专利名称：一种组织工程化双层皮肤的构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及将来自不同组织的干细胞在体外分别向表皮和向真皮细胞定向诱导分化，并将诱导分化的细胞群与生物材料相结合，共同构建组织工程化双层皮肤的方法，利用此方法可在支架材料上制备用于临床烧伤、溃疡、创伤、畸形、术后缺损、疤痕等皮肤组织修复和愈合的具有特定形状、厚度的皮肤组织替代物。
背景技术：
皮肤作为人体的最大器官，具有屏障、保护、调节体温和感觉的功能。由于炎症、溃疡、烫伤、烧伤等因素造成的皮肤缺损，严重的可危及生命。目前临床通常采用自体皮瓣或皮肤移植的方法治疗缺损创面，但面临供皮区新的创伤缺陷，以及供皮区来源的不足。此外移植物与移植部位临近的皮肤存在颜色、质地、功能上的差异。
组织工程学是应用工程学和生命科学的原理和方法，构建生物性替代物，以恢复、维持或增进受损器官或组织功能的一门科学(Nerem RM.Tissue engineeringin the USA.Med Biol Eng Comput，1992，30(4)CE8)。组织工程学的建立和发展为皮肤缺损治疗开创了崭新的途径。
目前应用于临床的组织工程产品主要有合成性敷料、人工皮片、人工真皮替代物和人工复合全层皮肤。IntegraTM是由美国Integra Life Sciences公司生产的双层基质的人工真皮。其真皮是由牛肌腱的胶原蛋白及硫酸软骨素制成具有一定孔洞大小的支架，利于血管内皮细胞通过和纤维细胞长入，表皮是由硅胶膜组成，可在真皮层愈合后除去，再进行人工表皮的移植。美国FDA于1996年核准IntegraTM用于烧烫伤的治疗。然而，IntegraTM由于缺乏活的细胞成分，可能延缓真皮的重建。
还有一类是含有单一细胞的皮肤，如人工表皮和人工真皮。
EpicelTM是由美国Genzyme组织修复公司生产的人工表皮，主要用于治疗大面积烧烫伤病人。它是将病人自体的角质细胞在体外放大培养，移植到溃疡、痔、大疱性表皮松懈症部位。虽然它们在残留的真皮部位黏附得很好，但它们不黏附脂肪、慢性创面或感染性创面；而且移植部位容易剥离，或者形成水疱，对机械损伤高度敏感；缺乏真皮成分；移植成功率主要与创面细菌污染程度有关；费用昂贵。DermagraftTM是由Advanced Tissue Sciences公司生产的人工真皮。是将新生儿包皮中获取的成纤维细胞接种于生物可降解的聚乳酸纤维网上，移植后14天，成纤维细胞大量增殖并分泌胶原等细胞外基质以及细胞因子，3～4周聚乳酸纤维网因生物降解而消失，用于治疗糖尿病引起的足部溃疡。但生产这种合成网膜真皮替代物需要大量成纤维细胞；难以改变网膜的厚度；市售产品只达到真皮重建。
ApligraftTM是第一种商业化的既含有表皮层又含有真皮层的组织工程化皮肤，由美国Organogenesis公司生产。它是将新生儿包皮中获取的成纤维细胞接种于牛的I胶原蛋白中，6天后细胞分泌细胞外基质，形成类似真皮层的组织，再种植上新生儿包皮的角质细胞。角质细胞附着在真皮上开始分裂分化形成表皮层。再将整个复合物置于气-液界面继续培养，促使角质细胞成熟。虽然ApligraftTM实现了一次外科手术同时重建真皮和表皮的目的，但由于采用同种异体细胞作为种子细胞来源，因而存在着不可避免的免疫排斥反应，以及潜在的病源微生物感染的风险；而且所用的种子细胞均为终末分化的成熟细胞，没有自我增殖分化的能力。
成体干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，国内外已有大量关于成体干细胞向骨、软骨、脂肪、肝脏和神经等诱导分化的离体实验研究报道，并且当其移植到体内，具有向病变部位迁移并分化成机体所需要的相应细胞的能力(Mackenzie TC，Flake AW.Blood Cells Mol Dis，2001，27(3)601.)，利用成体干细胞作为种子细胞，将为皮肤缺损的治疗开辟新的途径。
发明内容
