可提供活性甲基或参与甲基转移的化合物作为制备治疗病毒性疾病的药的应用的制作方法

专利名称：：可提供活性甲基或参与甲基转移的化合物作为制备治疗病毒性疾病的药的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一类可提供活性曱基或参与甲基转移的化合物的新用途'尤其是涉及此类化合物作为制备治疗病毒性疾病的药的应用。
背景技术：
：病毒感染引起的多种疾病，严重危害人类的健康和生命。迄今，全世界已发现使人类致病的病毒1200多种，数万种病毒亚型和变异抹。自二十世纪80年代以来，新发现的流行性传染病有三分之二是由病毒感染引起的，其中，发病率高，危害性大的病毒性疾病有A、B、C、D、E和G种肝炎病毒所致的急、慢性肝炎；8种人疱疹病毒引起的视网膜炎、角膜炎、间质性肺炎、脑炎、生殖器疱渗、带状疱渗和口唇部疱疹等；呼吸道病毒感染引发的支气管炎、肺炎、麻渗、腮腺炎和脊髓灰质炎等；肠道病毒所致的急性肠胃炎、旅行者和婴幼儿腹泻等；曱、乙型流感病毒常导致季节性全球或局部地区大流行；由多种病毒引起的肾综合征出血热、拉萨热、埃博拉出血热和登革热等死亡率很高。我国是病毒性肝炎高发区，约有1.2亿人携带乙型肝炎病毒。丙型肝炎也是一种常见的病毒性肝炎，在世界范围内广泛流行，是欧、美、日本等国家导致肝硬化和肝癌的最主要的病因，也是我国输血后肝炎的主要病因。我国人群中抗-HCV阳性率约为1%~3%,因此估计我国的抗-HCV阳性人群约有3千万。2002年末，SARS病毒开始蔓延。临床上急需有效的，特异性治疗策略和治疗新药。拉米夫定和干扰素是目前应用最多的抗病毒药物，主要用于乙肝和丙肝的治疗。干扰素或拉米夫定与其他药物(包括中草药)联合治疗慢性乙型肝炎的疗效尚需进一步证实。荟萃分析表明，HBeAg阳性患者经普通干扰素cc(普通IFNcc)治疗4~6个月后，治疗组和未治疗组HBVDNA转阴率(杂交法)分别为37%和17%,HBeAg转阴率分别为33%和12%,HBsAg转阴率分别为7.8°/。和1.8%。国内外随机对照临床试验表明，每日口服100mg拉米夫定(lamivudine)可明显抑制HBVDNA水平，HBeAg血清学转换率随治疗时间延长而提高，治疗1、2、3、4和5年后HBeAg血清转换率分别为16%、17%、23%、28%和35%。阿德福韦酯是5'-单磷酸脱氧阿糖腺苷的无环类似物。随机双盲安慰剂对照的临床试验表明，在HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，口服阿德福韦酯可明显抑制HBVDNA复制，应用1、2、3年时的HBVDNA转阴率(〈1000拷贝/ml)分别为28%、45%和56%,HBeAg血清学转换率分别为12%、29%和43%。尚有一半以上的HBeAg阳性的乙肝患者，现有药物治疗，HBeAg不能转阴，原因不清。丙肝感染是慢性肝病的主要致病因素。标准治疗为聚乙醇化cc-干扰素加利巴韦林，大约只对一半的病人有疗效，另一半失败的原因不清。因此，寻找对乙型肝炎和丙型肝炎更有效的治疗药物，是目前肝病研究领域的一大难点。对于其他病毒性疾病，也存在类似的问题，需要寻找更好的治疗药物。
发明内容本发明的目的在于提供一类可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物的新用途，即此类化合物作为制备治疗病毒性疾病的药的应用，此类化合物可明显增强机体和细胞综合抗病毒效果，尤其是明显增强已知抗病毒化合物对各类病毒的抑制效果。本发明所述的可提供活性甲基或参与甲基转移的化合物选自叶酸、维生素B12、维生素B6、维生素B2、胆碱、甜菜碱、丝氨酸和蛋氨酸的一种或一种以上的组合，优选为甜菜石成或者甜菜碱、叶酸、维生素B12三者合用。本发明所述的抗病毒化合物选自千扰素类化合物、核苦类似物化合物的一种或一种以上的组合。核苷类似物化合物包括阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿的福韦、安普那韦、阿扎那韦、地拉韦啶、去羟肌苷、依非韦伦、恩曲他滨、恩夫韦地、泛昔洛韦、更昔洛韦、印地那韦、拉米夫定、奈非那韦、奈维拉平、奥司他韦、喷昔洛韦、金刚乙胺、利托那韦、沙奎那韦、司他夫定、泰诺福韦、唯伐西洛韦、扎纳米韦、齐多夫定、膦甲酸钠，等。所述的病毒性疾病包括各型病毒性肝炎、乙型脑炎、流行性感冒和禽流行性感冒。本发明还提供了一种用于治疗病毒性疾病的组合物。本发明所述的一种用于治疗病毒性疾病的组合物，包括至少一种可提供活性曱基或参与甲基转移的化合物；以及至少一种抗病毒化合物。所述的可提供活性甲基或参与甲基转移的化合物选自叶酸、維生素B12、维生素B6、维生素B2、胆碱、甜菜碱、丝氨酸和蛋氨酸的一种或一种以上的组合，优选为甜菜碱或者甜菜碱、叶酸、维生素B12三者合用。所述的抗病毒化合物选自干扰素类化合物、核苷类似物化合物的一种或一种以上的组合。所述的病毒性疾病包括各型病毒性肝炎、乙型脑炎、流行性感冒和禽流行性感冒。本发明还纟是供了一种用于治疗病毒性疾病的药物组合物。本发明所述的一种用于治疗病毒性疾病的药物組合物'包括有效治疗剂量的至少一种可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物；有效治疗剂量的至少一种抗病毒化合物；以及药物学上可接受的载体。所述的可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物选自叶酸、維生素B12、维生素B6、维生素B2、胆碱、甜菜碱、丝氨酸和蛋氨酸的一种或一种以上的组合，优选为甜菜碱或者甜菜碱、叶酸、维生素B12三者合用。所述的抗病毒化合物选自干扰素类化合物，核苷类似物化合物的一种或一种以上组合。所述的病毒性疾病包括各型病毒性肝炎、乙型脑炎、流行性感冒和禽流行性感冒。所述的药物组合物配制成选自注射剂、粉针剂、胶囊剂、片剂、口服液，口服片、咀嚼片、吸入剂、透皮吸收剂之一的剂型。所述的药物组合物配制成选自注射剂、粉针剂、胶囊剂、片剂、口服液、咀嚼片之一的剂型。临床应用途径以口服为主，但也可同各种赋型剂做成口服、舌下含服、鼻内或各种注射给药或直肠或吸入或透皮方式给药，可做成实际应用中的各种剂型或方式进入人体。本发明通过各种动物模型及实验证明，可提供活性曱基或参与甲基转移的化合物能增强机体抗病毒能力，可明显增强机体和细胞综合抗病毒效果，尤其是明显增强已知抗病毒化合物对各种病毒的抑制效果。