专利名称：红车轴草提取物的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种植物提取物，特指采用新鲜状态原料制备红车轴草提取物的工艺方法。
背景技术：
红车轴草(Trifolium pratense L.)是豆科车轴草属多年生草本植物，又名红三叶草，红花苜蓿，原产小亚细亚与东南欧，广泛分布于温带及亚热带地区，我国新疆、云南、贵州有野生种，近年来在长江流域以南方各省均有种植。红车轴草原本是优良的牲畜牧草，近期研究结果表明，其花序及带花枝叶中含有大量异黄酮类物质，红车轴草异黄酮的双羟基酚式结构与动物体内雌激素的结构类似，因此具有雌激素样作用。异黄酮在机体内源性雌激素水平较低时表现为雌激素激动剂的作用；而当体内雌激素水平偏高时，它占据雌激素受体表现为抗雌激素作用。对预防乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、改善骨质疏松和改善妇女更年期症状有一定作用。在欧洲天然药物市场上，红车轴草制剂已成为一种出色的妇女保健用药，是最畅销的植物类制剂之一.以红车轴草提取物为主要成分的保健食品也在欧洲和美国热销。
目前国内对红车轴草的研究才起步不久，特别在红车轴草异黄酮高纯度提取物的工业生产上存在技术瓶颈，不利于红车轴草产品的深度开发。在一般的提取工艺中主要使用的原料状态是将从开花到花调谢时期红车轴草采收后晒干或阴干。但发明人发现上述状态下的红车轴草的干品其有效成份的含量不高，对后续的异黄酮精制影响较大。另外，一般工艺对原料的采收季节没有要求，怎样可使红车轴草原料中的有效成分得到最大限度的保留也没有人作出相关研究。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种红车轴草提取物的制备方法，能充分利用红车轴草次生代谢过程中其异黄酮高水平积累的生长时期和提高原料的有效成分的提取率，有利于后期的异黄酮高纯度制备以及提高产品得率，降低成本。
本发明是通过下述方式实现的本发明采用新鲜状态的红车轴草的地上部分，醇提取，经溶剂回收、提取液浓缩，静置得上清液和沉淀物(A)，A经干燥即为红车轴草提取物。
所述的上清液可经大孔树脂吸附，乙醇洗脱、洗脱液浓缩后，静置得稠膏沉淀物(B)。B干燥后即为红车轴草提取物；A与B也可以混合成为红车轴草提取物。
所述的醇提取为75-95％乙醇或甲醇提取。
本发明的原料采用的是新鲜状态的红车轴草的地上部分进行醇提之前，还可进行冷榨得榨汁液及原料渣；得到的原料渣再进行醇提，醇溶剂回收，提取液浓缩，静置，得沉淀物，沉淀物干燥后即为红车轴草提取物。
所述的榨汁是用重量比1～2∶1的水与新鲜红车轴草混合冷榨。
而得到的榨汁液经大孔树脂吸附，然后用乙醇洗脱，得洗脱液，洗脱液浓缩后，静置分离得稠膏沉淀物，沉淀物干燥后即为红车轴草提取物。
所述的原料渣以75-95％的乙醇或甲醇回流提取2次，每次1～4小时。
以上所述的沉淀物干燥后为总异黄酮含量为8-20％的红车轴草提取物，再用乙酸乙酯或乙酸乙酯及甲醇精制可得到总异黄酮含量在20-90％的红车轴草的提取物。
本发明的原料采用的是新鲜状态的，处于苗期、花蕾期、开花期、花谢期红车轴草的地上部分。
