生物合成多肽融合抑制剂的制作方法

专利名称：：生物合成多肽融合抑制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抑制膜融合事件并且包含至少一个非天然编码的氨基酸或利用至少一个非天然编码的氨基酸制造的生物合成多肽和融合蛋白。
背景技术：
：呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytialVirus,RSV)属于副粘液病毒(Pammyxoviridae)科。RSV是引起婴儿、老人和免疫功能低下的个体(包括但不限于移植患者)下呼吸道感染的主要原因。尚无有效治疗或疫苗。RSV是一种单股反义RNA病毒，其编码ll种蛋白质，其中有9种为结构蛋白并且有2种为病毒复制的调控蛋白。RSV含有两种主要的表面糖蛋白，意即使病毒与宿主受体连接的受体结合蛋白(G)和使病毒能够进入宿主细胞的融合(F)蛋白。在中性pH下发生的RSV包膜的融合诱导受感染细胞与近旁未受感染的细胞之间巨大合胞体的形成。F蛋白裂解产生两个经二硫键连接的多肽，即来自C末端的F1和来自N末端的F2。与这两个区相邻的为两个称为HR-C和HR-N的七肽重复序列，其形成使病毒与宿主细胞膜融合的具有发夹样结构的三聚体。七肽区为设计与HR-N结合且因此防止发夹样结构形成及随后融合的抑制肽的潜在标靶。RSV的融合过程与HIV融合机制极其类似。两个独立的研究小组已集中在研发抑制RSV进入的肽。就阻断HIV融合的产品FUZEON(Roche)来说，源自HR-C区的肽是类似的。也己证实具有常见阴离子特征的肽(诸如，源自GTPaseRhoA的肽)针对RSV具有抗病毒活性。这些RhoA来源的肽显然是通过抑制病毒细胞表面接触的单独机制起作用。肽被广泛用于研究和医学实践中，并且可以预期随着肽产品的制造和性能难题的解决，肽的重要性将增加。治疗肽(诸如本文所述的肽)被称为生物合成肽融合抑制剂(BPFI)。当将天然肽或其类似物用于疗法中时，通常会发现其具有极高的降解和/或清除率。在需要于较长时间段内保持高的治疗剂血液含量的情况下，治疗剂的高清除率相当不便，这是因为随后将需要重复投药。在一些情况下，可能通过施用适当的医药组合物来影响肽的释放曲线，但这种方法具有多个缺点且通常并不适用。肽酶通过跨肽键插入水分子来使肽中的肽键断裂。一般说来，大部分肽都是通过体内的肽酶以一种数分钟或更短的方式断裂。此外，一些肽酶对于某些类型的肽具有特异性，从而使其降解甚至更快。因此，如果将肽用作治疗剂，那么其活性通常会随着由肽酶作用引起的体内肽的迅速降解而降低。克服这一缺点的一种方式是对患者投与较大剂量的所关注的治疗肽，以致即使一些肽降解，仍有足够肽保持治疗有效性。然而，这种方法令患者相当不舒服。由于大部分治疗肽无法经口投与，故治疗肽将需要持续输注、通过静脉内注射频繁投与或者通过不方便的皮下注射途径频繁投与。对于频繁投药的需求也导致许多潜在肽治疗剂在每一治疗过程中的预计成本高的令人无法接受。大量降解肽的存在还可能产生不合需要的副作用。共价连接亲水性聚合物聚(乙二醇)(縮写为PEG)为一种增加许多生物活性分子(包括蛋白质、肽和尤其疏水性分子)的水溶性和生物利用性、增加其血清半衰期、增加其治疗半衰期、调节其免疫原性、调节其生物活性或延长其循环时间的方法。PEG已经广泛用于药品中、人工移植物上以及生物相容性、毒性缺乏和免疫原性缺乏至关重要的其它应用中。为使PEG的所需特性最大化，与生物活性分子连接的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高以赋予通常与PEG聚合物连接有关的有利特征，诸如增加的水溶性和循环半衰期，而不会不利地影响母体分子的生物活性。PEG衍生物通常经由反应性化学官能团与生物活性分子连接，所述官能团诸如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N末端和碳水化合物部分。蛋白质和其它分子通常具有有限数目的可用于聚合物连接的反应性位点。通常，最适于经由聚合物连接进行修饰的位点在受体结合中具有重要作用，并且为分子生物活性的保留所必需。结果，聚合物链与生物活性分子上所述反应性位点的不加选择的连接通常引起经聚合物修饰的分子的生物活性显著降低乃至完全丧失。R.Clark等人，(1996),J.Biol.Chem.,271:21969-21977。为形成具有赋予标靶分子所需优势的足够聚合物分子量的接合物，现有技术方法通常已涉及将众多聚合物臂与所述分子随机连接，从而增加母体分子的生物活性降低乃至完全丧失的风险。形成用于将PEG衍生物与蛋白质连接的基因座的反应性位点受蛋白质结构支配。蛋白质(包括酶)是由具有通用结构H2N—CHR—COOH的各种a氨基酸序列组成。一种6氨基酸的a氨基部分(H2N--)与相邻氨基酸的羧基部分(--COOH)连接形成酰胺键，其可表示为--(NH--CHR—C0)n--，其中下标"n"可等于数百或数千。由R表示的片段可含有用于蛋白质生物活性且用于连接PEG衍生物的反应性位点。举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在e位以及a位中存在-NH2部分。在碱性pH条件下s-NH2不发生反应。在以PEG对蛋白质进行衍生的领域中的许多技术已针对研发用于连接蛋白质中所存在的赖氨酸残基的e—NH2部分的PEG衍生物。"PolyethyleneGlycolandDerivativesforAdvancedPEGylation",NektarMolecularEngineeringCatalog,2003，第1-17页。然而，这些PEG衍生物都具有共同的局限，即其不能选择性地安装于蛋白质表面上所存在的通常众多的赖氨酸残基上。与在受体结合位点的情况下一样，在赖氨酸残基对于蛋白质活性重要(例如存在于酶活性位点中)的情况下，或在赖氨酸残基对于介导蛋白质与其它生物分子的相互作用起作用的情况下，此可为重要限制。用于蛋白质聚乙二醇化的现有方法的第二且同样重要的新增问题在于除所需反应之外，PEG衍生物可经历与残基的不合需要的副反应。组氨酸含有反应性亚氨基部分(结构表示为--N(H)--)，但与￡-->^2反应的许多化学反应性物质也可与--:^印--反应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链带有游离巯基，其结构表示为-SH。在一些情况下，针对赖氨酸s-NH2基团的PEG衍生物也可与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。此可产生经PEG衍生的生物活性分子的复杂异质混合物和破坏所靶向的生物活性分子的活性的风险。需要研发允许在蛋白质内的单一位点处引入化学官能团的PEG衍生物，其随后会使一种或一种以上PEG聚合物与生物活性分子在蛋白质表面上经明确定义且可预测的特异性位点处选择性偶合。除赖氨酸残基之外，所属领域中已针对研发靶向其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N末端)的活性PEG试剂作出相当大的努力。例如参看美国专利第6,610,281号，其是以引用的方式并入本文中；和"PolyethyleneGlycolandDerivativesforAdvancedPEGylation",NektarMolecularEngineeringCatalog,2003,第1-17页。可使用定点突变诱发和所属领域中已知的其它技术将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结构中，且所得游离巯基部分可与带有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。然而，这种方法相当复杂，原因在于引入游离巯基会使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性复杂化。因此，需要具有一种将化学官能团引入生物活性分子中的方法，其能够使一种或一种以上PEG聚合物与蛋白质选择性偶合，而同时与巯基和通常见于蛋白质中的其它化学官能团相容(即，不与其进行不需要的副反应)。自所属领域的取样可见，针对与蛋白质的侧链(具体说来，赖氨酸氨基酸侧链上的-NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分)连接所研发的这些衍生物中的多种已经证明在其合成和使用中有问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定键，其在水性环境中(诸如在血流中)经历水解且因此分解、降解或在其它方面不稳定。一些衍生物形成较稳定的键，但在键形成之前经历水解，这意谓着PEG衍生物上的反应性基团可在蛋白质连接之前失活。一些衍生物具有些许毒性且因此不太适用于活体内。一些衍生物反应过慢以致于实际上无用。一些衍生物通过与负责蛋白质活性的位点连接而导致蛋白质活性丧失。一些衍生物对于其将连接的位点无特异性，这也可导致所需活性丧失且结果缺乏再现性。为克服与用聚(乙二醇)部分修饰蛋白质相关的难题，已研发出较稳定(例如，美国专利6,602,498，其是以引用的方式并入本文中)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应(例如，美国专利6,610,281，其是以引用的方式并入本文中)的PEG衍生物。在所属领域中明显需要直到要求选择性反应形成稳定化学键之前都在生理环境中呈化学惰性的PEG衍生物。近来，在蛋白质科学中己报导一种全新的技术，其有希望克服与蛋白质的位点特异性修饰相关的许多局限。具体说来，已将新组分加到原核生物大肠杆菌(￡^^/^/力^//;co/O(例如，L.Wang等人，(2001),Science292:498-500)和真核生物酿酒酵母(SaccAra/w戸scerev涵e;S.(例如，J.Chin等人，Science301:964-7(2003))的蛋白质生物合成机构中，其使得能够在活体内向蛋白质中并入非基因编码的氨基酸。使用这种方法，已经回应琥珀密码子TAG而将具有新颖化学、物理或生物特性的众多新颖氨基酸(包括光亲和性标记和可光异构化氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基酸)有效且高保真地并入大肠杆菌和酵母中的蛋白质中。例如参看J.W.Chin等人，(2002),JournaloftheAmericanChemicalSociety124:9026-9027;J.W.Chin,&P.G.Schultz,(2002)，ChemBioChem3(11):1135-1137;J.W.Chin等人，(2002),PNASUnitedStatesofAmerica99:11020-11024:和L.Wang,&P.G.Schultz.园2),Chem.Comm.,1:1-11。这些研究已证实有可能选择性且常规地引入诸如酮基、炔基和叠氮基部分的化学官能团，所述化学官能团未见于蛋白质中，对见于20种常见基因编码氨基酸中的所有官能团呈化学惰性并且可用于有效且选择性地反应以形成稳定共价键。将非基因编码的氨基酸并入蛋白质中的能力允许引入可提供天然存在官能团(诸如赖氨酸的s-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等)的有价值替代物的化学官能团。已知某些化学官能团对见于20种常见基因编码氨基酸中的官能团呈惰性，但完全且有效地反应以形成稳定键。举例来说，在所属领域中已知叠氮基和乙炔基在存在催化量的铜的情况下在水性条件中经历Huisgen[3+2]环加成反应。例如参看Tomoe等人，(2002)J.Org.Chem.67:3057-3064;和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599。举例来说，通过将叠氮基部分引入蛋白质结构中，能够并入对见于蛋白质中的胺、巯基、羧酸、羟基呈化学惰性但也与乙炔部分平稳且有效地反应形成环加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮基在存在其它蛋白质侧链的情况下且在生理条件下保持化学惰性且不起反应。本发明尤其针对与BPFI的活性和制备相关的问题，且也针对具有改良的生物或药理学特性(诸如改良的治疗半衰期)的BPFI的制备。
发明内容本发明提供HR-C源性肽的具有改良的螺旋倾向的RSV进入抑制剂。本发明还提供具有融合抑制剂活性与阴离子肽活性的组合的RSV进入抑制剂。本发明还提供具有位点特异性聚乙二醇化以改良肽的药理学特性的BPFI。本发明提供生物合成肽融合抑制剂(BPFI)，其包括但不限于膜融合抑制肽和阴离子肽，BPFI包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸。具有治疗活性的任何BPFI、其片段、类似物或变体都可用于本发明中。已提供可用于本发明中的BPFI的众多实例。然而，所提供的列表并不详尽并且不欲以任何方式限制可用于本发明中的BPFI的数量或类型。因此，可根据本发明对任何BPFI和/或由任何BPFI(包括新颖BPFI)产生的片段、类似物和变体进行修饰并且在治疗上使用。在一些实施例中，BPFI包含一个或一个以上翻译后修饰。在一些实施例中，BPFI与连接基、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，BPFI与双官能聚合物、双官能连接基或至少一种其它BPFI连接。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物与第二多肽连接。在一些实施例中，第二多肽为BPFI。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸与具有连接基的水溶性聚合物连接或与水溶性聚合物键结。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸与具有可生物降解的连接基的水溶性聚合物连接。在一些实施例中，可生物降解的连接基可用于形成包含BPFI的前药。在所述前药方法的一个实例中，水溶性聚合物阻断BPFI活性并且连接基的降解释放活性BPFI。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸与酰基部分或酰基链连接。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸通过连接基与酰基部分或酰基链连接。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸通过聚(乙二醇)连接基或前药与酰基部分或酰基链连接。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸与血清白蛋白连接。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸通过连接基与血清白蛋白连接。在一些实施例中，连接基为聚(乙二醇)或前药。在一些实施例中，连接基为两次裂解(dualcleavage)的前药，其中第1步骤为诸如白蛋白的分子的受控释放并且第2步骤为连接基或其部分的第二次裂解释放。在一些实施例中，BPFI包含BPFI中存在的两个氨基酸之间的分子内桥。在一些实施例中，BPFI包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸。两个桥接残基中一个可为非天然编码的氨基酸或天然编码的氨基酸。非天然编码的氨基酸可通过连接基、聚合物或生物活性分子接合。在一些实施例中，BPFI包含至少两个与包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物连接的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸为非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入BPFI的任何位置处，诸如HR-C、HR-N或阴离子肽、这些肽中任一者或一者以上的融合体或这些肽中任一者或一者以上的片段、第一氨基酸(氨基酸末端处)之前、在羧基末端处添加或其任何组合。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入BPFI氨基酸序列内的任何位置处。在一些实施例中，在这些位置的一个或一个以上位置中的非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，本发明的BPFI多肽在与BPFI序列相邻或BPFI序列内的一个或一个以上氨基酸位置处包含一个或一个以上非天然存在的氨基酸以提供拮抗剂。在一些实施例中，BPFI包含调节BPFI对BPFI受体或结合搭配物(包括但不限于，蛋白质、多肽、小分子、脂质或核酸)的亲和力的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的稳定性相比时增加BPFI的稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的免疫原性相比时调节BPFI的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的血清半衰期或循环时间相比时调节BPFI的血清半衰期或循环时间的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的水溶性相比时增加BPFI的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的溶解性相比时增加宿主细胞中所产生的BPFI的溶解性的取代、10添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的表达或合成相比时增加宿主细胞中BPFI的表达或增加活体外合成的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的肽酶或蛋白酶敏感性相比时降低BPFI的肽酶或蛋白酶敏感性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的活性相比时调节BPFI受体或结合搭配物的信号转导活性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与无取代、添加或缺失的相应BPFI的结合相比时调节其与另一分子(诸如受体)的结合的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI包含当与在无取代、添加或缺失的相应BPFI结合后结合搭配物的构象或生物活性相比时调节其结合搭配物的构象或一种或一种以上生物活性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，BPFI中的氨基酸取代可以天然存在或非天然存在的氨基酸进行，条件是至少一个取代是以非天然编码的氨基酸进行。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含羰基、氨基氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸具有以下结构其中n为0-10;Ri为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、垸基、芳基、经取代垸基和经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含氨基氧基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含酰肼基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含酰肼基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸残基包含氨基脲基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸残基包含叠氮基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸具有以下结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中n为0-10;Ri为烷基、芳基、经取代垸基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含炔基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸具有以下结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中n为0-10;R!为垸基、芳基、经取代垸基或经取代芳基；X为O、N、S或不存在；m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，多肽为BPFI激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂。在一些实施例中，BPFI激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含与水溶性聚合物连接的非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，BPFI激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含非天然,码的氨基酸和一个或一个以上翻译后修饰、连接基、聚合物或生物活性分子。在一些实施例中，与水溶性聚合物连接的非天然编码的氨基酸是存在于BPFI的受体结合区内或干扰BPFI的受体结合。在一些实施例中，与水溶性聚合物连接的非天然编码的氨基酸是存在于BPFI的与结合搭配物结合的区域内或干扰结合搭配物与BPFI的结合。本发明还提供经分离核酸，其包含在严格条件下与编码具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列杂交的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包含至少一个选择密码子。在一些实施例中，选择密码子选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子组成的群组。本发明还提供制造与水溶性聚'合物连接的BPFI的方法。在一些实施例中，所述方法包含使包含非天然编码的氨基酸的经分离BPFI与水溶性聚合物接触，所述水溶性聚合物包含与非天然编码的氨基酸反应的部分。在一些实施例中，并入BPFI中的非天然编码的氨基酸对不能与20种常见氨基酸中的任一种反应的水溶性聚合物具有反应性。在一些实施例中，并入BPFI中的非天然编码的氨基酸对不能与20种常见氨基酸中的任一种反应的连接基、聚合物或生物活性分子具有反应性。在一些实施例中，通过使包含含羰基氨基酸的BPFI与包含氨基氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反应来制造与水溶性聚合物连接的BPFI。在一些实施例中，氨基氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基经由酰胺键与聚(乙二醇)分子连接。在一些实施例中，通过使包含羰基的聚(乙二醇)分子与包含包括氨基氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然编码的氨基酸的BPFI反应来制造与水溶性聚合物连接的BPFI。在一些实施例中，通过使包含含炔氨基酸的BPFI与包含叠氮基部分的聚(乙二醇)分子反应来制造与水溶性聚合物连接的BPFI。在一些实施例中，叠氮基或炔基经由酰胺键与聚(乙二醇)分子连接。在一些实施例中，通过使包含含叠氮基氨基酸的BPFI与包含炔部分的聚(乙二醇)分子反应来制造与水溶性聚合物连接的BPFI。在一些实施例中，叠氮基或炔基经由酰胺键与聚(乙二醇)分子连接。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有介于约O.lkDa与约100kDa之间的分子量。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有介于O.lkDa与50kDa之间的分子量。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为分枝聚合物。在一些实施例中，聚(乙二醇)分枝聚合物的各支链具有介于1kDa与100kDa之间或介于1kDa与50kDa之间的分子量。在一些实施例中，与BPFI连接的水溶性聚合物包含聚烷撑二醇部分。在一些实施例中，并入BPFI中的非天然编码的氨基酸残基包含羰基、氨基氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，并入BPFI中的非天然编码的氨基酸残基包含羰基部分且水溶性聚合物包含氨基氧基、酰肼、肼或氨基脲部分。在一些实施例中，并入BPFI中的非天然编码的氨基酸残基包含炔部分且水溶性聚合物包含叠氮基部分。在一些实施例中，并入BPFI中的非天然编码的氨基酸残基包含叠氮基部分且水溶性聚合物包含炔部分。本发明还提供组合物，其包含包括非天然编码的氨基酸的BPFI和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物连接。本发明还提供细胞，其包含编码包含选择密码子的BPFI的聚核苷酸。在一些实施例中，所述细胞包含将非天然编码的氨基酸取代入BPFI中的正交RNA合成酶和/或正13交tRNA。本发明还提供制造包含非天然编码的氨基酸的BPFI的方法。在一些实施例中，所述方法包含在允许BPFI表达的条件下培养包含编码BPFI的聚核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的细胞，和自细胞和/或培养基纯化BPFI。本发明还提供增加BPFI的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。本发明还提供调节BPFI的免疫原性的方法。在一些实施例中，所述方法包含用非天然编码的氨基酸取代天然存在的BPFI中的任一个或一个以上氨基酸和/或将BPFI与连接基、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子连接。本发明还提供用有效量的本发明的BPFI治疗需要所述治疗的患者的方法。在一些实施例中，所述方法包含对患者投与治疗有效量的医药组合物，所述医药组合物包含包括非天然编码的氨基酸的BPFI和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物连接。本发明提供一种包含至少一个连接基、聚合物或生物活性分子的BPFI，其中所述连接基、聚合物或生物活性分子经由以核糖体方法并入多肽中的非天然编码的氨基酸的官能团与多肽连接。在一些实施例中，BPFI经单聚乙二醇化。本发明还提供一种包含与一个或一个以上非天然编码的氨基酸连接的连接基、聚合物或生物活性分子的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸以核糖体方法并入多肽中预选位点处。在另一实施例中，由于用于接合非天然氨基酸的独特化学反应，包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的BPFI与另一分子(包括但不限于，PEG)的接合提供实质上纯化的BPFI。可用在接合步骤之前或之后进行的其它纯化技术来进行包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的BPFI与另一分子(诸如PEG)的接合以提供实质上纯的BPFI。图1_展示T20和TEX的克隆。图2—展示制备BPFI的策略。图3—展示TEX的螺旋分析。图4一展示用于并入非天然编码的氨基酸的选择密码子的抑制。图5—展示CNBr裂解肽以提供BPFI。图6—展示BPFI活性检定。图7图A和图7图B—展示病毒感染性的BPFI抑制。图8—展示BPFI与PEG的接合。图9一展示用于将非天然编码的氨基酸并入T-20和TEX中的构筑体(图9,图A)。图9图B展示CNBr裂解之前和之后的T-20多肽。图10—图10中展示野生型T-20与TEX序列的比较，并且由经琥珀密码子取代的密码子编码的残基用星号标出。图ll一展示用于测试T-20和TEX抗病毒活性的活体外融合检定。图12图A和图12图B—展示T20651抑制(图12,图A)和TEX636抑制(图12，图B)的经考马斯(Coomassie)染色的聚丙烯酰胺凝胶。图12图C和图D中展示图A和图B中所示的样本的Western印迹(抗His)。图12图E展示T-20(T-20-Mut651)和TEX(TEX-Mut636)中以星号表示的经对乙酰基-苯丙氨酸取代的残基。图13—展示具有肽融合抑制剂的RSVF蛋白的图。具体实施例方式定义应了解本发明不限于本文中所述的特定方法、方案、细胞系、构筑体和试剂且因此可变化。还应了解本文中所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，且并不打算限制本发明的范围，本发明的范围将仅由随附权利要求来限定。除非在上下文中另外明确指出，否则如本文中和随附权利要求中所用的单数形式"一"和"所述"包括多个指示物。因此，举例来说，提及一"BPFI"为提及一个或一个以上所述多肽且包括所属领域技术人员已知的其等效物等等。除非另外定义，否则在本文中所用的所有科技术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文中所述类似或等效的任何方法、装置和材料可用于本发明的实践或测试中，但现将描述优选方法、装置和材料。本文中所提及的所有公开案和专利都是以引用的方式并入本文中用于描述和揭示例如所述公开案中所述的构筑体和方法的目的，所述构筑体和方法可结合本发明一起使用。仅提供本文所讨论的公开案在本申请案申请日期之前的揭示内容。不应将本文中任何内容解释为承认发明者可因先前发明或任何其它原因而提前公开所述揭示内容。"BPFI"是指经由肽键共价连接的氨基酸残基的聚合物，其是由具有选择密码子的mRNA产生。BPFI包括但不限于HR-C、HR-N和阴离子肽。BPFI可为长度大于约100个氨基酸并且可包括或可不包括额外氨基酸的聚合物片段，诸如但不限于，前导序列或分泌信号序列。BPFI包括包含HR-C区片段、HR-N区片段或阴离子肽片段或者其任何组合的肽。BPFI还包括包含一个或一个以上源自HR-C的肽和阴离子肽的异二聚肽或多聚肽。BPFI分子包括融合体。融合体包括但不限于RhoA肽-氨基酸连接基-HR-C肽；HR-C肽-氨基酸连接基-RlioA肽。间隔子的大小可变化并且其包括但不限于Gly-Ser连接基。连接基本身可含有非天然编码的氨基酸。非天然编码的氨基酸可在RhoA肽或HR-C肽中经取代以连接包括但不限于聚合物、生物活性分子、PEG或其它化学连接基的分子。连接基还可为T形连接基，其连接RhoA肽和HR-C肽，而且还提供其本身用于包括但不限于聚合物、生物活性分子、PEG或其它化学连接基的连接点。针对"多肽"的描述同样适用于有关"肽"的描述，并且针对"肽"的描述适用于有关"多肽"的描述。术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"适用于天然存在的氨基酸聚合物以及一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码的氨基酸的氨基酸聚合物。所属领域技术人员将了解用于蛋白质的技术和修饰适用于多肽和肽且因此适用于BPFI。术语"实质上纯化"是指可实质上或基本上不含通常伴随见于BPFI天然存在环境(即天然细胞，或者在重组产生BPFI的情况下为宿主细胞)中的蛋白质或与见于BPFI天然存在环境中的蛋白质相互作用的组分的BPFI。可实质上不含细胞物质的BPFI包括具有小于约30%、小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%、小于约5%、小于约4%、小于约3%、小于约2%或小于约1%(以干重计)的污染蛋白质的蛋白制剂。当BPFI或其变体是由宿主细胞重组产生时，蛋白质可以细胞干重的约30%、约25%、约20%、约15%、约10%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%或更小存在。当BPFI或其变体是由宿主细胞重组产生时，蛋白质可以细胞干重计以约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约lmg/L或更小量存在于培养基中。因此，如由本发明的方法所产生的"实质上纯化"BPFI可具有如由适当方法(诸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳)所测定至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%的纯度级别，尤其至少约75%、80%、85%的纯度级别，且更尤其至少约90%的纯度级别、至少约95%的纯度级别、至少约99%或更大的纯度级别。"重组宿主细胞"或"宿主细胞"是指不管将何种方法用于插入(例如，直接吸收、转导、f配对或所属领域中用于产生重组宿主细胞的其它方法)，包括外源聚核苷酸的细胞。外源聚核苷酸可保持为非整合载体(例如，质粒)或者可整合入宿主基因组中。如本文中所用，术语"培养基"包括可支撑或容纳任何宿主细胞的任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性支撑物，所述宿主细胞包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞或大肠杆菌和细胞内含物。因此，所述术语可涵盖宿主细胞已生长于其中的培养基，例如，BPFI己分泌于其中的培养基，包括在增殖步骤之前或之后的培养基。所述术语也可涵盖含有宿主细胞溶菌液的缓冲液或试剂，诸如BPFI于细胞内产生且宿主细胞经溶解或破裂从而释放BPFI的情形。如本文中关于蛋白质再折叠所用的"还原剂"定义为保持处于还原状态的巯基且还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或物质。合适的还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原谷胱甘肽。所属领域技术人员易于了解，多种还原剂适用于本发明的方法和组合物中。如本文中关于蛋白质再折叠所用的"氧化剂"定义为能够从经氧化化合物移除电子的任何化合物或物质。合适的氧化剂包括但不限于氧化谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化二硫苏糖醇、氧化赤藓糖醇和氧。所属领域技术人员易于了解，多种氧化剂适用于本发明的方法中。如本文中所用的"变性剂"定义为将引起多肽可逆展开的任何化合物或物质。变性剂的强度将由特定变性剂的特性和浓度决定。合适的变性剂可为离液剂(chaotrope)、清洁剂、有机溶剂、水可混溶溶剂、磷脂或者两种或两种以上所述试剂的组合。合适的离液剂包括但不限于尿素、胍和硫氰酸钠。有用清洁剂可包括但不限于强清洁剂，诸如十二垸基硫酸钠或聚氧乙烯醚(例如Tween或Triton清洁剂)、Sarkosyl;温和非离子型清洁剂(例如，毛地黄皂苷(digitonin));温和阳离子型清洁剂，诸如N》2,3-(二油烯基氧基)-丙基-N，N,N-三甲基铵；温和离子型清洁剂(例如胆酸钠或脱氧胆酸钠)；或两性离子型清洁剂，其包括但不限于硫代甜菜碱(Zwittergent)、3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基铵基-l-丙烷硫酸盐(CHAPS)和3-(3-氯酰胺基丙基)二甲基铵基-2-羟基-l-丙垸磺酸盐(CHAPSO)。诸如乙腈、低碳垸醇(尤其C2-C4垸醇，诸如乙醇或异丙醇)或低碳垸二醇(尤其C2-C4垸二醇，诸如乙二醇)的水可混溶有机溶剂可用作变性剂。适用于本发明中的磷脂可为天然存在磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇；或合成磷脂衍生物或变体，诸如二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱。如本文中所用的"再折叠"描述将含有二硫键的多肽从不当折叠或展开状态转化为二硫键的天然或适当折叠构象的任何过程、反应或方法。如本文中所用的"共折叠"特别指使用至少两种彼此相互作用的多肽且使展开或不当折叠的多肽转化为天然、适当折叠的多肽的再折叠过程、反应或方法。17如本文所用，"BPFI"应包括那些具有至少一种融合抑制剂生物活性的多肽和蛋白质以及其类似物、同功异型物、模拟物、片段、杂交蛋白、融合蛋白、寡聚体和多聚体、同系物、糖基化模式变体和突变蛋白，而不管生物活性是否相同且另外不管其合成或制造方法如何，所述方法包括但不限于重组(无论是由cDNA、基因组DNA、合成DNA还是其它形式的核酸产生)、合成、转基因和基因活化法。可能通过使用如Maniatis,T.等人，MolecularBiology:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,N.Y.(1982)所揭示的重组DNA技术获得BPFI,并且通过所属领域技术人员已知的方法在宿主细胞中产生BPFI。BPFI还包括天然存在的HR-C、HR-N和/或阴离子肽的医药学上可接受的盐和前药以及所述盐的前药、多晶型物、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变体和立体异构体，以及天然存在的HR-C、HR-N和/或阴离子肽的激动剂、模拟物和拮抗剂变体，和其多肽融合体。术语"BPFI"涵盖在氨基末端、羧基末端或两者处包含额外氨基酸的融合体。例示性融合体包括但不限于例如由BPFI重组表达产生的其中甲硫氨酸与BPFI的N末端连接的甲硫氨酰基BPFI、用于纯化目的的融合体(包括但不限于与聚组氨酸或亲和性抗原决定基的融合体)、与血清白蛋白结合肽的融合体、与血清蛋白(诸如血清白蛋白)的融合体、与免疫球蛋白分子的恒定区(诸如Fc)的融合体和与脂肪酸的融合体。己知各种形式的天然存在的HR-C、HR-N以及阴离子肽核酸和氨基酸序列，也已知其变体(诸如单一氨基酸变体或剪接变体)。各种参考文献揭示通过聚合物接合或糖基化对多肽进行修饰。术语BPFI包括与诸如PEG的聚合物接合的多肽，并且可包含一个或一个以上半胱氨酸、赖氨酸或其它残基的额外衍生化。此外，BPFI可包含连接基或聚合物，其中与连接基或聚合物接合的氨基酸可为根据本发明的非天然氨基酸，或者可利用所属领域中已知的技术将其与天然编码的氨基酸接合，诸如与赖氨酸或半胱氨酸偶合。已报导多肽的聚合物修饰。美国专利第4,904,584号揭示耗尽聚乙二醇化赖氨酸的多肽，其中至少一个赖氨酸残基已缺失或经任何其它氨基酸残基置换。WO99/67291揭示使蛋白质与PEG接合的方法，其中缺失蛋白质上的至少一个氨基酸残基并且在足以实现与蛋白质接合的条件下使蛋白质与PEG接触。WO99/03887揭示属于生长激素总科的多肽的聚乙二醇化变体，其中半胱氨酸残基已经位于多肽指定区内的非必需氨基酸残基取代。WO00/26354揭示一种产生糖基化多肽变体的方法，所述多肽变体与包含至少一个额外糖基化位点的相应母体多肽相比具有降低的致过敏性。美国专利第5,218,092号揭示对粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和其它多肽进行修饰以便当与天然多肽相比引入至少一个额外的碳水化合物链。聚乙二醇化肽的实例包括GW395058、聚乙二醇化肽血小板生成素受体(TPOr)激动剂(deSerresM.等人，StemCells.1999;17(4):203-9)和生长激素释放因子的聚乙二醇化类似物(PEG-GRP;D'AntonioM等人GrowthHormIGFRes.2004Jun;14(3):226-34)。术语BPFI还包括糖基化BPFI，诸如(但不限于)在任何氨基酸位置处糖基化的BPFI，即多肽的N连接或O连接糖基化形式。含有单一核苷酸改变的变体也被视为BPFI的生物活性变体。此外，也包括剪接变体。术语BPFI还包括由化学方式连接或表示为融合蛋白形式的任一种或一种以上BPFI或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、连接基、配体或任何类型的其它生物活性分子的BPFI异二聚体、同二聚体、异多聚体或同多聚体，以及含有例如特定缺失或其它修饰但仍保持生物活性的多肽类似物。