本发明提供了一种干细胞体外向表皮和真皮细胞诱导分化后的细胞群与生物材料一起构建组织工程化双层皮肤的方法，利用此方法可在支架材料上制备用于临床烧伤、溃疡、创伤、畸形、术后缺损、疤痕等皮肤组织修复和愈合的具有特定形状、厚度的皮肤组织替代物。由于干细胞具有多向分化潜能，能够在诱导条件下分化为表皮细胞和真皮细胞，通过诱导分化的细胞及其分泌的可溶性细胞因子及细胞外基质等活性成分的共同作用，能够加速缺损创面的愈合。
本发明是通过以下技术方案实现的(1)体外诱导干细胞向表皮细胞分化将骨髓、脂肪、胚胎、脐带血、外周血等组织来源的MSC或其它成体干细胞种植于在预先铺有明胶(Sigma公司，货号G-1890)、胶原、纤维蛋白凝胶、Matrigel胶(BD公司，货号354240)或其它生物活性胶的孔板上，加入含10％胎牛血清(Biochrom公司，货号S0115)的低糖DMEM培养基(Sigma公司，货号D-5523)或者其它成体干细胞相应的基本培养基，于37℃，5％CO2培养箱中进行培养至细胞达到30％～50％的融合，遂改用表皮诱导条件培养液低糖DMEM/DF12(1∶1)培养基(DF12培养基，Sigma公司，货号D-0547)中含有下列成分10～20ng/ml EGF(R&D公司，货号236-EG)，10～20ng/ml bFGF(R&D公司，货号234-FSE)，5～20ng/ml PDGF(R&D公司，货号222-AB)，1％ITS(Sigma公司，货号I-3146)，5～15mmol/L地塞米松(Sigma公司，货号D-1756)，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素中的两种或两种以上的组合物进行诱导培养，10～14天后即可得到表皮细胞。
(2)体外诱导干细胞向真皮细胞分化将骨髓、脂肪、胚胎、脐带血、外周血、肌肉等组织来源的MSC或其它成体干细胞培养在含10％胎牛血清(Biochrom公司，货号S0115)的低糖DMEM培养基(Sigma公司，货号D-5523)或者其它成体干细胞相应的基本培养基中，在37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞达到30％～50％的融合，遂改用真皮诱导条件培养液高糖DMEM(Sigma公司，货号D-5648)中含有下列成分2～10％胎牛血清(Biochrom公司，货号S0115)，5～15ng/mlTGF-β1(R&D公司，货号240-B)，10～20ng/ml bFGF(R&D公司，货号234-FSE)，1％ITS(Sigma公司，货号I-3146)，5～15mmol/L地塞米松(Sigma公司，货号D-1756)，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素中的两种或两种以上的组合物进行诱导培养，10～14天后即可得到真皮细胞。
(3)胶原溶液制备和支持材料的准备新鲜牛尾浸于75％酒精中，无菌条件下剥离牛肌腱，生理盐水洗涤，剪碎，加入0.03～0.05M冰醋酸4℃反复振摇溶解，制备胶原溶液。加入1/10体积的10×低糖DMEM(Sigma公司，货号D-5523)，适量的胎牛血清，用1N的NaOH调节pH值至7.2～7.4。使用前将所需的胶原溶液注入培养皿中，置于冰上，紫外灯下照射30min～60min。
将猪、牛、羊等各种哺乳动物或其它来源的皮肤脱细胞基质或其它商业脱细胞基质或者诸如胶原海绵、蚕丝蛋白、PLA、PGA、PLGA等可降解、疏松多孔的生物或者聚合物材料进行钴60照射灭菌，用低糖DMEM培养基洗3次，之后置于4℃存放，待用。
(4)组织工程全层皮肤的制备将脱细胞基质或其它生物支架材料或聚合物材料(如家蚕丝或柞蚕丝溶解提纯得到的丝胶、丝素及甲壳素、纤维素、聚氨基酸、PLGA、PGA、PLA、聚酰胺、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚氯乙稀、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、硝化纤维等)放在硅化处理过的培养板(或其它培养皿)中。将向真皮细胞诱导10～14天的细胞群消化，用含10％胎牛血清(Biochrom公司，货号S0115)的低糖DMEM培养基(Sigma公司，货号D-5523)重悬，计数，和胶原溶液混合均匀，按1×103～5×104个/cm2的密度种进支持材料中。