发明人发现原料采用新鲜状态的处于花蕾期的红车轴草的地上部分，可使产品获得最佳得率。
本发明制得的红车轴草提取物不同的含量规格的性状分别为黄绿色至深绿色粉末，气香，味苦。
本发明解决了在工业化大生产中难以大量得到高纯度低成本提取红车轴草异黄酮产品的问题，并实现了最大限度的从新鲜的红车轴草原料药材中提取出有效物质异黄酮。节约了生产成本，为红车轴草产品的深度开发提供基础支持。
本发明的整个工艺简单，有效成分可以得到最大程度的保留。本发明采用原料状态是新鲜植物作为红车轴草异黄酮提取工艺的原料；在一般所用的晒干或阴干的植材中异黄酮含量只在0.1～0.5％范围内，而发明人通过实验研究发现新鲜的花前期红车轴草其异黄酮含量可达到0.8～1.5％，可见两者差距十分明显，因为原有的原料在日常干燥过程中造成红草轴草的有效成分的丧失，另外发明人还研究发现红车轴草生物次生代谢产物异黄酮的积累综合水平在花蕾期是最高的。因而发明人采用新鲜的红车轴草的地上部分进行提取，尤其是花蕾期的原料为最佳。本发明由于采用了新鲜的红车轴草原料制成的提取物有效成分异黄酮的收得率大大高于由干品制成的提取物，降低了成本，并有利于后续工序的提纯。本发明其相关研究还未见有关报道。
在红车轴草的原料考察中，发明人发现新鲜植物中异黄酮的含量(折干计)比干燥后的植物高出许多。具体数据见下表。
由上表可以看出无论红车轴草植物处于哪一个生长时期，其新鲜品的含量均高于干燥品的含量。然而在以前的工业化生产中从未使用过新鲜的红车轴草作为原料。因为使用原料中异黄酮含量高，无疑就大大降低了其最终产品的制造成本。
发明人通过对新鲜药材的整个生长周期的考察，为到一个有效生物总量最高的时期，以达到降低工业化生产成本，增加产品利润的目的。结果发现花蕾期的红车轴草的新鲜药材为最佳原料状态方式。(见图)
附图红车轴草的单位面积生物总量随生长期的变化趋势图。
附图描述的是单位面积红车轴草植物中含有的异黄酮总量，与红车轴草生长周期相关性的曲线图，曲线主要五个点组成小苗期时单位面积红车轴草异黄酮总量为6.75千克；盛长期时单位面积红车轴草异黄酮总量为11.55千克；花蕾期时单位面积红车轴草异黄酮总量为12.00千克；花期时单位面积红车轴草异黄酮总量为10.5千克；凋谢期时单位面积红车轴草异黄酮总量为8.25千克。从整个曲线图可以看出处在花蕾期的红车轴草是单位面积内生物异黄酮总量最高的时期。生物总异黄酮量＝生物总量×红车轴草总异黄酮含量(折干计)，生物总量是指单位面积的红车轴草产量(折干计)。
具体实施例方式
实施例1选取新鲜状态的、无黄萎、无腐坏、处于花蕾期的红车轴草植株的地上部分，切碎后，用鲜药材重量2倍的80％的乙醇一起回流提取2次，每次2小时。合并提取液，回收、浓缩、冷却、静置分离得沉淀物，将沉淀物干燥得总异黄酮含量17％的红车轴草提取物。
实施例2选取新鲜状态的、无黄萎、无腐坏、处于花蕾期的红车轴草植株的地上部分，切碎后，用鲜药材重量2倍的90％的乙醇一起回流提取2次，每次2小时。合并提取液，浓缩、冷却、静置分离得沉淀物，将沉淀物干燥得总异黄酮含量20％的红车轴草提取物。
