专利名称：一种鸡特异性的CpG ODN及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种CpG DNA(CpG DNA是指含胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸基序的DNA)，特别是涉及用作鸡特异性的CpG ODN(ODN是指寡核苷酸单链DNA)，以及这种CpG ODN作为H5亚型禽流感DNA疫苗佐剂的用途。
背景技术：
对高致病性禽流感(HPAI)的控制主要采用隔离封锁疫点，扑杀销毁感染和受威胁动物，以及其他生物安全措施。鉴于经济补偿压力等方面的制约，疫苗免疫接种亦已成为控制疫情的关键措施之一。目前应用的油乳剂全病毒灭活疫苗具有效果确实、保护率高、免疫期长和研制周期短等优点。但是使用这种灭活苗也存在许多缺陷，主要有①影响疫情监测和流行病学调查，无法区分免疫群和自然感染群；②不能激发局部粘膜免疫；③生产过程中存在散毒的风险；④免疫应激大，影响肉品品质等。所以，开展禽流感基因工程疫苗的研究，为禽流感的防制提供新型的免疫预防途径是一种必然。重组病毒疫苗(如禽痘病毒疫苗等)接种商品鸡时受母源抗体的影响较大。DNA疫苗能诱导机体产生细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫，兼有减毒活疫苗的有效性和亚单位疫苗的安全性，且不受母源抗体的干扰，可以非常容易操作质粒DNA以改变免疫反应的质和量，并具有简单、经济、易于储存运输等优点。许多研究表明，目前已构建的许多H5亚型AIV HA基因的DNA疫苗质粒虽可产生一定的免疫保护反应，但仍存在DNA疫苗免疫原性弱，不如油乳剂灭活疫苗引起的免疫反应强等不足，所以需进一步优化，以增强其免疫效力。
CpG是由胞嘧啶和鸟嘌呤通过磷酸连接成的二核苷酸。C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，p代表磷酸，胞嘧啶位于5’端。CpG DNA作为免疫增强剂已受到国内外学者的肯定，近年来的研究表明，人工合成的含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA(CpG ODN)可表现强效的免疫增强和免疫调节作用。但由于序列，尤其是CpG两侧的序列的不同，CpG ODN可有多种多样的形式，表现不同性质、不同强度的免疫增强和免疫调节作用，而且其作用具有种属特异性，中国专利00105728.6和03140821.4公开了人特异性CpG ODN，中国专利200310106226.1公开了适用于畜禽DNA疫苗佐剂的CpG ODN序列，中国专利02822715.8公开了可用于非人动物的CpG制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于鸡的CpG ODN，其序列具体为5’-TTGGAACGTTCCTTTCCAACGTTGGTTTGGAACGTTCCTT-3’，如SEQ IDNO1所示。该序列经人工合成，与已公开的CpG ODN均不相同。
本发明的另一个目的是提供本发明所说的CpG ODN作为H5亚型禽流感DNA疫苗佐剂的应用。
嵌合了本发明CpG ODN为佐剂的H5亚型禽流感DNA疫苗，通过口服、滴鼻途径对鸡直按进行免疫，可显著增强H5亚型禽流感DNA疫苗免疫后的攻毒保护率，提高免疫家禽的肠粘膜IgA抗体水平；且本发明中构建的DNA疫苗具有安全、免疫后不干扰禽流感疫情的监测、可克服母源抗体的干扰(可用于雏禽免疫)及使用方便等优点。
本发明所说的CpG ODN，作为一种鸡特异性的免疫刺激序列，除作为H5亚型禽流感DNA疫苗佐剂外，也能有效增强鸡其他疫苗(包括重组病毒疫苗等基因工程疫苗和灭活疫苗等)的免疫效果。
具体实施例方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
本发明的CpG单链脱氧核苷酸可通过已知的方法生产，例如固相亚磷酰胺三酯法合成。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1CpG单链脱氧核苷酸的制备ODN序列由上海英骏生物技术有限公司合成，使用ABI39X系列合成仪，采用固相亚磷酰胺三酯法。
实施例2嵌合CpG的H5亚型禽流感DNA疫苗的制备一、H5亚型禽流感病毒HA cDNA编码区和脑心肌炎病毒(ECMV)的内部核糖体结合位点(IRES)片段的PCR扩增1.引物的设计与合成用于扩增H5亚型禽流感病毒HA基因cDNA和脑心肌炎病毒(ECMV)的内部核糖体结合位点(IRES)片段的引物，是参照已经公布的序列，用引物设计软件Primer Premier 5辅助设计而成。在引物的5’端加有酶切位点和保护性碱基。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。引物序列如下HA P1TACTCGAGAAAATGGAGAAAATAGTGCTT (XhoI)HA P2ATGGGCCCTACAATCTGAACTCACA(ApaI)IRES P1TCGGATCCTGCATCTAGGGCGGCCAA (BamHI)IRES P2TTCTCGAGTTGTGGCAAGCTTATCATCGTG (XhoI)2.RT-PCR用Trizol提取H5亚型禽流感病毒接种的鸡胚尿囊液总RNA，再以引物中的下游引物反转录出相应的cDNA，最后用PCR方法扩增出H5亚型禽流感病毒HA基因cDNA，扩增片段的大小为1746bp。