术语BPFI涵盖包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失的BPFI多肽。本发明的BPFI可包含用一个或一个以上天然氨基酸进行的修饰以及一个或一个以上非天然氨基酸修饰。已描述在天然存在的BPFI中多个氨基酸位置上的例示性取代，其包括但不限于调节一种或一种所以上BPFI生物活性的取代，诸如(但不限于)增加激动剂活性、增加多肽溶解性、将多肽转变为拮抗剂、降低肽酶或蛋白酶敏感性等，且都涵盖于术语BPFI中。在一些实施例中，BPFI另外包含调节BPFI生物活性的添加、取代或缺失。举例来说，添加、取代或缺失可调节BPFI的一种或一种以上特性或活性。举例来说，添加、取代或缺失可调节对BPFI受体或结合搭配物的亲和力、调节(包括但不限于，增加或降低)受体二聚化、稳定受体二聚体、调节结合搭配物的构象或者一种或一种以上生物活性、调节循环半衰期、调节治疗半衰期、调节多肽稳定性、调节由肽酶或蛋白酶进行的裂解、调节剂量、调节释放或生物可用性、促进纯化或者改良或改变特定投药途径。类似地，BPFI可包含改良多肽检测(包括但不限于，GFP)、纯化或其它特征的蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括但不限于，FLAG或poly-His)或其它基于亲和力的序列(包括但不限于，FLAG、poly-His、GST等)或经连接分子(包括但不限于，生物素)。术语BPFI也涵盖连接的同二聚体、异二聚体、同多聚体和异多聚体，其包括但不限于经由非天然编码的氨基酸侧链与相同或不同非天然编码的氨基酸侧链、与天然编码的氨基酸侧链直接连接或经由连接基间接连接的那些。例示性连接基包括但不限于小有机化合物、多种长度的水溶性聚合物(诸如聚(乙二醇)或葡聚糖)或各种长度的多肽。"非天然编码的氨基酸"是指不是20种常见氨基酸或焦赖氨酸或硒半胱氨酸中的一种的氨基酸。可与术语"非天然编码的氨基酸"同义使用的其它术语为"非天然氨基酸(non-naturalaminoacid)"、"非天然氨基酸(unnaturalaminoacid)"、"非天然存在氨基酸"以及其各种带连字符和不带连字符形式。术语"非天然编码的氨基酸"也包括但不限于通过修饰(例如翻译后修饰)天然编码的氨基酸(包括但不限于，20种常见氨基酸或焦赖氨酸和硒半胱氨酸)产生，但其自身并不通过翻译复合物天然并入生长多肽链中的氨基酸。这些非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于iV-乙酰基葡糖胺基-L-丝氨酸、iV-乙酰基葡糖胺基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。"氨基末端修饰基"是指可与多肽的氨基末端连接的任何分子。类似地，"羧基末端修饰基"是指可与多肽的羧基末端连接的任何分子。末端修饰基包括但不限于各种水溶性聚合物、肽或蛋白质(诸如血清白蛋白)、免疫球蛋白恒定区部分(诸如Fc)或增加肽的血清半衰期的其它部分。术语"官能团"、"活性部分"、"活化基团"、"离去基"、"反应性位点"、"化学反应性基团"和"化学反应性部分"用于所属领域和本文中是指分子的独特的可定义部分或单位。这些术语在化学技术中有些同义且在本文中用于指示执行某种功能或活性且可与其它分子反应的分子部分。术语"键"或"连接基"在本文中用于指通常由化学反应形成且通常为共价键的基团或键。水解稳定键意谓键在水中实质上稳定且在有用pH值下(包括但不限于，在生理条件下)长时间、可能甚至无限期地不与水反应。水解不稳定或可降解键意谓键可在水或水溶液(例如包括血液)中降解。酶促不稳定或可降解键意谓键可由一种或一种以上酶降解。如所属领域所理解，PEG和相关聚合物在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间的连接基团中可包括可降解键。举例来说，由PEG羧酸或活性PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应所形成的酯键在生理条件下通常水解以释放药剂。其它水解可降解键包括但不限于碳酸酯键；由胺与醛反应所产生的亚胺键；由醇与磷酸酯基反应所形成的磷酸酯键；作为酰肼与醛的反应产物的腙键；作为醛与醇的反应产物的縮醛键；作为甲酸酯与醇的反应产物的原酸酯键；由胺基(包括但不限于，在诸如PEG的聚合物末端处的胺基)与肽的羧基形成的肽键；和由亚磷酰胺基(包括但不限于，在聚合物末端处的亚磷酰胺基)与寡核苷酸的5'羟基形成的寡核苷酸键。术语"生物活性分子"、"生物活性部分"或"生物活性剂"当用于本文中时意谓可影响与有机体(包括但不限于，病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、20植物、动物和人类)有关的生物系统、路径、分子或相互作用的任何物理或生物化学特性的任何物质。具体来说，如本文中所用的生物活性分子包括但不限于打算用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其他动物的疾病或以其它方式增强人类或动物的身体或精神良好状态的任何物质。生物活性分子的实例包括但不限于肽、蛋白质、酶、小分子药物、硬性药物(harddrug)、软性药物(softdmg)、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微粒和胶团。适用于本发明的生物活性剂的种类包括但不限于药物、前药、放射性核素、显影剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤药、心血管类药物、抗焦虑药、激素、生长因子、类固醇类药物、微生物产生的毒素等。"双官能聚合物"是指包含两个能够与其它部分(包括但不限于，氨基酸侧基)特异性反应以形成共价键或非共价键的不连续官能团的聚合物。具有一个可与特定生物活性组分上的基团反应的官能团和另一个可与第二生物组分上的基团反应的基团的双官能连接基可用于形成包括第一生物活性组分、双官能连接基和第二生物活性组分的接合物。已知用于将各种化合物与肽连接的众多程序和连接基分子。例如参看欧洲专利申请案第188,256号、美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4，680，338号、第4,569,789号和第4,589,071号，其是以引用的方式并入本文中。"多官能聚合物"是指包含两个或两个以上能够与其它部分(包括但不限于，氨基酸侧基)特异性反应以形成共价键或非共价键的不连续官能团的聚合物。双官能聚合物或多官能聚合物可具有任何所需分子长度或分子量，且可经选择以在与BPFI和其结合搭配物或BPFI连接的一个或一个以上分子之间提供尤其所需的间隔或构象。如果取代基是以从左向右书写的其常规化学式表示，那么其同样涵盖从右向左书写结构所得到的化学上相同的取代基，例如，结构-CH20-等同于结构-OCH2-。术语"取代基"包括但不限于"无干扰取代基"。"无干扰取代基"为产生稳定化合物的那些基团。合适的无干扰取代基或基团包括但不限于卤基、Q-d()垸基、C2-do烯基、C2-C10'块基、C广Cio院氧基、C广Ci2芳院基、C广Ci2院芳基、C3曙C12环院基、C3國C12环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯基、C2-Ci2垸氧基垸基、C2-C12垸氧基芳基、CVd2芳氧基烷基、C7-d2氧基芳基、d-C6烷基亚磺酰基、d-do垸基磺酰基、-(。112)1-0-((:1-(:1()垸基)(其中m为i到8)、芳基、经取代芳基、经取代垸氧基、氟垸基、杂环基、经取代杂环基、硝基垸基、-N02、-CN、-NRC(O)-(d-Cu)烷基)、-C(O)-(d-do烷基)、C2-CK)烷基硫垸基、-C(O)O-(Q-do垸基)、-OH、-S02、=S、-COOH、-NR2、羰基、-C(0)-(d-CK)烷基)-CF3、-C(0)-CF3、-C(0)NR2、-(C广d。芳基)國S-(C6-d。芳基)、-C(O)-(C广do芳基)、-(012)1國0-(-((:112)1-0-((:1-(:10垸基)(其中各m为l到8)、-C(0)NR2、-C(S)NR2、-S02NR2、-NRC(0)NR2、-NRC(S)NR2、其盐等。如本文中所用的R各自为H、垸基或经取代烷基、芳基或经取代芳基、芳垸基或烷芳基。术语"卤素"包括氟、氯、碘和溴。除非另外说明，否则术语"垸基"自身或当作为另一取代基的部分时意谓直链或支链或环状烃基或其组合，其可为完全饱和、单不饱和或多不饱和且可包括具有指定数目碳原子(即d-Qo意谓1到IO个碳)的二价基团和多价基团。饱和烃基的实例包括但不限于诸如以下各基的基团甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基；例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体等。不饱和烷基为具有一个或一个以上双键或三键的垸基。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(l,4-戊二烯基)、乙炔基、l-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及更高同系物和异构体。除非另外说明，否则术语"垸基"也打算包括在下文中更详细定义的那些垸基衍生物，诸如"杂烷基"。限于烃基的烷基被称作"均烷基"。术语"亚烷基"自身或当作为另一取代基的部分时意谓由烷烃衍生的二价基团，例如(但不限于)结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-，且进一步包括下文描述为"亚杂烷基"的那些基团。通常，烷基(或亚垸基)将具有1到24个碳原子，其中本发明优选具有IO个或更少碳原子的那些基团。"低碳垸基"或"低碳亚垸基"为通常具有8个或更少碳原子的较短链烷基或亚烷基。术语"垸氧基"、"烷基氨基"和"烷基硫基"(或硫垸氧基)是以其常规意义使用，且指分别经由氧原子、氨基或硫原子与分子的其余部分连接的那些烷基。除非另外说明，否则术语"杂烷基"自身或当与另一术语组合时意谓由指定数目的碳原子和至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成的稳定直链或支链或环状烃基或其组合，且其中氮和硫原子可视情况经氧化且氮杂原子可视情况经季铵化。杂原子0、N和S以及Si可位于杂烷基的任何内部位置或烷基与分子的其余部分连接的位置处。实例包括但不限于-CH2-CH2-0-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(0)-CH3、-CH2-CH2-S(0)2-CH3、-CH=CH-0-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3和-CH=CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可为连续的，诸如，-CH2-NH-OCH^n-CH2-0-Si(CH3)3。类似地，术语"亚杂垸基"自身或当作为另一取代基的部分时意谓由杂垸基衍生的二价基团，例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2-CH2^-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于亚杂烷基来说，相同或不同杂原子也可占据链末端的一端或两端(包括但不限于，亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨基氧基亚垸基等)。此外，对于亚烷基和亚杂烷基连接基团来说，由连接基团的式书写的方向来暗示连接基团的无方向性。举例来说，式-C(0)2R'-表示-C(0)2R'-与-R'C(0)2-。。除非另外说明，否则术语"环垸基"和"杂环垸基"自身或当与其它术语组合时分别表示"垸基"和"杂烷基"的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和和不饱和环键。另外，对于杂环烷基来说，杂原子可占据杂环与分子的其余部分连接的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、l-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于l-(l，2，5，6-四氢吡啶基)、l-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、l-哌嗪基、2-哌嗪基等。此外，所述术语涵盖双环和三环结构。类似地，术语"亚杂环烷基"自身或当作为另一取代基的部分时意谓自杂环垸基衍生的二价基团，且术语"亚环烷基"自身或当作为另一取代基的部分时意谓自环烷基衍生的二价基团。如本文中所用，术语"水溶性聚合物"是指可溶于水性溶剂中的任何聚合物。水溶性聚合物与BPFI连接可产生包括但不限于以下的改变相对于未经修饰形式增加或经调节的血清半衰期或者增加或经调节的治疗半衰期、经调节的免疫原性、经调节的物理缔合特性(诸如聚集和多聚体形成)、改变的受体结合、改变的与一种或一种以上结合搭配物的结合和改变的受体二聚合或多聚合。水溶性聚合物可具有或可不具有其自身生物活性，且可用作连接BPFI与其它物质(包括但不限于，一种或一种以上BPFI或者一种或一种以上生物活性分子)的连接基。合适的聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单d-do烷氧基或芳氧基衍生物(于美国专利第5,252,714号中描述，其是以引用的方式并入本文中)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚马来酸酐、iV-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括但不限于，甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚垸撑二醇和其衍生物、聚烷撑二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚和a-p-聚[(2-羟基乙基)-DL-天冬酰胺等，或其混合物。这些水溶性聚合物的实例包括但不限于聚乙二醇和血清白蛋白。如本文中所用，术语"聚垸撑二醇"或"聚(烯烃二醇)"是指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。术语"聚烷撑二醇"涵盖线性和分枝聚合物且平均分子量介于O.lkDa与100kDa之间。其它例示性实施例列在例如商业供应商目录中，诸如ShearwaterCorporation的目录"PolyethyleneGlycolandDerivativesforBiomedical23Applications"(2001)。除非另外说明，否则术语"芳基"意谓可为单环或稠合在一起或共价连接的多环(优选1到3个环)的多不饱和芳香族烃取代基。术语"杂芳基"是指含有1到4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子视情况经氧化，且一个或一个以上氮原子视情况经季铵化。杂芳基可通过杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、l-萘基、2-萘基、4-联苯基、l-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧锭基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、l-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环系统中的每一者的取代基选自下文所述的可接受取代基的群组。为了简便起见，当与其它术语(包括但不限于芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)组合使用时，术语"芳基"包括如上所定义的芳基与杂芳基环。因此，术语"芳基垸基"打算包括芳基与烷基连接的那些基团(包括但不限于，苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述垸基包括碳原子(包括但不限于，亚甲基)已经例如氧原子置换的那些烷基(包括但不限于，苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(l-萘基氧基)丙基等)。以上术语(包括但不限于，"烷基"、"杂烷基"、"芳基"和"杂芳基")各自打算包括指定基团的经取代与未经取代形式。每一类基团的例示性取代基提供于下文中。烷基和杂烷基(包括通常称作亚垸基、烯基、亚杂垸基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环垸基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可为选自(但不限于)以下各基的多种基团中的一个或一个以上基团-OR'、=0、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卣素、-SiR'R"R'"、-OC(O)R'、-C(O)R'、-C02R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-CXCONITR'^-NR"C(0)2R'、-NR-C(NR'R"R'")=NR""、-NR-C(NR'R")=NR'"、-S(O)R'、-S(0)2R'、-S(0)2NR'R"、-NRS02R'、-CN和-NO:!，其数目在0到(2m'+l)的范围内，其中m'为此基团中碳原子的总数。R'、R"、R"'和R""各自独立地指氢、经取代或未经取代杂垸基、经取代或未经取代芳基(包括但不限于，经l-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代垸基、垸氧基或硫烷氧基，或芳基烷基。当本发明的化合物包括一个以上R基团时，例如，各R基团是如当存在一个以上这些基团时各R'、R"、R'"和R""基团一样独立地选择。当R'和R"与同一氮原子连接时，其可与氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR'R"打算包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据对取代基的上述论述，所属领域技术人员应了解，术语"垸基"打算包括包含与除氢基外的基团结合的碳原子的基团，诸如卤垸基(包括但不限于，-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括但不限于，-C(0)CH3、-C(0)CF3、-C(0)CH2OCH3等)。与关于垸基所述的取代基类似，芳基和杂芳基的取代基经改变且选自(但不限于):卤素、-OR'、=0、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卣素、-SiR'R"R"'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-C02R'、陽CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(0)2R'、-NR-C(NR'R"R'")=NR""、-NR-C(NR'R")=NR'"、-S(O)R'、-S(0)2R'、-S(0)2NR'R"、-NRS02R'、-CN和-N02、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟(C广C4)垸氧基和氟(C广C4)烷基，其数目在O到芳香族环系统上开放价态的总数的范围内；且其中R'、R"、R'"和R""独立地选自氢、垸基、杂垸基、芳基和杂芳基。当本发明的化合物包括一个以上R基团时，例如，各R基团是如当存在一个以上这些基团时各R'、R"、R'"和R""基团一样独立地选择。如本文中所用，术语"经调节的血清半衰期"意谓经修饰BPFI的循环半衰期相对于其未经修饰形式的阳性或阴性变化。通过在投与BPFI后各个时间点时取血样且测定每一样本中所述分子的浓度来测量血清半衰期。血清浓度与时间的相互关系允许计算血清半衰期。增加的血清半衰期合意地具有至少约两倍的增加，但较小增加也是有用的，例如其能够促成令人满意的给药方案或避免毒性作用的情况。在一些实施例中，增加为至少约3倍、至少约5倍或至少约10倍。如在本文中所用的术语"经调节的治疗半衰期"意谓治疗有效量的BPFI的半衰期相对于其未经修饰形式的阳性或阴性变化。通过在投药后各个时间点时测量分子的药物动力学和/或药效特性和/或治疗作用来测量治疗半衰期。增加的治疗半衰期合意地能够促成特别有益的给药方案、特别有益的总剂量或避免不需要的效应。在一些实施例中，增加的治疗半衰期是由增加的效力、经修饰分子与其标靶的增加或降低的结合、由酶(诸如肽酶或蛋白酶)对分子的增加或降低的分解或者未经修饰分子的另一参数或作用机制的增加或降低而产生。当应用于核酸或蛋白质时，术语"经分离"表示核酸或蛋白质实质上不含在天然状态下与其有关的其它细胞组分。其可为均质状态。经分离物质可为干燥或半干燥状态，或为溶液(包括但不限于水溶液)形式。通常使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱的分析化学技术来测定纯度和均质性。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质实质上纯化。具体来说，经分离基因是从侧接基因且编码除所关注基因之外的蛋白质的开放阅读框分离。术语"经纯化"表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生实质上一个谱带。具体来说，其意谓核酸或蛋白质为至少85%纯、至少90%纯、至少95%纯、至少99%纯或更纯。术语"核酸"是指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸以及其聚合物。除非另外限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也指寡核苷酸类似物，包括PNA(肽核酸)、反义技术中使用的DNA类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等等)。除非另外说明，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰变体(包括但不限于，简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。特定来说，可通过产生一个或一个以上所选(或所有)密码子的第三位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人，M/c/"c爿"W19:5081(1991);Ohtsuka等人，/C/zew.260:2605-2608(1985);和Cassol等人(1992);Rossolini等人，Afo/.Ce〃.iVo6es8:91-98(1994))。术语"氨基酸"是指天然存在和非天然存在的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及焦赖氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构的化合物，B卩，与氢、羧基、氨基和R基团结合的a碳，诸如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。所述类似物具有经修饰R基团(诸如，正亮氨酸)或经修饰肽主链，但保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。在本文中可由氨基酸的通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推荐的单字母符号来指代氨基酸。同样，可由核苷酸的通常接受的单字母编码来指代核苷酸。"保守性修饰变体"适用于氨基酸与核酸序列。对于特定核酸序列来说，"保守性修饰变体"是指编码一致或基本上一致的氨基酸序列的那些核酸，或其中核酸不将氨基酸序列编码成基本上一致序列。由于遗传密码的简并性，故大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子表示丙氨酸的每一位置处，密码子可变为所述相应密码子中的任一个而不会改变所编码的多肽。所述核酸变异为"沉默变异"，其为保守性修饰变异的一种。编码多肽的本文中的每一核酸序列也描述核酸的每一可能的沉默变异。所属领域技术人员应26认识到，核酸中的每一密码子(除AUG和TGG之外，AUG通常为甲硫氨酸的唯一密码子，且TGG通常为色氨酸的唯一密码子)可经修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每一沉默变异在每一所述序列中为隐含的。至于氨基酸序列，所属领域技术人员应认识到，改变、添加或缺失编码序列中的单一氨基酸或小百分比氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加为"保守性修饰变体"，其中所述改变使得氨基酸经化学上类似的氨基酸取代。所属领域技术人员众所周知提供功能类似的氨基酸的保守性取代列表。所述保守性修饰变体是在本发明的多态变体、种间同源物和等位基因的范围之外且不将其排除在外。以下八组各自含有作为彼此的保守性取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(例如参看Creighton,5^rw"wmsMo/ect//or尸roper"es(WHFreeman&Co.;第2版(1993年12月))。在有关两个或两个以上核酸或多肽序列的上下文中，术语"一致"或"一致性"百分比是指相同的两个或两个以上序列或子序列。当经比较窗比较且比对最大符合或如使用以下序列比较算法中的一种或者通过手工比对且目测检查所测量指定区域时，如果序列具有相同(即，在指定区域上约60%—致性，视情况约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%或约95%—致性)的氨基酸残基或核苷酸百分比，那么其"实质上一致"。此定义也指测试序列的补体。一致性可存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域内，或长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域内，或(在未指定时)在整个聚核苷酸或多肽序列中，或者长度小于50个氨基酸或核苷酸的区域内。对于序列比较来说，通常一个序列充当与测试序列相比较的参考序列。在使用序列比较算法时，将测试序列与参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定替代参数。随后序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。如本文中所用，"比较窗"包括参考选自由20到600、通常约50到约200、更通常约100到约150组成的群组的连续位置数中的任一者的区段，其中在两个序列经最佳比对之后，可将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列相比较。所属领域众所周知用于比较的序列比对方法。可通过以下方法进行用于比较的最佳序列比对，这些方法包括但不限于Smith和Waterman(1970)爿dv.j^p/.MaA.2:482c的局部同源算法；Needleman和Wunsch(1970)/Mo/.所o/.48:443的同源比对算法；Pearson和Lipman(1988)Ato7.Jo^.f/5L485:2444的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实施(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA);或手工比对和目测检查(例如参看Ausubel等人，Cwre"fiVWoco/sMo/ecw/ar5z'o/ogy(1995年增干U))。适用于测定序列一致性百分比和序列相似性百分比的算法的一个实例为BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人，(1997)iVwc.爿c/ds25:3389-3402和Altschul等人，(1990)JMo/.脂.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公开获得。BLAST算法参数W、T和X测定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列来说)使用字长(W)11、期望值(E)10、M=5、N二-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列来说，BLASTP程序使用字长3和期望值(E)10作为默认值，且BLOSUM62得分矩阵(参看Henikoff和Henikoff(1992)/Voc.JVa".力cfldSc/.89:10915)使用比对数(B)50、期望值(E)10、M=5、N二-4以及两条链的比较作为默认值。通常在"低复杂性"过滤器关闭的情况下进行BLAST算法。BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(例如参看Karlin和Altschul(1993)Prac.Ato/.^cadScz'.90:5873-5787)。由BLAST算法提供的相似性的一个量度为最小和概率(smallestsumprobability,P(N))，其提供对于两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然会发生匹配的概率的指示。举例来说，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率小于约0.2、更优选小于约0.01且最优选小于约0.001,那么认为核酸与参考序列类似。"与……选择性(或特异性)杂交"一词是指当复杂混合物(包括但不限于，总细胞DNA或RNA或文库DNA或RNA)中存在特定核苷酸序列时，在严格杂交条件下分子仅与所述序列结合、二联或杂交。"严格杂交条件"一词是指如所属领域已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严格条件下，探针会与核酸的复杂混合物(包括但不限于，总细胞DNA或RNA或文库DNA或RNA)中的其标靶子序列杂交，但不与复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件具序列依赖性且在不同环境下会不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛矛旨导见于Tijssen,丄a6on^ory7fec/m/《wes/"5z'oc/^附"^yMo/ecw/ar5/o/ogy-//>>6WWza"oww"/ziVwc/e/ciVo6es，"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)中。对于指定离子强度pH值下的特定序列来说，严格条件通常经选择为低于热熔点(Tm)约5°C-10°C。Tm为与标靶互补的探针的50%与标靶序列杂交处于平衡(因为标靶序列过量存在，在Tm下，在平衡时占据50%的探针)时的温度(在指定离子强度、pH值和核酸浓度下)。严格条件可为在pH值7.0到8.3下盐浓度小于约l.OM钠离子、通常约0.01M到l.OM钠离子浓度(或其它盐)且温度对于短探针(包括但不限于，10到50个核苷酸)来说为至少约30'C且对于长探针(包括但不限于，大于50个核苷酸)来说为至少约60'C的那些条件。也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严格条件。对于选择性或特异性杂交来说，正信号可为至少两倍背景、视情况10倍背景杂交。例示性严格杂交条件可如下50。/。甲酰胺、5xSSC和1%SDS，在42T:下培育；或5xSSC、1%SDS，在65'C下培育，其中在65。C下在0.2xSSC和0.1%SDS中洗涤。这些洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。如本文中所用，术语"真核生物"是指属于系统发育真核领域的有机体，诸如动物(包括但不限于，哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括但不限于，单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。如本文中所用，术语"非真核生物"是指非真核有机体。举例来说，非真核有机体可属于真细菌(包括但不限于，大肠杆菌、嗜热栖热菌(7Tze/vm^Aenwo;^//^)、嗜热月旨肪芽孢杆菌(5acz7/w51Weara^ze/"附o//n7iw)、荧光假单胞菌(/^ewcto附owas^/7Moresce似)、铜绿假单胞菌(i^ewc/omowosaerwgiwosof)、恶臭假单胞菌(i^ewdomowas/w/7Wa)等)系统发育领域，或古细菌(包括但不限于，詹氏甲垸球菌(Me^mococcM_/"w7"sc/^)、嗜热自养甲院杆菌(il^e^2awo6ofc&r/w7w^zenwoawfo/rop/j/cwm)、嗜盐杆菌(//a/o6ac&r/w附)(诸如嗜盐富饶菌(Ha/o/emjcvo/cam7)和嗜盐杆菌种7ViC-J)、闪烁古生球菌"rc/weog/o6i^/w/gzWw51)、嗜热古菌(i^rococc^/w"'oms)、极端嗜热古菌(户戸coccwsZ/o〃'few///)、超嗜热需氧古生菌(Jewra/,ww/er"/;c)等)系统发育领域。如本文中所用，术语"个体"是指动物，优选哺乳动物，最优选人类，其为治疗、观察或实验的对象。如本文中所用的术语"有效量"是指所投与的(经修饰)非天然氨基酸多肽的量，所述量会在一定程度上减轻所治疗的疾病、病状或病症的一种或一种以上症状。可投与含有本文中所述的(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物以进行预防性、增强性和/或治疗性治疗。术语"增强"意谓增加或延长所需作用的效力或持续时间。因此，对于增强治疗剂的作用来说，术语"增强"是指增加或延长其它治疗剂对系统的作用的效力或持续时间的能力。如本文中所用，"增强有效量"是指足以增强所需系统中另一治疗剂的作用的量。当用于患者时，对于此用途有效的量将视以下因素而定疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及治疗医师的判断。如本文中所用，术语"经修饰"是指对给定多肽作出的任何改变，诸如对多肽长度、多肽的氨基酸序列、氨基酸组成、化学结构、共翻译修饰或翻译后修饰的改变。形式"(经修饰)"术语意谓所述多肽视情况经修饰，也就是说，所讨论的多肽可经修饰或未经修饰。术语"经翻译后修饰"是指在天然或非天然氨基酸已并入多肽链中之后，对所述氨基酸发生的天然或非天然氨基酸的任何修饰。仅举例来说，所述术语涵盖共翻译活体内修饰、共翻译活体外修饰(诸如在无细胞翻译系统中)、翻译后活体内修饰和翻译后活体外修饰。在预防应用中，将含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物投与易患上特定疾病、病症或病状或以其它方式处于特定疾病、病症或病状的风险下的患者。所述量经定义为"预防有效量"。在此使用中，确切量也视患者的健康状况、体重等而定。认为通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)确定所述预防有效量是在所属领域的技术范围内。术语"经保护"是指存在防止化学反应性官能团在某些反应条件下反应的"保护基"或部分。保护基将视所保护的化学反应性基团的类型而定。举例来说，如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸(诸如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可为苯甲基，或诸如甲基、乙基或叔丁基的烷基。所属领域已知的其它保护基也可用于本文中所述的方法和组合物中或与其一起使用。仅举例来说，封端基/保护基可选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>其它保护基描述于Greene禾口Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第3版,JohnWiley&Sons,NewYork,NY，1999中，其是以引用的方式全部并入本文中。在治疗应用中，将含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物以足以治愈或至少部分遏制疾病、病症或病状的症状的量投与已罹患疾病、病状或病症的患者。所述量经定义为"治疗有效量"，且将视以下因素而定疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及治疗医师的判断。认为通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)确定所述治疗有效量是在所属领域的技术范围内。术语"治疗"用于指预防性和/或治疗性治疗。除非另外指示，否则使用所属领域技术范围内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。丄3/0可用于本发明中的BPFI或其片段的非限制性实例包括下述。应了解，保持特定BPFI或任何蛋白质的某些活性或所有活性的其它变体、类似物、片段和/或类似物片段也可用于本发明的实施例中。可用于本发明中的多肽的代表性非限制性种类包括HR-C、HR-N和阴离子肽。副粘液病毒和慢病毒(lentivimse)是引起临床和兽医学疾病的重要因素。这些病毒包括重要的人类病原体，诸如呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒、麻疹、腮腺炎、HIV-1和HIV-2;和兽医学病原体，诸如牛RSV、火鸡鼻气管炎病毒、新城疫病毒(Newcastle'sdiseasevims)、牛瘟病毒、犬瘟病毒、见于海豹和马的新麻疹病毒和猴免疫31缺陷病毒(SIV)。引起婴儿和免疫功能低下个体的严重下呼吸道疾病的主要原因是称为呼吸道合胞病毒(RSV)的副粘液病毒。在全世界范围内，RSV每年引起六千五百万人感染和一百万人死亡。由RSV感染引起的疾病的最大发生率是在6周到6个月大时，其中在美国每年有近90,000名儿童因RSV引起的感染而入院。其中有4500名儿童死亡。也已将婴儿在RSV细支气管炎期间放大的RSVIgE反应与儿童期早期出现的反复喘息的普遍问题关联。RSV的再感染比大部分其它呼吸道病毒更为常见。严重疾病通常与第一次或第二次感染有关。尽管疾病的严重程度随着重复感染而下降，但RSV的先前感染不能预防随后感染所引起的疾病。显然免疫性是不完全的。已一般证实肝病毒疫苗当其已经减毒至足以不引起临床疾病的程度时具有不足的免疫原性。二十世纪六十年代所研发的福美林(formalin)灭活疫苗不仅无法针对病毒产生保护反应，而且还在随后流行期间诱导接种儿童的疾病恶化，并且一些减毒的RSV菌株具有在人类传代后恢复毒力的潜力。因此，巳谨慎地进行疫苗的研发，但预防婴儿和幼儿RSV疾病的尝试仍持续耙向用灭活疫苗、减毒的活病毒疫苗或亚单位疫苗进行主动免疫，和通过用人单克隆RSV抗体或超免疫RSV免疫球蛋白对母体主动免疫来使胎儿被动免疫。将高风险婴儿用免疫球蛋白(IG)治疗来防止RSV,但静脉内RSVIG相当昂贵并且投药需要每月输注持续7小时或更长时间以保持可接受的抗体滴度。目前，将Synagis(帕利珠单抗(palivi腿ab))或如利巴韦林(ribavirin)的药物投与患者群体。美国专利第6,814,968号(其是以引用的方式并入本文中)描述经分离肽、肽模拟物和与RhoA蛋白的病毒融合蛋白结合域或病毒融合蛋白的RhoA结合域结合的抗体的用途，其是用于在活体外和活体内抑制易感细胞的感染。所述病毒包括副粘液病毒呼吸道合胞病毒(RSV)和慢病毒人类免疫缺陷病毒(HIV)。