由于此类化合物来源方便、广泛，提取方法成熟，因此本发明提供了一系列价廉、高效的治疗病毒性疾病的药物。具体实施方式定义在具体描述本发明时，有必要对本文中所要用到的某些术语进行定义和解释，以利对本发明的理解。可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物是指一类与细胞内曱基化(Methylation)功能有关的元素总称，它们一般包括叶酸、维生素B12、维生素B6、維生素B2、胆碱、甜菜碱、丝氨酸和蛋氨酸等，它们均参与了细胞内一碳单位(曱基)的转移过程。活性曱基的主要生理功能是作为曱基化的来源和供体，体内曱基化过程就是将这些曱基小分子在体内相关曱基化酶的作用下，与相应的物质相联结，以发挥相应的生物学功能，如DNA曱基化在细胞分化、基因调控、抑制异常基因的表达以及癌症形成方面发挥作用。体内至少有37种甲基化酶和约有100余种物质可经曱基化改变其生物学活性'因此'曱基化在人体内具有十分重要的生理生物学意义。抗病毒化合物是指一类对病毒性疾病有治疗或预防性作用的化合物，这类化合物包括正在研究的、开发中的和市售的化合物。这类化合物包括但不限于千扰素类化合物、核苷类似物化合物等。此类化合物在本发明可以是一种或多种化合物组合使用，也可以是先后使用。实施例一、甜菜碱对CCLt损伤的大鼠急性肝损伤的影响本实施例利用CCU制作肝损伤小鼠模型，观察甜菜碱对小鼠肝损害的保护作用。1、材料与方法1.1健康雄性HIH小鼠32只，由中山大学医学院实验动物中心提供，体重18-20g,分笼饲养，标准饮食，自由饮水，在实验室饲养一周后用于实验。1.2随机分4组，空白对照组、四氯化碳(2.0ml/kg)模型组及高、低剂量甜菜碱组，每组8只。高、低两个剂量的甜菜碱组给药剂量分别600mg/kg和300mg/kg,灌胃给药，连续10天，CCU染毒24h后，摘取眼球，取血，分离血清。将小鼠断头处死，立即取肝，用生理盐水洗残血，然后固定于pH7.4PBS配成的10%曱醛溶液中，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色。于光镜下观察。1.3血清中丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST),用赖氏法测定，单位为U/L血清。2、结果及讨论2.1形态学观察结果表明，CCLt组，小鼠肝细胞条索排列紊乱，肝细胞广泛水样变性，出现细胞核固缩，细胞坏死，并有炎性细胞浸润和中央静脉充血。而给甜菜碱组，肝损伤则明显减轻，肝小叶结构清楚，可见肝细胞索围绕中央静脉仍呈放射状分布。仅有少量水样变性，少量肝细胞坏死，但无明显炎性细胞浸润和中央静脉充血。光镜检查表明，甜菜碱明显减轻CCU对肝组织的损伤。2.2血清酶学结果显示，甜菜碱能降低CCU造成的急性肝损伤小鼠的ALT,AST活性并呈剂量相关(表1)。表l甜菜碱对CCI4肝损伤小鼠血清转氨酶的影响(x±s,n=8)ALT(U/L)AST(U/L)正常对照组41.03±5.40—48.32±6.43CC14^I402.95±5.69316.68±5.60<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*P<0.05，**P<0.01(同CCU纟且比丰交)2.3结果显示甜菜碱对急性化学性肝损害具有保护作用。实施例二、甜菜碱对ecu慢性肝损伤小鼠肝动物模型的影响1、目的观察甜菜碱对d、鼠CC14慢性损伤肝炎的治疗作用。2、材料和方法2.1材料A、动物18-22g雌性BALB/C小鼠，30只，由中山医科大学实验动物中心提供。B、试剂1)CCU广州化学试剂公司产品。2)甜菜碱，Sigma公司产品(St.Louis,MO,USA)。3)戍巴比妥钠，广州化学试剂公司产品。2.2方法小鼠慢性肝炎模型雌性BALB/C小鼠，随机分组。禁食12h后，按0.5ml/kg体重腹腔注射CC14(10%石蜡油溶液)，每周二次，共八次。实验分为三组，甜菜碱组按600mg/kg体重每日灌胃，正常对照组及损伤对照组给予相应的生理盐水。聂后一次给药第三天杀鼠，取血测定ALT和血清白蛋白(A,g/L)。同时取肝大叶相同部位的一小块肝组织，用10。/。福尔马林固定后，做病理切片检查。实验还统计动物的总存活率。3、结果3.1CCl4中毒组，肝小叶周围炎性细胞浸润明显，可见纤维组织增生，小叶中心大部肝细胞坏死明显，部分肝细胞脂肪变，空泡样变明显；甜菜碱治疗组的肝组织学改变与CCU中毒组有明显不同，多数视野未见肝纤维组织增生和明显肝细胞坏死，炎性细胞浸润及脂肪样变性较轻。3.2血清酶学及血清白蛋白检查结果见表2。表2甜菜碱对CCU慢性肝损伤小鼠血清转氨酶和血清白蛋白的影响(x±s,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>**P<0.01(同CCl4组比较)4、结果显示，甜菜碱可以改善慢性肝损害肝组织空泡样变性、肝脂肪化和纤维化的形态学改变，明显降低血清中肝转氨酶和提升血清中白蛋白的含量，保护肝功能。实施例三甜菜碱联合cc-千扰素和拉米夫定对体外培养的乙型肝炎病毒细胞株的影响原理2.2.1.5细胞抹是国外建立的能主动分泌乙肝病毒的肝癌细胞株，它来源于H印G2肝癌细胞，已知a-干扰素通过其细胞内信号途径能抑制2.2.1.5细胞林分泌乙肝病毒'拉米夫定是核苷类似物，能直接抑制病毒DNA复制。通过检测培养液上清的HBsAg、HBeAg和HBVDNA的含量，可以鉴定拉米夫定抗病毒作用和ct-千扰素的生物学活性。本实施例用可提供活性甲基或参与曱基转移的化合物之一的甜菜碱，与cc-干扰素和拉米夫定同步作用于2.2.1.5细胞株，观察它们对乙肝病毒的抑制作用。1.材料和方法1.1材料2.2丄5细胞抹，引自中国医学科学院药物研究所；RPMI1640培养基(Sigma公司产品)，国产新生小牛血清(newborncalfserum,NCS;由杭州四季青生物工程材料研究所提供)，甜菜碱(Sigma公司产品)，cc千扰素(深圳科兴生物工程有限公司生产)；拉米夫定(英国葛兰素史克公司提供)。MTT(Fluka公司产品)；HBsAg和HBeAg酶免试剂盒(ABOTT公司产品)。