实施例3选取新鲜状态的、无黄萎、无腐坏、处于花蕾期的红车轴草植株的地上部分，切碎后，用鲜药材重量2倍的95％的乙醇一起回流提取2次，每次2小时。合并提取液，浓缩、冷却、静置分离得沉淀物，将沉淀物干燥得总异黄酮含量22.4％的红车轴草提取物。
实施例4选取新鲜状态的、无黄萎、无腐坏、处于花蕾期的红车轴草植株的地上部分，切碎后，用鲜药材重量2倍的80％的甲醇一起回流提取2次，每次2小时。合并提取液，浓缩、冷却、静置分离得沉淀物，将沉淀物干燥得总异黄酮含量18％的红车轴草提取物。
实施例5选取新鲜状态的、无黄萎、无腐坏、处于花蕾期的红车轴草植株的地上部分，切碎后，用鲜药材重量2倍的90％的甲醇一起回流提取2次，每次2小时。合并提取液，浓缩、冷却、静置分离得沉淀物，将沉淀物干燥得总异黄酮含量22.5％的红车轴草提取物。
实施例6选取新鲜状态的、无黄萎、无腐坏、处于花蕾期的红车轴草植株的地上部分，切碎后，用鲜药材重量2倍的95％的甲醇一起回流提取2次，每次2小时。合并提取液，浓缩、冷却、静置分离得沉淀物，将沉淀物干燥得总异黄酮含量24％的红车轴草提取物。
实施例7将实施例2得到的总异黄酮含量20％的红车轴草提取物经乙酸乙酯提取2次，浓缩后将析出物过滤干燥即得总异黄酮含量55％的红车轴草提取物。
实施例8将实施例7得到的总异黄酮含量55％的红车轴草提取物用乙酸乙酯冷浸三次，每次搅拌20分钟，弃去乙酸乙酯部分，固形物干燥后，得总异黄酮含量73％的异黄酮提取物。
实施例9将实施例8得到的总异黄酮含量73％的红车轴草提取物用5倍量甲醇热回流提取2次，每次15分钟，冷却后过滤，滤饼再用甲醇回流提取3次，每次2小时，趁热过滤，滤液冷却析晶，将晶体干燥后即得到总异黄酮含量95％的红车轴草提取物。
实施例10选取新鲜状态的、无黄萎、无腐坏、处于幼苗期的红车轴草植株的地上部分，切碎后，用鲜药材重量2倍的90％的乙醇一起回流提取2次，每次2小时。合并提取液，回收、浓缩、冷却、静置分离得沉淀物，将沉淀物干燥得总异黄酮含量19％的红车轴草提取物。
实施例11选取新鲜状态的、无黄萎、无腐坏、处于花开期的红车轴草植株的地上部分，切碎后，用鲜药材重量2倍的90％的乙醇一起回流提取2次，每次2小时。合并提取液，回收、浓缩、冷却、静置分离得沉淀物，将沉淀物干燥得总异黄酮含量15％的红车轴草提取物。
实施例12选取新鲜状态的、无黄萎、无腐坏、处于花谢期的红车轴草植株的地上部分，切碎后，用鲜药材重量2倍的90％的乙醇一起回流提取2次，每次2小时。合并提取液，回收、浓缩、冷却、静置分离得沉淀物，将沉淀物干燥得总异黄酮含量13％的红车轴草提取物。
实施例13将实施例10得到的总异黄酮含量19％红车轴草提取物用乙酸乙酯回流3次、回收、冷却、析晶、沉淀，将析出物干燥后得总异黄酮含量为72％的红车轴草提取物。
实施例14将实施例13得到的总异黄酮含量72％红车轴草提取物用4倍量甲醇溶解，用热回流2次，每次15分钟，冷却后过滤，滤饼再用甲醇回流提取3次，每次2小时，趁热过滤，滤液冷却后析晶，将晶体干燥后得总异黄酮含量为90％的红车轴草提取物。
实施例15选取新鲜状态的、无黄萎、无腐坏、处于花蕾期的红车轴草植株的地上部分。用重量比为2倍量的水与新鲜植物投入榨汁机。榨汁后压滤分离得到榨汁液与原料渣。