Pastey等人于NatureMedicine2000年1月；6(1):35-40和J.ofVirology1999;73(9):7262-7270中描述研究RSV的F蛋白(融合蛋白)与GTPaseRhoA之间的相互作用和RhoA肽对由RSV和副流感病毒3型组成的合胞体调配物的影响的研究。Budge等人于J.ofAntimicrobialChemotherapy2004;54:299-302和J.ofVirology2004;78(10):5015-5022中描述源自GTPaseRhoA的肽和其抗病毒活性。测量一组分子对病毒感染性和病毒粘附的抑制。具体来说，证实源自RhoA的氨基酸77-95的肽的净负电荷和肽截断形式(氨基酸80-94)的分子间二硫键对于抗RSV活性至关重要。已证实大于5kDa的聚阴离子分子会抑制包膜病毒。所述分子包括但不限于可溶肝素、硫酸葡聚糖、带负电蛋白质和合成聚阴离子聚合物。Budge等人提出，抗病毒活性不是由于抑制RSVF蛋白-GTPaseRhoA相互作用而产生。Lambert等人于PNAS119693:2186-2191中描述来自RSV的与DP-178和DP-107类似的肽作为病毒融合抑制剂的用途。T-20通过起病毒融合抑制剂作用来抑制HIV进入细胞中。HIV的融合过程已经良好表征。HIV经由gpl20与CD4受体结合，并且在与其受体结合后，gpl20经历一系列构象改变从而使其与其辅受体CCR5或CXCR4结合。在与其受体和辅受体结合后，gpl20暴露gp41以起始融合过程。gp41具有两个区，称为七肽重复1和2(HR1和2)。标识为HR1的细胞外域为a螺旋区，其为所提出的拉链区域(zipperdomain)的氨基末端。gp41的HR1与HR2—起形成发夹。所形成的结构为6螺旋束，其将HIV包膜放在邻近细胞膜处，引起两个膜之间的融合。T-20通过结合gp41跨膜糖蛋白的第一个七肽重复(HR1)来防止病毒融合所需的构象改变。因此，6螺旋束的形成因T-20与gp41的HR1区结合而阻断。HlVgp41蛋白的DP107和DP178域(即，HR1和HR2域)彼此非共价复合并且其相互作用为病毒正常感染性所需。破坏DP107与DP178之间相互作用和/或类DP107肽与类DP178肽之间相互作用的化合物具有抗融合作用，包括抗病毒作用。DP-178充当HIV-1介导的CD-4+细胞-细胞融合(即，合胞体形成)和无细胞病毒感染CD-4+细胞的有效抑制剂。所述抗逆转录病毒活性包括但不限于抑制HIV传播到未感染的CD-4+细胞中。DP-178在低浓度下起作用并且经证实其在活体外研究中和动物体内无毒。已描述DP-178(HIV-1和HIV-2的相应区)内的氨基酸保守性。DP-178肽的潜在用途描述于美国专利第5,464,933号和第6,133,418号以及美国专利第6,750,008号和第6,824,783号中(所有专利都是以引用的方式并入本文中)，其是用于抑制与HIV传播有关的融合事件。已对DP178和DP-107的部分、同源物和类似物以及DP178/DP-107、类DP178/类DP107或HR1/HR2相互作用的调节剂进行研究，其展现抗病毒活性，和/或展现抗膜融合能力或者调节涉及除HIV-1外的逆转录病毒和非逆转录病毒中巻曲螺旋肽结构的细胞内加工的能力。所述研究中的病毒包括猴免疫缺陷病毒(美国专利第6,017,536号)、呼吸道合胞病毒(美国专利第6,228,983号、第6,440,656号、第6,479,055号、第6,623,741号)、艾伯斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvims)(美国专利第6,093,794号、第6,518,013号)、副流感病毒(美国专利第6,333,395号)、流感病毒(美国专利第6,068,973号、第6,060,065号)和麻疹病毒(美国专利第6,013,263号)。所有专利都是以引用的方式并入本文中。市售形式的DP-178为Fuzeon(恩夫韦地(enfuvirtide)，RocheLaboratoriesInc.和Trimeris,Inc.)。Fuzeor^具有乙酰化N末端和作为C末端的甲酰胺，并且以以下一级氨基酸序列描述CH3CO-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2。将其与其它抗病毒剂组合用于尽管正在进行抗逆转录病毒疗法但仍展现HIV-1复制的HIV-1患者。美国专利第5,464,933号和第6,824,783号(以引用的方式并入本文中)描述DP-178、DP-178片段、类似物和同源物，其包括但不限于具有氨基和羧基末端截断、取代、插入、缺失、添加或大分子载体基团的分子；以及在氨基和/羧基末端处存在化学基团(诸如疏水基团)的DP-178分子。其它变体包括但不限于美国专利第6,830,893号中所述的那些变体和美国专利第6,861,059号中所揭示的DP-178的衍生物。一组T-20杂交多肽描述于美国专利第6，656，卯6号、第6,562,787号、第6,348,568号和第6,258,782号中，并且DP-178-毒素融合体描述于美国专利第6,627,197号中。HAART(高活性抗逆转录病毒疗法)为HIV的标准疗法，其组合来自数类抗逆转录病毒剂的药物以降低病毒负荷。美国专利第6,861,059号(其是以引用的方式并入本文中)揭示使用DP-178或DP-107或其衍生物与至少一种其它抗病毒治疗剂治疗HIV-1感染或抑制HIV-1复制的方法，所述抗病毒治疗剂诸如逆转录酶抑制剂(例如，AZT、ddl、ddC、ddA、d4T、3TC或者其它双脱氧核苷酸或双脱氧氟核苷)或HIV-1蛋白酶抑制剂(例如，茚地那韦(indinavir)、利托那韦(ritonavir))。其它抗病毒剂包括细胞因子(例如，rIFNa、rIFNp、rIFN"jO、病毒mRNA帽抑制剂(例如，利巴韦林)、HIV蛋白酶抑制剂(例如，ABT-538和MK-639)、具有抗HIV活性的作为脂质结合分子的两性霉素B(amphotericinB)和作为糖蛋白加工抑制剂的栗精胺(castanospermine)。其它抗病毒剂(包括但不限于，具有T-20的逆转录酶抑制剂、整合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、细胞因子拮抗剂和趋化因子受体调节剂)的潜在组合疗法描述于多种参考文献中，包括但不限于美国专利第6,855,724号、第6,844,340号、第6,841,558号、第6,833,457号、第6,825,210号、第6,811,780号、第6,809,109号、第6,806,265号、第6,768,007号、第6,750,230号、第6,706,706号、第6,696,494号、第6,673,821号、第6,673,791号、第6,667,314号、第6,642,237号、第6，599，911号、第6,596,729号、第6,593,346号、第6,589,962号、第6,586,430号、第6,541,515号、第6,538,002号、第6,531,484号、第6,511,994号、第6,506,777号、第6,500,844号、第6,498,161号、第6,472,410号、第6,432,981号、第6,410,726号、第6,399,619号、第6,395,743号、第6,358,979号、第6,265,434号、第6,248,755号、第6,245,806号和第6,172,110号。DP-178的潜在传递系统包括但不限于美国专利第6，844，324号和第6,706,892号中所述的那些传递系统。此外，在包涵体中产生T-20的方法描述于美国专利第6,858,410号中。i可引起增强的免疫反应的抗原多肽增强免疫反应，和/或引起对疾病和/或致病因子(包括但不限于，呼吸道合胞病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV))的致免疫有效反应。本发明克服与传递具有较短血浆半衰期的BPFI有关的问题。本发明的化合物涵盖与具有较长循环半衰期的另一蛋白质(诸如，免疫球蛋白的Fc部分或白蛋白)融合的BPFI。已考虑靶向HIV生命周期的若干阶段以供治疗干预(Mitsuya,H.等人，1991，FASEBJ.5:2369-2381)。干预可潜在抑制HIV与细胞膜的结合、HIVRNA基因组逆转录成DNA或病毒从宿主细胞脱离和新细胞标靶的感染。正尝试研发可抑制病毒进入细胞(即，HIV感染的最早阶段)的药物。T-20充当HIV-1与CD4+细胞融合的抑制剂，从而以与其它抗病毒疗法不—同的机制靶向HIV。美国专利第6,861,059号揭示使用DP-178或DP-107或其衍生物与至少一种其它抗病毒治疗剂治疗HIV-1感染或抑制HIV-1复制的方法，所述抗病毒治疗剂诸如逆转录酶抑制剂(例如，AZT、ddl、ddC、ddA、d4T、3TC或者其它双脱氧核苷酸或双脱氧氟核苷)或HIV-1蛋白酶抑制剂(例如，茚地那韦、利托那韦)。其它抗病毒剂包括细胞因子(例如，rIFNa、rIFNp、rIFN"y)、病毒mRNA帽抑制剂(例如，利巴韦林)、HIV蛋白酶抑制剂(例如，ABT-538和MK-639)、具有抗HIV活性的作为脂质结合分子的两性霉素B和作为糖蛋白加工抑制剂的栗精胺。本发明的化合物包括异源融合蛋白，其包含与具有N末端和C末端的第二多肽融合的具有N末端和C末端的第一多肽，其中所述第一多肽为BPFI，诸如阴离子肽、HR-C或HR-N;且所述第二多肽选自由以下物质组成的群组a)人类白蛋白；b)人类白蛋白类似物；和c)人类白蛋白片段，且其中所述第一多肽的C末端与所述第二多肽的N末端融合。本发明的化合物还包括异源融合蛋白，其包含与具有N末端和C末端的第二多肽融合的具有N末端和C末端的第一多肽，其中所述第一多肽为BPFI，诸如阴离子肽、HR-C或HR-N;且所述第二多肽选自由以下物质组成的群组a)人类白蛋白；b)人类白蛋白类似物；和c)人类白蛋白片段，且其中所述第一多肽经由连接基、肽连接基、前药连接基或水溶性聚合物与所述第二多肽融合。肽连接基可选自由以下物质组成的群组35a)富集甘氨酸的肽；b)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(其中n为1、2、3、4、5、6或更高)的肽；和c)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3的肽。本发明的其它化合物包括异源融合蛋白，其包含与具有N末端和C末端的第二多肽融合的具有N末端和C末端的第一多肽，其中所述第一多肽为BPFI，诸如阴离子肽、HR-C或HR-N;且所述第二多肽选自由以下物质组成的群组a)免疫球蛋白的Fc部分；b)免疫球蛋白的Fc部分的类似物；和c)免疫球蛋白的Fc部分的片段，且其中所述第一多肽的C末端与所述第二多肽的N末端融合。BPFI(诸如阴离子肽、HR-C或HR-N)可经由肽连接基、前药连接基或水溶性聚合物与第二多肽融合。肽连接基可选自由以下物质组成的群组a)富集甘氨酸的肽；b)具有序列[GIy-Gly-Gly-Gly-Ser]n(其中n为1、2、3、4、5、6或更高)的肽；和c)具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3的肽。作为异源融合蛋白的部分的阴离子肽、HR-C或HR-N可具有多个氨基酸取代，并且可具有超过6、5、4、3、2或1个不同于分子的天然形式的氨基酸。本发明还包括编码本文所述的异源融合蛋白的聚核苷酸、包含这些聚核苷酸的载体和经本文所述的载体转染或转化的宿主细胞。还包括一种产生异源融合蛋白的方法，其包含以下步骤在使异源融合蛋白以可检测的量表达的条件下转录和翻译本文所述的聚核苷酸。本发明提供包含至少一个非天然氨基酸的BPFI分子。在本发明的某些实施例中，具有至少一个非天然氨基酸的BPFI包括至少一个翻译后修饰。在一个实施例中，所述至少一个翻译后修饰包含利用适用于特定反应性基团的所属领域技术人员已知的化学方法，将包含第二反应性基团的分子与至少一个包含第一反应性基团的非天然氨基酸连接，所述包含第二反应性基团的分子包括但不限于标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和性标记、光亲和性标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反义聚核苷酸、水溶性树枝状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属的部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分(photocagedmoiety)、可光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、延长的侧链、碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、有毒部分、经同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或上述物质的任何组合，或任何其它所需36化合物或物质。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包括但不限于，在非天然氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中，其中炔丙基有时也称作乙炔部分)，且第二反应性基团为叠氮基部分，且利用[3+2]环加成化学方法。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(包括但不限于，在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)且第二反应性基团为炔基部分。在本发明的经修饰BPFI的某些实施例中，使用至少一个包含至少一个翻译后修饰的非天然氨基酸(包括但不限于，含有酮基官能团的非天然氨基酸)，其中所述至少一个翻译后修饰包含糖部分。在某些实施例中，翻译后修饰是在真核细胞或非真核细胞中活体内进行。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个由一种宿主细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不由另一宿主细胞类型进行。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个由真核细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不由非真核细胞进行。翻译后修饰的实例包括但不限于乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成(palmitateaddition)、磷酸化、糖脂键联修饰等。在一个实施例中，翻译后修饰包含通过GkNAc-天冬酰胺键将寡糖与天冬酰胺连接(包括但不限于，其中寡糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等)。在另一个实施例中，翻译后修饰包含通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键将寡糖(包括但不限于，Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。在某些实施例中，本发明的蛋白质或多肽可包含分泌或定位序列或肽、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等。可用于本发明中的标签或连接基的实例包括但不限于多肽、聚合物、亲和标签、抗原、检测标签、成像标签、多成员结合复合物的成员和放射性同位素标签。亲和标签和检测标签的实例包括但不限于聚His标签、生物素、抗生物素蛋白、蛋白质A、蛋白质G和包括但不限于免疫球蛋白抗原决定基的抗原。成像标签的实例包括但不限于金属、放射性核素和磁性分子。多成员结合复合物标签的实例包括但不限于抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)、抗生物素蛋白、生物素、蛋白质A和蛋白质G。术语"定位肽"包括但不限于分泌信号序列的实例。分泌信号序列的实例包括但不限于原核分泌信号序列、真核分泌信号序列、5'经最优化以进行细菌表达的真核分泌信号序列、新颖分泌信号序列、果胶裂解酶分泌信号序列、OmpA分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实例包括但不限于STII(原核)、FdGIII和M13(噬菌体)、Bgl2(酵母)和从转座子获得的信号序列bla。分泌信号序列包括但不限于细菌分泌信号序列、酵母分泌信号序列、昆虫信号分泌序列、哺乳动物分泌信号序列和独特分泌信号序列。"定位序列"的另一实例包括但不限于TrpLE序列。20所关注的蛋白质或多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或十个或十个以上非天然氨基酸。非天然氨基酸可相同或不同，例如，在蛋白质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上不同位点可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上不同非天然氨基酸。在某些实施例中，蛋白质的天然存在形式中所存在的特定氨基酸中的至少一个(但少于全部)经非天然氨基酸取代。具有治疗活性的任何BPFI或其片段都可用于本发明中。已提供可用于本发明中的BPFI的众多实例。然而，所提供的列表并不详尽并且不欲以任何方式限制可用于本发明中的BPFI的数量或类型。因此，可根据本发明对任何BPFI和/或由任何BPFI(包括新颖BPFI)制备的片段进行修饰并且在治疗上使用。本发明提供基于包含至少一个非天然编码的氨基酸的BPFI的方法和组合物。将至少一个非天然编码的氨基酸引入BPFI中可允许应用涉及特定化学反应(包括但不限于，与一个或一个以上非天然编码的氨基酸反应而不与通常存在的20种氨基酸反应)的接合化学。在一些实施例中，包含非天然编码的氨基酸的BPFI(诸如，阴离子肽、HR-C或HR-N)经由非天然编码的氨基酸的侧链与水溶性聚合物(诸如聚乙二醇(PEG))连接。本发明提供一种用PEG衍生物选择性修饰蛋白质的高效方法，其涉及回应选择密码子而将非基因编码的氨基酸(包括但不限于，含有未见于20种天然并入的氨基酸中的官能团或取代基的那些氨基酸，所述官能团或取代基包括但不限于酮基、叠氮基或乙炔部分)选择性并入蛋白质中，且随后用适当反应性PEG衍生物修饰那些氨基酸。并入后，随后就可通过利用所属领域技术人员已知适用于天然编码的氨基酸中存在的特定官能团或取代基的化学方法来修饰氨基酸侧链。多种已知的化学方法适用于本发明中以将水溶性聚合物并入蛋白质中。所述方法包括但不限于分别与(包括但不限于)乙炔或叠氮衍生物的Huisgen[3+2]环加成反应(例如参看Padwa,A.ComprehensiveOrganicSynthesis,第4巻,(1991)Trost，B.M.编，Pergamon,Oxford,第1069-1109页；禾口Huisgen，R.1,3-DipolarCycloadditionChemistry.(1984)Padwa,A.编，Wiley,NewYork,第1-176页)。因为Huisgen[3+2]环加成方法涉及环加成而非亲核取代反应，所以蛋白质可在极高选择性下经修饰。通过向反应混合物中加入催化量的Cu(I)盐，可在室温下在水性条件下以优良的区域选择性(1,4>1,5)进行反应。例如参看Tornoe等人，(2002)J.Org.Chem.67:3057-3064;和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599;和WO03/101972。可通过[3+2]环加成反应加成到本发明的蛋白质上的分子包括具有适当官能团或取代基(包括但不限于，叠氮基或乙炔衍生物)的几乎任何分子。这些分子可分别与具有乙炔基的非天然氨基酸(包括但不限于，对炔丙基氧基苯丙氨酸)或具有叠氮基的非天然氨基酸(包括但不限于，对叠氮基-苯丙氨酸)加成。由Huisgen[3+2]环加成得到的5元环在还原性环境中通常为不可逆的且在水性环境中于长时期内对水解是稳定的。因此，在苛刻水性条件下多种物质的物理和化学特性可经本发明的活性PEG衍生物修饰。更重要的是，由于叠氮基和乙炔部分彼此具有特异性(且例如不与20种常见基因编码氨基酸中的任一种反应)，故可在一个或一个以上特异性位点以极高选择性修饰蛋白质。本发明还提供PEG衍生物的水溶性和水解稳定衍生物以及具有一个或一个以上乙炔或叠氮基部分的相关亲水性聚合物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物对于与已回应选择密码子而选择性地引入蛋白质中的叠氮基部分偶合具有极高选择性。类似地，含有叠氮基部分的PEG聚合物衍生物对于与已回应选择密码子而选择性地引入蛋白质中的乙炔部分偶合具有极高选择性。更具体来说，叠氮基部分包含(但不限于)垸基叠氮化物、芳基叠氮化物和这些叠氮化物的衍生物。烷基和芳基叠氮化物的衍生物可包括其它取代基，只要保持乙炔特异性反应性即可。乙炔部分包含垸基和芳基乙炔和各自的衍生物。垸基和芳基乙炔的衍生物可包括其它取代基，只要保持叠氮化物特异性反应性即可。本发明提供具有多种官能团、取代基或部分的物质与其它物质的接合物，所述其它物质包括但不限于标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或者多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA;RNA;反义聚核苷酸；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分；生物素；生物素的衍生物；生物素类似物；并入重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；有毒部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。本发明也包括具有叠氮基或乙炔部分的物质与具有相应乙炔或叠氮基部分的PEG聚合物衍生物的接合物。举例来说，含有叠氮基部分的PEG聚合物可在含有带有乙炔官能团的非基因编码氨基酸的蛋白质中的位置处与生物活性分子偶合。偶合PEG与生物活性分子的键包括但不限于Huisgen39[3+2]环加成产物。所属领域中已确定PEG可用于修饰生物材料的表面(例如参看美国专利6,610,281;Mehvar,R.,J.PharmPharmSci.,3(1):125-136(2000)，其是以引用的方式并入本文中)。本发明也包括包含具有一个或一个以上反应性叠氮基或乙炔位点的表面的生物材料和经由Huisgen[3+2]环加成键与表面偶合的一种或一种以上本发明的含叠氮基或乙炔聚合物。生物材料和其它物质也可通过除叠氮基或乙炔键外的其它键(诸如通过包含羧酸、胺、醇或硫醇部分的键)与经叠氮基或乙炔活化的聚合物衍生物偶合以留下可用于随后反应的叠氮基或乙炔部分。本发明包括一种合成本发明的含叠氮基聚合物和含乙炔聚合物的方法。在含叠氮基PEG衍生物的情况下，叠氮化物可与聚合物的碳原子直接键结。或者，可通过在一个末端处将具有叠氮基部分的连接剂与常规活性聚合物连接来制备含叠氮基PEG衍生物，以使得所得聚合物在其末端具有叠氮基部分。在含乙炔PEG衍生物的情况下，乙炔可与聚合物的碳原子直接键结。或者，可通过在一个末端处将具有乙炔部分的连接剂与常规活性聚合物连接来制备含乙炔PEG衍生物，以使得所得聚合物在其末端具有乙炔部分。更具体来说，在含叠氮基PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经历反应以产生其上具有更强反应性的部分(诸如甲磺酸酯、三氟乙基磺酸酯、甲苯磺酸酯或卤素离去基)的经取代聚合物。所属领域技术人员众所周知含有磺酰卤、卤素原子以及其它离去基的PEG衍生物的制备和使用。所得经取代聚合物随后经历反应以在聚合物的末端处用叠氮基部分取代反应性较强的部分。或者，具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物与在一个末端处具有叠氮基的连接剂进行反应，以使得在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键，且叠氮基部分位于聚合物的末端处。所属领域技术人员众所周知亲核和亲电子部分，包括胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等。更特定来说，在含乙炔PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经历反应以将卤素或其它活性离去基自含有乙炔部分的前体置换。或者，具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物与在一个末端处具有乙炔的连接剂进行反应，以使得在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键，且乙炔部分位于聚合物的末端处。所属领域的专业人员充分确定卤素部分、活性离去基、亲核和亲电子部分在有机合成上下文中的使用以及PEG衍生物的制备和使用。本发明也提供一种选择性修饰蛋白质以将其它物质加入经修饰蛋白质上的方法，所述其它物质包括但不限于水溶性聚合物，诸如PEG和含有叠氮基或乙炔部分的PEG衍生物。含叠氮基和含乙炔的PEG衍生物可用于改变生物相容性、稳定性、溶解性和缺乏免疫原性至关重要的表面和分子的特性，而同时提供一种比所属领域先前己知更具选择性的将PEG衍生物与蛋白质连接的方式。可利用本发明的方法制备的BPFI可为天然存在或非天然编码的具有任何长度或序列的氨基酸的任何组合。唯一要求是BPFI链中至少一个氨基酸为非天然编码的氨基酸。如果多肽是经生物合成方法制备，那么当由包含至少一个选择密码子的mRNA翻译时，将非天然编码的氨基酸并入肽链中。可通过化学合成制备的本发明的新颖BPFI可在合成过程中并入至少一个非天然编码的氨基酸。非天然编码的氨基酸可位于氨基酸链的任一位置并且还可位于最终BPFI的任何部分中，包括但不限于生物活性肽、连接基或融合搭配物(诸如白蛋白或Fc)内。当提及本申请案中的阴离子肽、HR-C或HR-N多肽时打算将其用作适用于本发明中的肽或多肽的实例。因此，应了解，本文所述的关于阴离子肽、HR-C或HR-N的修饰和化学同样可适用于任何其它BPFI，包括但不限于本文特别列出的那些BPFI。可以多种不同方式有利地将非天然氨基酸(包括但不限于，合成非天然氨基酸、经取代氨基酸或者一种或一种以上D-氨基酸)并入本发明的异源融合蛋白中。含D-氨基酸的肽等与含L-氨基酸的对应物相比展现增加的活体外或活体内稳定性。因此，当需要或要求较高细胞内稳定性时，构建并入D-氨基酸的肽等可特别有用。更具体来说，当所述特性合乎需要时，D-肽等对内源肽酶和蛋白酶具抗性，从而提供经改良的分子的生物可用性和延长的活体内寿命。另外，无法对D-肽等进行有效加工以用于对T辅助细胞的主要组织相容性复合物II类的限制性递呈，且因此不太可能诱导整个有机体的体液免疫反应。///.厉于本发剪的通历童组核麼方法在本发明的众多实施例中，将使用重组方法分离、克隆且通常改变编码所关注BPFI的核酸。这些实施例用于(包括但不限于)蛋白质表达或在从BPFI获得的变体、衍生物、表达盒或其它序列的产生期间使用。在一些实施例中，编码本发明的多肽的序列是可操作地连接到异源启动子上。阴离子肽、HR-C或HR-N的分离以及宿主细胞中阴离子肽、HR-C或HR-N的产生描述于例如美国专利第[]号中，其是以引用的方式并入本文中。可以母体多肽的氨基酸序列为基础来合成编码包含非天然编码的氨基酸的BPFI的核苷酸序列，且随后改变核苷酸序列以实现相关氨基酸残基的引入(即，并入或取代)41或去除(即，缺失或取代)。可根据常规方法通过定点突变诱发来便利地修饰核苷酸序列。或者，核苷酸序列可由化学合成来制备，所述化学合成包括但不限于通过使用寡核苷酸合成仪(其中寡核苷酸是根据所需多肽的氨基酸序列来设计)且优选选择在将产生重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子。举例来说，可通过PCR、接合或接合链式反应来合成和组装编码所需多肽部分的若干小寡核苷酸。例如参看Barany等人，Proc.Jcad.Sc/.88:189-193(1991);美国专利第6,521,427号，其是以引用的方式并入本文中。本发明利用重组遗传学领域中的常规技术。揭示用于本发明中的通用方法的基础文章包括Sambrook等人，M)/ecw/oTC7om'"g,力丄a60AY^07Mawwa/(第3版.2001);Kriegler,Gewe7)"ara/erawc/五x;re5^/ow,'爿丄a6on^o^yikfanwa/(1990);禾口Cwrewf尸rofoco/sMo/ecw/ar祝o/ogy(Ausubel等人编，1994)。描述分子生物技术的一般文章包括Berger和Kimmel,GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology,第152巻AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA(Berger);Sambrook等人,MolecularCloning-ALaboratoryManual(第2版)，第1-3巻，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989("Sambrook"沐CurrentProtocolsinMolecularBiology,RM.Ausubel等人编,CurrentProtocols,GreenePublishingAssociates,Inc.与JohnWiley&Sons,Inc.的合资公司，(1999年增补)("Ausubd")。这些文章描述突变诱发、载体的使用、启动子以及许多其它相关课题，其涉及(包括但不限于)产生包括用于制备包括非天然氨基酸、正交tRNA、正交合成酶和其对的蛋白质的选择密码子的基因。启动子包括但不限于原核启动子、真核启动子、细菌启动子、酵母启动子、昆虫启动子、哺乳动物启动子、独特启动子和可诱导启动子。各种类型的突变诱发是出于多种目的用于本发明中，其包括但不限于产生tRNA文库、产生合成酶文库、产生选择密码子、在所关注蛋白质或多肽中插入编码非天然氨基酸的选择密码子。所述突变诱发包括但不限于定点突变诱发、随机点突变诱发、同源重组、DNA改组或其它递归突变诱发方法、嵌合建构、使用含尿嘧啶模板的突变诱发、寡核苷酸定向突变诱发、硫代磷酸酯修饰DNA突变诱发、使用缺口双链DNA的突变诱发等或其任何组合。其它适当方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主菌株的突变诱发、限制选择和限制纯化、缺失突变诱发、通过总基因合成进行的突变诱发、双股断裂修复等。(包括但不限于)涉及嵌合构筑体的突变诱发也包括在本发明中。在一个实施例中，可由天然存在的分子或者经改变或突变的天然存在的分子的已知信息(包括但不限于，序列、序列比较、物理特性、晶体结构等)来指导突变诱发。在本文中出现的文章和实例描述这些程序。其它信息见于以下公开案和其中引用的参考文献中Ling等人,々/raac/^ZWJww/^gwei-overview,AnalBiochem,254(2):157-178(1997);Dale等人，Wgowwc/eo"Vife-￡ft>ec^/ram/ow附wfagewey/sws/wg/7ze;/^一ora肠她膨Ao《MethodsMol.Biol.57:369-374(1996);Smith，/"*o/ww/agewes/s,Ann.Rev.Genet.19:423-462(1985);Botstein&Shortle,5^ra&g/^sam/";^/cfl"(9;751o/v"ra歸赠ewe51/51,Science229:1193-1201(1985);Carter,S7^-d/re"^则啤ewe57'51,Biochem.J.237:1-7(1986);Kunkel,TTzecfemry0/o"gowwc,eof^direct腦啤gwe57乂NucleicAcids&MolecularBiology(Eckstein,F.禾口Lilley,D.M.J,编，SpringerVerlag,Berlin)(1987);Kunkel,am/ej^7c/ew/1We邵eczyc附由gewe^w/Aow/;/^woO^/c^/e"/o"，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492(1985);Kunkel等人，am/c/ewf577e邵e"yc附wfflgewe57、vv/z^ow/1/7/zewo妙/cse/e"/ow，MethodsinEnzvmol.154，367-382(1987);Bass等人，Mw咖/7>7邵ms^onswz7/zwewi)iV/4-6zW//7gs/ec7yk77/e51，Science242:240-245(1988);Zoller&Smith,(9//gowwc/eo"We-<iz>eCedmwfagewesfs(ier/vedvectors:^^c/ewfawJgewera/procedwre/orf/zeprot/wc^/ow0/po/wfww她owsawjZ)AC4女ag膨wf,NucleicAcidsRes.10:6487-6500(1982);Zoller&Smith，(9//gowwc/eo"We-c/zrec&(i/wwfagewe57so/Z)A^4yhafg/wewAyc/owed/wfovecfory，MethodsinEnzvmol.100:468-500(1983》Zoller&Smith,Wgcwwc/eo"*<ie-(iz>ec^/aMethodsinEnzvmol.154:329-350(1987);Taylor等人，77^0/AcidsRes.13:8749-8764(1985);Taylor等人，gewera"ow0/Nucl.AcidsRes.13:8765-8785(1985》Nakamaye&Eckstein,励/础ow"欲/c"owo/zgowwc/eo"We-A>ecW歸啤ewe我Nucl,AcidsRes.14:9679-9698(1986);Sayers等人，5'-3'五xowwcZease51i打p/iasp/zon^/zfoafe-hasedo/z'gowwc/eo/7*<ie-(iz>ecfedmwfagewes&，Nucl.AcidsRes.16:791-802(1988);Sayers等人，》應d，"ycc/譜，o/6rom/t/e，(1988)Nucl.AcidsRes,16:803-814;Kramer等人,77zegaj^peddw//exZ)A^4a^proac//too//gowwc/eo"We-t//re"edeow加wc/7ow，Nucl.AcidsRes.12:9441-9456(1984);Kramer&Fritz(9//gowwc/eo"*<ie-(iz>ec&<icowWrwc/io/0//wwfa"owsWag卿d一/exZ)凤MethodsinEnzvmol.154:350-367(1987);Kramer等人，Jm戸vWcow^m"/o"o/附w她'o叫Nucl.AcidsRes.16:7207(1988);Fritz等人，ewz^7wa"creac"ofw/wvz'"o,NucLAcidsRes.16:6987-6999(1988);Kramer等人,Dzj^rewfw/swafc/jesarecorrectedw"/dz炎rewfe^cz'e"c/esw"/2_y/-<5z>ec/"edm/sffmk/Ke/^/r5^Wewo/co",￡^1138:879-887(1984);Carter等人，/w;raved0//go肌c/eo"cfew7"e-力Ve"edwz^。ge"e^ve"ors,Nucl.AcidsRes.13:4431-4443(1985);Carter,//wprovedo/z'gowwc/eo"We-<^>e"ed附t^agewes/s"57'"gvecfoAS,MethodsinEnzvmol.154:382-403(1987);Eghtedarzadeh&Henikoff，C/seo/0//go聰c/eo"Vfesto/argede/"/o叫Nucl.AcidsR6S.14:5115(1986);Wells等人，/mpoW朋ceo/A_yc/ragew-6owd/orffj加'ow/w加6z7/ziwg^"fl肌'"'ow加Zeo/si/6"7z'57'w,Phil.Trans.R.Soc.Lond.A317:415-423(1986);Nambiar等人,7b^/，f/^/sawJc/ow/"g0/acoW"g/orn'6owMc/eoweS_p,ofez>7,Science223:1299-1301(1984);Sakmar禾口Khorana,7b/a/sywf/ze^ex/pmy^/ow0/ageweaf//)/za-1ywZ)wm7:0/radoWerseg膨"/g認m'wewwc/eo"We-6zWz'wgprato'w"mw^m"'"」，Nucl.AcidsRes.14:6361-6372(1988);^Mells等人,C"a5\ye//eww/agewe57j..awe^c/ewf/we/Tzod/orgewera/iow0/附w/^p/eW(iey"dw'to,Gene34:315-323(1985);Grundstrom等人,(9//gowwc/eo"'(ie-(iz>e"e<i7m^age"e57i脂'crascfl/e's/W-gim'gewe57威e^,Nucl.AcidsRes.13:3305-3316(1985);Mandecki,(9//gowwc/eWi/e-^e"edfifow6/e-欲awd6reaA:re/a/rz'w/j/ay/w/cfeo/^E^c/zen'c/u.aco/z':a附e/Zzod/or57Ye-5^ec(/c附z^tfgewe57^,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83:7177-7181(1986);Arnold,/Vofe/wewg/wee〃-"g/o"wnwsKa^e打v!Vonnewfs,CurrentOpinioninBiotechnology4:450-455(1993);Sieber,等人，NatureBiotechnology,19:456-460(2001);W.P.C.Stemmer,Nature370,389-91(1994);和I.A.Lorimer,I.Pastan,NucleicAcidsRes.23,3067-8(1995)。关于众多上述方法的其它细节可见于MethodsinEn讓ol瞎第154巻中，其也描述对于各种突变诱发方法引起的故障检修问题的有用控制。本发明也涉及经由正交tRNA/RS对在活体内并入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和有机体。宿主细胞经本发明的聚核苷酸或包括本发明的聚核苷酸的构筑体(包括但不限于，本发明的载体，其可为例如克隆载体或表达载体)进行基因工程改造(包括但不限于，转化、转导或转染)。载体可为例如质粒、细菌、病毒、裸聚核苷酸或接合聚核苷酸的形式。可通过标准方法将载体引入细胞和/或微生物中，所述方法包括电穿孔(Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82，5824(1985))、通过病毒载体感染、在小珠粒或粒子基质内或在表面上用具有核酸的小粒子高速弹道渗透(Klein等人，Nature327.70-73(1987))等。可在经调节适用于诸如筛检步骤、活化启动子或选择转化株的活动的常规营养培养基中培养经工程改造的宿主细胞。这些细胞可视情况培养入转基因有机体中。用于(包括但不限于)细胞分离和培养(例如用于随后核酸分离)的其它有用参考文献包括Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,第3版，Wiley-Liss,NewYork及其中引用的参考文献；Payne等人(1992)PlantCellandTissueCultureinLiquidSystemsJohnWiley&Sons,Inc.NewYork,NY;Gamborg和Phillips(编)(1995)PlantCell,TissueandOrganCulture;FundamentalMethodsSpringerLabManual,Springer-Verlag(BerlinHeidelbergNewYork)以及Atlas和Parks(编)TheHandbookofMicrobiologicalMedia(1993)CRCPress,BocaRaton,FL。