1.2细胞培养与2.2.1.5细胞分泌抗原的动态观察2.2.1.5细胞接种于含10%小牛血清的1640培养基中，长满培养瓶后，转接种于96孔培养板，浓度1x105个细胞/ml,每孔100yl,在5%二氧化碳浓度下37。C培养。每天换相同的培养液一次，换出的上清液置-20。C保存备用。第8天终止试验，将所有上清液同时进行抗原测定。1.3给药在接种24小时后换用含药培养液，每种药物浓度均加8孔，实验分组如下A不同浓度的a-干扰素(0,50,100,200,500,1000,2000和5000IU/ml)和不同浓度的甜菜石咸(0'0.1，0.2，0.5,1,2,5,10ng/ml)和不同浓度的拉米夫定(0,10，50,100,200,500,1000，2000yg/ml),分别加入到培养基中，设阴性对照组。B选取适合浓度的a-干扰素(200IU/ml)、拉米夫定(200ng/ml)和适合浓度的甜菜碱(5jag/ml),分别配伍组合加入培养基中，设阴性对照组。每天换相同的培养液一次，第8天终止试验。1.4HBsAg和HBeAg抑制率测定将-20'C保存的细胞上清液置37。C水浴上融化，用酶免试剂盒检测HBsAg和HBeAg列公式分别计算抑制率抑制率=(对照孔的HBsAg和HBeAg效价-实验孔HBsAg和HBeAg效价)/对照孔HBsAg和HBeAg效价x100%。1.5MTT(四曱基偶氮唑盐)法检测细胞存活率，参见文献(邹清雁，孔祥平'等'乳猪脑提取物和脑活素对培养中胎鼠大脑皮层神经元的影响，天津医药，1994,11(4):661-664)。计算存活细胞的百分比。细胞存活率-实验孔OD值/对照孔OD值。2、结果2.1HepG2.2丄5细胞分泌抗原的特性实验发现，细胞培养24小时，其生长液中即可测到HBsAg和HBeAg,且随时间增加，抗原分泌呈稳定增加。结果见表3。表3:HepG2.2.1.5细胞分泌抗原的动态观察抗原分泌量细胞培养天数(OD)12345678HBsAg0.260.460.881.421.882.553.124.06HBeAg0.180.320.661.091.562.012.663.242.2药物对细胞抗原分泌和细胞存活的影响三种成分对HepG2.2丄5细胞分泌抗原和细胞存活的影响见表4。结果表明a-干扰素在200IU/ml和拉米夫定在200pg/ml以上浓度时对病毒抗原的分泌可达有效的抑制作用，且对细胞没有明显的毒副作用。而甜菜碱在1pg/ml以内对细胞的增殖有促进作用，但对病毒抗原的分泌影响不明显，当甜菜碱在10yg/ml以上时对细胞的增殖才有轻微的抑制作用，而对病毒抗原的分泌影响不明显。因此我们选用cc-干扰素(200IU/ml)、拉米夫定(200yg/ml)和甜菜碱(5ug/ml)做为配伍组合进行协同抑制试验。表4:药物对HepG2.2丄5细胞分泌抗原和细胞存活的影响抑制率a-千扰素(KJ/ml)(%)50100200500100020005000HBsAg15.235.448.157.672.378.289.4HBeAg8.428.639.649.261.466.282.3细胞存活率跳4116.5106.898.288.671.448.6拉米夫定(Ug/ml)1050100200500画2000HBsAg19.532.635.144.261.474.991.6HBeAg12.319.628.835.854.868.286.3细胞存活率10199.399.298.288.541.831.2甜菜城("g;/ml)0.10.20.51,02.05.010.0HBsAg-0.9-2.1-7.2-6.2-3.14.215.2HBeAg-0.6-1.6-5.2-5.4-2.51.87.9细胞存活率104.5118.6138.5128.2121.5111.295.82.3药物的协同抑制作用选用cx-千扰素(200iu/ml)、拉米夫定(200mg/ml)和甜菜碱(5ug/ml)做为配伍组合进行协同抑制试验，取第8天的上清进行测定，结果见表5。表5:药物对HepG2.2.1.5细胞分泌抗原的协同抑制作用抑制率干扰素十一—+-++(%)拉米夫定—+-++-+甜菜碱一—+-+++HBsAg-46.643.23.157.258.266,873.4HBeAg—38.131.81,645.647.558.267.4注"+"表示示加相应的药物；"-"表示不加相应的药物。结果表明甜菜碱与千扰素、拉米夫定相配伍，均显示明显的协同作用，对病毒抗原的抑制作用明显大于它们的简单相加作用。而干扰素和拉米夫定相配伍也有相互增强的作用。3、讨论和结论3.1甜菜碱在2ug/ml以下浓度时似对病毒的分泌有促进作用，但与对照比较无显著差异。这可能与低浓度的甜菜碱促进细胞生长有关。我们推测，甜菜碱可能通过抑制细胞内质网应激而抑制病毒蛋白的组装和分泌，因为病毒的组装主要通过诱导细胞内质网应激而进行自身的蛋白合成。3.2a-干扰素在500rU/ml对细胞的增殖影响不明显，在低浓度(200IU/ml以下)时可能有一定的促进作用，但与对照比较无显著差异。拉米夫定在500iug/ml以内时对细胞增殖无影响，当大于500ng/ml时则显示明显的抑制作用。3.3甜菜碱可明显提高a-干扰素的抗病毒的效果，它们的抑制作用明显大于它们的相加作用，其机理可能与细胞内曱基化作用有关。有研究(DuongFH,etal.S-AdenosylmethionineandbetainecorrecthepatitisCvirusinducedinhibitionofinterferonsignalinginvitro.Hepatology.2006Apr:43(4):796-806.)表明:HCV蛋白的表达引发STAT1曱基化抑制而损害Jak-STAT的信号过程。未曱基化的STAT1活性低，因为它能被抑制剂-STATl激活抑制蛋白(PIAS1)灭活。用SAM(S-腺苷曱疏氨酸)和甜菜碱处理细胞能恢复STAT1的曱基化和改进cc-千扰素的信号传导。3.4甜菜碱可明显提高拉来夫定的抗病毒效果，它们联合使用时的作用明显大于两者分別作用时效果的简单相加，其机理可能与甜菜碱通过抑制细胞内质网应激抑制细胞内病毒组装和分泌有关，同时甜菜碱通过蛋白曱基化改善细胞内酶的活力和蛋白活性，通过核苷酸甲基化促进细胞内dUTP向dTTP转化，使细胞复制时能获得足够的胸腺嘧啶而减少细胞基因变异和病毒基因变异，增强细胞综合抗病毒效果。