加入适量含10％胎牛血清(Biochrom公司，货号S0115)的低糖DMEM培养基(Sigma公司，货号D-5523)，静置10分钟，随后放入37℃，5％CO2培养箱中培养，4h后将培养基吸去，换成真皮细胞培养液培养。2天后将向表皮细胞诱导10～14天的细胞群消化，用含10％胎牛血清(Biochrom公司，货号S0115)的低糖DMEM培养基(Sigma公司，货号D-5523)重悬，计数，按2×103～2×105个/cm2的密度均匀种植于含有真皮细胞的材料表面。2h后将培养基吸去，换成表皮细胞培养液进行培养，3天后换成气-液界面培养，继续培养7天后即可用于皮肤创伤的修复。
本发明是将不同组织来源的干细胞在体外分别向表皮和向真皮细胞定向诱导分化后再与猪、牛、羊等各种哺乳动物或其它来源的皮肤脱细胞基质或其它商业脱细胞基质或者诸如胶原海绵、蚕丝蛋白、PLA、PGA、PLGA等可降解、疏松多孔的生物或者聚合物材料结合起来，共同构成组织工程化皮肤，利用此方法可在支架材料上制备用于临床烧伤、溃疡、创伤、畸形、术后缺损、疤痕等皮肤组织修复和愈合的具有特定形状、厚度的皮肤组织替代物。由于干细胞具有多向分化潜能，能够在诱导条件下分化为表皮细胞和真皮细胞，通过诱导分化的细胞及其分泌的可溶性细胞因子及细胞外基质等活性成分的共同作用，能够加速缺损创面的愈合。因此，市场价值潜力巨大，具有广阔的应用前景。
图1干细胞向表皮细胞诱导分化a诱导分化后5天，细胞呈表皮细胞典型的“铺路石状”(×200)b诱导分化后10天透射电镜观察，相邻细胞间出现桥粒连接(×13000)c免疫组织化学鉴定，诱导分化的细胞表达CK19(×100)d免疫组织化学鉴定，诱导分化的部分细胞表达CK10(×200)图2干细胞向真皮细胞诱导分化a诱导分化后10天透射电镜观察，细胞外出现少量胶原微纤维(×60000)b免疫组织化学鉴定，诱导分化部分细胞表达I型胶原图3组织工程化双层皮肤裸鼠移植试验及体内免疫荧光检测a覆盖组织工程化双层皮肤的裸鼠移植试验模型b免疫荧光鉴定，组织工程化双层皮肤移植后3天，裸鼠皮肤细胞表达CK10c免疫荧光鉴定，组织工程化双层皮肤移植后7天，细胞向皮肤缺损创面迁移d组织工程化双层皮肤裸鼠移植试验21天后，缺损创面完全愈合
具体实施例方式
实施例1、以骨髓MSC为例，体外分离不同组织来源的干细胞无菌条件下直接抽取患者骨髓，加等量生理盐水稀释，200目筛网过滤，加入6％HES(B.Braun公司)沉降红细胞，吸取上层细胞悬液，离心去上清，加生理盐水制成细胞悬液，用比重1.073g/ml的Percoll分离液(AmershamBiosciences公司，货号17-0891-01)分离(1000g×20min)，小心吸出中间层细胞，用含10％胎牛血清(Biochrom公司，货号S0115)的低糖DMEM培养基(Sigma公司，货号D-5523)重悬，接种于T-25培养瓶中。置CO2培养箱(温度设定为37℃，CO2浓度为5％)内培养；培养72h后换液，此后依细胞生长速度对培养体系进行换液，待培养瓶内细胞长至80％以上融合时，用0.25％的胰蛋白酶37℃消化细胞，分别按5.5～7.0×103个/cm2接种于培养瓶中，置CO2培养箱培养。
实施例2、体外诱导MSC向表皮细胞分化将骨髓来源的MSC种植于预先铺有Matrigel胶(BD公司，货号354240)的孔板上，加入含(Biochrom公司，货号S0115)的低糖DMEM培养基(Sigma公司，货号D-5523)，于37℃，5％CO2培养箱中进行培养至细胞达到50％的融合，遂改用表皮诱导条件培养液低糖DMEM/DF12(1∶1)培养基(Sigma公司，货号D-0547)，15ng/ml EGF(R&D公司，货号236-EG)，15ng/ml bFGF(R&D公司，货号234-FSE)，5ng/ml PDGF(R&D公司，货号222-AB)，1％ITS(Sigma公司，货号I-3146)，10mmol/L地塞米松(Sigma公司，货号D-1756)，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素进行诱导培养，10～14天后即可得到表皮细胞。结果显示，干细胞向表皮细胞诱导分化后5天，细胞呈表皮细胞典型的“铺路石状”。诱导分化后10天，胞浆中出现大量张力细丝和黑色素小体，免疫荧光检测细胞表达CK19，免疫组化检测部分细胞表达CK10(图1)。