可使用将标靶核酸引入细胞中的若干种众所周知的方法，其中任一种都可用于本发明中。这些方法包括受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、基因枪法和经病毒载体(在下文中进一步论述)感染等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA构筑体的质粒的数目。使细菌生长到对数生长期且可通过所属领域中已知的多种方法分离细菌中的质粒(例如参看Sambrook)。另外，可购得多种试剂盒以从细菌中纯化质粒(例如参看都来自PharmaciaBiotech的EasyPrep、FlexiPrep;来自Stratagene的StrataClean;和来自Qiagen的QIAprep)。随后进一步操作经分离且经纯化的质粒以产生其它质粒，所述质粒用于转染细胞或并入相关载体中以感染有机体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调控特定标耙核酸的表达的启动子。载体视情况包含通用表达盒，其含有至少一个独立终止子序列、允许表达盒在真核细胞或原核细胞或两者(包括但不限于，穿梭载体)中复制的序列和用于原核系统与真核系统的选择标记。载体适用于在原核细胞、真核细胞或优选两者中复制和整合。参看Gillam&Smith,Gene8:81(1979);Roberts等人，Nature.328:731(1987);Schneider,E.等人，ProteinExpr.Purif.6(1)10-14"995):Ausubel,Sambrook，Berger(都同上文)。可用于克隆的细菌和噬菌体目录由例如ATCC提供，例如由ATCC出版的TheATCCCatalogueofBacteriaandBacteriophage(1992)Gherna等人(编)。用于测序、克隆和分子生物学的其它方面的其它基本程序以及基础理论考虑也见于Watson等人(1992)RecombinantDNA第2版ScientificAmericanBooks.NY中。另外，基本上任何核酸(和实际上任何标记核酸，无论标准或非标准)都可从多种商业来源中的任一种定制或标准定购，这些商业来源诸如MidlandCertifiedReagentCompany(Midland,TX，可通过万维网在mcrc.com上获得)、TheGreatAmericanGeneCompany(Ramona,CA，可通过万维网在genco.com上获f寻)、ExpressGenInc.(Chicago,IL，可通过万维网在expressgen.com上获得)、OperonTechnologiesInc.(Alameda,CA)和许多其它来源。选择密码子本发明的选择密码子扩展蛋白质生物合成机构的遗传密码子框架。举例来说，选择密码子包括但不限于独特的三碱基密码子、无义密码子(诸如终止密码子，其包括但不限于琥珀密码子(UAG)或蛋白石密码子(UGA))、非天然密码子、四个或四个以上碱基的密码子、稀有密码子等。所属领域技术人员易于了解，可引入所需基因中的选择密码子的数目范围很广，包括但不限于在编码至少一部分BPFI的单一聚核苷酸中存在一个或一个以上、两个或两个以上、超过三个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上。在一个实施例中，所述方法涉及使用作为用于在真核细胞中在活体内并入非天然氨基酸的终止密码子的选择密码子。举例来说，产生识别终止密码子(包括但不限于，UAG)的O-tRNA，且通过具有所需非天然氨基酸的O-RS使其氨酰基化。此O-tRNA并不由天然存在的宿主的氨酰基-tRNA合成酶识别。常规定点突变诱发可用于在所关注多肽中的所关注位点处引入终止密码子(包括但不限于TAG)。例如参看Sayers,J.R.等人，(1988)，5'-3'_Exo"t/c/eoye/^c^/wra/Zn'oo^e-^sedo//gowwc/eo"We-cz're"e￡/7w她gewe57iNucleicAcidsRes,16:791-802。当O-RS、O-tRNA和编码所关注多肽的核酸在活体内组合时，回应UAG密码子而并入非天然氨基酸以得到在指定位置处含有非天然氨基酸的多肽。可在不显著干扰真核宿主细胞的情况下在活体内进行非天然氨基酸的并入。举例来说，由于对于UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包括但不限于，琥珀抑制tRNA)与真核释放因子(包括但不限于，eRF)(其与终止密码子结合且起始核糖体释放生长肽)之间的竞争，故可通过(包括但不限于)增加O-tRNA和/或抑制tRNA的表达水平来调节抑制效率。选择密码子还包含延长密码子，其包括但不限于四个或四个以上碱基的密码子，诸如，四个、五个、六个或六个以上碱基密码子。四碱基密码子的实例包括但不限于AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五碱基密码子的实例包括但不限于AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本发明的特征包括使用基于移码抑制的延长密码子。四个或四个以上碱基密码子可将(包括但不限于)一个或一个以上非天然氨基酸插入同一蛋白质中。举例来说，在存在突变O-tRNA(包括但不限于，具有反密码子环(例如，具有至少8-10个核苷酸的反密码子环)的特定移码抑制tRNA)的情况下，四个或四个以上碱基密码子被读成单一氨基酸。在其它实施例中，反密码子环可解码(包括但不限46于)至少一个四碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多碱基密码子。由于存在256种可能的四碱基密码子，故可使用四个或四个以上碱基密码子在同一细胞中编码多种非天然氨基酸。参看Anderson等人，(2002)^p/or/wgAe￡/m/"o/CWow爿Wcot/ow5fee,ChemistryandBiology,9:237-244;Magliery,(2001)五;c戶"W"g0/"iS7n/Z)/'FoMr-6iweCWo"51w"/za丄z'6n^^praac/z五"/m'c/z/aco//,J.Mol.Biol.307:755-769。举例来说，使用活体外生物合成方法，已经用四碱基密码子将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参看Ma等人，(1993)Biochemistry,32:7939;和Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc.121:34。CGGG和AGGU用于在活体外通过两种化学酰化的移码抑制tRNA将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物同时并入抗生物素蛋白链菌素中。例如参看Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc,121:12194。在活体内研究中，Moore等人研究具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可为U、A、G或C)的能力，并且发现四联体UAGA可由具有UCUA反密码子的tRNALeu以13%至26%的效率解码，其中在0或-l框架中几乎无解码。参看Moore等人，(2000)J.Mol.Biol.,298:195。在一个实施例中，可将以稀有密码子或无义密码子为基础的延长密码子用于本发明中，其可降低在其它不需位点处的错义通读和移码抑制。对于给定系统来说，选择密码子也可包括天然三碱基密码子中的一种，其中内源系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说，这包括缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或三碱基密码子为稀有密码子的系统。选择密码子视情况包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩展现存的遗传代码。一个额外碱基对将三联密码子的数目从64增加到125。第三碱基对的特性包括稳定和选择性的碱基配对、通过聚合酶以高保真度有效地酶促并入DNA中以及在合成新生非天然碱基对之后有效持续的引物延伸。可用于方法和组合物的非天然碱基对的描述包括例如Hirao等人,(2002)wwwfl/wa/6aye戸/r/or/wco770ra^/wga附/wo"wa/ogt/es/"to/jrafe/n,NatureBiotechnology,20:177-182。其它相关公开案列于下文中。对于活体内使用来说，非天然核苷可透过膜且经磷酸化形成相应三磷酸盐。另外，增加的遗传信息为稳定的且不受细胞酶破坏。Benner等人的先前努力利用不同于标准Watson-Crick对中的氢键结模式，其最值得注意的实例为iso-C:iso-G对。例如参看Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc,111:8322;禾nPiccirilli等人，(1990)Nature,343:33;Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol,4:602。这些碱基通常在一定程度上与天然碱基错配且不能酶促复制。Kool和同事证实碱基之间的疏水填充相互作用可替代氢键结来驱动碱基对的形成。参看Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol,4:602;和Guckian及Kool,(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,36，2825。在致力于开发满足所有上述要求的非天然碱基对的过程中，Schultz、Romesberg和同事已系统地合成且研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS:PICS自身对比天然碱基对稳定，且可通过大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)有效地并入DNA中。例如参看McMinn等人.(1999)J.Am.Chem.Soc,121:11585-6:以及Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc,122:3274。可通过KF以对于生物功能足够的效率和选择性合成3MN:3MN自身对。例如参看Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc,122:8803。然而，两种碱基都充当进一步复制的链终止子。突变DNA聚合酶近来已得到发展，其可用于复制PICS自身对。此外，可复制7AI自身对。例如参看Tae等人，(2001)J.Am.Chem.Soc,123:7439。也已研发新颖金属碱基对Dipic:Py，其在结合Cu(II)后形成稳定对。参看Meggers等人，(2000)J.Am,Chem.Soc,122:10714。因为延长密码子和非天然密码子固有地与天然密码子正交，所以本发明的方法可利用此特性来产生其正交tRNA。翻译旁路系统(translationalbypassingsystem)也可用于将非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻译旁路系统中，将大序列并入基因中，但并不翻译成蛋白质。所述序列含有充当诱导核糖体跃过序列的线索且继续插入下游的翻译的结构。在某些实施例中，在本发明的方法和/或组合物中的所关注蛋白质或多肽(或其部分)是由核酸编码。通常，核酸包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上选择密码子。可使用所属领域技术人员众所周知且在本文中描述的方法诱变编码所关注蛋白质或多肽的基因以包括例如一个或一个以上选择密码子以并入非天然氨基酸。举例来说，使所关注蛋白质的核酸诱变以包括一个或一个以上选择密码子，从而提供一个或一个以上非天然氨基酸的并入。本发明包括例如包含至少一个非天然氨基酸的任何蛋白质的任何此种变体(包括但不限于突变体)形式。类似地，本发明也包括相应核酸，即，具有一个或一个以上编码一个或一个以上非天然氨基酸的选择密码子的任何核酸。可容易地使编码BPFI(诸如，阴离子肽、HR-C或HR-N)的核酸分子突变以在多肽的任何所需位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、蛋白质或多种其它分子引入所关注蛋白质上。所属领域中众所周知适于将半胱氨酸并入多肽的所需位置中的方法，诸如在美国专利第6,608,183号中所述的那些方法，并且包括标准突变诱发技术。非天然编码的氮基酸多种非天然编码的氨基酸适用于本发明中。任何数目的非天然编码的氨基酸可引入BPFI中。一般来说，所引入的非天然编码的氨基酸实质上对20种常见基因编码氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)呈化学惰性。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包括可与未见于20种常见氨基酸中的官能团(包括但不限于，叠氮基、酮、醛和氨基氧基)有效且选择性地反应形成稳定接合物的侧链官能团。举例来说，包括含有叠氮基官能团的非天然编码的氨基酸的BPFI可与聚合物(包括但不限于，聚(乙二醇))或者含有炔部分的第二多肽反应形成稳定接合物，所述稳定接合物是由叠氮基与炔官能团的形成Huisgen[3+2]环加成产物的选择性反应形成。a-氨基酸的一般结构说明如下(式I):IR非天然编码的氨基酸通常为具有上述式(其中R基团为除用于20种天然氨基酸中的取代基之外的任何取代基)的任何结构，且可适用于本发明中。由于本发明的非天然编码的氨基酸通常仅侧链结构不同于天然氨基酸，故非天然编码的氨基酸以其形成于天然存在多肽中的相同方式与其它氨基酸(包括但不限于，天然或非天然编码的氨基酸)形成酰胺键。然而，非天然编码的氨基酸具有将其区别于天然氨基酸的侧链基团。举例来说，R视情况包含烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤基-、49酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-、硼酸酯基(borate)、硼酸酯基(boronate)、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等，或其任何组合。可适用于本发明中的其它所关注的非天然存在氨基酸包括但不限于包含可光活化交联剂的氨基酸、自旋标记氨基酸、荧光氨基酸、结合金属的氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼蔽和/或可光异构化氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸(诸如糖取代丝氨酸)、其它碳水化合物修饰氨基酸、含酮基氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代氨基酸、可化学裂解和/或可光裂解的氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长侧链(包括但不限于，聚醚或长链烃，包括但不限于，大于约5个或大于约10个碳)的氨基酸、含碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或一个以上有毒部分的氨基酸。可适用于本发明中且可用于与水溶性聚合物反应的例示性非天然编码的氨基酸包括但不限于具有羰基、氨基氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮基和炔反应性基团的那些非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含糖部分。这些氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。这些氨基酸的实例还包括氨基酸与糖之间的天然存在的N或0键经自然界中不常见的共价键(包括但不限于，烯烃、肟、硫醚、酰胺等)置换的实例。这些氨基酸的实例也包括天然存在蛋白质中不常见的糖，诸如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。本文中提供的众多非天然编码的氨基酸可购自例如Sigma-Aldrich(St.Louis,MO，USA)、Novabiochem(EMDBiosciences,Darmstadt,Germany的分公司)或Peptech(Burlington,MA,USA)。不能购得的氨基酸视情况按本文所提供进行合成或使用所属领域的技术人员已知的标准方法进行合成。关于有机合成技术，例如参看Fessendon和Fessendon的OrganicChemistry,(1982,第2版,WillardGrantPress,BostonMass.);March的AdvancedOrganicChemistry(第3版，1985,Wiley和Sons,NewYork);以及Carey和Sundberg的AdvancedOrganicChemistry(第3版，A和B部分，1990,PlenumPress,NewYork)。也参看美国专利申请公开案2003/0082575和2003/0108885，其是以引用的方式并入本文中。除含有新颖侧链的非天然氨基酸之外，可适用于本发明中的非天然氨基酸还视情况包含(包括但不限于)如由式II和III的结构说明的经修饰主链结构.IIRin其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R'或S-R';X和Y可相同或不同，其通常包含S或O;且R和R'视情况相同或不同，其通常选自上文关于具有式I的非天然氨基酸所述的R基团的相同组分列表以及氢。举例来说，本发明的非天然氨基酸视情况包含在如式II和III所示的氨基或羧基中的取代。此类非天然氨基酸包括但不限于a-羟基酸、a-硫代酸、a-氨基硫代羧酸酯，包括但不限于具有对应于20种常见天然氨基酸的侧链或非天然侧链。另外，在a-碳上的取代视情况包括但不限于L、D或a-a-二取代氨基酸，诸如D-谷氨酸盐、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其它结构替代物包括环状氨基酸，诸如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物；P和y氨基酸，诸如经取代P-丙氨酸和，氨基丁酸。许多非天然氨基酸是以诸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等天然氨基酸为基础且适用于本发明中。酪氨酸类似物包括但不限于对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸和间位取代的酪氨酸，其中经取代酪氨酸包含(包括但不限于)酮基(包括但不限于，乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基团、硝基、炔基等。另外，也涵盖多取代芳基环。可适用于本发明中的谷氨酰胺类似物包括但不限于a-羟基衍生物、y-取代衍生物、环状衍生物以及酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。可适用于本发明中的苯丙氨酸类似物的实例包括但不限于对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含(包括但不限于)羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘、溴、酮基(包括但不限于，乙酰基)、苯甲酰基、炔基等。可适用于本发明中的非天然氨基酸的特定实例包括但不限于对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcP-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸和对炔丙基氧基-苯丙氨酸等。可适用于本发明中的多种非天然氨基酸的结构的实例提供于例如标题为"Invivoincorporationofunnaturalaminoacids"的WO2002/085923中。关于额外甲硫氨酸类似物，也参看Kiick等人,(2002)/"corpom"'owo/azz'cfezXoreco附6iwa"//rc^ez'"s/orc/ew(we/e"/vemo&yca"ow//zeiS/aM<iz>2ger//g加》"，PNAS99:19-24。在一个实施例中，提供包括非天然氨基酸(诸如对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸)的BPFI的组合物。还提供包含对(炔丙基氧基)-苯丙氨酸且包括但不限于蛋白质和/或细胞的各种组合物。一方面，包括对(炔丙基氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包括正交tRNA。非天然氨基酸可与正交tRNA键结(包括但不限于，共价键结)，其包括但不限于通过氨基-酰基键与正交tRNA共价键结、与正交tRNA的末端核糖的3'OH或2'OH共价键结等。经由非天然氨基酸可并入蛋白质中的化学部分提供多种优点以及对蛋白质的操作。举例来说，酮基官能团的独特反应性允许在活体外和活体内用众多含肼或含羟胺试剂中的任一种对蛋白质进行选择性修饰。重原子非天然氨基酸例如可用于定相X射线结构数据。使用非天然氨基酸进行重原子的位点特异性引入在选择重原子的位置时也提供选择性和灵活性。光反应性非天然氨基酸(包括但不限于，具有二苯甲酮和芳基叠氮化物(包括但不限于，叠氮基苯)侧链的氨基酸)例如允许在活体内和活体外有效地光交联蛋白质。光反应性非天然氨基酸的实例包括但不限于对叠氮基-苯丙氨酸和对苯甲酰基-苯丙氨酸。随后可通过激发提供光反应性基团的时间控制使具有光反应性非天然氨基酸的蛋白质随意交联。在一个实例中，可通过使用(包括但不限于)核磁共振和振动光谱学，用作为局部结构和动力学的探针的同位素标记(包括但不限于)甲基取代非天然氨基的甲基。炔基或叠氮基官能团例如允许通过[3+2]环加成反应用分子对蛋白质进行选择性修饰。并入多肽的氨基末端处的非天然氨基酸可由R基团(其为除用于20种天然氨基酸中的取代基之外的任何取代基)和不同于a-氨基酸(参看式I)中通常存在的NH2基团的第二反应性基团组成。可在具有不同于a-氨基酸(参看式I)中通常存在的COOH基团的第二反应性基团的羧基末端处并入类似的非天然氨基酸。非天然氨基酸的化学合成适用于本发明中的许多非天然氨基酸是购自例如Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee:WI,USA)。不可购得的那些非天然氨基酸是视情况如本文中所提供或如各种公开案中所提供进行合成，或者使用所属领域技术人员已知的标准方法合成。关于有机合成技术，例如参看Fessendon和Fessendon的OrganicChemistry,(1982,第2版，WillardGrantPress,BostonMass.);March的AdvancedOrganicChemistry(第3版，1985,Wiley和Sons,NewYork);以及Carey和Sundberg的AdvancedOrganicChemistry(第3版，A及B部分，1990，PlenumPress,NewYork)。描述非天然氨基酸合成的其它公开案包括例如标题为"InvivoincorporationofUnnaturalAminoAcids"的WO2002/085923;Matsoukas等人，(1995)LMed.Chem..38,4660-4669;King,RE.&Kidd,D.A.A.(1949)^7Vew5^"Aewio/G7w/a/w/weawdo/y-D(pe/^/^feyo/G7i^awfc爿czW戶ow/V^^y/afeJ/nfer/wed/fl/es.J.Chem.Soc,3315-3319;Friedman,O.M.&Chatterrji,R.(1959)5^"Ae^o/Den她veso/G7wtom'"e<xsMocfe/Sw6掛afes/or乂W-r訓orJ.Am.Chem.Soc.81,3750-3752;Craig,J.C.等人(1988)^510/^Co"ygwr加'owo/五"otw"'owerso/7-€72/0/*0-4//￥-(^&^^/7/"0)-7-2"/^/6"/>^/07/"0_7《"/"0//"￡^CTi/orogw/we).J.Org.Chem.53,1167-1170;Azoulay,M.,Vilmont,M.&Frappier,F.(1991)G/Mton/weawa/ogwes<xy尸ofewda/Jw/iwat/an'fl/s'Eur.J.Med.Chem.26,201-5;Koskinen，A.M.P.&Rapoport,H.(1989)iSyw/Zzen'so/^-5"w6wz7"w/"ed/Vo//we>y<xyCow/o"wa"owa〃yCowWra/wec/yi/w/wo颠/og證J.Org.Chem.54，1859-1866;Christie,B.D.&Rapoport,H.(1985)5>wtez\yo/f+J-J/ov/wca!ffn'we,/znwgTi爿wn'wo爿c/dZ)eca7"6owy/fl/iow/owC_yc/z'za/7'c".J.Org.Chem.50:1239-1246;Barton等人，(1987)S少威e^o/iVove/a一"脂力""Wsam/i-a/_p/ja-awn'wopz'wencvlcii/Jp/^opn'a^ef/"sa/wY,e(iDen'va^ives.Tetrahedron43:4297-4308;禾口Subasinghe等人,(1992)gw—wa〃cflwa/ogww5>7^/ze57\so/6"a-/z"eroc_yc//c2-細/"o/ro/awo/cac/<it/en'varivesawc/f/e/ra"/v/^yWawove/《w/WWfl/a^-w"w'feeJwYe.J.Med.Chem.35:4602-7。也参看2003年12月22日申请的标题为"ProteinArrays"的专利申请案第10/744,899号和2002年12月22日申请的第60/435,821号。A.羰基反应性基团具有羰基反应性基团的氨基酸允许多种反应以通过亲核加成或醇醛縮合反应与分子(包括但不限于，PEG或其它水溶性分子)连接。例示性含羰基氨基酸可如下所示53(H2)nR，COR2其中n为0-10;Ri为垸基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为l，Ri为苯基且R2为简单烷基(即，甲基、乙基或丙基)且酮部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为l，Ri为苯基且R2为简单烷基(即，甲基、乙基或丙基)且酮部分位于垸基侧链的间位。对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang，Z.等人，Biochemistry42:6735-6746(2003)中，其是以引用的方式并入本文中。其它含羰基氨基酸可由所属领域技术人员以类似方式制备。在一些实施例中，包含非天然编码的氨基酸的多肽经化学修饰以产生反应性羰基官能团。举例来说，可用于接合反应的醛官能团可由具有相邻氨基和羟基的官能团产生。如果生物活性分子为多肽，那么可使用例如iV末端丝氨酸或苏氨酸(其通常可存在或可通过化学或酶促消化暴露)在温和氧化性裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能团。例如参看Gaertner等人，万zo函/wg.C/亂3:262-268(1992);Geoghegan,K.和Stroh,J.,所ocowwg.C/^附.3:138-146(1992);Gaertner等人，/B/o/.C/em.269:7224-7230(1994)。然而，所属领域中已知的方法局限于在肽或蛋白质的N末端的氨基酸。在本发明中，带有相邻羟基和氨基的非天然编码的氨基酸可作为"掩蔽"醛官能团并入多肽中。举例来说，5-羟基赖氨酸在与s胺相邻处带有羟基。产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下加入摩尔过量的偏高碘酸钠以避免在多肽内的其它位点处发生氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型反应涉及向多肽的缓冲溶液中加入约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，接着在黑暗中培育约10分钟。例如参看美国专利第6,423,685号，其是以引用的方式并入本文中。羰基官能团可在温和条件下在水溶液中与含肼、酰肼、羟胺或氨基脲的试剂选择性反应以分别形成在生理条件下稳定的相应腙、肟或縮氨基脲键。例如参看Jencks,W.P.,/Oiem.Soc.81,475-481(1959);Shao，J.和Tam,J.P"爿m.C/ze附.Soc.117:3893-3899(1995)。此外，羰基的独特反应性允许在存在其它氨基酸侧链的情况下的选择性修饰。例如参看Cornish,V.W.等人，颠.C/^肌118:8150-8151(1996);Geoghegan，K.F.&Stroh,J.G"5/oco")wg.CTzew.3:138-146(1992);Mahal,L.K.等人'Sc/ewce276:1125-1128(1997)。B.肼、酰肼或氨基脲反应性基团含有亲核基团(诸如肼、酰肼或氨基脲)的非天然编码的氨基酸允许与多种亲电子基团反应以形成接合物(包括但不限于，与PEG或其它水溶性聚合物的接合物)。例示性含肼、酰肼或氨基脲的氨基酸可如下所示(CH2)nF^X-C(0)-NH相2其中n为0-10;Ri为烷基、芳基、经取代垸基或经取代芳基或不存在；X为O、N或S或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为4，Ri不存在且X为N。在一些实施例中，n为2，&不存在且X不存在。在一些实施例中，n为l，Ri为苯基，X为O，且氧原子位于芳基环上的脂肪族基团的对位。含酰肼、肼和氨基脲的氨基酸是自商业来源获得。举例来说，L-谷氨酸-酰肼是自SigmaChemical(St.Louis,MO)获得。不可购得的其它氨基酸可由所属领域技术人员制备。例如参看美国专利第6,281,211号，其是以引用的方式并入本文中。含有带有酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码的氨基酸的多肽可与含有醛或具有类似化学反应性的其它官能团的多种分子有效且选择性地反应。例如参看Shao，J.和TarnJ.，/Jw.Soc.117:3893-3899(1995)。与20种常见氨基酸上存在的亲核基团(包括但不限于，丝氨酸或苏氨酸的羟基或赖氨酸的氨基以及N末端)相比，酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使其对醛、酮和其它亲电子基团的反应性显著更强。C.含氨基氧基的氨基酸含有氨基氧基(也称作羟胺)的非天然编码的氨基酸允许与多种亲电子基团反应形成接合物(包括但不限于，与PEG或其它水溶性聚合物的接合物)。与肼、酰肼和氨基脲一样，氨基氧基的增强的亲核性允许其与含有醛或具有类似化学反应性的其它官能团的多种分子有效且选择性地反应。例如参看Shao,J.和Tam,J.,/jm.Soc.117:3893-3899(1995);H.Hang和C.Bertozzi,爿cc.Ozem.及"34:727-736(2001)。尽管与肼基团的反应产生相应腙，但氨基氧基与含羰基的基团(诸如酮)的反应通常产生后。例示性含氨基氧基的氨基酸可如下所示:(CH2)nRrX-(CH2)m-Y-0"NH2R2HN'、COR3其中n为0-10;^为垸基、芳基、经取代垸基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10;Y:C(O)或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，且Rs为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为l，&为苯基，X为O，m为1且Y存在。在一些实施例中，n为2，R^和X都不存在，m为0且Y不存在。含氨基氧基的氨基酸可由易于获得的氨基酸前体(高丝氨酸、丝氨酸和苏氨酸)来制备。例如参看M.Carrasco和R.Brown，《/Og.C/ie肌68:8853-8858(2003)。某些含氨基氧基的氨基酸(诸如L-2-氨基-4-(氨基氧基)丁酸)已从天然来源分离(Rosenthal,G.,LifeSci.60:1635-1641(1997))。其它含氨基氧基的氨基酸可由所属领域技术人员来制备。D.叠氮基和炔反应性基团叠氮基和炔官能团的独特反应性使其尤其适用于多肽和其它生物分子的选择性修饰。有机叠氮化物(尤其是脂肪族叠氮化物)和炔通常对常见反应性化学条件稳定。具体来说，叠氮基与炔官能团对见于天然存在多肽中的20种常见氨基酸的侧链(即，R基团)呈惰性。然而，当达到紧密接近时，显示出叠氮基和炔基的"弹簧负载(spring-loaded)"本质且其通过Huisgen[3+2]环加成反应选择性且有效地反应以产生相应三唑。例如参看ChinJ.等人，Scz'e"ce301:964-7(2003);Wang，Q.等人，《/X附.C/iem.Soc.125,3192-3193(2003);Chin,J.W.等人，■/C&附.Soc.124:9026-9027(2002)。因为Huisgen环加成反应涉及选择性环加成反应(例如参看Padwa,A.,COMPREHENSIVEORGANICSYNTHESIS,第4巻，(Trost,B.M.编，1991),第1069-1109页；Huisgen,R.1,3-DipolarCycloadditionChemistry,(Padwa,A.编，1984),第1-176页)而非亲核取代，所以并入带有含叠氮基和炔侧链的非天然编码的氨基酸允许所得多肽在非天然编码的氨基酸的位置处经选择性修饰。可在存在催化量的用于将Cu(II)原位还原为Cu(I)的还原剂的情况下，通过加入Cu(II)(包括但不限于，催化量的CuS04的形式)在室温下在水性条件下进行涉及含叠氮基或炔的BSP的环加成反应。例如参看Wang,Q.等人，為.C/ze附.Soc.125,3192-3193(2003);Tornoe,C.W.等人,乂Og.56C/zew.67:3057-3064(2002);Rostovtsev等人，C/zem./"A￡d41:2596-2599(2002)。例示性还原剂包括(包括但不限于)抗坏血酸盐、金属铜、奎宁(quinine)、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、0)2+和施加电势。在需要叠氮基与炔之间的Huisgen[3+2]环加成反应的一些情况下，BSP包含包括炔部分的非天然编码的氨基酸且欲与氨基酸连接的水溶性聚合物包含叠氮基部分。或者，也可进行逆向反应(即，在氨基酸上具有叠氮基部分且在水溶性聚合物上存在炔部分)。叠氮基官能团也可与含有芳基酯的水溶性聚合物选择性反应且经芳基膦部分适当官能化以产生酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮基且随后所得胺与最接近的酯键有效反应产生相应酰胺。例如参看E.Saxon和C.Bertozzi,Sc/ewce287，2007-2010(2000)。含叠氮基的氨基酸可为烷基叠氮化物(包括但不限于，2-氨基-6-叠氮基-l-己酸)或芳基叠氮化物(对叠氮基-苯丙氨酸)。含有芳基酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下所示其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物且R可为H、垸基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基团包括但不限于-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R"、-SR'、-卣素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(0)2R'、-S(0)2NR'R"、-CN和-N02。R'、R"、R"'和R""各自独立地指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括但不限于，经l-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳基垸基。当本发明的化合物包括一个以上R基团时，例如，各R基团是如当存在一个以上这些基团时各R'、R"、R"'和R""基团一样独立地选择。当R'和R"连接到相同氮原子时，其可与氮原子组合形成5、6或7元环。举例来说，-NR'R"打算包括但不限于l-吡咯垸基和4-吗啉基。根据上述关于取代基的论述，所属领域技术人员应了解术语"烷基"打算包括包含与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团，诸如卤烷基(包括但不限于，-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括但不限于，-C(0)CH3、-C(0)CF3、-C(0)CH2OCH3等)。叠氮基官能团也可与含有硫酯的水溶性聚合物选择性反应且经芳基膦部分适当官能化以产生酰胺键。芳基膦基团原位还原叠氮基且所得胺随后与硫酯键有效反应产生相应酰胺。含有硫酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下表示其中n为l-10;X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。例示性含炔氨基酸可如下所示((H禍X(CH2〉mCCH其中n为0-10;Ri为垸基、芳基、经取代垸基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10，R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R!为苯基，X不存在，m为O且乙炔部分位于垸基侧链的对位。在一些实施例中，n为l，Ri为苯基，X为O,m为1且炔丙基氧基位于垸基侧链的对位(即，O-炔丙基-酪氨酸)。在一些实施例中，n为l，Ri和X都不存在且m为O(即，炔丙基甘氨酸)。含炔氨基酸在市面上有售。举例来说，炔丙基甘氨酸是购自Peptech(Burlington,MA)。或者，可根据标准方法来制备含炔氨基酸。举例来说，可如例如Ddters,A.等人,/爿附.C/em.Soc.125:11782-11783(2003)中所述来合成对炔丙基氧基苯丙氨酸，且可如Kayser，B.等人，:r"ra/e^ow53(7):2475-2484(1997)中所述来合成4-炔基-L-苯丙氨酸。所属领域技术人员可制备其它含炔氨基酸。例示性含叠氮基氨基酸可如下所示(9H禍X(CH2)mN3其中n为0-10;Ri为烷基、芳基、经取代垸基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。在一些实施例中，n为1，Ri为苯基，X不存在，m为0且叠氮部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为0-4且&和X不存在，im=0。在一些实施例中，n为l，Ri为苯基，X为O，m为2且对叠氮基乙氧基部分位于垸基侧链的对位。。含叠氮基的氨基酸可自商业来源获得。举例来说，4-叠氮基苯丙氨酸可自Chem-ImpexInternational,Inc.(WoodDale,IL)获得。对于那些不可购得的含叠氮基的氨基酸来说，可相对容易地使用所属领域技术人员巳知的标准方法来制备叠氮基，所述方法包括但不限于通过适当离去基(包括但不限于，卤基、甲磺酸根、甲苯磺酸根)置换或通过打开经适当保护的内酯。