实施例四甜菜碱增强拉米夫定抑制鸭体内乙肝病毒复制的实验研究原理鸭乙型肝炎是鸭自然感染的肝炎模型，能导致慢性肝炎和肝硬化，已知拉米夫定是核苷类似物，能直接抑制鸭体内乙肝病毒DNA复制。通过检测鸭血清的HBsAg、HBeAg和HBVDNA的含量，可以测定药物的抗病毒活性。本实施例用可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物之一甜菜碱，与拉米夫定配伍作用，观察它们对乙肝病毒的协同抑制作用。1、材料与方法1.1试剂32P-dCTP和缺口翻译试剂盒(Promega公司产品)；鱼精DNA、牛血清白蛋白(Sigma公司产品)；甜菜碱(Sigma公司产品)；拉米夫定(葛兰素史克制药有限公司产品)。l.2动物雌性麻鸭，6只，购自自由市场；1日龄北京鸭，购自广东省广州市力康农工商联合公司。1.3筛选阳性血清6只麻鸭，在无菌条件下抽血，分离血清。常规PCR反应，结果有3只麻鸭PCR扩增结果呈阳性，出现3条阳性条带，阴性对照未出现阳性条带。选取病毒滴度较高的麻鸭血清作为阳性血清，备用。1.4制备鸭乙肝模型取阳性鸭血清感染1日龄麻鸭。于孵化当日取200只健康雏鸭，其中l95只每只经腿静脉注射100y1阳性鸭血清，5只不处理作为正常对照组。鸭乙肝感染率检测于感染后第2周静脉采血，-PCR法检测DHBV。结果感染DHBV阳性血清的1W只鸭有U0只阳性'5只正常对照鸭全部阴性。鸭乙肝模型造模成功。选择病毒血清滴度大于10000的60只庥鸭进fl^弍-睑。1.5拉来夫定100mg/kg体重和甜菜碱20mg/kg体重配伍组合治疗。将60只阳性鸭分成4组，分组情况如下实一睑分组情况<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注"+"表示加相应的药物，"-"表示不加相应的药物。于感染后第2周开始治疗，连续治疗8周后半定量PCR法检测鸭乙肝病毒滴度变化情况1.6PCR反应取5ul鸭血清加50ul裂解液，100。C煮沸10min,快速离心后置于冰上，作为模板待用。常规PCR反应，以阳性血清为阳性对照，每次反应共设5个阳性对照，空白对照含有RT-PCR所需的所有成分，但不加模板。1.7凝胶电泳分析PCR反应产物用琼脂糖凝胶分离，结果在多功能成像分析系统上进行定量分析。1.8病理学检查肝组织常规石腊切片，HE染色，观察肝脏的组织形态学、炎症程度和变性程度。1.9统计分析所有结果均用SPSS统计软件包进行统计分析，P<0.05判断为差异有显著性。2、结果2.1拉米夫定和甜菜碱治疗后，同对照组相比，单一甜菜碱组和单一拉米夫定组肝细胞变性和炎性均明显减轻，而合用组肝细胞变性和炎症同正常对照组相似，说明配伍应用能明显提高病变肝细胞的恢复功能。-2.2拉米夫定和甜菜;威治疗前后鸭体内病毒滴度变化结果见表6。表6:拉米夫定和甜菜碱治疗对鸭体内乙肝病毒滴度的影响(n=15,x±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注"+"表示加相应的药物，"-"表示不加相应的药物承表示p〈0.05;^表示p0.05(同生理盐水組比较)结果表明治疗结東后，单纯拉米夫定治疗组仍有低滴度DHBV,联合甜菜碱治疗后，鸭血清中DHBV滴度进一步下降，抗病毒效果优于单纯拉米夫定治疗组。单纯拉米夫定治疗组DHBV滴度(3896.4.2±1108.7)显著低于生理盐水对照组(17867.6±11576.4)(PO.01)。联合甜菜碱治疗后，鸭血清中DHBV滴度(1836.8±879.6)进一步下降同正常对照组(2526.3±1022.6)相似，抗病毒效果优于单纯拉米夫定治疗组。3.结论3.1拉米夫定和甜菜J成治疗均能明显减轻鸭乙型肝炎的病理改变，两者配伍使用，效莱更好。3.2甜菜碱本身对鸭乙肝病毒也呈一定的抑制作用。3.3甜菜碱能明显增强拉米夫定对鸭乙肝病毒的抑制效果。实施例五甜菜^成配伍拉米夫定抑制体外培养乙型脑炎病毒的实验研究原理流行性乙型脑炎病毒做为黄病毒科中一代表性成员，利用流行性乙型脑炎病毒野生抹与人肝癌细胞抹KN73建立乙脑病毒体外持续性感染模型，并通过病毒抑制实验，观察甜菜碱配伍拉米夫定抑制体外培养乙型脑炎病毒的作用。1、才才津牛和方法1.1RPMI1640培养液(sigma),3%FBS(国产，杭州四季青公司)，24孔细胞培养板(Costar)。甜菜碱(Sigma公司产品)；拉米夫定(葛兰素史克制药有限公司产品)。1.2细胞与病毒人肝癌细胞株KN73和流行性乙型脑炎病毒抹来源于广州进出口检验检疫局中心实验室。1.3细胞抹KN73,以1640加10%胎牛血清37°C5%C02条件下，每5~7天，采用0.25%胰蛋白酶进行传代。1.4流行性乙型脑炎病毒持续感染模型流行性乙型脑炎病毒感染KN73细胞，37。C吸附90分钟，更换培养液直到90%细胞出现细胞病变，继续培养残存细胞，待形成单层细胞后进行细胞传代。1.5应用抗病毒药物进行病毒抑制实验传代、培养持续性感染细胞KN73,形成单层细胞后，在无细胞毒性作用的前提下添加甜菜碱0-20mg/ml和拉米夫定0-1000)jg/ml，收集用药后1天细胞培养液及2天后的细胞，应用病毒滴定法;f企测培养液及细胞内病毒量。选择合适剂量的甜菜碱5ug/ml和拉米夫定200ng/ml进行配伍试验，每组4孔。实验分组如下<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注"+"表示加相应的药物，"-"表示不加相应的药物。1.6病毒滴度测定方法采用地鼠肾细胞空斑试验方法。收集不同时期病毒感染细胞上清液及细胞，将细胞在-80。C与室温之间反复冻融3次，因胞膜破裂而使胞内病毒释出。经双抗处理，分别作10-1、10-2、10-3、10-4、10-5……10-9倍稀释，按常4见方法接种于敏感细胞。培养3~6天并观察CPE(包括细胞变圆、细胞核固缩和细胞溶解)。按照Reech-Mud的方法测定病毒的半数组织感染量(TCID50)。1%结晶紫溶液染色，计数空斑数，单位plaqueformingunit(PFU)/ml。2、结旲2.1甜菜碱和拉米夫定对体外培养流行性乙型脑炎病毒滴度的影响，见表7。表7:甜菜碱和拉米夫定对体外培养流行性乙型脑炎病毒滴度的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>结果显示5-20iag/ml甜菜碱对体外培养流行性乙型脑炎病毒有轻微的抑制作用，而50-1000iag/ml拉米夫定则显示有明显的抑制作用。