实施例3、体外诱导MSC向真皮细胞分化将骨髓来源的MSC种植于预先铺有Matrigel胶的孔板上，加入含10％胎牛血清(Biochrom公司，货号S0115)的低糖DMEM培养基(Sigma公司，货号D-5523)，于37℃，5％CO2培养箱中进行培养至细胞达到50％的融合，遂改用真皮诱导条件培养液高糖DMEM(Sigma公司，货号D-5648)，5％胎牛血清(Biochrom公司，货号S0115)，15ng/mlTGF-β1(R&D公司，货号240-B)，15g/mlbFGF(R&D公司，货号234-FSE)，1％ITS(Sigma公司，货号I-3146)，10mmol/L地塞米松(Sigma公司，货号D-1756)，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素进行诱导培养，10～14天后即可得到真皮细胞。结果显示，干细胞向真皮细胞诱导分化后10天，细胞外出现少量胶原微纤维，免疫组化检测，部分细胞表达I型胶原(图2)。
实施例4、胶原溶液准备新鲜牛尾浸于75％酒精中，无菌条件下剥离牛肌腱，生理盐水洗涤，剪碎，加入0.05M冰醋酸4℃反复振摇溶解，制备胶原溶液。加入1/10体积的10×低糖DMEM，适量的胎牛血清，用1N的NaOH调节pH值至7.2～7.4。使用前将所需的胶原溶液注入培养皿中，置于冰上，紫外灯下照射40min。
实施例5、以脱细胞基质为例，制备组织工程化双层皮肤将牛来源的皮肤脱细胞基质进行钴60照射灭菌，用低糖DMEM培养基洗3次，之后置于硅化处理过的培养板(或其它培养皿)中。将向真皮细胞诱导10～14天的细胞群消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬，计数，和胶原溶液混合均匀，按5×104个/cm2的密度种进支持材料中。加入适量含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基，静置10分钟，随后放入37℃，5％CO2培养箱中培养，4h后将培养基吸去，换成真皮细胞培养液培养。4天后将向表皮细胞诱导10～14天的细胞群分别消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬，计数，以2×105个/cm2的密度均匀种植于含有真皮细胞的材料表面。2h后将培养基吸去，换成表皮细胞培养液进行培养，3天后换成气-液界面培养，继续培养7天后组织工程化双层皮肤即可用于移植。
实施例6、组织工程化双层皮肤修复裸鼠创面实验用3.5％水合氯醛麻醉裸鼠后，于背部尾侧切取全层皮肤作直径1.5cm的圆形缺损创面，移植组织工程化双层皮肤替代物。结果显示术后3天去除包扎敷料，皮肤与创面贴合较紧，成活，裸鼠皮肤缺损创面细胞表达CK10；移植后7天，细胞向皮肤创面迁移；移植后21天，裸鼠皮肤缺损处完全愈合，皮肤生长完好，未见疤痕(图3)。
权利要求
1.一种组织工程化双层皮肤的构建方法，其特征在于由向表皮细胞和向真皮细胞诱导分化的细胞群与生物材料共同构建而成。
2.根据权利要求1所述的组织工程化双层皮肤的构建方法，其特征在于所述的向表皮细胞或向真皮细胞诱导分化的细胞包括从脐带血、外周血、骨髓、脂肪、胎盘、脐带等组织分离的干细胞经体外诱导分化而获得。
3.根据权利要求1所述的组织工程化双层皮肤的构建方法，其特征在于所述的生物材料包括可降解型生物材料包括家蚕丝或柞蚕丝溶解提纯得到的丝胶、丝素及胶原、甲壳素、纤维素、聚氨基酸、PLGA、PGA、PLA；还包括脱细胞真皮基质；非降解型生物材料如聚酰胺、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚氯乙稀、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、硝化纤维。