例如参看March的AdvancedOrganicChemistrv(第3版，1985，WileyandSons,NewYork)。E.氨基硫醇反应性基团P取代氨基硫醇官能团的独特反应性使其极其适用于通过形成噻唑垸来对含有醛基的多肽和其它生物分子进行选择性修饰。例如参看J.Shao和J.Tam,/Zw.C/e肌Soc.1995,117(14)3893-3899。在一些实施例中，(3取代氨基硫醇氨基酸可并入BSP中且随后与包含醛官能团的水溶性聚合物反应。在一些实施例中，水溶性聚合物、药物接合物或其它有效负载可通过形成噻唑烷而与包含P取代氨基硫醇氨基酸的BSP偶合。非天然氨基酸的细胞吸收真核细胞对非天然氨基酸的吸收为设计和选择(包括但不限于)并入蛋白质中的非天然氨基酸时通常考虑的一个问题。举例来说，a-氨基酸的高电荷密度表明这些化合物不太可能透过细胞。通过以蛋白质为基础的输送系统的集合将天然氨基酸吸收入真核细胞中。可进行迅速筛检，其评估哪种非天然氨基酸(如果存在)是由细胞吸收。例如参看2003年12月22日申请的标题为"ProteinArrays"的申请案第10/744,899号和2002年12月22日申请的第60/435,821号；以及Liu,D.R.和Schultz,P.G.(1999)尸ragreMtowaWevo/Wowo/aworgflm'swawex/a"<iec/gew"/ccocfe.PNASUnitedStates96:4780-4785中的毒性检定。尽管用各种检定可容易地分析吸收，但设计适合于细胞吸收路径的非天然氨基酸的替代方案为提供在活体内产生氨基酸的生物合成路径。非天然氨基酸的生物合成许多生物合成路径已存在于细胞中以用于产生氨基酸和其它化合物。尽管用于特定非天然氨基酸的生物合成方法在自然界中(包括但不限于，在真核细胞中)可能不存在，但本发明提供这些方法。举例来说，非天然氨基酸的生物合成路径是通过加入新酶或改变现有宿主细胞路径视情况在宿主细胞中产生。其它新酶视情况为天然存在的酶或人工发展的酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成(如在标题为"Invivoincorporationofunnaturalaminoacids"的WO2002/085923中的实例中所呈现)依赖于加入来自其它有机体的已知酶的组合。可通过用包含针对这些酶的基因的质粒转化真核细胞将基因引入细胞中。当于细胞中表达时，基因提供合成所需化合物的酶促路径。视情况加入的酶的类型的实例提供于下文实例中。其它酶序列见于例如Genbank中。人工发展的酶也以相同方式视情况加到细胞中。以此方式操作细胞的细胞机构和资源以产生非天然氨基酸。多种方法可用于产生用于生物合成路径中或用于发展现有路径的新颖酶。举例来说，将如由(包括但不限于)Maxygen,Inc.(可通过万维网在maxygen.com上获得)研发的递归重组视情况用于研发新颖酶和路径。例如参看Stemmer(1994)，ia;^evo/Wowo/av/加ZWJs/m,"g,Nature370(4):389-39h和Stemmer,(1994),IWJgvo/Wo",Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,91:10747-10751。类似地，由Genencor(可通过万维网在genencor.com上获得)研发的DesignPathTw视情况用于代谢路径工程改造，其包括但不限于工程改造在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸的路径。此技术使用(包括但不限于)经由功能基因组学以及分子发展和设计鉴别的那些新基因的组合在宿主有机体中重建现有路径。DiversaCorporation(可通过万维网在diversa.com上获得)也提供用于迅速筛检基因文库和基因路径的技术(包括但不限于)以产生新路径。通常，由本发明的经工程改造生物合成路径产生的非天然氨基酸是以足以进行有效蛋白质生物合成(包括但不限于，天然细胞量)，但未达到影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度的浓度产生。以此方式在活体内产生的典型浓度为约10mM至约0.05mM。用包含用于产生特定路径所需的酶的基因的质粒转化细胞且产生非天然氨基酸后，视情况使用活体内选择进一步最优化用于核糖体蛋白质合成与细胞生长的非天然氨基酸的产生。具有非天然氨基酸的多肽可出于多种目的进行非天然氨基酸的并入，所述目的包括但不限于定制蛋白质结构和/或功能的改变；改变尺寸、酸度、亲核性、氢键结、疏水性、蛋白酶标靶位点的可接近性；靶向部分(包括但不限于，对于蛋白质阵列来说)；加入生物活性分子；连接聚合物；连接放射性核素；调节血清半衰期；调节组织渗透(例如肿瘤)；调节活性输送；调节组织、细胞或器官特异性或分布；调节免疫原性；调节蛋白酶抗性等。包括非天然氨基酸的蛋白质可具有增强或甚至全新的催化或生物物理特性。举例来说，视情况通过将非天然氨基酸包括于蛋白质中来改变以下特性毒性、生物分布、结构特性、光谱特性、化学和/或光化学特性、催化能力、半衰期(包括但不限于，血清半衰期)、与其它分子反应(包括但不限于，共价或非共价)的能力等。包括包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质的组合物可用于(包括但不限于)新颖疗法、诊断学、催化酶、工业酶、结合蛋白(包括但不限于，抗体)以及(包括但不限于)蛋白质结构和功能的研究。例如参看Dougherty,(2000)t/"wo^wa/Jmz力oJcz'tfecw/Vo6eso//Vo/e/wSfrwcfweFwwcdow,CurrentOpinioninChemicalBiology,4:645-652。在本发明的一个方面中，组合物包括至少一种具有至少一个(包括但不限于，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或者至少十个或十个以上)非天然氨基酸的蛋白质。非天然氨基酸可相同或不同，包括但不限于在蛋白质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10个以上不同位点可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10个以上不同非天然氨基酸。另一方面，组合物包括蛋白质中存在的特定氨基酸中的至少一个(但少于全部)经非天然氨基酸取代的蛋白质。对于-具有一个以上非天然氨基酸的给定蛋白质来说，非天然氨基酸可相同或不同(包括但不限于，所述蛋白质可包括两个或两个以上不同类型的非天然氨基酸，或可包括两个相同的非天然氨基酸)。对于具有两个以上非天然氨基酸的给定蛋白质来说，非天然氨基酸可相同、不同或为相同种类的多个非天然氨基酸与至少一个不同的非天然氨基酸的组合。具有至少一个非天然氨基酸的所关注蛋白质或多肽为本发明的特征。本发明也包括使用本发明的组合物和方法产生的具有至少一个非天然氨基酸的多肽或蛋白质。赋形剂(包括但不限于，医药学上可接受的赋形剂)也可与蛋白质一起存在。通过在真核细胞中产生具有至少一个非天然氨基酸的所关注蛋白质或多肽，蛋白质或多肽通常将包括真核翻译后修饰。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个非天然氨基酸和至少一个在活体内由真核细胞进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰并非由原核细胞进行。举例来说，翻译后修饰包括(包括但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰、糖基化等。一方面，翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺键将寡糖(包括但不限于(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)与天冬酰胺连接。参看表l,其列出真核蛋白的N连接寡糖的一些实例(也可存在其它残基，其未显示)。另一方面，翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨酸键或者GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键将寡糖(包括但不限于，Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。另一方面，翻译后修饰包括前体(包括但不限于，降血钙素前体、降血钙素基因相关肽前体、前甲状旁腺激素原、前胰岛素原、胰岛素原、前阿黑皮素原、阿黑皮素原等)的蛋白水解处理、组装成多亚单位蛋白质或大分子组装、翻译到细胞中的另一位点中(包61括但不限于，翻译到诸如内质网、高尔基体(Golgiapparatus)、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等细胞器中，或通过分泌路径)。在某些实施例中，蛋白质包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等。非天然氨基酸的一个优点在于其提供可用于添加其它分子的其它化学部分。这些修饰可在真核或非真核细胞中在活体内或在活体外进行。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是通过非天然氨基酸进行。举例来说，翻译后修饰可通过亲核-亲电子反应进行。目前用于蛋白质的选择性修饰的大多数反应涉及亲核与亲电子反应搭配物之间共价键的形成，其包括但不限于a-卤酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情况下通过蛋白质中亲核残基的数目和可接近性来测定选择性。在本发明的蛋白质中，可使用其它选择性更大的反应，诸如在活体外和活体内非天然酮基氨基酸与酰肼或氨基氧基化合物的反应。例如参看Cornish等人，(1996)J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151;Mahal等人，(1997)Science,276:1125-1128;Wang等人.(2001)Science292:498-500:Chin等人，(7002)J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027;Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci..99:11020-11024;Wang等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.,100:56-61;Zhang等人，(2003)Biochemistry,42:6735-6746;以及Chin等人，(2003)Science,301:964-7。此允许用包括荧光团、交联剂、糖衍生物和细胞毒性分子的大量试剂选择性标记几乎任何蛋白质。也参看2003年IO月15日申请的标题为"Glycoproteinsynthesis"的美国专利申请案第10/686,944号，其是建立在2002年10月16日申请的美国临时专利申请案第60/419,265号、2002年10月23日申请的美国临时专利申请案第60/420,990号和2003年1月16日申请的美国临时专利申请案第60/441,450号，所述专利是以引用的方式并入本文中。翻译后修饰(包括但不限于，通过叠氮基氨基酸进行)也可通过施陶丁格接合(Staudingerligation)(包括但不限于，用三芳基膦试剂)进行。例如参看Kiick等人，(2002)/"co^ora"owo/flz/^feyz'Worecom6/waW，ofez>w/orc/ewose/ec"'ve/noc^ca"'ow//gWow,PNAS99:19-24。本发明提供用于选择性修饰蛋白质的另一高效方法，其涉及回应选择密码子而将非天然氨基酸(包括但不限于，含有叠氮基或炔基部分)遗传并入蛋白质中。这些氨基酸侧链随后可通过(包括但不限于)分别与(包括但不限于)炔基或叠氮基衍生物的Huisgen[3+2]环加成反应(例如参看Padwa,A.ComprehensiveOrganicSynthesis.第4巻,(1991)Trost,B.M.编，Pergamon,Oxford,第1069-1109页；禾nHuisgen，R.1,3-DipolarC油additionChemistry,(1984)Padwa,A.编，Wiley,NewYork,第1-176页)而经修饰。因为此方法涉及环加成而非亲核取代，所以可在极高选择性下对蛋白质进行修饰。通过62向反应混合物中加入催化量的Cu(I)盐，可在室温下在水性条件下以优良的区域选择性(1,4>1,5)进行此反应。例如参看Tornoe等人，(2002)J.Org.Chem.67:3057-3064;和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599。可使用的另一方法为在双砷化合物上用四半胱氨酸基元进行配体交换，例如参看Griffin等人，(1998)Science281:269-272。可通过[3+2]环加成反应加成到本发明的蛋白质中的分子几乎包括具有叠氮基或炔基衍生物的任何分子。分子包括但不限于染料、荧光团、交联剂、糖衍生物、聚合物(包括但不限于，聚乙二醇的衍生物)、光交联剂、细胞毒性化合物、亲和性标记、生物素的衍生物、树脂、珠粒、第二蛋白质或多肽(或更多)、聚核苷酸(包括但不限于，DNA、RNA等)、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物等。这些分子可分别加成到具有炔基的非天然氨基酸(包括但不限于，对炔丙基氧基苯丙氨酸)或具有叠氮基的非天然氨基酸(包括但不限于，对叠氮基-苯丙氨酸)中。K包含非基齿编码的氨基酸的5户FJ的活体内产生可使用经修饰tRNA和tRNA合成酶在活体内产生本发明的BPFI以加成到在天然存在系统中未编码的氨基酸上或将其取代。使用在天然存在系统中未编码的氨基酸产生tRNA和tRNA合成酶的方法描述于例如美国专利申请公开案第2003/0082575号(第10/126,927号)和第2003/0108885号(第10/126,931号)中，其是以引用的方式并入本文中。这些方法涉及产生独立于翻译系统(且因此有时被称作"正交")的内源性合成酶和tRNA起作用的翻译机构。通常，翻译系统包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。通常，O-RS优先在翻译系统中使具有至少一个非天然存在氨基酸的O-tRNA氨酰基化且O-tRNA识别至少一个不由系统中的其它tRNA识别的选择密码子。因此翻译系统回应经编码的选择密码子而将非天然编码的氨基酸插入系统中所产生的蛋白质中，从而将氨基酸"取代"入所编码多肽中的一定位置中。所属领域中已描述用于将特定合成氨基酸插入多肽中的多种正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶，且其通常适用于本发明中。举例来说，酮基特异性0-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶描述于Wang,L.等人，Ptoc.JVa".^cadScz'.100:56-61(2003)和Zhang,Z.等人，5z'oc&m.42(22):6735-6746(2003)中。例示性O-RS或其部分是由聚核苷酸序列编码且包括美国专利申请公开案2003/0082575和2003/0108885中所揭示的氨基酸序列，这些文献各自以引用的方式并入本文中。与O-RS—起使用的相应O-tRNA分子也描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号)中，其是以引用的方式并入本文中。叠氮基特异性0-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶系统的实例描述于Chin,J.W.等人，C&附.Soc.124:9026-9027(2002)中。对叠氮基-L-Phe的例示性O-RS序列包括但不限于如美国专利申请公开案2003/0108885(第10/126,931号)中所揭示的核苷酸序列SEQIDNO:14-16和29-32以及氨基酸序列SEQIDNO:46-48和61-64，所述文献是以引用的方式并入本文中。适用于本发明中的例示性O-tRNA序列包括但不限于如美国专利申请公开案2003/0108885(第10/126,931号)中所揭示的核苷酸序列SEQIDNO:1-3，所述文献是以引用的方式并入本文中。对特定非天然编码的氨基酸具特异性的O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对的其它实例描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)中，所述文献是以引用的方式并入本文中。在酿酒酵母(S.cwev&'ae)中并入含酮基与含叠氮基氨基酸的O-RS和O-tRNA描述于Chin，J.W.等人，301:964-967(2003)中。0-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的使用涉及选择编码非天然编码的氨基酸的特定密码子。尽管可使用任何密码子，但通常希望选择在表达0-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的细胞中很少或从未使用的密码子。举例来说，例示性密码子包括无义密码子(诸如终止密码子(琥珀、赭石和蛋白石))、四个或四个以上碱基密码子和很少或未使用的其它天然三碱基密码子。可使用所属领域中己知的突变诱发方法(包括但不限于，位点特异性突变诱发、盒式突变诱发、限制选择突变诱发等)将特定选择密码子引入BPFI编码序列中的适当位置中。用于产生可用于并入非天然编码的氨基酸的蛋白质生物合成机构的组分(诸如O-RS、O-tRNA和正交O-tRNA/0-RS对)的方法描述于Wang,L.等人，Sc/wce292:498-500(2001);Chin，J.W.等人，/X/n.C/zem.124:卯26-9027(2002);Zhang，Z.等人，石/oc/e/m'W^42:6735-6746(2003)中。用于在活体内并入非天然编码的氨基酸的方法和组合物描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)中，其是以引用的方式并入本文中。用于选择用于有机体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号)中，其是以引用的方式并入本文中。用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包含(a)由第一有机体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况突变)RS的文库，所述第一有机体包括但不限于原核有机体，诸如詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐杆菌、大肠杆菌、闪烁古生球菌、嗜热古菌、极端嗜热古菌、超嗜热需氧古生菌、极端嗜热菌(ZAw附印/u7m)等；或真核有机体；(b)在RS(视情况突变RS)文库中选择(和/或筛检)在存在非天然编码的氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化的成员，从而提供活性(视情况突变)RS的集合；和域(c)在所述集合中选择(视情况通过阴性选择)在不存在非天然编码的氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(包括但不限于，突变RS)，从而提供所述至少一种重组O-RS;其中所述至少一种重组O-RS优先使具有非天然编码的氨基酸的O-tRNA氨酰基化。在一个实施例中，RS为非活性RS。非活性RS可通过使活性RS突变而产生。举例来说，可通过使至少约l个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或至少约10个或10个以上氨基酸突变为不同氨基酸(包括但不限于，丙氨酸)来产生非活性RS。可使用所属领域中已知的各种技术来产生突变RS的文库，这些技术包括但不限于以蛋白质三维RS结构为基础的理性设计或在随机或理性设计技术中RS核苷酸的突变诱发。举例来说，可通过位点特异性突变、随机突变、产生多样性的重组突变、嵌合构筑体、理性设计和在本文中所述或所属领域中已知的其它方法产生突变RS。在一个实施例中，在RS(视情况突变RS)的文库中选择(和/或筛检)(包括但不限于)在存在非天然编码的氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化的活性成员包括将阳性选择或筛检标记(包括但不限于，抗生素抗性基因等)和(视情况突变)RS的文库引入多个细胞中，其中阳性选择和/或筛检标记包含至少一个选择密码子(包括但不限于，琥珀、赭石或蛋白石密码子)；使所述多个细胞在存在选择剂的情况下生长；通过抑制阳性选择或筛检标记中的至少一个选择密码子来鉴别在存在选择剂和/或筛检剂的情况下存活(或显示特异性反应)的细胞，从而提供含有活性(视情况突变)RS的集合的经阳性选择细胞的子集。视情况可改变选择剂和/或筛检剂浓度。一方面，阳性选择标记为氯霉素(chloramphenicol)乙酰基转移酶(CAT)基因且在CAT基因中选择密码子为琥珀终止密码子。视情况，阳性选择标记为p-内酰胺酶基因且在P-内酰胺酶基因中选择密码子为琥珀终止密码子。另一方面，阳性筛检标记包含荧光或发光筛检标记或以亲和性为基础的筛检标记(包括但不限于，细胞表面标记)。在一个实施例中，在集合中阴性选择或筛检在不存在非天然编码的氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(视情况突变)包括将阴性选择或筛检标记与来自阳性选择或筛检的活性(视情况突变)RS的集合引入第二有机体的多个细胞中，其中阴性选择或筛检标记包含至少一个选择密码子(包括但不限于，抗生素抗性基因，其包括但不限于氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因)；以及鉴别在补充有非天然编码的氨基酸和筛检剂或选择剂的第一培养基中存活或显示特异性筛检反应，但在未补充非天然编码的氨基酸和选择剂或筛检剂的第二培养基中不能存活或显示特异性反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛检细胞。举例来说，CAT鉴别方案在测定适当0-RS重组体时视情况充当阳性选择和/或阴性筛检。举例来说，视情况在存在或不存在一个或一个以上非天然编码的氨基酸的情况下于含有CAT(其包含至少一个选择密码子)的生长板上复制克隆集合。因此认为仅在含有非天然编码的氨基酸的平板上生长的菌落含有重组O-RS。一方面，改变选择(和/或筛检)剂的浓度。在一些方面中，第一与第二有机体不同。因此，第一和/或第二有机体视情况包含原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌(archaebacterium)、真细菌(eubacterium)、植物、昆虫、原生生物等。在其它实施例中，筛检标记包含荧光或发光筛检标记或以亲和性为基础的筛检标记。在另一个实施例中，在集合中筛检或选择(包括但不限于，阴性选择)活性(视情况突变)RS包括自阳性选择步骤(b)分离活性突变RS的集合；将阴性选择或筛检标记和活性(视情况突变)RS的集合引入第二有机体的多个细胞中，其中阴性选择或筛检标记包含至少一个选择密码子(包括但不限于毒性标记基因，其包括但不限于包含至少一个选择密码子的核糖核酸酶barnase基因)；以及鉴别在未补充非天然编码的氨基酸的第一培养基中存活或显示特异性筛检反应，但在补充有非天然编码的氨基酸的第二培养基中不能存活或显示特异性筛检反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛检细胞，其中所述至少一种重组O-RS对非天然编码的氨基酸具特异性。一方面，所述至少一个选择密码子包含约两个或两个以上选择密码子。这些实施例视情况可包括其中所述至少一个选择密码子包含两个或两个以上选择密码子，且其中第一与第二有机体不同(包括但不限于，各有机体视情况为(包括但不限于)原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等)的情形。同样，一些方面包括阴性选择标记包含核糖核酸酶bamase基因(其包含至少一个选择密码子)的情形。其它方面包括筛检标记视情况包含荧光或发光筛检标记或以亲和性为基础的筛检标记的情形。在本文中的实施例中，筛检和/或选择视情况包括筛检和/或选择严格度的变化。在一个实施例中，用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法可进一步包含(d)分离所述至少一种重组O-RS;(e)产生来源于所述至少一种重组O-RS的第二组O-RS(视情况突变)；以及(f)重复步骤(b)和(c)直到获得包含优先使O-tRNA氨酰基化的能力的突变O-RS。视情况，将步骤(d)-(f)重复(包括但不限于)至少约两次。一方面，可通过突变诱发(包括但不限于，随机突变诱发、位点特异性突变诱发、重组或其组合)产生来源于至少一种重组O-RS的第二组突变O-RS。上述方法中选择/筛检步骤(包括但不限于，阳性选择/筛检步骤(b)、阴性选择/筛检步骤(c)或阳性与阴性选择/筛检步骤(b)与(c))的严格度视情况包括改变选择/筛检严格度。在另一个实施例中，阳性选择/筛检步骤(b)、阴性选择/筛检步骤(c)或阳性与阴性选择/筛检步骤(b)与(c)包含使用报告基因，其中报告基因是由荧光活化细胞分选法(FACS)检测或其中报告基因是由发光检测。视情况，报告基因是展示于细胞表面上、噬菌体展示上等且根据涉及非天然编码的氨基酸或类似物的亲和性或催化活性进行选择。在一个实施例中，突变合成酶是展示于细胞表面上、噬菌体展示上等。用于产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包括(a)由第一有机体产生来源于至少一种tRNA(包括但不限于，抑制tRNA)的突变tRNA的文库；(b)在所述文库中选择(包括但不限于，阴性选择)或筛检在不存在来自第一有机体的RS的情况下由来自第二有机体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(视情况突变)tRNA,从而提供tRNA(视情况突变)的集合；以及(c)在所述tRNA(视情况突变)集合中选择或筛检由经引入正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA;其中所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且并不由来自第二有机体的RS有效识别且由O-RS优先氨酰基化。在一些实施例中，所述至少一种tRNA为抑制tRNA和/或包含具有天然和/或非天然碱基的独特三碱基密码子，或为无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包含至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石终止密码子。在一个实施例中，重组O-tRNA具有正交性的改良。应了解在一些实施例中，O-tRNA无需修饰而视情况从第二有机体引入第一有机体中。在各种实施例中，第一与第二有机体相同或不同且视情况选自(包括但不限于)原核生物(包括但不限于，詹氏甲垸球菌、嗜热自养甲垸杆菌、大肠杆菌、嗜盐杆菌等)、真核生物、哺乳动物、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外，重组tRNA是由非天然编码的氨基酸视情况氨酰基化，其中非天然编码的氨基酸是在活体内天然生物合成或通过基因操作生物合成。视情况将非天然编码的氨基酸加到至少第一或第二有机体的生长培养基中。一方面，在所述文库中选择(包括但不限于，阴性选择)或筛检由氨酰基-tRNA合成酶氨酰基化的(视情况突变)tRNA(步骤(b))包括将毒性标记基因和(视情况突变)tRNA文库引入来自第二有机体的多个细胞中，其中毒性标记基因包含至少一个选择密码子(或导致产生毒性剂或抑制剂(staticagent)的基因或有机体必需的基因，其中所述标记基因包含至少一个选择密码子)；和选择存活细胞，其中存活细胞含有包含至少一个正交tRNA或非功能性tRNA的(视情况突变)tRNA的集合。举例来说，可通过使用比较比率细胞密度检定来选择存活细胞。另一方面，毒性标记基因可包括两个或两个以上选择密码子。在这些方法的另一个实施例中，毒性标记基因为核糖核酸酶bamase基因，其中核糖核酸酶bamase基因包含至少一个琥珀密码子。核糖核酸酶barnase基因视情况可包括两个或两个以上琥珀密码子。在一个实施例中，在(视情况突变)tRNA的集合中选择或筛检由经引入正交RS(O-RS)氨酰基化的成员可包括将阳性选择或筛检标记基因以及O-RS和(视情况突变)tRNA的集合引入来自第二有机体的多个细胞中，其中阳性标记基因包含药物抗性基因(其包括但不限于P-内酰胺酶基因，其包含至少一个选择密码子，诸如至少一个琥珀终止密码子)或有机体必需的基因或使得毒性剂解毒的基因；和鉴别在存在选择剂或筛检剂(包括但不限于，抗生素)的情况下生长的存活或筛检细胞，从而提供具有至少一种重组tRNA的细胞的集合，其中所述至少一种重组tRNA是由O-RS氨酰基化且回应所述至少一个选择密码子而将氨基酸插入由阳性标记基因编码的翻译产物中。在另一个实施例中，改变选择剂和/或筛检剂的浓度。提供用于产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。所述方法包括(a)由第一有机体产生来源于至少一种tRNA的突变tRNA的文库；(b)在所述文库中阴性选择或筛检在不存在来自第一有机体的RS的情况下由来自第二有机体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(视情况突变)tRNA，从而提供(视情况突变)tRNA的集合；(c)在(视情况突变)tRNA集合中选择或筛检由经引入正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且并不由来自第二有机体的RS有效识别且由O-RS优先氨酰基化。所述方法还包括(d)由第三有机体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况突变)RS的文库；(e)在突变RS文库中选择或筛检在存在非天然编码的氨基酸和天然氨基酸的情况下优先使所述至少一种重组O-tRNA氨酰基化的成员，从而提供活性(视情况突变)RS的集合；和(f)在所述集合中阴性选择或筛检在不存在非天然编码的氨基酸的情况下优先使所述至少一种重组O-tRNA氨酰基化的活性(视情况突变)RS，从而提供至少一种特异性O-tRNA/O-RS对，其中所述至少一种特异性O-tRNA/O-RS对包含至少一种对非天然编码的氨基酸具特异性的重组O-RS和所述至少一种重组O-tRNA。包括由所述方法产生的特异性O-tRNA/0-RS对。举例来说，特异性O-tRNA/0-RS对可包括(包括但不限于)mutRNATyr隱mutTyrRS对，诸如mutRNATyr-SS12TyrRS对、mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对等等。另外，这些方法包括第一与第三有机体相同(其包括但不限于，詹氏甲烷球菌)的情形。在本发明中也包括用于选择用于第二有机体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法。这些方法包括将标记基因、tRNA和从第一有机体分离或获得的氨酰基-tRNA合成酶(RS)引入来自第二有机体的第一组细胞中；将标记基因和tRNA引入来自第二有机体的复制细胞组中；和选择在复制细胞组中不能存活的第一组中的存活细胞或筛检显示特异性筛检反应但在复制细胞组中不能提供这种反应的细胞，其中第一组与复制细胞组是在存在选择剂或筛检剂的情况下生长，其中存活或筛检细胞包含用于第二有机体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中，比较和选择或筛检包括活体内互补检定。可改变选择剂或筛检剂的浓度。本发明的有机体包含多种有机体和多种组合。举例来说，本发明的方法的第一与第二有机体可相同或不同。在一个实施例中，有机体视情况为原核有机体，其包括但不限于詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐杆菌、大肠杆菌、闪烁古生球菌、嗜热古菌、极端嗜热古菌、超嗜热需氧古生菌、极端嗜热菌等。或者，有机体视情况包含真核有机体，其包括但不限于植物(包括但不限于，复杂植物，诸如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包括但不限于，酵母等)、动物(包括但不限于，哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等。在另一个实施例中，第二有机体为原核有机体，其包括但不限于詹氏甲垸球菌、嗜热自养甲垸杆菌、嗜盐杆菌、大肠杆菌、闪烁古生球菌、嗜盐杆菌、嗜热古菌、极端嗜热古菌、超嗜热需氧古生菌、极端嗜热菌等。或者，第二有机体可为真核有机体，其包括但不限于酵母、动物细胞、植物细胞、真菌、哺乳动物细胞等。在各种实施例中，第一与第二有机体不同。W.非天然存在氨基酸在5户FJ中的位置本发明涵盖将一个或一个以上非天然存在氨基酸并入BPFI中。可将一个或一个以上非天然存在氨基酸并入不破坏多肽活性的特定位置处。这可通过进行"保守性"取代来实现，其包括但不限于用疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸、用庞大氨基酸取代庞大氨基酸、用亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸和/或在活性不需的位置中插入非天然存在氨基酸。可使用多种生物化学和结构方法来选择用于在BPFI内经非天然编码的氨基酸取代的所需位点。所属领域技术人员易于了解多肽链的任何位置适于选择以并入非天然编码69的氨基酸，且选择可基于理性设计或出于任何或无特定要求目的通过随机选择进行。所需位点的选择可用于产生具有任何所需特性或活性的BPFI分子，包括但不限于激动剂、超激动剂、反向激动剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂、与结合搭配物结合的调节剂、结合搭配物活性调节剂、结合搭配物构象调节剂、二聚体或多聚体形成、与天然分子相比活性或特性无变化或操纵多肽的任何物理或化学特性(诸如溶解性、聚集或稳定性)。举例来说，可使用所属领域中己知的点突变分析、丙氨酸扫描或同源物扫描方法来鉴别BPFI的生物活性所需的在多肽中的位置。视对于多肽所追求的所需活性而定，除由丙氨酸或同源物扫描突变诱发鉴别为对生物活性关键的那些残基之外的残基可为用非天然编码的氨基酸取代的良好候选者。或者，仍然视对于多肽所追求的所需活性而定，经鉴别对生物活性关键的位点也可为用非天然编码的氨基酸取代的良好候选者。另一替代方法将为在多肽链上的各位置中用非天然编码的氨基酸简单进行连续取代且观察对多肽活性的影响。所属领域技术人员易于了解用于选择用于经非天然氨基酸取代入任何多肽中的位置的任何方式、技术或方法都适用于本发明中。也可研究含有缺失的BPFI的天然存在突变体的结构和活性以确定可能容许经非天然编码的氨基酸取代的蛋白质区域。以类似方式，蛋白酶消化和单克隆抗体可用于鉴别负责结合BPFI受体或结合搭配物的BPFI的区域。在去除可能不容许经非天然编码的氨基酸取代的残基后，可从BPFI和其受体或结合搭配物的结构来研究在每一剩余位置上的提议取代的影响。因此，所属领域技术人员可容易地鉴别可经非天然编码的氨基酸取代的氨基酸位置。在一些实施例中，本发明的BPFI包含位于不破坏多肽的螺旋或(3折叠二级结构的蛋白质区域中的一个或一个以上非天然存在氨基酸。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入HR-N、HR-C或阴离子肽的任何位置、第一氨基酸之前(氨基末端处)、羧基末端处添加或其任何组合处。在一些实施例中，将这些位置或其它位置处的非天然存在的氨基酸与水溶性分子连接。并入非天然编码的氨基酸的例示性残基可为包括或不包括潜在受体结合区或与结合搭配物结合的区域的那些残基，其可完全或部分暴露在溶剂中、与附近残基具有最小或无氢键结相互作用、可最小程度地暴露于附近反应性残基、可在BPFI的一个或一个以上暴露表面上、可在如通过与其受体或结合搭配物结合或不结合或者与另一BPFI或另一生物活性分子偶合或不偶合的BPFI的三维、二级、三级或四级结构所预测的高度灵活或结构呈刚性的区域中，或者可通过根据需要改变完整结构的灵活性或刚性来调节BPFI自身或包含一个或一个以上BPFI的二聚体或多聚体的构象。在一个实施例中，所述方法另外包括将非天然氨基酸并入蛋白质中，其中所述非天然氨基酸包含第一反应性基团；和使所述蛋白质与包含第二反应性基团的分子(包括但不限于，标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和性标记、光亲和性标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反义聚核苷酸、水溶性树枝状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属的部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分、可光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并入重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、延长的侧链、碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、有毒部分、经同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质)接触。第一反应性基团与第二反应性基团反应以通过[3+2]环加成将分子与非天然氨基酸连接。在一个实施例中，第一反应性基团为炔基部分或叠氮基部分并且第二反应性基团为叠氮基部分或炔基部分。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包括但不限于，在非天然氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中)且第二反应性基团为叠氮基部分。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(包括但不限于，在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)且第二反应性基团为炔基部分。在一些情况下，将非天然编码的氨基酸取代与BPFI内的其它添加、取代或缺失组合以影响BPFI的其它生物特征。在一些情况下，所述其它添加、取代或缺失可增加BPFI的稳定性(包括但不限于，对蛋白水解降解的抗性)或增加BPFI对其受体或结合搭配物的亲和性。在一些情况下，所述其它添加、取代或缺失可增加BPFI的溶解性(包括但不限于，当在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达时)。在一些实施例中，添加、取代或缺失可在于大肠杆菌重组宿主细胞中表达后增加多肽的溶解性。在一些实施例中，选择除用于并入非天然氨基酸的另一位点之外的用于经天然编码或非天然氨基酸取代的位点，其使得在大肠杆菌重组宿主细胞中表达后多肽溶解性增加。在一些实施例中，BPFI包含另一添加、取代或缺失，其调节对BPFI受体或结合搭配物的亲和性、调节(包括但不限于，增加或降低)受体二聚合、使受体二聚体稳定、调节结合搭配物的构象或其一种生物活性、调节循环半衰期、调节释放或生物可用性、促进纯化或者改良或改变特定投药途径。