实施例16将实施例15得到的原料渣部分以80％的乙醇，回流提取2次，每次2小时。将提取液减压浓缩回收到基本无醇味，冷却、静置24小时，分离得到粘稠状沉淀物干燥后即得含总异黄酮18％的提取物。再将此18％红车轴草提取物用乙酸乙酯回流精制得到异黄酮含量为51％的红车轴草提取物。
榨汁液通过大孔树脂吸附后，先以10％的乙醇洗脱3倍柱体积(另置)，再以80％的乙醇洗脱3倍柱体积，并将洗脱液回收、浓缩，干燥后即得总异黄酮含量为24％的红车轴草提取物。将此提取物用乙酸乙酯回流两次，得到总异黄酮含量67％的红车轴草提取物。
实施例17
将实施例15得到的原料渣部分以90％的乙醇，回流提取2次，每次2小时。将提取液减压浓缩回收到基本无醇味，冷却、静置12小时，得到粘稠状沉淀物。沉淀物以乙酸乙酯回流精制得到异黄酮含量为55％的红车轴草提取物。
实施例18将实施例15得到的原料渣部分以95％的乙醇，回流提取2次，每次2小时。将提取液减压浓缩回收到基本无醇味，冷却、静置12小时，得到粘稠状沉淀物。沉淀物以乙酸乙酯回流精制得到异黄酮含量为58％的红车轴草提取物。
实施例19将实施例15得到的原料渣部分以90％的甲醇，回流提取2次，每次2小时。将提取液减压浓缩回收到基本无醇味，冷却、静置12小时，得到粘稠状沉淀物。沉淀物以乙酸乙酯回流精制得到异黄酮含量为53％的红车轴草提取物。
实施例20将实施例15得到的榨汁液通过大孔树脂吸附后，先以10％的乙醇洗脱3倍柱体积(另置)，再以80％的乙醇洗脱3倍柱体积，并将洗脱液回收、浓缩，干燥后即得总异黄酮含量为24％的红车轴草提取物。将此提取物用乙酸乙酯回流两次，得到总异黄酮含量67％的红车轴草提取物。
实施例21选取新鲜状态的、无黄萎、无腐坏、处于幼苗期的红车轴草植株的地上部分。用重量比为1倍量的水与新鲜植物投入榨汁机。榨汁后压滤得到榨汁液与原料渣。
将原料渣部分以90％的乙醇，回流提取2次，每次2小时。将提取液减压浓缩回收到基本无醇味，冷却、静置12小时，得到粘稠状沉淀物。沉淀物以乙酸乙酯回流精制得到异黄酮含量为56％的红车轴草提取物。
榨汁液通过大孔树脂吸附后，先以10％的乙醇洗脱3倍柱体积(另置)，再以90％的乙醇洗脱3倍柱体积，并将洗脱液回收、浓缩，干燥后即得总异黄酮含量为24％的红车轴草提取物。将此提取物用乙酸乙酯回流两次，得到总异黄酮含量67％的红车轴草提取物。
实施例22选取新鲜状态的、无黄萎、无腐坏、处于花开期的红车轴草植株的地上部分。用重量比为2倍量的水与新鲜植物投入榨汁机。榨汁压滤得到榨汁液与原料渣。
将原料渣部分以90％的乙醇，回流提取2次，每次2小时。将提取液减压浓缩回收到基本无醇味，冷却、静置12小时，得到粘稠状沉淀物。沉淀物以乙酸乙酯回流精制得到异黄酮含量为59％的红车轴草提取物。
榨汁液通过大孔树脂吸附后，先以10％的乙醇洗脱3倍柱体积(另置)，再以90％的乙醇洗脱3倍柱体积，并将洗脱液回收、浓缩，干燥后即得总异黄酮含量为24％的红车轴草提取物。将此提取物用乙酸乙酯回流两次，得到总异黄酮含量67％的红车轴草提取物。
实施例23选取新鲜状态的、无黄萎、无腐坏、处于花谢期的红车轴草植株的地上部分。用重量比为2倍量的水与新鲜植物投入榨汁机。榨汁后用缸压滤法分离得到榨汁液与原料渣。