4.根据权利要求1所述的组织工程化双层皮肤的构建方法，包括有不同组织来源的干细胞的分离、干细胞的体外诱导分化、与生物材料的共培养，其特征在于，本发明方法包括以下步骤(1)不同组织来源的干细胞的分离培养；(2)不同组织来源干细胞向表皮细胞诱导分化；(3)不同组织来源干细胞向真皮细胞诱导分化；(4)胶原溶液制备和支持材料的准备；(5)含有诱导分化的表皮细胞和真皮细胞的组织工程化双层皮肤的构建1)将脱细胞基质或者其它生物或者聚合物材料放在硅化处理过的培养板(或其它培养皿)中，将向真皮细胞诱导10～14天的细胞群消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬，计数，和胶原溶液混合均匀，按1×103～5×104个/cm2的密度种进支持材料中，加入适量含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基，静置10分钟，随后放入37℃，5％CO2培养箱中培养，4h后将培养基吸去，换成真皮细胞培养液培养；2)2天后将向表皮细胞诱导10～14天的细胞群消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬，计数，按2×103～2×105个/cm2的密度均匀种植于含有真皮细胞的材料表面；3)2h后将培养基吸去，换成表皮细胞培养液进行培养，3天后换成气-液界面培养，继续培养7天后即可用于皮肤创伤的修复。
5.根据权利要求1所述的组织工程化双层皮肤的构建方法，其特征在于用于诱导不同组织来源干细胞向表皮细胞分化的培养基是在低糖DMEM/DF12(1∶1)培养基中含有下列成分EGF，bFGF，PDGF，ITS，地塞米松，青霉素，链霉素中的两种或两种以上的组合物。
6.根据权利要求1所述的组织工程化双层皮肤的构建方法，其特征在于用于诱导干细胞向真皮细胞分化的培养基是在高糖DMEM培养基中含有下列成分胎牛血清，TGF-β1，bFGF，ITS，地塞米松，青霉素，链霉素中的两种或两种以上的组合物。
7.根据权利要求1所述的组织工程化双层皮肤的构建方法，其特征在于用于干细胞向表皮细胞分化的一种诱导方案可以是低糖DMEM/DF12(1∶1)培养基，15ng/ml EGF，15ng/ml bFGF，5ng/ml PDGF，1％ITS，10mmol/L地塞米松，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素。
8.根据权利要求1所述的组织工程化双层皮肤的构建方法，其特征在于用于干细胞向真皮细胞分化的一种诱导方案可以是高糖DMEM，5％胎牛血清，15ng/mlTGF-β1，15g/ml bFGF，1％ITS，10mmol/L地塞米松，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素。
9.组织工程化双层皮肤的应用，其特征在于根据权利要求1所述方法构建的组织工程化双层皮肤可制备应用于临床烧伤、溃疡、创伤、畸形、术后缺损、疤痕等皮肤组织修复和愈合的皮肤组织替代物。
全文摘要
本发明涉及生物医学领域，具体是涉及将来自不同组织的干细胞在体外分别向表皮和向真皮细胞定向诱导分化，并将诱导分化的细胞群与生物材料相结合，共同构建组织工程化双层皮肤的方法。利用此方法可在支架材料上制备用于临床烧伤、溃疡、创伤、畸形、术后缺损、疤痕等皮肤组织修复和愈合的具有特定形状、厚度的皮肤组织替代物。由于干细胞具有多向分化潜能，能够在诱导条件下分化为表皮细胞和真皮细胞，通过诱导分化的细胞及其分泌的可溶性细胞因子及细胞外基质等活性成分的共同作用，能够加速缺损创面的愈合。因此，市场价值潜力巨大，具有广阔的应用前景。
文档编号A61L27/38GK101062429SQ20061007636
公开日2007年10月31日 申请日期2006年4月24日 优先权日2006年4月24日
发明者裴雪涛, 何丽娟, 陈琳, 南雪, 王韫芳, 管利东, 刘大庆, 白慈贤 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所