类似地，BPFI可包含改良多肽的检测(包括但不限于，GFP)、纯化、通过组织或细胞膜输送、前药释放或活化、BPFI尺寸减小或其它特性的蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括但不限于，FLAG或poly-His)或其它以亲和性为基础的序列(包括但不限于，FLAG、poly-His、GST等)或连接分子(包括但不限于，生物素)。F几在非真核细胞和真核都胞中的表达为获得克隆BPFI的高水平表达，通常将编码本发明的BPFI的聚核苷酸亚克隆至!i含有引导转录的强启动子、转录/翻译终止子以及(对于编码蛋白质的核酸来说)用于翻译起始的核糖体结合位点的表达载体中。所属领域中众所周知适当细菌启动子且其描述例如于Sambrook等人和Ausubel等人中。构建用于表达本发明的BPFI的表达载体的适当策略包括但不限于图2中所示的策略。用于表达本发明的BPFI的细菌表达系统可自(包括但不限于)大肠杆菌、芽孢杆菌)和沙门氏菌(S"/附o"函)获得(Palva等人，22:229-235(1983);Mosbach等人，302:543-545(1983))。用于这些表达系统的试剂盒在市面上有售。所属领域中众所周知用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统且其也在市面上有售。在将正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶(上述)用于表达本发明的BPFI的情况下，用于表达的宿主细胞是根据其使用正交组分的能力进行选择。例示性宿主细胞包括革兰氏阳性细菌(包括但不限于，短小芽孢杆菌(及6mv&)、枯草杆菌(及w6"fc)或链霉菌(5^e^omycM))和革兰氏阴性细菌(大肠杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌)，以及酵母和其它真核细胞。如本文中所述可使用包含0-tRNA/0-RS对的细胞。本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成较大有用量的包含非天然氨基酸的蛋白质的能力。一方面，组合物视情况包括(包括但不限于)至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或更多包含非天然氨基酸的蛋白质，或可通过活体内蛋白质制备方法实现的量(关于重组蛋白制备和纯化的细节提供于本文中)。另一方面，蛋白质视情况是以于(包括但不限于)细胞溶菌液、缓冲液、医药缓冲液或其它液体悬浮液(包括但不限于，体积(包括但不限于)介于约lnl至约100L之间)中的(包括但不限于)每升至少10微克蛋白质、每升至少50微克蛋白质、每升至少75微克蛋白质、每升至少100微克蛋白质、每升至少200微克蛋白质、每升至少250微克蛋白质、每升至少500微克蛋白质、每升至少1毫克蛋白质、或每升至少10毫克蛋白质或更多的浓度存在于组合物中。在包括至少一个非天然氦基酸的真核细胞中产生大量(包括但不限于，大于用其它方法(包括但不限于活体外翻译)通常可能获得的量)蛋白质是本发明的特征。本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供生物合成较大有用量的包含非天然氨基酸的蛋白质的能力。举例来说，包含非天然氨基酸的蛋白质可以于细胞提取物、细胞溶菌液、培养基、缓冲液等中的(包括但不限于)至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少l毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900毫克/升、l克/升、5克/升、10克/升或更多的蛋白质的浓度制备。I.表达系统、培养和分离BPFI可在任何数目的适当表达系统(包括例如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌)中表达。例示性表达系统的描述提供于下文中。酵母如本文中所用，术语"酵母"包括能够表达编码BPFI的基因的各种酵母中的任一种。这些酵母包括但不限于产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(五"i/o/n少c"fl/ej))、担孢子酵母(basidiosporogenousyeast)和属于半矢卩菌(Fungiimperfecti)(芽孢纲(B/wtomKW"))类的酵母。产子囊酵母分为两个科蚀精霉科(S/ermo;/^/2omceae)和酵母菌禾斗(Sacc/wrawyceMceae)。后者由四个亚禾斗组成，Sc/z'mracc/zflro，cozV/eae(例如，裂殖酵母属(ScWmsacc/wraw戸s))、拿逊酵母亚禾斗(iVo(iyom.ozWeae)、丄^o附ycozWeae禾口SaccAaro附yco/cfeae(^!j女口，毕赤酵母属(尸z'c/n'a)、克鲁维酵母属(幻z^vero^c^)和酵母属(Sacc/zarom少c^))。担孢子酵母包括白冬孢酵母属(Zewcowo〃Ww;n)、红冬孢酵母属(i^odo印onW/wm)、锁掷酵母属(SponWfo6o/w)、线黑粉酵母属(A7okwW"m)和香灰拟锁担菌属(M7oZ>asWe//a)。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两个科掷孢酵母科(5^wo6o/o/^ce/aceae)(例如，掷孢酵母属(印oro/2o/om;/CM)和布勒掷孢酵母属(5w〃em))和隐球酵母科(O^fococcaceae)(例如，假丝酵母属(Cam/Wa))。用于本发明的尤其关注者为毕赤酵母属、克鲁维酵母属、酵母菌属(Sa"^ra，c^)、裂殖酵母属(Sc/2feo^cc/wrawyc^)、汉逊酵母属(//a/we肌/fl)、球拟酵母属(7bnJo;w&)和假丝酵母属内的物种，其包括但不限于巴斯德毕赤酵母(尸.；^Wo&)、谷勒氏酵母(Pgw〃/eW附om/")、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(S.car/Werge";^)、糖化酵母(S.WaWa"cws)、道格拉斯酵母(S.cfowg/aW)、克鲁维酵母".W矽verf)、诺本酵母(S.朋Me"^s)、卵73形酵母(S.ovz/onm';y)、乳酸克鲁维酵母(K/acto)、脆壁克鲁维酵母(K/mg/fc)、白色念珠菌(C.fl/6/cfl^)、麦芽糖假丝酵母(C.wa/toM)和汉森酵母(//.;0/>^0^;^)。选择用于表达BPFI的适合酵母是在所属领域技术人员的技术范围内。在选择用于表达的酵母宿主时，适合宿主可包括显示具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好可溶性蛋白质产生和总体稳固性的那些酵母宿主。酵母通常可自多种来源获得，包括但不限于加利福尼亚大学生物物理和医学物理系酵母基因保藏中心(加州伯克利)(YeastGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics,UniversityofCalifornia(Berkeley,CA))和美国典型菌种保藏中心("ATCC")(北弗吉尼亚马纳萨斯)(AmericanTypeCultureCollection("ATCC")(Manassas,VA))。术语"酵母宿主"或"酵母宿主细胞"包括可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的酵母。所述术语包括已接收重组载体或其它转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA上可能未必完全相同。与以相关特性(诸如存在编码BPFI的核苷酸序列)为特征的母体足够类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指的后代中。已研发包括染色体外复制子或整合载体的表达和转化载体以转化入许多酵母宿主中。举例来说，已研发用于以下各有机体的表达载体酿酒酵母(Sikorski等人，Genetics(1989)122:19;Ito等人,J.Bacteriol.(1983)153:163;Hinnen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75:1929);白色念珠菌(Kurtz等人，Mol.CELL.BIOL.(1986)6:142);麦芽糖假丝酵母(Kunze等人，J.BasicMicrobiol.(1985)25:141);汉森酵母(Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.(1986)132:3459;Roggenkamp等人，Mol.Geneticsandgenomics(1986)202:302);脆壁克鲁维酵母(TDas等人，J.Bacteriol.(1984)158:1165);乳酸克鲁维酵母(DeLouvencourt等人，J.Bacteriol.(1983)154:737;VandenBerg等人，Biotechnology(NY)(1990)8:135);谷勒氏酵母(Kunze等人，J.BasicMicrobiol.(1985)25:141);巴斯德毕赤酵母(美国专利第5,324，639号；第4,929,555号；和第4,837，148号；Cregg等人，Mol.Cell.Biol.(1985)5:3376);粟酒裂殖酵母(Sc/^osacc/zara/^c^;ow6e)(Beach等人，NATURE(1982)300:706);和解脂耶氏酵母(K//po(y"c")(Davidow等人，Curr.Genet.(1985)10:380(1985);Gaillardin等人，Curr.Genet.(1986)10:49);构巢曲霉".m窗顯)(Ballance等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1983)112:284-89;Tilburn等人，Gene(1983)26:205-221;和Yelton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81:1470-74);黑曲霉(Am'，)(Kelly和Hynes,EMBOJ.(1985)4:475-479);里氏木霉(7:reew力)(EP0244234);和诸如脉孢菌(A^wmspora)、青霉菌(Pe"/c/〃/ww)、弯颈霉(7b/;^0C/^//"m)(WO91/00357)的丝状真菌，其中各文献是以引用的方式并入本文中。所属领域技术人员众所周知用于酵母载体的控制序列且其包括但不限于来自诸如以下基因的启动子区域诸如醇脱氢酶(ADH)(EP0284044);烯醇化酶；葡萄糖激酶；葡萄糖-6-磷酸异构酶；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH);己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸变位酶；和丙酮酸激酶(PyK)(EP0329203)。编码酸性磷酸酶的酵母PH05基因也可提供有用的启动子序列(Miyanohara等人，Proc.Natl.Acad.SCI.USA(1983)80:1)。用于酵母宿主的其它适合启动子序列可包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J.BIOLChem.(1980)255:12073)和其它糖解酶(诸如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡萄糖异构酶(Holland等人，Biochemistry(1978)17:4900;Hess等人，J.Adv.EnzymeReg.(1969)7:149))的启动子。具有由生长条件控制的誇录的其它优点的可诱发酵母启动子可包括醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、与氮代谢相关的降解酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。用于酵母表达中的适合载体和启动子进一步描述于EP0073657中。酵母增强子也可与酵母启动子一起使用。另外，合成启动子也可充当酵母启动子。举例来说，酵母启动子的上游活化序列(UAS)可与另一酵母启动子的转录活化区接合，产生合成杂合启动子。所述杂合启动子的实例包括与GAP转录活化区连接的ADH调控序列。参看美国专利第4,880,734号和第4,876,197号，其是以引用的方式并入本文中。杂合启动子的其它实例包括与诸如GAP或PyK的糖解酶基因的转录活化区组合的由ADH2、GAL4、GAL10或PH05基因的调控序列组成的启动子。参看EP0164556。此外，酵母启动子可包括具有与酵母RNA聚合酶结合且起始转录的能力的非酵母来源的天然存在的启动子。可包含酵母表达载体的部分的其它控制元件包括例如来自GAPDH或烯醇酶基因的终止子(Holland等人，J.Biol.Chem.(1981)256:1385)。另外，来自2p质粒来源的复制起点适用于酵母。用于酵母中的适当选择基因为酵母质粒中存在的trP7基因。参看Tschumper等人，Gene(1980)10:157;Kingsman等人，Gene(1979)7:141。trp7基因对缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母的突变菌株提供选择标记。类似地，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC20,622或38,626)是由带有丄ew2基因的已知质粒补充。所属领域技术人员众所周知将外源DNA引入酵母宿主中的方法，且其通常包括但不限于转化原生质球状体或转化经碱性阳离子处理的完整酵母宿主细胞。举例来说，可根据Hsiao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76:3829和VanSolingen等人，J.Bact.(1977)130:946中所述的方法来进行酵母的转化。然而，也可如Sambrook等人，MolecularCloning:ALab.Manual(2001)中通常所述使用将DNA引入细胞中的其它方法，诸如通过核注射、电穿孔或原生质体融合。随后可使用所属领域的技术人员已知的标准技术来培养酵母宿主细胞。所属领域技术人员众所周知在酵母宿主细胞中表达异源蛋白质的其它方法。通常参看美国专利公开案第20020055169号；美国专利第6,361,969号；第6,312,923号；第6,183,985号；第6,083,723号；第6,017,731号；第5,674,706号；第5,629,203号；第5,602,034号；和第5,089,398号；美国复审专利第RE37,343号和第RE35，749号；PCT公开专利申请案WO99/07862;WO98/37208;和WO98/26080;欧洲专利申请案EP0946736;EP0732403;EP0480480;EP0460071;EP0340986;EP0329203;EP0324274;和EP0164556。也参看Gellissen等人，AntonieVanLeeuwenhoek(1992)62(1-2):79隱93;Romanos等人，Yeast(1992)8(6):423-488;Goeddel,MethodsinEnzymology(1990)185:3-7，其各自是以引用的方式并入本文中。在使用所属领域技术人员众所周知的标准进料分批发酵方法的扩增阶段期间，酵母宿主菌株可在发酵罐中生长。发酵方法可用于解释特定酵母宿主的碳利用路径或表达控制模式的差异。举例来说，酵母菌酵母宿主的发酵可能需要单一葡萄糖进料、复合氮源(例如，酪蛋白水解产物)和多种维生素补充。相比之下，甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母可能需要甘油、甲醇和痕量矿物进料，但仅需要简单铵(氮)盐以进行最佳生长和表达。例如参看美国专利第5,324,639号；Elliott等人，J.ProteinChem.(1990)9:95;和Fieschko等人，Biotech.Bioeng.(1987)29:1113，其是以引用的方式并入本文中。然而，这些发酵方法可具有与所用酵母宿主菌株无关的某些常见特征。举例来说，在扩增期间，可将限制生长的养分(通常为碳)加到发酵罐中以允许最大生长。另外，发酵方法通常使用经设计成含有足量碳、氮、基本盐、磷和其它微量养分(维生素、痕量矿物和盐等)的发酵培养基。适用于毕赤酵母的发酵培养基的实例描述于美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中，其是以引用的方式并入本文中。感染杆状病毒的昆虫细胞术语"昆虫宿主"或"昆虫宿主细胞"是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的昆虫。所述术语包括已经转染的原始昆虫宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA上可能未必完全相同。与由相关特性(诸如存在编码BPFI的核苷酸序列)为特征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在此定义所指的后代中。所属领域技术人员众所周知用于表达BPFI的合适昆虫细胞的选择。若干种昆虫物种在所属领域中得以充分描述且在市面上有售，其包括埃及伊蚊(^&^egy;^)、桑蚕(_Sow6_yx7wo〃')、黑腹果虫虽(Z)nwo;/n7a附e/a"ogaWer)、草地贪夜蛾(S/o(/opfera/rwgi;eY/a)和粉纹夜蛾(7WW叩/^/flm')。在选择用于表达的昆虫宿主时，合适宿主可包括显示尤其具有良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的那些宿主。昆虫通常可自多种来源获得，包括但不限于加利福尼亚大学生物物理和医学物理系昆虫基因保藏中心(加州伯克禾!j)(InsectGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics,UniversityofCalifornia(Berkeley,CA));和美国典型菌种保藏中心("ATCC")(北弗吉尼亚马纳萨斯)(AmericanTypeCultureCollection("ATCC")(Manassas,VA))。通常，感染杆状病毒的昆虫表达系统的组分包括转移载体(通常为细菌质粒)，其含有杆状病毒基因组的片段和用于插入欲表达的异源基因的便利限制位点；具有与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源的序列的野生型杆状病毒(此允许异源基因同源重组到杆状病毒基因组中)；以及适当昆虫宿主细胞和生长培养基。所属领域中已知用于构建载体、转染细胞、挑选斑块、使细胞在培养物中生长等的材料、方法和技术且可使用描述这些技术的手册。在将异源基因插入转移载体中后，将载体和野生型病毒基因组转染到昆虫宿主细胞中，其中载体与病毒基因组重组。表达经包装重组病毒并且鉴别和纯化重组体斑块。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可试剂盒形式购自例如InvitrogenCorp.(Carlsbad,CA)。所属领域技术人员通常已知这些技术且其充分描述于SummersandSmith,TexasAgriculturalExperimentStationBulletin第1555期(1987)中，其是以引用的方式并入本文中。还参看Richardson,39MethodsinMolecularBiology:BaculovirusExpressionProtocols(1995);Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology16.9-16.11(1994);King和Possee，TheBaculovirusSystem:ALaboratoryGuide(1992);禾口O'Reilly等人，BaculovirusExpressionVectors:ALaboratoryManual(1992)。事实上，所属领域中众所周知使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来制备各种异源蛋白质。例如参看，美国专利第6,368,825号;第6,342,216号；第6,338,846号;第6,261,805号；第6,245,528号；第6,225,060号；第6,183,987号；第6,168,932号；第6,126,944号；第6,096,304号；第6,013,433号；第5,965,393号；第5,939,285号；第5,891,676号；第5,871,986号；第5,861,279号；第5,858,368号；第5,843,733号；第5,762,93977号；第5,753,220号；第5,605,827号；第5,583,023号；第5,571,709号；第5,516,657号；第5,290,686号；WO02/06305;WO01/903卯;WO01/27301;WO01/05956;WO00/55345;WO00/20032;WO99/51721;WO99/45130;WO99/31257;WO99/10515;WO99/09193;WO97/26332;WO96/29400;WO96/25496;WO96/06161;WO95/20672;WO93/03173;WO92/16619;WO92/03628;WO92/01801;WO卯/14428;WO90/10078;WO90/02566;WO90/02186;WO90/01556;WO89/01038;WO89/01037;WO88/07082，其是以引用的方式并入本文中。所属领域中已知可用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的载体且其包括例如从杆状病毒苜蓿银纹夜蛾"wtogm;/2"ca/(/brm'ca)核型多角体病毒(AcNPV)获得的昆虫表达和转移载体，其为不依赖于辅助细胞的病毒表达载体。从此系统得到的病毒表达载体通常使用强病毒多角体蛋白基因启动子以驱动异源基因的表达。通常参看O'Reilly等人，BaculovirusExpressionVectors:ALaboratoryManual(1992)。在将外来基因插入杆状病毒基因组中之前，通常将包含启动子、前导序列(必要时)、所关注的编码序列和转录终止序列的上述组分组装到中间错位构筑体(intermediatetransplacementconstruct)(转移载体)中。中间错位构筑体通常保持在能够稳定保持在宿主(诸如细菌)中的复制子(诸如染色体外元件(例如，质粒))中。复制子将具有复制系统，因此允许其保持在供克隆和扩增用的合适宿主中。更具体来说，质粒可含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号(Miller,Ann.Rev.Microbiol.(1988)42:177)和用于在大肠杆菌中选择和繁殖的原核抗氨比西林(ampicillin)基因和复制起点。一种将外来基因引入AcNPV中的常用转移载体为pAc373。也己经对所属领域技术人员已知的许多其它载体进行设计，包括例如pVL985，其将多角体蛋白起始密码子由ATG变为ATT，且其将BamHI克隆位点引入ATT下游32个碱基对处。参看Luckow和Summers,VIROLOGY170:31(1989)。其它市售载体包括例如PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)。在插入异源基因之后，将转移载体和野生型杆状病毒基因组共转染到昆虫细胞宿主中。所属领域中已知将异源DNA引入杆状病毒的所需位点中的方法。参看summers和Smith,TexasAgriculturalExperimentStationBulletin第1555期(1987);Smith等人，Mol.Cell.Biol.(1983)3:2156;Luckow和Summers,Virology(1989)170:31。举例来说，可通过同源双交叉重组插入诸如多角体蛋白基因的基因中；也可插入所需杆状病毒基因中经工程改造的限制酶位点中。参看Miller等人，BiOESSAYS(1989)11(4):91。可通过电穿孔来实现转染。参看Trotter禾卩Wood,39MethodsinMolecularBiology(1995);Mann和King,J.Gen.Virol.(1989)70:3501。或者，脂质体可用于以重组表达载体和杆状病毒转染昆虫细胞。例如参看，Liebman等人BIOTECHNIQUES(1999)26(1):36;Graves等人，Biochemistry(1998)37:6050;Nomura等人，J.Biol.Chem.(1998)273(22):13570;Schmidt等人，PROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION(1998)12:323;Siffert等人，NatureGenetics(1998)18:45;Tilkins等人，CellBiology:ALaboratoryHandbook145-154(1998);Cai等人，ProteinExpressionandPurification(1997)10:263;Dolphin等人，NATUREGENETICS(1997)17:491;Kost等人，GENE(1997)190:139;Jakobsson等人，J.Biol.Chem.(1996)271:22203;Rowles等人，J.Biol.Chem.(1996)271(37):22376;Reverey等人，J.Biol.Chem.(1996)271(39):23607陽10;Stanley等人，J.Biol.Chem.(1995)270:4121;Sisk等人，J.VIROL.(1994)68(2):766;和Peng等人，BIOTECHNIQUES(1993)14(2):274。市售脂质体包括例如Cellfectin⑧和Lipofectin(Invitrogen,Corp.,Carlsbad,CA)。另外，也可使用磷酸钶转染。参看Trotter和Wood,39MethodsinMolecularBiology(1995);Kitts,NAR(1990)18(19):5667;以及Mann和King,J.Gen.Virol.(1989)70:3501。杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是能够与杆状病毒RNA聚合酶结合且起始编码序列(例如，结构基因)下游(3')转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5'端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可具有称作增强子的第二区域，当存在时，其通常在结构基因的末梢。此外，表达可经调控或为组成性。在感染周期末期大量转录的结构基因提供特别有用的启动子序列。实例包括源自编码病毒多面体蛋白的基因(FRIESEN等人，7T2eiegw/a"o"o/5acw/ovzVw五x/mwz'o"，TheMolecularBiologyofBaculoviruses(1986);EP0127839和0155476)和编码pl0蛋白的基因(Vlak等人，J.GEN.VIROL.(1988)69:765)的序列。将新近形成的杆状病毒表达载体包装到感染性重组杆状病毒中且随后可通过所属领域技术人员已知的技术来纯化所生长的斑块。参看Miller等人，BIOESSAYS(1989)11(4):91;SUMMERS禾口Smith,TexasAgriculturalExperimentStationBulletin第1555期(1987)。已开发用于感染到若干种昆虫细胞中的重组杆状病毒表达载体。举例来说，巳开发尤其用于埃及伊蚊(ATCC第CCL-125号)、桑蚕(ATCC第CRL-8910号)、黑腹果蝇(ATCC第1963号)、草地贪夜蛾和粉纹夜蛾的重组杆状病毒。参看WO89/046,699;Wright,Nature(1986)321:718;Carbonell等人，J.Virol.(1985)56:153;Smith等人，Mol.Cell.Biol.(1983)3:2156。通常参看Fraser等人，f7z7oCell.Dev.Biol.(1989)25:225。更具体来说，用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包括但不限于Sf9(草地贪夜蛾)(ATCC第CRL-1711号)、Sf21(草地贪夜蛾)(InvitrogenCorp.,目录号11497-013(Carlsbad,CA))、Tri-368(粉纹夜蛾)和High-FiveBTI-TN-5B1-4(粉纹夜蛾)。用于在杆状病毒表达载体中异源多肽的直接表达和融合表达的细胞和培养基在市面上有售，且所属领域技术人员通常已知细胞培养技术。大肠籽菌、假単胞菌和其它原核生物所属领域中众所周知细菌表达技术。多种载体可用于细菌宿主中。载体可为单拷贝或者低或高多拷贝载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于存在关于载体的丰富文献、许多载体的商业可用性以及甚至描述载体和其限制酶图谱和特征的手册，无需在本文中广泛讨论。众所周知，载体通常涉及允许选择的标记，这些标记可提供细胞毒性剂抗性、原营养或免疫性。通常存在多个标记，其提供不同特征。细菌启动子为能够结合细菌RNA聚合酶且起始编码序列(例如结构基因)下游(3')转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5'端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可具有称作操纵子的第二区域，其可与开始RNA合成的相邻RNA聚合酶结合位点重叠。操纵子允许负调控(可诱导)转录，这是因为基因抑制蛋白可结合操纵子且由此抑制特定基因的转录。在不存在负调控元件(诸如操纵子)的情况下可发生组成性表达。另外，通过基因活化蛋白结合序列可实现正调控，当存在时，所述序列通常最接近RNA聚合酶结合序列的(5')。基因活化蛋白的实例为代谢物活化蛋白(CAP)，其有助于起始大肠杆菌中lac操纵子的转录[Raibaud等人，annu.REV.Genet.(1984)18:173]。因此，调控表达可为正调控或负调控，由此增强或减弱转录。编码代谢路径酶的序列提供特别有用的启动子序列。实例包括来源于糖代谢酶(诸如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人，Nature(1977)198:1056]和麦芽糖)的启动子序列。其它实例包括来源于生物合成酶(诸如色氨酸(trp))的启动子序列[Goeddel等人,NUC.AcidsRes.(1980)8:4057;Yelverton等人，Nucl.AcidsRes.(1981)9:731;美国专利第4,738,921号；欧洲公开案第036776号和第121775号，其是以引用的方式并入本文中]。p-半乳糖苷酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981)"Thecloningofinterferonandothermistakes."Interferon3(I.Gresser编)]、噬菌体XPL[Shimatake等人，Nature(1981)292:128]和T5[美国专利第4,689,406号，其是以引用的方式并入本文中]启动子系统也提供有用的启动子序列。本发明的优选方法利用强启动子(诸如T7启动子)以诱发高80含量的BPFI。所属领域中众所周知这些载体的实例且其包括来自Novagen的pET29系列和WO99/05297(其是以引用的方式并入本文中)中所述的pPOP载体。这些表达系统在宿主中产生高含量的BPFI，而不损害宿主细胞生存能力或生长参数。另外，在自然界中不存在的合成启动子也充当细菌启动子。举例来说，可将一个细菌或噬菌体启动子的转录活化序列与另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列接合，从而产生合成杂合启动子[美国专利第4,551,433号，其是以引用的方式并入本文中]。举例来说，tac启动子是由trp启动子与lac操纵子序列组成的杂合trp-lac启动子，其由lac阻遏物调控[Amann等人，Gene(1983)25:167;deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1983)80:21]。此外，细菌启动子可包括非细菌来源的天然存在启动子，其具有与细菌RNA聚合酶结合且起始转录的能力。也可将非细菌来源的天然存在启动子与可相容的RNA聚合酶偶合以产生一些基因在原核生物中的高水平表达。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统为偶合启动子系统的实例[Studier等人，J.Mol.BIOL.(1986)189:113;Tabor等人，ProcNatl.Acad.Sci.(1985)82:1074]。另外，杂合启动子也可由噬菌体启动子和大肠杆菌操纵子区域组成(欧洲公开案第267851号)。除功能性启动子序列之外，有效核糖体结合位点还可用于在原核生物中表达外来基因。在大肠杆菌中，核糖体结合位点称作Shine-Dalgarno(SD)序列且包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列[Shine等人，Nature(1975)254:34]。据悉，SD序列通过SD序列与大肠杆菌16SrRNA的3'端之间的碱基配对来促进mRNA与核糖体的结合[Steitz等人，"Geneticsignalsand皿cleotidesequencesinmessengerRNA",BiologicalRegulationandDevelopment:GeneExpression(Ed.R.F.Goldberger,1979)]。为表达具有弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[Sambrook等人,"ExpressionofclonedgenesinEscherichiacoli"，MolecularCloning:ALaboratoryManual,1989]。术语"细菌宿主"或"细菌宿主细胞"是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的细菌。所述术语包括已经转染的原始细菌宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA上可能未必完全相同。与以相关特性(诸如存在编码BPFI的核苷酸序列)为特征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在此定义所指的后代中。所属领域技术人员众所周知用于表达BPFI的适当宿主细菌的选择。在选择供表达的细菌宿主时，合适宿主可包括显示尤其具有良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的那些宿主。细菌宿主通常可自多种来源获得，包括但不限于加利福尼亚大81学生物物理和医学物理系细菌基因保藏中心(加州伯克利)(BacterialGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics,UniversityofCalifornia(Berkeley,CA))和美国典型菌种保藏中心("ATCC")(北弗吉尼亚马纳萨斯)(AmericanTypeCultureCollection("ATCC")(Manassas,VA))。工业/医药发酵通常使用来源于K菌株(例如W3110)的细菌或来源于B菌株(例如BL21)的细菌。这些菌株因其生长参数众所周知且稳定而特别有用。另外，这些菌株为非病原性的，出于安全性和环境原因，其在商业上相当重要。在本发明方法的一个实施例中，大肠杆菌宿主为BL21菌株。在本发明方法的另一个实施例中，大肠杆菌宿主为蛋白酶缺乏菌株，其包括但不限于OMP-和LON-。在本发明方法的另一个实施例中，宿主细胞株为假单胞菌，包括但不限于荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌。已知荧光假单胞菌生物型1(命名为菌株MB101)可用于重组制备并且可用于治疗性蛋白质的制备工艺。假单胞菌表达系统的实例包括可以宿主菌株形式自DowChemicalCompany获得的系统(Midland,MI,可通过万维网在dow.com上获得)。美国专利第4，755，465号和第4,859,600号(其是以引用的方式并入本文中)描述假单胞菌菌株作为用于hGH制备的宿主细胞的用途。在形成重组宿主细胞株(即，已将表达构筑体引入宿主细胞中且分离具有合适表达构筑体的宿主细胞)后，在适于产生BPFI的条件下培养重组宿主细胞株。所属领域技术人员将了解，培养重组宿主细胞株的方法将取决于所利用的表达构筑体的性质和宿主细胞的身份。通常使用所属领域中众所周知的方法来培养重组宿主菌株。重组宿主细胞通常是在含有可吸收的碳源、氮源和无机盐源且视情况含有维生素、氨基酸、生长因子和所属领域中众所周知的其它蛋白质培养补充物的液体培养基中培养。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有抗生素或抗真菌剂以防止不需要的微生物和/或化合物(包括但不限于，用于选择含有表达载体的宿主细胞的抗生素)的生长。重组宿主细胞可以分批或连续模式培养，其中细胞采集(在BPFI在细胞内积聚的情况下)或培养物上清液的采集为分批或连续模式。对于在原核宿主细胞中制备来说，优选分批培养和细胞采集。本发明的BPFI通常在于重组系统中表达之后纯化。可通过所属领域已知的多种方法从宿主细胞中纯化BPFI。通常，细菌宿主细胞中所产生的BPFI具有弱溶解性或不可溶(呈包涵体形式)。在本发明的一个实施例中，可利用本文中揭示的方法以及所属领域已知的方法，可容易地在BPFI中进行出于增加重组产生的蛋白质的溶解性的目的而选择的氨基酸取代。在不溶性蛋白质的情况下，可通过离心从宿主细胞溶菌液收集蛋白质，且其后可接着进行细胞的'均质化。在具有弱溶解性的蛋白质的情况下，可加入包括但不限于聚乙烯亚胺(PEI)的化合物以诱导部分可溶性蛋白质的沉淀。随后可通过离心便利地收集沉淀蛋白质。可使用所属领域技术人员众所周知的多种方法使重组宿主细胞破裂或均质化以释放细胞内的包涵体。可使用众所周知的技术来进行宿主细胞的破裂或均质化，这些技术包括但不限于酶促细胞破裂、超声波降解法、杜恩斯均质化(douncehomogenization)或高压释放破裂。在本发明方法的一个实施例中，高压释放技术可用于使大肠杆菌宿主细胞破裂以释放BPFI的包涵体。在处理BPFI的包涵体时，有利的是使均质化时间的重复最小化以便最大化包涵体产率而不会由于诸如溶解、机械剪切或蛋白质水解的因素造成损失。可通过使标靶蛋白与某些其它蛋白质(诸如，TrpLE)融合[Georgiou,G.(1996)Proteinengineering:PrinciplesandPractice(Cleland,J.L.和Craik，C.S.编)，第101-127页，Wiley-Liss,NewYork,Ford,C.F.,Suominen,I.和Glatz,C.E.(1991)ProteinExpressionPurif.2,95-107]，或者通过在高温下或在不为7.0的pH值下培养，来增强形成包涵体的倾向。随后可使用所属领域已知的众多适合溶解剂中的任一种来溶解不溶性或沉淀BPFI。优选用尿素或盐酸胍来溶解BPFI。应使溶解BPFI的体积最小化，从而可使用可方便操作的批量大小制备大批量。在重组宿主可以体积为数千升的批量生长的大规模商业情况中，这个因素可为重要的。另外，当在大规模商业情况中制造BPFI时，特别是对于人类医药用途来说，如果可能的话，那么应避免可损害机器和容器的苛刻化学品或其蛋白质产物。在本发明的方法中已证实，较温和的变性剂尿素可代替较苛刻的变性剂盐酸胍用于溶解BPFI包涵体。尿素的使用在有效溶解BPFI包涵体的同时，显著降低了损害在BPFI的制造和纯化过程中所利用的不锈钢设备的风险。在可溶性BPFI的情况下，可将BPFI分泌到周质空间或培养基中。