2.2拉米夫定和甜菜碱配伍治疗对体外培养上清中流行性乙型脑炎病毒滴度的影响见表8表8:拉米夫定和甜菜碱配伍对乙型脑炎病毒滴度的影响(n-4，x±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注"+"表示加相应的药物，"—"表示不加相应的药物*-p<0.05,**,p<0.01,同7十,昭、纟且fc匕4i。拉米夫定和甜菜碱配伍抑制病毒实验结果表明，细胞传代后2天，拉米夫定可非常明显地抑制细胞培养中的乙型脑炎病毒，而甜菜碱可使病毒滴度进一步下降。3、结论可提供活性甲基或参与曱基转移的化合物-甜菜碱可轻微抑制细胞培养中的流行性乙型脑炎病毒，并与拉米夫定有协同抑制作用。实施例六、甜菜碱和利巴韦林(ribavirin,三氮唑核苦)联合应用对HCV(丙肝病毒)RNA阳性血清感染体外培养的人肝癌细胞系HepG2中HCV复制的影响。原理利巴韦林作用机制尚未阐明。它在宿主细胞内经细胞酶的作用转化成单磷酸、双磷酸和三磷酸利巴韦林。单磷酸利巴韦林能竟争性地抑制单磷酸肌芬脱氢酶，减少三磷酸鸟噪呤核苷酸(GTP)的合成，三磷酸利巴韦林能竟争性地抑制GTP依赖的病毒mRNA帽盖形成，从而抑制多种RNA、DNA病毒的复制。应用丙型肝炎患者的HCVRNA阳性血清感染体外培养的人肝癌细胞系HepG2，观察甜菜碱和利巴韦林对HCV在细胞中复制的影响。1、材料和方法1.1材料1丄1HCV阳性血清来自门诊丙型肝炎患者，病程在3个月以上，且未接受抗病毒治疗，既往有输血史，肝功能检查ALT反复异常。逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测血清HCVRNA结果为阳性。l丄2细胞抹:人肝癌细胞抹HepG2购自中国医学科学院细胞所。l丄3HCVPCR检测试剂盒:系中山大学达安基因诊断中心产品。RPMI1640为美国Sigma公司产品，逆转录酶(MMLV)为美国Promega公司产品，TaqDNA聚合酶和dNTP为日本宝生物公司产品。HCVRNA荧光定量PCR检测试剂盒，由广州华银医药科技有限公司生产。l丄4注射用利巴韦林(ribavirin,三氮唑核苷)，0.25g,5ml,由浙江亚太药业股份有限公司生产。甜菜碱(Sigma公司产品)。1.2实验方法1.2.1细胞培养:用含10%小牛血清的RPMI1640培养基，在"。C5。/。C02条件下培养HepG2细胞，每隔3d换液、传代一次。1.2.2HCV体外感染HepG2细胞:用1x105H印G2细月包培养传代，细胞长至满80%'且生长状态良好时，加入HCV阳性血清(感染血清终浓度为10%),轻轻摇匀，继续培养。并分別于感染后第2、4、6天收集部分细胞，吸取培养上清后，用1640液洗涤5次，025%胰蛋白酶消化制成细胞悬液，1000r/min离心5min,弃上清，用PBS离心洗涤5次后，-20'C冰箱冻存待4企测。1.2.3RTPCR检测培养细胞HCVRNA:采用中山大学达安基因诊断中心提供的HCVRNA检测试剂盒，操作按说明书进行。以试剂盒中阳性血清作为阳性对照。当培养细胞中检测到HCVRNA后进行后续试验。1.2.4甜菜碱和拉米夫定对培养中H印G2细胞HCVRNA的影响。HCV感染的HepG2细胞接种于含10。/。小牛血清的1640培养基中，长满培养瓶后，转接种于24孔培养板，浓度1x105个细胞/ml，每孔500ju1.在5%二氧化碳浓度下37。C培养。在接种24小时后换用含药培养液，每种药物浓度均加4孔，实验分组如下A不同浓度的甜菜碱(O,0.5,1，2,5,10|ug/ml)和不同浓度的利巴韦林(O,100,200,500,1000,2000ng/ml),分别加入到培养基中，设阴性对照组。B选取适合浓度的利巴韦林(500ng/ml)和适合浓度的甜菜碱(5jug/ml),分别配伍组合加入培养基中，设阴性对照組。每天换相同的培养液一次，继续培养3天终止试验。1.2.5HCVRNA分别用荧光定量RTPCR方法检测，操作按说明书进行。细胞HCVRNA量用106cps(拷贝数)/孔表示。用下列公式分别计算抑制率抑制率=(对照孔的HCVRNA含量-实验孔HCVRNA含量)/对照孔HCVRNA含量x100%。1丄6MTT(四曱基偶氮唑盐)法检测细胞存活率，参见文献(邹清雁，等。乳猪脑提取物和脑活素对培养中胎鼠大脑皮层神经元的影响。天津医药，1994,11(4):661-664)。计算存活细胞的百分比。细胞存活率=实验孔OD值/对照孔OD值。2、结果2.1HCV感染HepG细胞的特性实验发现，细胞感染后第4天，其细胞液中即可测到HCVRNA。2.2药物对细胞中HCVRNA和细胞存活的影响对HepG细胞中HCVRNA滴度和细胞存活的影响见表9。结果表明利巴韦林在100"g/ml以上浓度时对病毒抗原的分泌可达有效的抑制作用，且对细胞活性没有明显的毒副作用。而甜菜石成在1ug/ml以内对细胞的增殖有促进作用，但对病毒RNA滴度影响不明显。因此我们选用利巴韦林(500yg/ml)和甜菜碱(5yg/ml)做为配伍组合进行协同抑制试验。表9:药物对HepG细胞中病毒RNA含量和细胞存活的影响(n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>2.3药物的协同抑制作用我们选用利巴韦林(500ng/ml)和甜菜碱(5(ag/ml)做为配伍组合进行协同抑制试验，取药物作用后第3天的细胞，进行RNA抽提和RNA定量测定，结果见表10。表10:药物对HepG2细胞丙肝病毒的协同抑制作用(n=6，x±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注"+"表示加相应的药物，"-"表示不加相应的药物。*,p<0.05，**,p<0.01,同对照组比较。结果表明，甜菜碱与利巴韦林相配伍，对丙肝病毒显示明显的协同抑制作用。3、结论3.1利巴韦林在lOOOyg/ml以内时对细胞活性没有明显的抑制作用，而甜菜碱在l;ug/ml以内时对细胞生长有轻微的促进作用，至10ng/ml才显示出有轻微的促进作用。3.2利巴韦林在100Mg/ml时对细胞内丙肝病毒即显示有抑制作用，IC50为777.3yg/ml。