将原料渣部分以90％的乙醇，回流提取2次，每次2小时。将提取液减压浓缩回收到基本无醇味，冷却、静置12小时，得到粘稠状沉淀物。沉淀物以乙酸乙酯回流精制得到异黄酮含量为57％的红车轴草提取物。
榨汁液通过大孔树脂吸附后，先以10％的乙醇洗脱3倍柱体积(另置)，再以90％的乙醇洗脱3倍柱体积，并将洗脱液回收、浓缩，干燥后即得总异黄酮含量为24％的红车轴草提取物。将此提取物用乙酸乙酯回流两次，得到总异黄酮含量67％的红车轴草提取物。
权利要求
1.红车轴草提取物的制备方法，原料采用的是新鲜状态的红车轴草的地上部分，经醇提取，醇溶剂回收，提取液浓缩、静置，得到的沉淀物干燥后即为红车轴草提取物。
2.根据权利要求1所述的红车轴草提取物的制备方法，原料采用的是新鲜状态的红车轴草的地上部分，经冷榨得榨汁液及原料渣，原料渣经醇提取，醇溶剂回收，提取液浓缩，静置，得到沉淀物干燥后即为红车轴草的提取物。
3.根据权利要求1或2所述的红车轴草提取物的制备方法，原料采用的是新鲜状态的，处于苗期、花蕾期、开花期、花谢期红车轴草的地上部分。
4.根据权利要求3所述的红车轴草提取物的制备方法，原料采用的处于花蕾期新鲜状态的红车轴草地上部分原料。
5.根据权利要求1或2所述的红车轴草提取物的制备方法，沉淀物干燥后为总异黄酮含量为8-20％的红车轴草提取物，再用乙酸乙酯或及甲醇精制得总异黄酮含量在20-90％的红车轴草的提取物。
6.根据权利要求1所述的任一项红车轴草提取物的制备方法，原料采用的是新鲜状态的红车轴草的地上部分，用75-95％乙醇或甲醇提取，经溶剂回收、提取液浓缩，静置得上清液和沉淀物；上清液经大孔树脂吸附，乙醇洗脱、洗脱液浓缩后，冷却静置得稠膏沉淀物，干燥后即为红车轴草提取物。
7.根据权利要求2所述的任一项红车轴草提取物的制备方法，所述的榨汁是用重量比1～2∶1的水与新鲜红车轴草混合冷榨。
8.根据权利要求2或7所述的红车轴草提取物的制备方法，榨汁液经大孔树脂吸附后以乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，冷却静置得稠膏沉淀物，经干燥后即为红车轴草提取物。
9.根据权利要求8所述的红车轴草提取物的制备方法，所述的稠膏沉淀物经干燥再经乙酸乙酯或乙酸乙酯及甲醇精制得含量为20-90％的红车轴草提取物。
10.根据权利要求2所述的红车轴草提取物的制备方法，所述的原料渣以75-95％乙醇或甲醇的回流提取2次，每次1～4小时。
全文摘要
红车轴草提取物的制备方法，原料采用的是新鲜状态的红车轴草的地上部分，经醇提取，醇溶剂回收，提取液浓缩、静置，得到的沉淀物干燥后即为红车轴草提取物。采用新鲜状态的红车轴草的地上部分进行醇提之前，还可以经冷榨得榨汁液及原料渣，原料渣再进行醇提。本发明由于采用了新鲜状态的红车轴草原料制成的提取物有效成分异黄酮的含量高于由干品制成的提取物，可大大节约制造成本，有利于后续工序的提纯。
文档编号A61P35/00GK1981799SQ20061003171
公开日2007年6月20日 申请日期2006年5月25日 优先权日2006年5月25日
发明者曾建国, 缪建荣, 罗琪, 罗练辉 申请人:湖南省中药提取工程研究中心有限公司