另外，可溶性BPFI可存在于宿主细胞的细胞质中。可能需要在进行纯化步骤之前浓縮可溶性BPFI。所属领域技术人员已知的标准技术可用于浓縮来自例如细胞溶菌液或培养基的可溶性BPFI。另外，所属领域技术人员已知的标准技术可用于使宿主细胞破裂并从宿主细胞的细胞质或周质空间释放可溶性BPFI。当制备呈融合蛋白形式的BPFI时，优选去除融合序列。可在多种不同条件(包括但不限于，通过酶促裂解或化学裂解)下实现融合序列的去除。可使用所属领域技术人员众所周知的方法来实现融合序列的酶促去除。如所属领域技术人员所了解，用于去除融合序列的酶的选择将由融合体的身份决定，且反应条件将由酶的选择指定。可使用所属领域技术人员众所周知的试剂来实现化学裂解。一种此类试剂为溴化氰，其在甲硫氨酸残基处裂解。优选通过众所周知的方法从裂解的融合序列中纯化经裂解BPFI。如所属领域技术人员所了解，这些方法将由融合序列和BPFI的身份和特性决定。为去除融合序列，可例如在暴露于光子能、增加的温度、降低的温度、增加的pH值、降低的pH值、暴露于亚原子粒子、加入催化剂、与酶一起培育、与另一化学官能团接触和/或其它条件下裂解肽键。对于欲在一个或一个以上所述条件下裂解的肽键来说，非天然编码的氨基酸可具有具备一个或一个以上以下特征的官能团包括但不限于，光活化官能团、pH值活化官能团、温度活化官能团、需要催化剂的官能屈，和由蛋白酶、酶或另一化学官能团所识别的官能团。纯化方法可包括但不限于尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱或透析或其任何组合。也优选纯化BPFI以从蛋白质溶液中去除DNA。可通过所属领域己知的任何适合方法(诸如沉淀或离子交换色谱)去除DNA，但优选通过用核酸沉淀剂(诸如(但不限于)硫酸鱼精蛋白)沉淀来去除。可使用包括但不限于离心或过滤的众所周知的标准方法使BPFI与沉淀DNA分离。在欲将BPFI用于治疗人类的情况中，宿主核酸分子的去除是重要因素，且本发明的方法将宿主细胞DNA降到医药学上可接受的含量。用于小规模或大规模发酵的方法也可用于蛋白质表达中，所述方法包括但不限于发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养系统和搅拌槽生物反应器系统。这些方法中的每一种都可以分批、馈料分批或连续模式过程进行。通常可使用所属领域中的标准方法来回收本发明的人类BPFI。举例来说，可将培养基或细胞溶菌液离心或过滤以去除细胞碎片。可将上清液浓縮或稀释到所需体积或者透滤到适当缓冲液中以调节制备以供进一步纯化。本发明的BPFI的进一步纯化包括从完整形式分离脱酰胺化和剪短形式的BPFI变体。以下例示性程序中的任一种都可用于纯化本发明的BPFI:亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括但不限于)DEAESEPHAROSE);硅胶色谱；反相HPLC;凝胶过滤(使用(包括但不限于)SEPHADEXG-75);疏水相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合物色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序(包括但不限于，制备型等电聚焦)；差示溶解度(包括但不限于，硫酸铵沉淀)；SDS-PAGE;或萃取。根据所属领域技术人员已知且使用的标准程序，可将本发明的蛋白质(包括但不限于，包含非天然氨基酸的蛋白质、包含非天然氨基酸的肽、包含非天然氨基酸的蛋白质的抗体、包含非天然氨基酸的蛋白质的结合搭配物等)部分或实质上纯化到均质。因此，可通过所属领域中众所周知的众多方法中的任一种来回收和纯化本发明的多肽，这些方法包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱萃取、柱色谱、亲和柱色谱、阴离子或阳离84子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、外源凝集素色谱、凝胶电泳等。必要时，在制备正确折叠的成熟蛋白质时可使用蛋白质再折叠步骤。可将高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其它适合方法用于需要高纯度的最后纯化步骤中。在一个实施例中，将针对非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的蛋白质或肽)制成的抗体用作纯化试剂(包括但不限于)以用于包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质或肽的以亲和性为基础的纯化。必要时，在部分纯化或达到均质后，即视情况将多肽用于多种应用，包括但不限于作为检定组分、治疗剂、预防剂、诊断剂、研究试剂和/或作为抗体产生的免疫原。除了本文中指出的其它参考文献之外，所属领域中众所周知多种纯化/蛋白质折叠方法，包括但不限于以下文献中描述的那些R.Scopes,ProteinPurification,Springer-Verlag,N.Y.(1982);Deutscher,MethodsinEnzvmology第182巻GuidetoProteinPurification.AcademicPress,Inc.N.Y.(1990);Sandana,(1997)BioseparationofProteins.AcademicPress,Inc.;Bollag等人(1996)ProteinMethods,第2版Wiley-Liss,NY;Walker,(1996)TheProteinProtocolsHandbookHumanaPress,NJ，Harris禾口Angal,(1990)ProteinPurificationApplications:APracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,England;Harris禾口Angal,ProteinPurificationMethods:APracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,England;Scopes,(1993)ProteinPurification:PrinciplesandPractice第3版SpringerVerlag,NY;Janson禾口Ryden,(1998)ProteinPurification:Principles.HighResolutionMethodsandApplications,第2版Wiley-VCH,NY;和Walker(1998),ProteinProtocolsonCD-ROMHumanaPress,NJ:以及其中所引用的参考文献。在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中产生具有非天然氨基酸的所关注蛋白质或多肽的一个优点在于，通常所述蛋白质或多肽将以其天然构象折叠。然而，在本发明的某些实施例中，所属领域技术人员将认识到，在合成、表达和/或纯化之后，蛋白质或肽可具有与相关多肽的所需构象不同的构象。在本发明的一个方面中，经表达蛋白质或多肽视情况经变性且随后复性。这是利用所属领域中已知的方法来实现，所述方法包括但不限于通过将伴侣蛋白(chaperonin)加入所关注蛋白质或多肽中、通过将蛋白质溶解于诸如盐酸胍的离液剂中、利用蛋白质二硫化物异构酶等。一般来说，有时候需要变性和还原经表达多肽且随后使多肽再折叠成优选构象。举例来说，可将胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣蛋白加到所关注的翻译产物中。所属领域技术人员众所周知还原、变性和复性蛋白质的方法(参看上述参考文献以及Debinski等人，(1993)J.Biol.Chem.,268:14065-14070;Kreitman和Pastan(1993)Bioconiug.Chem.,4:581-585;以及Buchner等人，(1992)Anal.Biochem.,205:263-270)。举例来说，Debinski等人描述胍-DTE中包涵体蛋白质的变性和还原。蛋白质可在含有(包括但不限于)氧化谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中再折叠。再折叠试剂可流动或以其它方式移动以与一种或一种以上多肽或其它表达产物接触，或反之亦然。在原核产生BPFI的情况下，由此产生的BPFI可能错误折叠且因而缺乏生物活性或具有降低的生物活性。可通过"再折叠"来恢复蛋白质的生物活性。一般来说，通过使用例如一种或一种以上离液剂(例如尿素和/或胍)和能够还原二硫键的还原剂(例如二硫苏糖醇、DTT或2-巯基乙醇(2-ME))溶解(其中BPFI也不可溶)、展开且还原多肽链而使错误折叠的BPFI再折叠。在中等浓度的离液剂下，随后加入氧化剂(例如，氧、胱氨酸或胱胺)，其允许再形成二硫键。可使用所属领域中已知的标准方法将BPFI再折叠，诸如美国专利第4,511,502号、第4,511,503号和第4,512,922号中所述的那些方法，所述文献是以引用的方式并入本文中。BPFI也可与其它蛋白质共折叠以形成异二聚体或异多聚体。在再折叠或共折叠之后，优选进一步纯化BPFI。通用纯化方法可以任何适当次序对包含BPFI的细胞溶菌液或由任何分离步骤产生的任何BPFI混合物进行多种分离步骤中的任一种，所述分离步骤包括但不限于亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱("HPLC")、反相HPLC("RP-HPLC")、膨胀床吸附或其任何组合和/或重复。用于进行本文中所述技术的设备和其它必要材料在市面上有售。泵、馏分收集器、监测器、记录器和整个系统可自例如AppliedBiosystems(FosterCity,CA)、Bio-RadLaboratories,Inc.(Hercules,CA)禾口AmershamBiosciences,Inc.(Piscataway,NJ)获得。包括但不限于交换基质材料、培养基和缓冲液的色谱材料也可自这些公司获得。可使用专用设备(诸如泵)更迅速地实现平衡和本文中所述的柱色谱过程中的其它步骤(诸如洗涤和洗提)。市售泵包括但不限于HILOAD⑧泵P-50、蠕动泵P-1、泵P-901和泵P-903(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。馏分收集器的实例包括RediFrac馏分收集器、FRAC-100和FRAC-200馏分收集器以及SUPERFRAC⑧馏分收集器(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。混合器也可用于形成pH值和线性浓度梯度。市售混合器包括梯度混合器GM-1和管道混合器(AmershamBiosciences,Piscataway,N化可使用任何市售监测器来监测色谱过程。这些监测器可用于收集如UV、pH值和传导率的信息。检测器的实例包括监测器UV-l、UVICORDSII、监领(j器UV-MII、监测器UV-900、监测器UPC-卯0、监测器pH/C-900和传导率监测器(AmershamBiosciences,86Piscataway，NJ)。实际上，整个系统在市面上有售，包括来自AmershamBiosciences(Piscataway,NJ)的各种AKTA⑧系统。在本发明的一个实施例中，例如，可通过首先在尿素中使所得经纯化BPFI变性，接着在合适pH值下稀释于含有还原剂(诸如DTT)的TRIS缓冲液中来还原BPFI且使其变性。在另一个实施例中，BPFI是以介于约2M到约9M之间的浓度范围于尿素中变性，接着在约5.0到约8.0的范围内的pH值下于TRIS缓冲液中稀释。可随后培育此实施例的再折叠混合物。在一个实施例中，在室温下将再折叠混合物培育4小时到24小时。随后可将还原且变性的BPFI混合物进一步分离或纯化。如本文中所述，在进行任何后续分离步骤之前，可调整第一BPFI混合物的pH值。另外，可使用所属领域中已知的技术来浓縮第一BPFI混合物或其任何后续混合物。此外，可使用所属领域技术人员众所周知的技术将包含第一BPFI混合物或其任何后续混合物的洗提缓冲液换为适用于下个分离步骤的缓冲液。离子交换色谱在一个实施例中且作为可选的额外步骤，可对第一BPFI混合物进行离子交换色谱。通常参看IonExchangeChromatography:PrinciplesandMethods(目录号18-1114-21,AmershamBiosciences(Piscataway,NJ))。市售离子交换柱包括HITRAP、HIPREP⑧和HILOAD⑧柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。这些柱利用强阴离子交换剂，诸如QSEPHAROSEFastFlow、QSEPHAROSEHighPerformance和QSEPHAROSEXL;强阳离子交换剂，诸如SPSEPHAROSEHighPerformance、SPSEPHAROSEFastFlow和SPSEPHAROSEXL;弱阴离子交换剂，诸如DEAESEPHAROSEFastFlow;和弱阳离子交换剂，诸如CMSEPHAROSEFastFlow(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。可在纯化过程的任何阶段对BPFI进行阴离子或阳离子交换柱色谱以分离实质上纯化的BPFI。可使用任何适合阳离子交换基质来进行阳离子交换色谱步骤。有用的阳离子交换基质包括但不限于纤维状、多孔、无孔、微粒、珠粒或交联阳离子交换基质材料。这些阳离子交换基质材料包括但不限于纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何上述物质的复合物。阳离子交换基质可为任何适当的阳离子交换剂，包括强和弱阳离子交换剂。强阳离子交换剂可在较宽的pH值范围内保持离子化，且因此能够在较宽的pH值范围内结合BPFI。然而，弱阳离子交换剂可随pH值变化而丧失离子化。举例来说，当pH值降到约pH4或pH5以下时，弱阳离子交换剂可失去电荷。合适的强阳离子交换剂包括但不限于带电官能团，诸如磺丙基(SP)、磺酸甲基(S)或磺乙基(SE)。阳离子交换基质可为优选具有约2.5到约6.0的BPFI结合pH值范围的强阳离子交换剂。或者，强阳离子交换剂可具有约pH2.5到约pH5.5的BPFI结合pH值范围。阳离子交换基质可为优选具有约3.0的BPFI结合pH值的强阳离子交换剂。或者，阳离子交换基质可为优选具有约6.0到约8.0的BPFI结合pH值范围的强阳离子交换剂。阳离子交换基质可为优选具有约8.0到约12.5的BPFI结合pH值范围的强阳离子交换剂。或者，强阳离子交换剂可具有约pH8.0到约pH12.0的BPFI结合pH值范围。在装载BPFI之前，可例如使用数倍柱体积的稀弱酸(例如，4倍柱体积的20mM乙酸，pH3)来平衡阳离子交换基质。平衡后，可加入BPFI并且可洗涤柱一次到数次，随后也使用弱酸溶液(诸如，弱乙酸或磷酸溶液)洗提实质上纯化的BPFI。举例来说，可使用约2-4倍柱体积的20mM乙酸(pH3)洗涤柱。还可使用例如2-4倍柱体积的0.05M乙酸钠(pH5.5)或与0.1M氯化钠混合的0.05M乙酸钠(pH5.5)再洗涤数次。或者，使用所属领域中已知的方法，可使用数倍柱体积的稀弱碱来平衡阳离子交换基质。另外，可通过使阳离子交换剂基质与具有足够低pH值或离子强度的缓冲液接触来洗提实质上纯化的BPFI，以从基质中置换出BPFI。洗提缓冲液的pH值可在约pH2.5到约pH6.0的范围内。更具体来说，洗提缓冲液的pH值可在约pH2.5到约pH5.5、约pH2.5到约pH5.0的范围内。洗提缓冲液可具有约3.0的pH值。此外，洗提缓冲液的量可广泛变化并且一般在约2到约IO倍柱体积的范围内。在将BPFI吸附到阳离子交换基质上后，可通过使基质与具有足够高pH值或离子强度的缓冲液接触来洗提实质上纯化的BPFI,以从基质中置换出BPFI。用于实质上纯化的BPFI的高pH值洗提的适当缓冲液包括但不限于浓度在至少约5mM到至少约100mM的范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES和MES缓冲液。反相色谱可根据所属领域技术人员已知的适合方案进行RP-HPLC以纯化蛋白质。例如参看Pearson等人，AnalBIOCHEM.(1982)124:217-230(1982);Rivier等人，J.Chrom.(1983)268:112-119;Kunitani等人，J.Chrom.(1986)359:391-402。可对BPFI进行RP-HPLC以分离实质上纯化的BPFI。在这方面，可使用具有多种长度(包括但不限于，至少约C3到至少约C30、至少约C3到至少约C20或至少约C3到至少约d8)的烷基官能团的二氧化硅衍生树脂。或者，可使用聚合性树脂。举例来说，可使用TosoHaasAmberchromeCG1000sd树脂，其为苯乙烯聚合物树脂。也可使用具有多种烷基链长度的氰基或聚合性树脂。此外，可用诸如乙醇的溶剂洗涤RP-HPLC柱。SourceRP柱为RP-HPLC柱的另一个实例。含有离子配对剂和有机改性剂(诸如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇)的合88适洗提缓冲液可用于从RP-HPLC柱洗提BPFI。最常用的离子配对剂包括但不限于乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基铵、四丁基铵、乙酸三乙基铵。可使用一种或一种以上梯度或等度条件来进行洗提，其中优选减少分离时间且降低峰宽度的梯度条件。另一种方法涉及使用具有不同溶剂浓度范围的两种梯度。用于本文中的合适洗提缓冲液的实例可包括但不限于乙酸铵和乙腈溶液。—疏水相互作用色谱纯化技术可对BPFI进行疏水相互作用色谱(HIC)。通常参看HydrophobicInteractionChromatographyHandbook:PrinciplesandMethods(巨录号18-1020-90,AmershamBiosciences(Piscataway,NJ))，其是以引用的方式并入本文中。适合HIC基质可包括但不限于经烷基或芳基取代的基质，诸如经丁基、己基、辛基或苯基取代的基质，所述基质包括琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质和混合模式树脂(包括但不限于，聚乙二胺树脂或经丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基质)。疏水相互作用柱色谱的市售来源包括但不限于HITRAP、HIPREP⑧和HILOAD⑧柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。简单地说，在装载之前，可使用所属领域技术人员已知的标准缓冲液(诸如乙酸/氯化钠溶液或含有硫酸铵的HEPES)来平衡HIC柱。在装载BPFI后，随后可使用标准缓冲液和条件来洗涤柱以去除不需要的物质，但将BPFI留在HIC柱上。可用约3到约10倍柱体积的标准缓冲液(诸如含有EDTA和浓度低于平衡缓冲液的硫酸铵的HEPES缓冲液，或乙酸/氯化钠缓冲液)来洗提BPFI。也可使用例如使用磷酸钾梯度的降低的线性盐梯度来洗提BPFI分子。随后可例如通过过滤(诸如透滤或超滤)来浓縮洗出液。可利用透滤来去除用于洗提BPFI的盐。其它纯化技术可对第一BPFI混合物或其任何后续混合物进行使用例如凝胶过滤(GelFiltration:PrinciplesandMethods(目录号18-1022-18，AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)，其是以引用的方式并入本文中)、羟基磷灰石色谱(适合基质包括但不限于HA-Ultrogel、HighResolution(Calbiochem)、CHT陶瓷羟基磷灰石(BioRad)、Bio-GelHTP羟基磷灰石(BioRad))、HPLC、膨胀床吸附、超滤、透滤、冻干等的另一分离步骤，以去除任何过量盐且用适合缓冲液来代替所述缓冲液以用于下个分离步骤或甚至最终药物产品的调配。本文中所述的各步骤中可使用所属领域技术人员已知的技术来监测BPFI(包括实质上纯化的BPFI)的产率。这些技术也可用于在最后分离步骤后评估实质上纯化的BPFI的产率。举例来说，可使用具有多种垸基链长度的若干反相高压液相色谱柱(诸如氰基89RP-HPLC、C18RP-HPLC以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC)中的任一种来监测BPFI的产率。在本发明的特定实施例中，在各纯化步骤后BPFI的产率可为至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、至少约99.9%或至少约99.99%的各纯化步骤的原材料中的BPFI。可使用诸如SDS-PAGE的标准技术或通过使用Western印迹法和ELISA检定测量BPFI来测定纯度。举例来说，可针对从阴性对照酵母发酵和阳离子交换回收分离的蛋白质产生多克隆抗体。抗体也可用于探测污染性宿主细胞蛋白质的存在。RP-HPLC材料VydacC4(Vydac)是由硅胶粒子组成，其表面带有C4-烷基链。BPFI与蛋白质杂质的分离是基于疏水相互作用强度的差别。用稀三氟乙酸中的乙腈梯度来进行洗提。使用不锈钢柱(填充2.8到3.2升VydacC4硅胶)进行制备型HPLC。通过加入三氟乙酸来酸化羟基磷灰石Ultrogel洗出液且将其装载于VydacC4柱上。对于洗涤和洗提来说，使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集洗提部分且立即用磷酸盐缓冲液将其中和。汇集在IPC限度内的BPFI洗提部分。DEAESepharose(Pharmacia)材料是由与琼脂糖凝胶珠粒的表面共价结合的二乙基氨基乙基(DEAE)基团组成。通过离子相互作用来介导BPFI与DEAE基团的结合。乙腈和三氟乙酸无滞留地通过柱。在洗掉这些物质之后，通过用低pH值的乙酸盐缓冲液洗涤柱来去除痕量杂质。随后用中性磷酸盐缓冲液洗涤柱且用具有增加的离子强度的缓冲液洗提BPFI。用DEAESepharosefastflow填充柱。调节柱体积以确保BPFI装载量在每毫升凝胶3-10mgBPFI的范围内。用水和平衡缓冲液(磷酸钠/钾)洗涤柱。装载汇集的HPLC洗出液洗提部分且用平衡缓冲液洗涤柱。随后用洗涤缓冲液(乙酸钠缓冲液)洗涤柱，接着用平衡缓冲液洗涤。随后，根据标准洗提曲线用洗提缓冲液(氯化钠、磷酸钠/钾)将BPFI从柱洗提且收集于单一洗提部分中。将DEAESepharose柱的洗出液调节到指定传导率。将所得药物物质无菌过滤到铁氟隆(Teflon)瓶中且在-7(TC下储存。可使用的其它方法包括但不限于去除内毒素的步骤。内毒素为位于革兰氏阴性宿主细胞(诸如，大肠杆菌)的外部膜上的脂多糖(LPS)。所属领域技术人员已知用于降低内毒素含量的方法且其包括但不限于使用二氧化硅支撑物、玻璃粉或羟基磷灰石的纯化技术、反相色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱、阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱、这些方法的组合等。可能需要修改或其它方法以从所关注的多肽中去除污染物(诸如共迁移蛋白质)。可使用多种方法和程序评估包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的BPFI的产率和纯度，包括但不限于Bradford检定、SDS-PAGE、银染色SDS-PAGE、考马斯(coomassie)染色SDS-PAGE、质谱(包括但不限于，MALDI-TOF)和所属领域技术人员已知的用于表征蛋白质的其它方法。表征本发明的异源融合蛋白存在多种表征本发明的融合蛋白的方法。一些所述方法包括但不限于与蛋白质染色方法联合的SDS-PAGE，或者使用抗IgG或抗HSA抗体的免疫印迹。其它方法包括例如基质辅助激光解吸附/离子化质谱(MALDI-MS)、液相色谱/质谱、等电聚焦、分析型阴离子交换、色谱聚焦和圆二色谱。W/丄在替代系统中的表达已使用若干种策略以在非重组宿主细胞、诱变宿主细胞或无细胞系统中将非天然氨基酸引入蛋白质中。这些系统也适用于制造本发明的BPFI。氨基酸经诸如Lys、Cys和Tyr的反应性侧链衍生使得赖氨酸转化为N、乙酰基-赖氨酸。化学合成也提供并入非天然氨基酸的直接方法。利用肽片段的酶促接合和天然化学接合的新近发展，有可能制造较大蛋白质。例如参看P.E.Dawson和S.B.H.Kent,A皿u.Rev.Biochem,69:923(2000)。已使用将经所需非天然氨基酸以化学方式酰化的抑制tRNA加到能够支持蛋白质生物合成的活体外提取物中的通用活体外生物合成方法，将100个以上非天然氨基酸位点特异性地并入几乎任何尺寸的多种蛋白质中。例如参看V.W.Cornish,D.Mendel禾卩P.GSchultz，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34:621(1995);C丄Noren，S丄Anthony-Cahill,M.C.Griffith,P.G.Schultz,爿ge"em/附"/oc//orwYe-5^ec(/cz'wcorpora/iowo/w朋a化m/a/m"oflczVfepro&z."&Science244:182-188(1989);和J.D.Bain,C.G.Glabe,T.A.Dix，A.R.Chamberlin,E.S.Diala，5/(w;vw/7ze/"/c57Ye-印ec折c/wcorpom/iowo/atw朋偷m/aczWa/w/we/^We,J.Am.Chem.Soc.111:8013-8014(1989)。已经将多种官能团引入蛋白质中以供蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶机理和信号转导的研究。已提出称作选择性压力并入的活体内方法以利用野生型合成酶的杂乱性。例如参看N.Budisa,C.Minks,S.Alefelder,W.Wenger,RM.Dong，L.Moroder和R.Huber,FASEBJ.,13:41(1999)。向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢路径关闭的营养缺陷型菌株是生长于含有有限浓度的天然氨基酸的基本培养基中，而标靶基因的转录受到阻遏。在稳定生长期开始时，天然氨基酸被耗尽且经非天然氨基酸类似物置换。对重组蛋白表达的诱导使得含有非天然类似物的蛋白质积聚。举例来说，已使用这种策略将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和对氟苯丙氨酸并入蛋白质中，且其在UV光谱中显示两个易于鉴别的特征性肩，例如参看C.Minks,R.Huber,L.Moroder和N.Budisa,Anal.Biochem..284:29(2000);已使用三氟甲硫氨酸代替噬菌体T4溶菌酶中的甲硫氨酸以通过19FNMR研究其与壳寡糖配体的相互作用，例如参看H.Duewel,E.Daub,V.Robinson和J.F.Honek,Biochemistry,36:3404(1997);且已并入三氟亮氨酸代替亮氨酸，从而使亮氨酸拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性增加。例如参看Y.Tang，G.Ghirlanda,W.A.Petka，T.Nakajima,W.F.DeGrado和D.A.Tirrell,Angew.Chem.Int.Ed.Engl..40:1494(2001)。此外，将硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸并入各种重组蛋白中以促进X射线结晶学中的相溶解。例如参看W.A.Hendrickson，J.R.Horton和D.M.Lemaster,EMBOJ.,9:1665(1990);丄O.Boles，K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom,B.Dunlap,L.Lebioda和M.Hatada，Nat.Struct.Biol..1:283(1994);N.Budisa,B.Steipe,P.Demange，C.Eckerskorn,J.Kellermann和R.Huber,Eur.J.Biochem..230:788(1995);和N.Budisa，W.Karnbrock，S.Steinbacher,A.Humm,L.Prade，T.Neuefeind,L.Moroder和R.Huber,J.Mol.Biol..270:616(1997)。也已有效地并入具有烯或炔官能团的甲硫氨酸类似物，从而允许通过化学方式对蛋白质进行其它修饰。例如参看J.C.M.vanHest和D.A.Tirrell，FEBSLett.,428:68(1998);J.C.vanHest,K.L.Kiick和D.A.Tirrell,J.Am.Chem.Soc.122:1282(2000);以及K.L.Kiick和D.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487(2000);美国专利第6,586,207号；美国专利公开案第2002/0042097号，其是以引用的方式并入本文中。这种方法的成功取决于氨酰基-tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别，所述合成酶通常需要高选择性以确保蛋白质翻译的保真度。扩展这种方法的范围的一种方式是放宽氨酰基-tRNA合成酶的底物特异性，这已在有限数目的情况下实现。举例来说，在大肠杆菌苯丙氨酰基-tRNA合成酶(PheRS)中用Gly置换Ala294可增加底物结合口袋的尺寸，且导致对氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)对tRNAPhe的酰化。参看，M.Ibba，P.Kast和H.Hennecke,Biochemistrv,33:7107(1994)。带有这种突变PheRS的大肠杆菌菌株允许并入对氯苯丙氨酸或对溴苯丙氨酸替代苯丙氨酸。例如参看M.Ibba和H.Hennecke,FEBSLett..364:272(1995);以及N.Sharma,R.Furter，P.Kast和D.A.Tirrell,FEBSLett.,467:37(2000)。类似地，显示接近大肠杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合位点的点突变Phel30Ser允许比酪氨酸更有效地并入重氮酪氨酸。参看F.Hamano-Takaku,T.Iwama,S.Saito-Yano，K.Takaku,Y.Monden,M.Kitabatake,D.Soll禾口S.Nishimura,J.Biol.Chem.,275:40324(2000)。在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一种策略为修饰具有校对机制的合成酶。这些合成酶不能区分在结构上与同源天然氨基酸类似的氨基酸且因此将其活化。此错误在单独位点上得到修正，这使来自tRNA的错配氨基酸去酰基化以保持蛋白质翻译的保真度。如果合成酶失去校对活性，那么错误活化的结构类似物可避开编辑功能且被并入。近来已用缬氨酰基-tRNA合成酶(ValRS)证实这种方法。参看V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle,T.L.Hendrickson,V.deCrecy-Lagard,P.Schimmel禾口P.Marliere，Science,292:501(2001)。ValRS可使具有Cys、Thr或氨基丁酸(Abu)的tRNAVal错误氨酰基化；随后通过编辑域水解这些非同源氨基酸。在使大肠杆菌染色体随机突变诱发之后，选择在ValRS的编辑位点中具有突变的突变大肠杆菌菌株。这种编辑缺陷型ValRS错误地使tRNAVal装有Cys。由于Abu与Cys在空间上类似(Cys的-SH基团经Abu中的-CKb置换)，因此当使这种突变大肠杆菌菌株在存在Abu的情况下生长时，突变ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析显示在天然蛋白质的各缬氨酸位置处约24。/。的缬氨酸经Abu置换。固相合成和半合成方法也已允许合成含有新颖氨基酸的多种蛋白质。举例来说，参看以下公开案和其中所引用的如下所述的参考文献Crick,F.H.C.,Barrett,L.Brenner,S.Watts-Tobin,R.Gewera/o///ecoc/e/ra/"e/肌Nature,192:1227-1232(1961);Hofmann,K.,Bohn,H.iSh/Wes/o/少/epf/cfes.XQ"T7.TTzeo/加g膨wf，J.AmChem,88(24):5914陽5919(1966);Kaiser,E.T.S声/e"c卿"露hto6/0/og/ca〃yac"'vej;e//7'cfesowe//jra^'w/wc/t//wgewyz脂s，AccChemRss'22:47-54(1989);Nakatsuka,T.,Sasaki,T.,Kaiser,E.T._PeW<iesegwewfcowp//wgcafa/少ze(i6>>yewz'i>72^z"/cA/o5^6"7/5777,JAmChemSoc.109:3808-3810(1987);Schnolzer,M.,Kent,SBH.Cow欲M"/Mg;rafez'/wi/ov"az7/wgw"/rWe"e<iw威Wc/ep"Ww6ac幼owe-ewgfweered/ZZFprafease,Science,256(5054》221-225(1992);Chaiken,I.M.Se附一wf/zWc/raW叫CRCCritRevBiochem.11(3):255-301(1981);Offord,R.E.JVoto'wewg/wee"'wgcAe脂'ca/膨a/wProteinEng.,1(3):151-157(1987);以及Jackson,D.Y.,Burnier,J.,Quan,C,Stanley,M.,Tom,J.,"Wells,J.A.乂尸ep"fife丄z'gose/or7bto/办禍e^o/iz力owwc/eoyeXw站t/""a/wra/Ca/一"'ciJes/t/""Science,266(5183):243(1994)。已使用化学修饰在活体外将包括辅因子、自旋标记和寡核苷酸的多种非天然侧链引入蛋白质中。例如参看，Corey,D.R.,Schultz,P.G.0/aZ^6nWse《we"ce-印ecz力cy/wg/e-Wrawcfecfifeojc>r/6owwc/ease,Science,238(4832):1401-1403(1987);Kaiser,E.T.,93LawrenceD.S.,Rokita，S.E.7Tec/e附/ca/附od(/cfl/iowo/ewz，a"'c5^e"y"Xv,AmiuHevBiochem,54:565-595(1985);Kaiser,E.T.,Lawrence,D.S.C7ieww'ca/附m^s^'owo/ac"vew'^y,Science,226(4674):505-511(1984);Neet,K.E.,NanciA,Koshland,D.E.iVo戸"eso/赫"w磁wXJBiol.Chem.243(24):6392-6401(1968);Polgar,L.etM丄.Bender.爿wewen27附ecowto'm'wgfl5^7^"/ca〃yac"'ve77z/o/-1yw6"7/1s/".J.AmChemSoc,88:3153-3154(1966);和Pollack,S丄，Nakayama,G.Schultz,P.G.胁oc/wc"owo/wwc/eopMesofwd5^e"ra5ropZcpra6es/w/ocm"'6o办com6/m'wgs/to,Science,242(4881):1038國1040(1988)。或者，使用以化学方式修饰的氨酰基-tRNA的生物合成方法已用于将若干种生物物理探针并入在活体外合成的蛋白质中。参看以下公开案和其中所引用的参考文献Brunner,J.iVewawecrow/z'wAiwgwe^o<iy,Annu.RevBiochem,62:483-514(1993);禾口Krieg,U.C.,Walter,P.,Hohnson,A.E.PAofocrc^/z'wAiwg0///ze0/wosceW7repro/a"/wo/54-A77o<ia/fow/o/y;eWtfeo//"/ew'gwa/recogm'"'ow戸"/c/e,Proc.Natl.Acad.Sci.83(22):8604-8608(1986)。先前已证实，通过将以化学方式氨酰基化的抑制tRNA加入经含有所需琥珀无义突变的基因编程的蛋白质合成反应，可在活体外将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中。使用这些方法，可使用对特定氨基酸来说为营养缺陷型的菌株，用密切结构同源物代替20种常见氨基酸中的多种氨基酸，例如，用氟苯丙氨酸代替苯丙氨酸。例如参看Noren,C丄,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.,Schultz,P.G爿gewera//or57Ye-印e"yc/wcor_pon3"ow0/w朋她m/otw/woz'wfo;ro/"e/叫Science,244:182-188(1989》M.W.Nowak等人,Science268:439-42(1995);Bain，J.D.,Glabe，C.G"Dix,T.A.,Chamberlin,A.R.,Diala，E.S.说osy"^2"z'c57'fe-印e"yc/"cor_pom"'ow0/aaw/woaczWWoa;oi>pepOWe,J.AmChemSoc,111:8013-8014(1989);N.Budisa等人，FASEBJ.13:41-51(1999);Ellman,J.A.,Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.，Noren,C.J.,Schultz,P.G.5zo^wAericwe/Z;oc//o尸//7z尸o^MciwgMwwa^wra/am/"os"e-s/)ec(^ca//_y/wfo/^ofe/ws.MethodsinEnz"第202巻，301-336(1992);和Mendel,D.,Cornish，V.W.&Schultz,P.G.幼e措e"MM齒ge"ewjw油￡jc_paw(iedGe""ZcCWe，AnnuRevBiophys.BiomolStruct.24,435-62(1995)。举例来说，制备识别终止密码子UAG的抑制tRNA且用非天然氨基酸以化学方式使其氨酰基化。使用常规定点突变诱发在蛋白质基因中的所关注位点处引入终止密码子TAG。例如参看Sayers,J.R.,Schmidt,W.Eckstein,F.5'-3'Exowwc/ecwes;/z(w/AoTO^2/o她-6twe(io/fgwowc/eo/7We-<iz>e"edNucleicAcidsRes,16(3):79194-802(1988)。当将酰基化抑制tRNA和突变基因组合于活体外转录/翻译系统中时，回应UAG密码子而并入非天然氨基酸，得到在指定位置处含有所述氨基酸的蛋白质。使用[3H]-Phe的实验和用a-羟基酸的实验证实，在UAG密码子指定的位置处仅并入所需氨基酸且未在蛋白质中的任何其它位点处并入此氨基酸。例如参看，Noren等人，局上文；Kobayashi等人，(2003)NatureStructuralBiology10(6):425-432;和Ellman，J.A.,Mendel,D.，Schultz,P.G.S"e-s/e"yc/"cor_pom".owo/"ove/6ac&6owe掛wc/w^yz'"foScience,255(5041):197-200(1992)。也已使用微注射技术将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参看，M.W.Nowak,P.C.Kearney,J.R.Sampson,M.E.Saks，C.G.Labarca，S.K.Silverman,W.G.Zhong,J.Thorson,J.N.Abelson,N.Davidson,P.G.Schultz，D.A.Dougherty和H.A.Lester,Science,268:439(1995);和D.A.Dougherty,Curr.Opin.Chem.Biol..4:645(2000)。