而甜菜碱在10/ag/ml以内对细胞内的丙肝病毒未显示有明显的抑制作用。3.3利巴韦林(500pg/ml)和甜菜碱(5ng/ml)做为配伍组合，对病毒RNA的量显示有明显的协同抑制作用。其机理与细胞内甲基化作用有关，甜菜碱能恢复细胞内STAT1的曱基化和改进cc-千扰素的信号传导。实施例七甜菜碱和拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的临床试验研究一、临床研究;+划1.目的意义在对照的条件下详细观察可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物的疗效、有效剂量、适应症和不良反应。2.病例选择拟临床验证50-100例。男、女各半，主要为HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，受试病例必须符合以下条件2.1诊断明确HBeAg阳性慢性乙型肝炎，参考2000年《病毒性肝炎防治方案》和2005年《慢性乙型肝炎防指南》。诊断标准具备以下6项中5项者纳入观察范围1、年龄18~65岁；2、HBsAg阳性〉6个月；3、血清HBV-DNA〉10A5cc3pies/tnl;4、HBeAg阳性和抗HBe阴性；5、血清ALT持续或反复升高；6、肝组织学检查有肝炎病变。2.2能随诊一年者。2.3无心、肾、内分泌，明显造血系统疾患及其它影响药物评价因素者。2.4—般选择住院病人，也可选择部分门诊病人，但均须满足试验设计中的各项要求。2.5排除标准HIV、抗HIV和抗HCV阳性者；结締组织病、曱状腺疾病、抑郁症患者；严重肝、肾功能不全患者，患严重心脏病患者、癌症及其他严重疾病患者；正在应用其它治疗肝炎药物和可能影响本品疗效观察的患者。有药物过敏史或不能耐受者。孕妇、哺乳期的妇女和儿童。研究医师认为有任何不适合入选者。3.试-睑过程中病例淘汰标准3.1试验过程中发现不符合病例选择标准者。3.2用药过程中无不良反应，因其它原因中断治疗者。3.3用药过程中，因非药物因素而患其它疾病(如肺炎、肾炎等)而中止治疗。3.4试验期间未按本方案要求服药，依从性差。4.实验组和对照组设置4.1采用随机分组，方法如下4.1.1临床诊断一致4.1.2年龄一致年龄相差不超过10岁4.1.3性别一致4.2以拉来夫定治疗50例作为阳性药物对照組。实验组50-150例'在拉米夫定治疗的基础上加用可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物(甜菜碱或其它可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物，如蛋氨酸等)。5.药物剂量、疗程及给药方法5.1—般治疗合理饮食，建议低盐饮食。慢性乙型肝炎治疗主要包括抗病毒、免疫调节、抗炎保肝、抗纤維化和对症治疗。.5.2治疗组可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物，每次0.3g,每日3次，和常规拉束夫定治疗，第一疗程为12个月。部份病例必要时可继续进行第二疗程，剂量根据第一疗程的情况加大l-4倍剂量，时间为12个月。5.3对照组常规拉米夫定治疗，每一疗程12个月，可观察1-2个疗程。治疗期间不得任意加用其它药物(如其它临床研究用药，保肝降酶药、降血脂药和激素等)，原则上用可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物，若治疗1个月以上，病情改善不明显，且出现病情加重时，可改用其它治疗用药。统计时按无效病例总结。6.结果观察与记录6.1症状乏力、纳差、疼痛、腹胀、恶心、呕吐、低热、关节疼、齿龈出血、鼻衄等。治疗前症状有、无以十、-表示，治疗后症状消失、减轻、不变、加重以"-、±、+、++"表示。于治疗前、治疗期间每周、治疗结束、治疗结束后3个月分别观察和记录一次。临床症状严重程度以0-3分计，其标准如下0分，无症状；1分，轻度，稍加注意感到有症状；2分，中度，自觉有症状但不影响工作；3分，明显影响工作和生活。6.2体征肝、脾肿大，蜘蛛痣等观察和记录时间同上。6.3心、肝、肺、肾等各重要脏器功能血清丙氨酸转氨酶(sALT)、血清天门冬氨酸转氨酶(sAST)、碱性磷酸酶、胆红素、曱胎蛋白(AFP)、血清总蛋白、白蛋白、球蛋白于治疗前，治疗期间每月，治疗结束、治疗结束后3个月各检测一次。6.4HBV血清学标志，包括HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc和抗-HBcIgM，于治疗前、治疗期间每月、治疗结束后3、6、9、12个月各;f企测一次。6.5HBVDNA定性和定量、基因型和变异检测7.疗效判定主要观察指标肝功能指标、病原学指标的联合应答(HBsAg、HBeAg阴转率，HBVDNA<105拷贝/ml和ALT复常)。疗效标准治疗应答(一)单项应答1.病毒学应答指血清HBVDNA检测不到(PCR法)或低于检测下限，或较基线下降>2loglO。2.血清学应答指血清HBeAg转阴或HBeAg血清学转换或HBsAg转阴或HBsAg血清学转换。3.生化学应答指血清ALT和AST恢复正常。(二)时间顺序应答1.初始或早期应答治疗12周时的应答。2.治疗结束时应答治疗结東时应答。3.持久应答治疗结束后随访6个月或12个月以上，疗效维持不变，无复发。4.维持应答在抗病毒治疗期间表现为HBVDNA检测不到(PCR法)或低于检测下限，或ALT正常。5.反弹达到了初始应答，但在未更改治疗的情况下，HBVDNA水平重新升高，或一度转阴后又转为阳性，可有或无ALT升高。有时也指ALT和AST复常后，在未更改治疗的情况下再度升高，但应排除由其他因素引起的ALT和AST升高。6.复发达到了治疗结束时应答，但停药后HBVDNA重新升高或阳转，有时亦指ALT和AST在停药后的再度升高，但应排除由其他因素引起的ALT和AST升高。(三)联合应答1.完全应答HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，治疗后ALT恢复正常，HBVDNA检测不出(PCR法)和HBeAg血清学转换；HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者，治疗后ALT恢复正常，HBVDNA4金测不出(PCR法)。