ml/只。分别抽取免疫前和免疫后21天血，分离血清，测定血清中血抑抗体。流行性感冒灭活疫苗的动物免疫原性试验结果见下表-<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实验例2流行性感冒灭活疫苗血凝素含量测定单向免疫扩散法测流行性感冒灭活疫苗成品的血凝素含量每剂疫苗各(亚)型血凝素含量分别为Al亚型36ng/ml、A3亚型34ng/ml、B型31吗/ml。权利要求1、一种新型流行性感冒疫苗的制备方法，其特征在于包括下列步骤1)分别将流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型经病毒培养液稀释后以1∶10-1～1∶10-7单独接种已长至单层的哺乳动物细胞，于33℃～35℃条件下培养至细胞病变(CPE)达到+++～+++++时，分别收获含流行性感冒病毒的病毒液；2)将1)中收获的病毒液中的流行性感冒病毒灭活，已灭活的病毒抗原采用层析方法进行分别纯化，获得各病毒原液；3)检测各病毒原液的抗原含量；4)分别调节流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型病毒原液的抗原含量，制备流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型单价灭活疫苗半成品；或调节各原液的抗原含量，混合流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型病毒原液，制备三价流行性感冒灭活疫苗半成品。2、根据权利要求1所述的新型流行性感冒疫苗的制备方法，其哺乳动物细胞是Vero细胞。3、根据权利要求1所述的新型流行性感冒疫苗的制备方法，其特征在于流行性感冒病毒感染动物细胞的条件是在病毒培养液中感染细胞，该病毒培养液的成份是MEM培养液；0.011%牛血清白蛋白；2ng/ml20吗/ml胰蛋白酶或TPCK处理的胰蛋白酶；使用HEPES或5%8%碳酸氢钠溶液调整溶液pH值至7.08.0;20μg/ml500μg/ml的新霉素。4、根据权利要求1所述的新型流行性感冒疫苗的制备方法，其特征在于灭活病毒所用试剂包括1:10001:10000甲醛溶液或l:1000l:10000β-丙内酯。5、根据权利要求1所述的新型流行性感冒疫苗的制备方法，其特征在于提纯病毒用层析介质包括DEAEStreamline,DEAESepharoseFF,或Sepharose4FF。6、根据权利要求5所述的新型流行性感冒疫苗的制备方法，其特征在于层析条件是DEAEStreamline和/或DEAES印haroseFF的基础缓冲液pH6.8-8.0、0.01-0,2Mol/LPBS缓冲液或Tris缓冲液，洗脱用氯化钠浓度为0.01-lMol/L;Sepharose4FF洗脱缓冲液为pH6.8-8.0、0.001-0.2Mol/LPBS缓冲液、含0.1-0.15Mol/L氯化钠。全文摘要本发明涉及一种新型流行性感冒疫苗的制备方法，属于疫苗制备工艺
技术领域：
。包括分别将流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型经病毒培养液稀释后以1∶10^-1～1∶10^-7单独接种已长至单层的哺乳动物细胞，收获含流行性感冒病毒的病毒液；灭活、纯化，获得各病毒原液；检测各病毒原液的抗原含量；分别调节流行性感冒病毒A1、A3亚型及B型病毒原液的抗原含量，制备疫苗。优点是用哺乳动物细胞生产流行性感冒疫苗，该产品动物免疫原性试验结果表明15微克血凝素可使所有的实验动物血清阳转，HI抗体滴度均在1∶40以上。文档编号A61K39/145GK101168055SQ20061001727公开日2008年4月30日申请日期2006年10月27日优先权日2006年10月27日发明者张凤羽,徐艳君,朱昌林,沈艳杰,鹏葛,达马申请人:长春百克生物科技有限公司