3.用PCR扩增ECMV的IRES片段以质粒pIRES为模板，用PCR扩增出ECMV的IRES片段，扩增片段的大小为624bp。
二、重组质粒pVAX1-HA-CpG的构建1、重组质粒pVAX1＝CpG的构建合成的CpG片段的两条互补序列分别用灭菌的超纯水溶解，再各取等量加到0.5mlPCR管中混匀，在PCR仪上97℃变性10分钟，取出置室温自然冷却。将退火后的CpG片段进行5’端磷酸化(10μl体系)Kinase 10×buffer 1μlCpG片段(已退火) 6μl(约0.3μg)ATP(1mM) 1μlT4 Polynucleotide Kinase 2μlS.W. 1μl37℃水浴作用30min后，再65℃水浴作用8min，置室温自然冷却。合成的CpG片段两端分别设计有XbaI和ApaI酶切位点，这样合成后的两条互补序列经变性、退火及5’端磷酸化处理后就可用于下面的连接反应。
真核表达载体pVAX1用XbaI和ApaI酶切，经电泳、切胶回收后，用T4DNA连接酶与CpG片段相连(10μl体系)10×ligase buffer 1μlpVAX1(XbaI+ApaI)2μlCpG(XbaI+ApaI) 5μlT4DNA ligase1μlATP(5mM)1μl连有CpG片段的重组质粒送到上海博亚生物技术有限公司测序，以验证构建的正确性。
2.重组质粒pVAX1-HA-CpG的构建重组质粒pVAX1-CpG和pVAX1-HA(张小荣构建，微生物学报，2004，44(2)157～161，HA基因两侧有HindIII和BamHI位点)分别用HindIII和BamHI酶切，电泳后，分别切胶回收pVAX1-CpG和HA片段。用T4DNA连接酶连接这两个片段，构建重组质粒pVAX1-HA-CpG。连接产物4℃连接过夜后，转化到DH5α感受态细胞。转化菌落接种LB肉汤(Kana+)，振荡培养，小量法提取质粒，用HindIII和BamHI双酶切鉴定，得到构建的重组质粒pVAX1-HA-CpG。
三、电转化用电穿孔法分别将pVAX1空载体质粒、pVAX1-HA-CpG和pVAX1-HA各0.1μg(冰上预冷)转化减毒鼠伤寒沙门氏菌ST(冰上预冷)。
所获得阳性转化子分别命名为ST(pVAX1)、ST(pVAX1-HA-CpG)和ST(pVAX1-HA)。
实施例3嵌合CpG的H5亚型禽流感DNA疫苗的免疫应用将重组沙门氏菌ST(pVAX1-HA-CpG)和ST(pVAX1-HA)经口服和滴鼻途径首免3日龄商品代伊莎褐蛋鸡，剂量为5×109CFU/只；并以禽流感油乳剂灭活疫苗免疫组、空载体ST(pVAX1)免疫组和空白组分别作为阳性和阴性对照。首免后二周以相同的免疫剂量和免疫途径加强免疫，二免后3周攻毒，以评估嵌合CpG DNA在减毒沙门氏菌ST运送H5亚型禽流感核酸疫苗中的佐剂作用，见表1。
表1不同疫苗对商品代伊莎褐蛋鸡的免疫保护效果
**p＜0.01，差异极显著。
实验显示，首免后二周和二免后三周，各重组沙门氏菌免疫组的血清HI抗体水平都很低，且与空载体组和空白对照组相比无显著差异(p＞0.05)；但以CpG为佐剂的免疫组，其肠道AIV特异性的IgA抗体与对照组比较有显著性差异(p＜0.05)。攻毒保护性试验结果表明，ST(pVAX1-HA-CpG)免疫组的攻毒保护率最高与ST(pVAX1-HA)免疫组和空白对照组相比差异极显著(p＜0.01)。但油乳剂灭活疫苗免疫组在免疫后血清抗体水平和攻毒保护率方面都高于各重组沙门氏菌免疫组。
由以上实施例表明发明人成功地构建了H5亚型AIV HA基因及嵌合CpG DNA的禽流感核酸疫苗，经实验验证ST(pVAX1-HA-CpG)免疫组的保护率与对照组相比差异极显著；且本研究构建的重组沙门氏菌免疫后，能诱导粘膜免疫应答。
SEQUENCE LISTING<110>扬州大学<120>一种鸡特异性的CpG ODN及其应用<160>1<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CpG DNA<400>1ttggaacgtt cctttccaac gttggtttgc aacgttcctt 40
权利要求
1.一种鸡特异性的CpG ODN，其序列具体为5’-TTGGAACGTTCCTTTCCAACGTTGGTTTGGAACGTTCCTT-3’，如SEQ IDNO1所示。
2.权利要求1所说的CpG ODN，作为H5亚型禽流感DNA疫苗佐剂的应用。
全文摘要
本发明涉及一种CpG DNA，特别是涉及用作鸡特异性的CpG ODN，以及这种CpG ODN作为H5亚型禽流感DNA疫苗佐剂的用途。该CpG ODN序列具体为5’－TTGGAA CGTTCCTTTCCAACGTTGGTTTGGAACGTTCCTT－3’，嵌合了本发明CpG ODN为佐剂的H5亚型禽流感DNA疫苗，通过口服、滴鼻途径对鸡直接进行免疫，可显著增强H5亚型禽流感DNA疫苗免疫后的攻毒保护率，提高免疫家禽的肠粘膜IgA抗体水平；且本发明中构建的DNA疫苗具有安全、免疫后不干扰禽流感疫情的监测、可克服母源抗体的干扰及使用方便等优点。
文档编号A61P31/16GK1810823SQ200610038448
公开日2006年8月2日 申请日期2006年2月23日 优先权日2006年2月23日
发明者焦新安, 胡青海, 潘志明, 黄金林, 孙林, 殷月兰, 唐丽华, 张成全 申请人:扬州大学