2.部分应答介于完全应答与无应答之间。如HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，治疗后ALT恢复正常，HBVDNA<105拷贝/ml,但无HBeAg血清学转换。3.无应答未达到以上应答者。二、临床研究初步结论1、资料与方法1.1研究对象选择56例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，均系2004年10月~2006年8月住院和部分门诊患者。诊断及临床分型标准符合2000年9月第十次全国病毒性肝炎会议修订标准。其中，男32例，女24例，平均年龄33岁。肝炎病程6月-3年，平均1.2年，HBsAg、HBeAg和HBcAb均阳性；肝功能检查ALT65U/L-276U/L,总胆红素升高20.5pmol/L-291.6nmol/L,白蛋白降低23.2-39.5g/L。两组在治疗前进行配对比较'类似者随机分别列入实验组和对照组。1.2药物拉米夫定，葛兰素史克制药有限公司产品。可提供活性甲基或参与曱基转移的化合物(含甜菜碱、B2、B6、B12和叶酸)胶囊，自制。1.3治疗分组试验组可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物胶嚢0.3g/次，一天三次口服；拉米夫定片，100mg/次，一天一次口服，12个月为一疗程。对照组单用拉米夫定，疗程同治疗组。1.4实验室检查血清ALT按赖氏法。HBsAg和HBeAg定量分析采用全自动快速微量子酶免分析系统，仪器和试剂均为美国雅培公司产品。HBVDNA定量检测采用定量聚合酶链反应(PCR)检测，AG—9600焚光DNA分析检测仪由美国Biotronics公司生产。1.5统计学处理采用SPSS统计软件对数据进行卡方检验或方差检验。2、结果2.1症状与体征脾肿大治疗组中4-例恢复正常，其余变化不大。其他症状和体征治疗组与对照组改善情况无显著性差别。2.2可提供活性甲基或参与曱基转移的化合物对乙肝患者血清肝生化指标的影响可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物对乙肝患者治疗1年中ALT、AST、ALP、血清白蛋白和胆红素的影响，结果见表ll。实验组和对照组肝功能在治疗1年后基本均恢复正常，因些无法统计和比较转阴率，但肝功能恢复速度在两者间有明显的差别。表ll:可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物治疗l年中对乙肝患者肝脏生化指标的斧》响(n=28，x±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>AST(U/L)84±2569±2448±5+51±6+39±4++41±4++ALP(U/L)302±48236±32248±53191±68+118±33++104±36++月旦纟工素(^mol/L)72±1258±2141±29+37±8+32±9.2+28±3.6++白蛋白(g/L)31土3.630±4.933±5.235±5.636±4.8十38±5.3十伞表示pO.05;m表示PO.OI(两组间相应数据比较)+.p<0,05;++p<0.01同v'台疗前t匕4交可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物在促进肝功能(ALT和AST)恢复时，其速度明显快于对照组。对一些顽固性黄疸—病人，可提供活性甲基或参与曱基转移的化合物的降黄疰效果也很明显，尤其是对肝炎患者促进肝细胞白蛋白的合成效果好。2.3可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物对乙肝患者病毒病原学指标的影响结果见表12。表12:可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物对乙肝患者病原学指标的影响(n=28,x土SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>承表示p〈0.05;"表示PO.Ol(同对照组比较)。结果表明可提供活性甲基或参与甲基转移的化合物可明显提高拉米夫定的HBeAg阴转率和血清转换率以及HBVDNA阴转率。3、结论3.1可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物通过保护肝细胞和明显促进肝细胞白蛋白合成，可以加快肝细胞功能的恢复。3.2同拉米夫定合用可明显提高其抗乙肝病毒的效果。由于流感病毒、禽流感病毒也可用本发明所述的干扰素类化合物、核芬类似物化合物等抗病毒化合物来治疗，通过与实施例一至七类似的实验验证，也取得很好的效果，表明药，可明显提高干扰素类化合物、核苷类似物化合物等抗病毒化合物的治疗效果。实施例八利用甜菜碱为主料，可以制成注射剂、粉针剂、胶囊剂和片剂。可做成口服或注射药物治疗有关病毒性疾病。1、注射剂配方甜菜碱1-10份+蒸馏水(注射用水)90-99份(1%-10%),用lmol/LHC1调pH至7.0,做成lml至100ml注射液。优选10。/。的甜菜碱做成2ml注射液。2、4分4十剂配方甜菜碱l-10份+蒸馏水(注射用水)90-99份(1%-10%),优选10%浓度，用lmol/LHC1调pH至7.0，加甘露醇使甘露醇的最终浓度为4%,以2-20ml量(优选2ml)加入至瓶中，冷冻千燥备用。3、胶囊剂配方:甜菜碱3份，微晶纤维素0-l份，淀粉0-0.5份，装0号或2号胶囊，使胶囊含甜菜碱最终量为0.1g/粒或0.3g/粒。本配方对胶囊大小和装量不作限定。4、片剂配方甜菜碱3份，微晶纤维素0-l份，可压性淀粉0-2份，做成0.1g-lg的片型，使每片含甜菜碱最终量为0.1g/片-0.5g/片。本配方对片型、片剂包衣、大小和装量不作限定。5、口H液配方甜菜碱1-10份，甜蜜素适量，香精(柠檬香型、玫瑰香型适量)+蒸馏水(注射用水)调甜菜碱浓度为(1%-10%),进行口感调试。优选3%的甜菜碱做成10ml口服液。6、口且嚼片酉己方甜菜碱80-90份,甜味剂为600-680份,矫味剂为10-14份,香精为3-5份'色素为6-6.5份，润滑剂为10-14份，粘合剂适量。口感调试。实施例九利用甜菜碱为主料，配以多种维生素及辅料参考实施例八的方法可以制成口服液，胶嚢剂，或口服片或咀嚼片(也可做成食品或保健食品)。最优配方甜菜碱500份，VB1为10份，VB2为20份，VB6为50份，VB12为2份，VE为100份，VA为5份，VC为50份，烟酸50份，生物素0.3份，泛酸1份，叶酸2份；微量元素适量。选择配方可以甜菜碱为主料任选上迷二—十数种组合而成，组合的量可随要求而变，如甜菜碱可为10-500份，VB1可为0-50份，VE可为0-200份等。实施例十利用甜菜碱、叶酸和维生素B12为主料，配以多种维生素及辅料参考实施例八的方法可以制成口服液，胶囊剂，或d:服片或咀嚼片(可做成食品或保健食品)。最优配方甜菜碱500份，叶酸10份、维生素B12为1份力口窗10份，VB2:20份，VB6:50份'VE:100份'VA:5份，VC:50份，烟酸50份，生物素0.3份，泛酸1份；微量元素适量。选择配方可以甜菜碱、叶酸和維生素B12为主料任选上述二-十数种组合而成，组合的量可随要求而变，如甜菜碱可为10-500份，VB1可为0-50份，VE可为0-200份等。实施例十一利用甜菜石咸为主料，配以抗病毒药(核苷类似物如拉米夫定)及辅料可以制成胶囊剂和片剂。可做成口服药物治疗有关病毒性疾病。1、力i囊剂配方甜菜碱500份，拉米夫定100份，微晶纤维素0-100份，淀粉0-50份，装0号或2号胶囊，使胶囊含甜菜碱最终量为O.lg/粒或0.3g/粒，拉米夫定量为0.02g/粒或0.06g/粒。本配方对胶囊大小和装量不作限定。2、片剂配方甜菜碱500份，拉米夫定100份，可压性淀粉0-200份，做成O.lg-lg的片型，使每片含甜菜碱最终量为0.1g/片-0.5g/片，拉米夫定最终量为0.02g/片-0.10g/片。本配方对片型、片剂包衣、大小和装量不作限定。实施例十二利用甜菜碱、叶酸和维生素B12为主料，配以抗病毒药(核苷类似物如拉米夫定)及辅料可以制成胶囊剂和片剂。可做成口服药物治疗有关病毒性疾病。1、胶囊剂配方:甜菜碱500份，叶酸10份，维生素B12:1份，拉米夫定IOO份，微晶纤维素0-100份，淀粉0-50份，装0号或2号胶囊，使胶囊含甜菜碱最终量为O.lg/粒或0.3g/粒，拉米夫定量为0.02g/粒或0,06g/粒。本配方对胶囊大小和装量不作限定。2、片剂配方甜菜碱500份，叶酸10份，维生素B12:1份，拉米夫定100份，可压性淀粉0-200份,做成O.lg-lg的片型，使每片含甜菜碱最终量为O.lg/片-0.5g/片，拉米夫定最终量为0.02g/片-0.10g/片。本配方对片型、片剂包衣、大小和装量不作限定。实施例十三利用甜菜碱为主料，配以干扰素可以制成注射剂和粉针剂'可做成注射药物治疗有关病毒性疾病。1、注射剂配方甜菜石成0.1-l.Og千扰素5.0-50.0MU蒸馏水(注射用水)2-20ml,用lmol/LHC1调pH至7.0,做成2-20ml注射液。优选2ml注射液。2、粉针剂配方3廿菜石成O.l-l.Og干扰素5.0-50.0MU蒸馏水(注射用水)2-20ml，用lmol/LHC1调pH至7.0,加甘露醇使甘露醇的最终浓度为4。/。，以2-20ml量(优选2ml)加入至瓶中，冷冻千燥备用。权利要求1、可提供活性甲基或参与甲基转移的化合物作为制备治疗病毒性疾病的药的应用。2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物选自叶酸、维生素B12、维生素B6、维生素B2、胆碱、甜菜碱、丝氨酸和蛋氨酸的一种或一种以上的组合，优选为甜菜碱或者甜菜碱、叶酸、維生素B12三者合用。3、根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的抗病毒化合物选自干扰素类化合物、核芬类似物化合物的一种或一种以上的组合。4、根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的病毒性疾病包括各型病毒性肝炎、乙型脑炎、流行性感冒和禽流行性感冒。5、一种用于治疗病毒性疾病的组合物，其特征在于，该组合物包括至少一种可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物；以及至少一种抗病毒化合物。6、一种用于治疗病毒性疾病的药物组合物，其特征在于，包括有效治疗剂量的至少一种可提供活性曱基或参与曱基转移的化合物；有效治疗剂量的至少一种抗病毒化合物；以及药物学上可接受的载体。7、根据权利要求5或6所述的组合物，其特征在于所述的可提供活性甲基或参与曱基转移的化合物选自叶酸、维生素B12、维生素B6、维生素B2、胆碱、甜菜碱、丝氨酸和蛋氨酸的一种或一种以上的组合，优选为甜菜碱或者甜菜碱、叶酸、维生素B12三者合用。8、根据权利要求5或6所述的组合物，其特征在于所述的抗病毒化合物选自干扰素类化合物、核苷类似物化合物的一种或一种以上的组合。9、根据权利要求5或6所述的组合物，其特征在于所述的病毒性疾病包括各型病毒性肝炎、乙型脑炎、流行性感冒和禽流行性感冒。10、才艮据4又利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物配制成选自注射剂、粉针剂、胶囊剂、片剂、口服液、咀嚼片之一的剂型。全文摘要本发明涉及一类可提供活性甲基或参与甲基转移的化合物作为制备治疗病毒性疾病的药的应用。所述的可提供活性甲基或参与甲基转移的化合物选自叶酸、维生素B12、维生素B6、维生素B2、胆碱、甜菜碱、丝氨酸和蛋氨酸的一种或一种以上的组合。所述的抗病毒化合物选自干扰素类化合物，核苷类似物化合物的一种或一种以上的组合。所述的病毒性疾病包括各型病毒性肝炎、乙型脑炎、流行性感冒和禽流行性感冒。本发明还提供了一种用于治疗病毒性疾病的组合物，包括至少一种可提供活性甲基或参与甲基转移的化合物；以及至少一种抗病毒化合物。本发明可明显增强机体和细胞综合抗病毒效果，尤其是明显增强已知抗病毒化合物对各类病毒的抑制效果。文档编号A61P11/00GK101116670SQ20061003684公开日2008年2月6日申请日期2006年8月1日优先权日2006年8月1日发明者丁先风,张晓元,李公信,李远友,王尚武,邹清雁申请人:广州和竺生物科技有限公司