将爪蟾卵母细胞(Xenopusoocyte)与活体外产生的以下两种RNA物质共注射在所关注氨基酸位置处具有UAG终止密码子的编码标耙蛋白的mRNA，和经所需非天然氨基酸氨酰基化的琥珀抑制tRNA。随后卵母细胞的翻译机构将非天然氨基酸插入UAG指定的位置处。这种方法己允许通常不适用于活体外表达系统的整合膜蛋白的活体内结构-功能研究。实例包括将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量转移测量距离，例如参看G.Turcatti,K.Nemeth,M.D.Edgerton,U.Meseth,F.Talabot,M.Peitsch，J.Knowles,H.Vogel和A.Chollet,J.Biol.Chem.,271:19991(1996);并入生物素化氨基酸以鉴别离子通道中表面暴露的残基，例如参看J.P.Gallivan,H.A.Lester和D.A.Dougherty,Chem.Biol..4:739(1997);使用经笼蔽酪胺酸类似物以实时监测离子通道中的构象变化，例如参看J.C.Miller,S.K.Silverman,P.M.England,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Neuron,20:619(1998);以及使用a羟基氨基酸以改变用于探究其门控机制的离子通道主链。例如参看P.M.England,Y.Zhang，D.A.Dougherty和H.A.Lester,^11,96:89(1999);以及T.Lu,A.Y.Ting,J.Mainland,L.Y.Jan,P.G.Schultz和J.Yang,Nat.Neurosci.,4:239(2001)。活体内直接将非天然氨基酸并入蛋白质中的能力提供以下优点突变蛋白的高产率、技术简易性、在细胞中或可能在活有机体中研究突变蛋白的可能性以及这些突变蛋白于治疗性治疗中的用途。将具有各种尺寸、酸度、亲核性、疏水性和其它性质的非天然氨基酸包括在蛋白质中的能力可极大地扩展理性且系统地操纵蛋白质结构的能力，从而探査蛋白质功能并且产生具有新颖特性的新蛋白质或有机体。然而，由于在蛋白质翻译中达到高保真度所需的tRNA合成酶相互作用的复杂性质，故这种方法相当困难。在位点特异性地并入p-F-Phe的一次尝试中，将酵母琥珀抑制tRNAPheCUA/苯丙氨酰基-tRNA合成酶对用于p-F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌菌株中。例如参看R.Furter,ProteinSci.,7:419(1998)。使用无细胞(活体外)翻译系统获得本发明的BPFI的表达也是可能的。在可包括mRNA作为模板(活体外翻译)或DNA作为模板(组合活体外转录与翻译)的这些系统中，活体外合成是由核糖体指导。已进行相当多的尝试来研发无细胞蛋白质表达系统。例如参看，Kim，D.M.和J.R.Swartz,历ofec/mo/ogyam/5z'oewg/"een'wg,74:309-316(2001);Kim,D.M.和J.R.Swartz,5/o&c/z"o/ogy22,1537-1542,(2000);Kim,D.M.和J.R.Swartz,说o^c/mo/ogyPragre^，16,385-390,(2000);Kim,D.M.和J.R.Swartz，otw/5/oewgz"eenwg,66,180-188，(1999);以及Patnaik,R.和J.R.Swartz，胸ec/mz々薦24,862-868,(1998);美国专利第6,337,191号；美国专利公开案第2002/0081660号；WO00/55353;WO90/05785，其是以引用的方式并入本文中。可用于表达包含非天然编码的氨基酸的BPFI的另一种方法包括mRNA-肽融合技术。例如参看R.Roberts和J.Szostak,Prac.A^/^cfld(T/S4)94:12297-12302(1997);A.Frankel等人，C/zew/Wo;&Ao/ogy10:1043-1050(2003)。在本方法中，在核糖体上将与嘌呤霉素(puromycin)连接的mRNA模板翻译成肽。如果已对一个或一个以上tRNA分子进行修饰，那么也可将非天然氨基酸并入肽中。在已读取最后一个mRNA密码子后，嘌呤霉素捕获肽的C末端。如果发现所得mRNA-肽接合物在活体外检定中具有引人关注的特性，那么可容易地由mRNA序列揭示其身份。以此方式，可筛检包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的BPFI文库，以鉴别具有所需特性的多肽。最近，已报导利用经纯化组分的活体外核糖体翻译，其允许合成经非天然编码的氨基酸取代的肽。例如参看A.Forster等人，Proc.iV^/^cadSc/.(T7S^100:6353(2003)。JX与5PFJ偶合的大分子聚合物可使用本文中所述的组合物、方法、技术和策略来实现对本文中所述的非天然氨基酸多肽的各种修饰。这些修饰包括将其它官能团并入到多肽的非天然氨基酸组分上，这些官能团包括但不限于标记；染料；聚合物;水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；放射性核素；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA;RNA;反义聚核苷酸；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分；生物素；生物素的衍生物；生物素类似物；并入重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。作为本文中所述组合物、方法、技术和策略的说明性非限制性实例，以下描述将集中在将大分子聚合物加成到非天然氨基酸多肽上，且应理解，对其所述的组合物、方法、技术和策略也适用于(必要时经适当修改且所属领域技术人员可用本文中的揭示内容进行)添加其它官能团(包括但不限于，上文列出的那些官能团)。多种大分子聚合物和其它分子可与本发明的BPFI连接以调节BPFI的生物特性和/或向BPFI分子提供新颖生物特性。这些大分子聚合物可经由天然编码的氨基酸、非天然编码的氨基酸或者天然或非天然氨基酸的任何官能取代基或加成到天然或非天然氨基酸上的任何取代基或官能团与BPFI连接。聚合物的分子量可为宽范围，包括但不限于介于约100Da与约100,000Da或更大之间。聚合物的分子量可为宽范围，包括但不限于介于约100Da与约100,000Da或更大之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括但不限于100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4，000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约l，OOODa与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与40,000Da之间。本发明提供实质上均质的聚合物:蛋白质接合物的制剂。如在本文中所用的"实质上均质"意谓观察到聚合物:蛋白质接合物分子大于总蛋白质的一半。聚合物:蛋白质接合物具有生物活性且本文中所提供的本发明的"实质上均质"的聚乙二醇化BPFI制剂为足够均质以显示均质制剂的优点(例如，在批次与批次之间药物动力学可预测性的临床应用中的简易性)的制剂。也可选择制备聚合物:蛋白质接合物分子的混合物，且本文中所提供的优点在于可选择混合物中欲包括的单一聚合物:蛋白质接合物的比例。因此，必要时，可制备各种蛋白97质与各种数目的所连接的聚合物部分(即，二、三、四等)的混合物，且将所述接合物与使用本发明的方法制备的单一聚合物:蛋白质接合物组合，并获得具有预定比例的单一聚合物:蛋白质接合物的混合物。所选聚合物可为水溶性的，从而使其所连接的蛋白质在水性环境(诸如生理环境)中不沉淀。聚合物可分枝或不分枝。对于最终产品制剂的治疗用途来说，聚合物优选将为医药学上可接受的。聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例会变化，且其在反应混合物中的浓度也会变化。一般来说，可通过所选聚乙二醇的分子量和可提供的可用反应性基团的数目来确定最佳比率(就反应效率来说，因为存在最小过量的未反应蛋白质或聚合物)。当涉及分子量时，通常聚合物的分子量越高，可与蛋白质连接的聚合物分子的数目就越少。类似地，当最佳化这些参数时，应将聚合物的分枝考虑在内。通常，分子量越高(或分枝越多)，则聚合物:蛋白质比率就越高。如本文中所用且当涵盖PEG:BPFI接合物时，术语"治疗有效量"是指对患者提供所需益处的量。举例来说，术语"治疗有效量"是指调节病毒含量从而对患者提供益处的量。所述量随个体不同而变化且将视多种因素而定，包括患者的整体身体状况和待治疗病状的潜在病因。用于疗法的BPFI的量提供可接受的变化率并且保持有益水平的所需反应。所属领域技术人员使用可公开获得的材料和程序可容易地确定本发明组合物的治疗有效量。水溶性聚合物可为包括但不限于线性、分叉或分枝的任何结构形式。水溶性聚合物通常为聚(烷撑二醇)(诸如聚乙二醇(PEG))，但也可使用其它水溶性聚合物。举例来说，使用PEG来描述本发明的某些实施例。PEG为众所周知的水溶性聚合物，其在市面上有售或可根据所属领域中众所周知的方法通过乙二醇的开环聚合来制备(Sandler和Karo,PolymerSynthesis,AcademicPress,NewYork,第3巻，第138-161页)。术语"PEG"广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子而无须考虑PEG的大小或在PEG末端处的修饰，且可以下式表示与BPFI连接的形式XO-(CH2CH20)n-CH2CH2-Y，其中n为2到10,000且X为H或末端修饰，包括但不限于d—4烷基。在一些情况下，本发明中所用的PEG在一端经羟基或甲氧基封端，g卩，X为H或CH3("甲氧基PEG")。或者，PEG可经反应性基团封端，从而形成双官能聚合物。典型反应性基团可包括通常用于与见于20种常见氨基酸中的官能团反应的那些反应性基团(包括但不限于，马来酰亚胺基、活性碳酸酯(包括但不限于，对硝基苯酯)、活性酯(包括但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)以及对20种常见氨基酸呈惰性但与非天然编码的氨基酸中所存在的互补官能团特异性反应的官能团(包括但不限于，叠氮基、炔基)。应注意，PEG的另一端(在上式中以Y表示)将经由天然存在或非天然编码的氨基酸与BPFI直接或间接连接。举例来说，Y可为与多肽的胺基(包括但不限于，赖氨酸的s胺或N末端)的酰胺、氨基甲酸酯或脲键。或者，Y可为与硫醇基团(包括但不限于，半胱氨酸的硫醇基团)的马来酰亚胺键。或者，Y可为与经由20种常见氨基酸通常不可接近的残基的键。举例来说，PEG上的叠氮基可与BPFI上的炔基反应以形成Huisgen[3+2]环加成产物。或者，PEG上的炔基可与非天然编码的氨基酸中所存在的叠氮基反应以形成类似产物。在一些实施例中，强亲核试剂(包括但不限于，肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可与非天然编码的氨基酸中所存在的醛或酮基反应以形成腙、肟或縮氨基脲，适当时，其可在一些情况下通过用适当还原剂处理而进一步还原。或者，可经由非天然编码的氨基酸将强亲核试剂并入BPFI中且用于优先与水溶性聚合物中所存在的酮或醛基反应。可按照实际需要使用任何分子质量的PEG，必要时，其包括但不限于约IOO道尔顿(Dalton;Da)到100,000道尔顿或更大(包括但不限于，有时为0.1-50kDa或10-40kDa)。也可使用支链PEG，其包括但不限于各链具有在1-100kDa(包括但不限于，1-50kDa或5-20kDa)范围内的MW的PEG分子。多种PEG分子描述于(包括但不限于)ShearwaterPolymers,Inc.目录、NektarTherapeutics目录中，其以引用的方式并入本文中。通常，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然编码的氨基酸反应。举例来说，带有用于与氨基酸侧链反应的炔和叠氮基部分的PEG衍生物可用于将PEG与如本文中所述的非天然编码的氨基酸连接。如果非天然编码的氨基酸包含叠氮基，那么PEG通常将含有实现[3+2]环加成产物形成的炔部分或实现酰胺键形成的含有膦基的活性PEG物质(即，酯、碳酸酯)。或者，如果非天然编码的氨基酸包含炔，那么PEG通常将含有实现[3+2]Huisgen环加成产物形成的叠氮基部分。如果非天然编码的氨基酸包含羰基，那么PEG通常将分别包含有效亲核试剂(包括但不限于，酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能团)以便实现相应腙、肟和縮氨基脲键的形成。在其它替代物中，可使用上述反应性基团的相反定向，即，可使非天然编码的氨基酸中的叠氮基部分与含有炔的PEG衍生物反应。在一些实施例中，具有PEG衍生物的BPFI变体含有可与非天然编码的氨基酸的侧链上所存在的化学官能团反应的化学官能团。在一些实施例中，本发明提供含叠氮基和乙炔的聚合物衍生物，其包含具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链。水溶性聚合物的聚合物主链可为聚(乙二醇)。然而，应了解包括但不限于聚(乙二醇)和其它相关聚合物(包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇))的多种水溶性聚合物也适用于实施本发明，且预期术语PEG或聚(乙二醇)的使用涵盖且包括所有这些分子。术语PEG包括但不限于任何形式的聚(乙二醇)，包括双官能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、分叉PEG、分枝PEG、侧接PEG(即，具有一个或一个以上与聚合物主链侧接的官能团的PEG或相关聚合物)或其中具有可降解键的PEG。PEG通常为透明、无色无味的，可溶于水中，对热稳定，对许多化学剂呈惰性，不水解或变质，且通常无毒。认为聚(乙二醇)具有生物可相容性，也就是说，PEG能够与活组织或有机体共存而不造成伤害。更具体来说，PEG实质上为非免疫原性的，也就是说，PEG在体内不倾向于产生免疫反应。当与在体内具有一些所要功能的分子(诸如生物活性剂)连接时，PEG倾向于掩蔽所述药剂且可减少或消除任何免疫反应，从而使有机体可耐受所述药剂的存在。PEG接合物倾向于不产生实质免疫反应或者造成凝血或其它不需的效应。具有式--CH2CH20—(CH2CH20)n—CH2CH2—(其中n为约3到约4000，通常约20到约2000)的PEG适用于本发明中。在本发明的一些实施例中，具有约800Da到约100,000Da分子量的PEG尤其适于用作聚合物主链。聚合物主链可为线性或分枝的。所属领域中通常已知分枝聚合物主链。通常，分枝聚合物具有中心分枝核心部分和多个与中心分枝核心连接的线性聚合物链。PEG通常是以分枝形式使用，其可通过将环氧乙垸加成到各种多元醇(诸如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇和山梨糖醇)上来制备。中心分枝部分也可由若干种氨基酸(诸如赖氨酸)衍生。分枝聚(乙二醇)可以通式R(-PEG-OH)m表示，其中R是衍生自诸如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇的核心部分，且m表示臂数目。多臂PEG分子(诸如在美国专利第5,932,462号；第5,643,575号；第5,229,490号；第4,289,872号；美国专利申请案2003/0143596;WO96/21469;和WO93/21259中所述的那些PEG分子，这些文献各自是以全文引用的方式并入本文中)也可用作聚合物主链。分枝PEG也可为以PEG(--YCHZ2)n表示的分叉PEG的形式，其中Y为连接基且Z为通过规定长度的原子链与CH连接的活性末端基团。另一分枝形式侧接PEG沿PEG主链而不是在PEG链的末端具有诸如羧基的反应性基团。除这些形式的PEG之外，也可制备在主链中具有弱键或可降解键的聚合物。举例来100说，可制备在聚合物主链中具有受水解影响的酯键的PEG。如下文所示，此水解使聚合物裂解为具有较低分子量的片段-PEG-C02-PEG-+H20PEG-C02H+HO-PEG-。所属领域技术人员应了解，术语聚(乙二醇)或PEG表示或包括所属领域中已知的所有形式，包括但不限于本文中所揭示的那些形式。许多其它聚合物也适用于本发明中。在一些实施例中，具有2到约300个末端的水溶性聚合物主链尤其适用于本发明中。适合聚合物的实例包括但不限于其它聚(垸撑二醇)，诸如聚(丙二醇)("PPG")、其共聚物(包括但不限于，乙二醇与丙二醇的共聚物)、其三聚物、其混合物等。尽管聚合物主链中各链的分子量可改变，但其通常在约800Da到约100,000Da、通常约6,000Da到约80,000Da的范围内。所属领域技术人员将认识到，实质上水溶性主链的上述列表决不详尽且仅为说明性的，且预期具有上述品质的所有聚合物材料都适用于本发明中。在本发明的一些实施例中，聚合物衍生物为"多官能的"，意谓聚合物主链具有经官能团官能化或活化的至少两个末端且可能多达约300个末端。多官能聚合物衍生物包括但不限于具有两个末端的线性聚合物，各末端与可相同或不同的官能团键结。在一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构X—A—POLY—B—N=N=N，其中N:N-N为叠氮基部分；B为连接部分，其可存在或不存在；POLY为水溶性非抗原聚合物；A为连接部分，其可存在或不存在且其可与B相同或不同；且x为第二官能团。关于A和B的连接部分的实例包括但不限于含有多达18个且更优选介于1-10个之间的碳原子的多官能化烷基。诸如氮、氧或硫的杂原子可包括于垸基链中。垸基链也可在杂原子上分枝。关于A和B的连接部分的其它实例包括但不限于含有多达10个且更优选5-6个碳原子的多官能化芳基。芳基可经一个或一个以上碳原子、氮、氧或硫原子101取代。适当连接基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号；第5,643,575号；和美国专利申请公开案2003/0143596中所述的那些连接基团，所述文献各自是以引用的方式并入本文中。所属领域技术人员将认识到，有关连接部分的上述列表决不详尽且仅为说明性的，且预期具有上述品质的所有连接部分都适用于本发明中。用作X的合适官能团的实例包括但不限于羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯(诸如N-羟基琥珀酰亚胺基酯和l-苯并三唑基酯)、活性碳酸酯(诸如N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯和l-苯并三唑基碳酸酯)、縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烃、酮和叠氮化物。如所属领域技术人员所了解，所选X部分应与叠氮基相容以使得不与叠氮基发生反应。含叠氮基的聚合物衍生物可为同双官能的，意谓第二官能团(即，X)也是叠氮基部分；或者为异双官能的，意谓第二官能团为不同官能团。术语"经保护"是指存在防止化学反应性官能团在某些反应条件下反应的保护基或部分。保护基应视所保护的化学反应性基团的类型而改变。举例来说，如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸(诸如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可为苯甲基或诸如甲基、乙基或叔丁基的垸基。所属领域中已知的其它保护基也可用于本发明中。文献中末端官能团的特定实例包括但不限于N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(例如参看美国专利第5,281,698号、第5,468,478号)、胺(例如参看，Buckmann等人Makromol.Chem.182:1379(1981);Zalipsky等人Eur.Polym.J.19:1177(1983))、酰肼(例如参看，Andresz等人Makromol.Chem.179:301(1978))、琥珀酰亚胺基丙酸酯和琥珀酰亚胺基丁酸酯(例如参看，Olson等人Poly(ethyleneglycol)Chemistry&BiologicalApplications,第170-181页，Harris&Zalipsky编，ACS,Washington,D.C.,1997;还参看美国专利第5,672,662号)、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(例如参看，Abuchowski等人CancerBiochem.Biophys.7:175(1984)和Joppich等人Makrolol.Chem.180:1381(1979))、琥珀酰亚胺基酯(例如参看，美国专利第4,670,417号)、苯并三唑碳酸酯(例如参看，美国专利第5,650,234号)、縮水甘油醚(例如参看，Pitha等人Eur.JBiochem.94:11(1979);Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13:354(1991))、氧基羰基咪唑(例如参看，Beauchamp等人,Anal.Biochem.131:25(1983);Tondelli等人J.ControlledRelease1:251(1985))、碳酸对硝基苯酯(例如参看，Veronese等人,Appl.Biochem.Biotech"11:141(1985);和Sartore等人,Appl.Biochem.Biotech"27:45(1991))、醛(例如参看，Harris等人J.Polym.Sci.Chem.编22:341(1984);美国专利第5,824,784号、美国专利第5,252,714号)、马来酰亚胺(例如参看，Goodson等人Biotechnology(NY)8:343(1990);Romani等人ChemistryofPeptidesandProteins2:29(1984);和Kogan,SyntheticComm.22:2417(1992))、邻吡啶基-二硫化物(例如参看Woghiren等人Bioconj.Chem.4:314(1993))、丙烯醇(例如参看，Sawhney等人，Macromolecules，26:581(1993))、乙烯基砜(例如参看美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。在本发明的某些实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链X~CH2CH20(CH2CH20)n—CH2CH2-N=N=N，其中X为如上所述的官能团；且n为约20到约4000。在另一个实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链X~~CH2CH20—(CH2CH20)n—CH2CH2-0-(CH2)m-W-N=N=N，一其中W为包含介于l-10个之间的碳原子的脂肪族或芳香族连接部分；n为约20到约4000;且X为如上所述的官能团；m介于l与10之间。可通过所属领域中已知和/或本文中揭示的多种方法来制备本发明的含叠氮基的PEG衍生物。在下文所示的一种方法中，具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链具有与第一官能团键结的第一末端和与合适离去基键结的第二末端)与叠氮基阴离子(其可与众多合适抗衡离子(包括钠、钾、叔丁基铵等)中的任一种配对)反应。离去基经历亲核置换且经叠氮基部分置换，得到所需含叠氮基的PEG聚合物。X-PEG-L+N3-+X-PEG-N3如所示，用于本发明中的合适聚合物主链具有式X-PEG-L，其中PEG为聚(乙二醇)且X为不与叠氮基反应的官能团且L为合适离去基。适合官能团的实例包括但不限于羟基、经保护羟基、縮醛、烯基、胺、氨基氧基、经保护胺、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、马来酰亚胺、二硫吡啶、乙烯基吡啶和酮。适合离去基的实例包括但不限于氯离子、溴离子、碘离子、甲磺酸根、三氟乙磺酸根和甲苯磺酸根。在用于制备本发明的含叠氮基的聚合物衍生物的另一种方法中，使带有叠氮基官能团的连接剂与具有约800Da到约IOO，OOODa的平均分子量的水溶性聚合物主链接触，其中所述连接剂带有将与PEG聚合物上的化学官能团选择性反应的化学官能团，以形成含叠氮基的聚合物衍生物产物，其中叠氮基是通过连接基与聚合物主链分离。例示性反应流程展示如下X-PEG-M+N-连接基-N=N=N^PG-X-PEG-连接基-N-N-N其中PEG为聚(乙二醇)且X为诸如垸氧基的封端基团或如上文中所述的官能团；且M为不与叠氮基官能团反应但将与N官能团有效且选择性地反应的官能团。合适官能团的实例包括但不限于如果N为胺，那么M为羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N为酰肼或氨基氧基部分，那么M为酮；如果N为亲核基团，那么M为离去基。可由已知方法(包括但不限于，沉淀产物，必要时接着色谱)实现粗产物的纯化。下文展示在PEG二胺的情况下的更具体实例，其中一个胺经诸如叔丁基-Boc的保护基部分保护且所得单保护PEG二胺与带有叠氮基官能团的连接部分反应BocHN-PEG-NH2+H02C-(CH2)3-N==N=N在这种情况下，可使用多种活化剂(诸如亚硫酰氯或碳化二亚胺试剂和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基苯并三唑)使胺基与羧酸基团偶合，以在单胺PEG衍生物与带有叠氮基的连接部分之间产生酰胺键。在酰胺键成功形成之后，可将所得经N-叔丁基-Boc-保护的含叠氮基衍生物直接用于修饰生物活性分子或其可经进一步精制以安装其它有用104官能团。举例来说，可通过用强酸处理使N-t-Boc基团水解以产生co-氨基-PEG-叠氮化物。所得胺可用作安装其它有用官能团(诸如马来酰亚胺基、活性二硫化物、活性酯等)的合成把手(synthetichandle)以产生有价值的异双官能试剂。当需要将不同分子与聚合物的每一末端连接时，异双官能衍生物尤其有用。举例来说，(o-N-氨基-N-叠氮基PEG会允许具有活性亲电子基团(诸如醛、酮、活性酯、活性碳酸酯等)的分子与PEG的一个末端连接且具有乙炔基的分子与PEG的另一个末端连接。在本发明的另一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构X—A—POLY—B~OC-R其中R可为H或烷基、烯烃、垸氧基或芳基或经取代芳基；B为连接部分，其可存在或不存在；POLY为水溶性非抗原聚合物；A为连接部分，其可存在或不存在且其可与B相同或不同；且x为第二官能团。关于A和B的连接部分的实例包括但不限于含有多达18个且更优选介于1-10个之间的碳原子的多官能化烷基。诸如氮、氧或硫的杂原子可包括于烷基链中。烷基链也可在杂原子上分枝。关于A和B的连接部分的其它实例包括但不限于含有多达10个且更优选5-6个碳原子的多官能化芳基。芳基可经一个或一个以上碳原子、氮、氧或硫原子取代。适当连接基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号和第5,643,575号；和美国专利申请公开案2003/0143596中所述的那些连接基团，所述文献各自是以引用的方式并入本文中。所属领域技术人员将认识到，有关连接部分的上述列表决不详尽且仅为说明性的，且预期具有上述品质的多种连接部分都适用于本发明中。用作X的合适官能团的实例包括但不限于羟基、经保护羟基、垸氧基、活性酯(诸如N-羟基琥珀酰亚胺基酯和l-苯并三唑基酯)、活性碳酸酯(诸如N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯和l-苯并三唑碳酸酯)、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烃、酮和叠氮化物。如应了解，所选X部分应与乙炔基相容从而不与乙炔基发生反应。含乙炔的聚合物衍生物可为同双官能的，意谓第二官能团(即，X)也是乙炔部分；或者为异双官能的，意谓第二官能团为不同官能团。在本发明的另一个实施例中，聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链X~CH2CH20—(CH2CH20)n"Cl^CIfc-CKCH^-OCH，其中X为如上所述的官能团；n为约20到约4000;且-m介于1与IO之间。各异双官能PEG聚合物的特定实例如下所示。可使用所属领域技术人员已知和/或本文中揭示的方法来制备本发明的含乙炔的PEG衍生物。在一种方法中，使具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链具有与第一官能团键结的第一末端和与适合亲核基团键结的第二末端)与带有适于与PEG上的亲核基团反应的乙炔官能团和离去基的化合物反应。当将带有亲核部分的PEG聚合物与带有离去基的分子组合时，离去基经历亲核置换且经亲核部分置换，得到所需含乙炔的聚合物。X-PEG-Nu+L-A-C+X-PEG-Nu-A-<>CR，如所示，用于反应中的优选聚合物主链具有式X-PEG-Nu，其中PEG为聚(乙二醇)，Nu为亲核部分且X为不与Nu、L或乙炔官能团反应的官能团。Nu的实例包括但不限于主要经由SN2型机制反应的胺、烷氧基、芳氧基、巯基、亚氨基、羧酸酯、酰肼、氨基氧基。Nu基团的其它实例包括主要经由亲核加成反应来反应的那些官能团。L基团的实例包括氯离子、溴离子、碘离子、甲磺酸根、三氟乙基磺酸根和甲苯磺酸根和预期经历亲核置换的其它基团，以及酮、醛、硫酯、烯烃、a-|3不饱和羰基、碳酸酯和预期经历亲核试剂加成的其它亲电子基团。在本发明的另一个实施例中，A为具有介于1-10个之间的碳原子的脂肪族连接基或具有介于6-14个之间的碳原子的经取代芳基环。X为不与叠氮基反应的官能团且L为106在制备本发明的含乙炔聚合物衍生物的另一种方法中，使具有约800Da到约100,000Da的平均分子量、在一个末端带有经保护官能团或封端剂且在另一个末端带有合适离去基的PEG聚合物与乙炔阴离子接触。例示性反应方案如下所示X-PEG-L+-CsCR'+X-PEG-CsCR'其中PEG为聚(乙二醇)且X为诸如垸氧基的封端基团或如上文中所述的官能团；且R'为H、垸基、垸氧基、芳基或芳氧基或者经取代烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。在上述实例中，当与足够浓度的乙炔阴离子接触时，离去基L应充分反应以经历SN2型置换。所属领域技术人员众所周知通过乙炔阴离子实现离去基的SN2置换所需的反应条件。通常可由所属领域中已知的方法(包括但不限于，沉淀产物，必要时接着色谱)来实现粗产物的纯化。水溶性聚合物可与本发明的BPFI连接。水溶性聚合物可经由并入BPFI中的非天然编码的氨基酸或者非天然编码或天然编码的氨基酸的任何官能团或取代基，或加成到非天然编码或天然编码的氨基酸上的任何官能团或取代基连接。或者，将水溶性聚合物经由天然存在氨基酸(包括但不限于，半胱氨酸、赖氨酸或N末端残基的胺基)与并有非天然编码的氨基酸的BPFI连接。在一些情况下，本发明的BPFI包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO个非天然氨基酸，其中一个或一个以上非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物(包括但不限于，PEG和/或寡糖)连接。在一些情况下，本发明的BPFI另外包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上与水溶性聚合物连接的天然编码的氨基酸。在一些情况下，本发明的BPFI包含一个或一个以上与水溶性聚合物连接的非天然编码的氨基酸和一个或一个以上与水溶性聚合物连接的天然存在氨基酸。在一些实施例中，相对于未接合形式，本发明中所用的水溶性聚合物增强BPFI的血清半衰期。与本发明的BPFI连接的水溶性聚合物的数目(即，聚乙二醇化或糖基化程度)可经调节以提供改变(包括但不限于，增加或降低)的药理学、药物动力学或药效特征，诸如活体内半衰期。在一些实施例中，BPFI的半衰期比未经修饰多肽增加至少约10%、10720%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、5倍、10倍、50倍或至少约100倍。含有强亲核基团(即，酰肼、肼、羟胺或氨基脲)的PEG衍生物在本发明的一个实施例中，用含有与PEG主链直接连接的末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基非天然编码的氨基酸的BPFI。在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-0-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。在一些实施例中，含肼或酰肼的PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n~0-(CH2)m-X-NH-NH2其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-l，000且X视情况为可存在或不存在的羰基(C=0)。在一些实施例中，含氨基脲的PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2VNH"C(0)-MI-NH2其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000。在本发明的另一个实施例中，用含有借助于酰胺键与PEG主链连接的末端羟胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基氨基酸的BPFI。在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构R0-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-0-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。108在一些实施例中，含肼或酰肼的PEG衍生物具有以下结构-RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-X-NH-NH2,其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，n为100-1,000且X视情况为可存在或不存在的羰基(C=0)。在一些实施例中，含氨基脲的PEG衍生物具有以下结构RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000。在本发明的另一个实施例中，将包含含羰基氨基酸的BPFI用含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的分枝PEG衍生物修饰，其中分枝PEG的各链具有在10-40kDa且更优选5-20kDa的范围内的MW。在本发明的另一个实施例中，用具有分枝结构的PEG衍生物修饰包含非天然编码的氨基酸的BPFI。举例来说，在一些实施例中，肼或酰肼末端PEG衍生物将具有以下结构2CH(CH2)m-X-NH-NH2其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为IOO-I，OOO,且X视情况为可存在或不存在的羰基(C=0)。在一些实施例中，含氨基脲基的PEG衍生物将具有以下结构2CH-X-(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2其中R为简单垸基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、0、S、C(O)或不存在，m为2-10且n为100-1,000。在一些实施例中，含羟胺基的PEG衍生物将具有以下结构[RO-((^2CH20)nO-(CH2)2-C(O^NH"CH2^lJ2]2CH5C-(CH2)m'0-NHz，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10且n为100-1,000。水溶性聚合物与BPFI连接的程度和位点可调节BPFI与BPFI受体或结合搭配物的结合。在一些实施例中，如由平衡结合检定所测量，键经排列从而使BPFI以约400nM或更低的Kd、以150nM或更低的Kd且在一些情况下以100nM或更低的Kd与BPFI受体结合。用于聚合物活化以及肽接合的方法和化学描述于文献中且在所属领域中已知。用于活化聚合物的常用方法包括但不限于用溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、双环氧化物、表氯醇、二乙烯基砜、碳化二亚胺、磺酰卤、三氯三嗪等活化官能团(参看，R.F.Taylor,(1991)，ProteinImmobilisation.FundamentalandApplications,MarcelDelcker，N.Y.;S.S.Wong,(1992),Chemistry'ofProteinConjugationandCrosslinking,CRCPress,BocaRaton;G.T.Hermanson等人，(1993)，ImmobilizedAffinityLigandTechniques,AcademicPress,N.Y.;Dunn,R丄.等人编POLYMERICDRUGSANDDRUGDELIVERYSYSTEMS,ACSSymposiumSeries第469巻，AmericanChemicalSociety,Washington,D.C.1991)。可获得关于PEG的官能化和接合的若干概述和专论。例如参看，Harris,Macromo/C/zem.P/z>^.C25:325-373(1985);Scouten，M"/zo&z."五wzy附o/ogy135:30-65(1987);Wong等人，M/cra6.7fec/mo/.14:866-874(1992》Delgado等人，CW"ca/及ev/,77zem/eWcCar"'er9:249-304(1992);Zalipsky,g她CTze/w.6:150-165(1995)。活化聚合物的方法也可见于WO94/17039、美国专利第5,324，844号、WO94/18247、WO94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO卯/13540、美国专利第5,281,698号和WO93/15189中，以及使活性聚合物与包括但不限于凝血因子VIII(WO94/15625)、血红蛋白(WO94/09027)、携氧分子(美国专利第4,412,989号)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，4pp.Woc/je肌所o&c/z.11:141-52(1985))的酶之间接合的方法。所引用的所有参考文献和专利都以是引用的方式并入本文中。通过任何便利方法进行含有非天然编码的氨基酸(诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸)的BPFI的聚乙二醇化(即，加入任何水溶性聚合物)。举例来说，用经炔封端的mPEG衍生物使BPFI聚乙二醇化。简单地说，在室温下在搅拌下向含对叠氮基-L-Phe的BPFI的水溶液中加入过量的固体mPEG(5000)-O-CH2-CECH。通常，用具有接近反应进行的pH值(通常约pH4-10)的pKa的缓冲液缓冲水溶液。用于在pH7.5下聚乙二醇化的合适缓冲液的实例例如包括但不限于HEPES、磷酸盐、硼酸盐、TRIS-HC1、EPPS禾nTES。必要时连续监测且调节pH值。通常使反应持续进行约1-48小时。随后使反应产物经历疏水相互作用色谱以将聚乙二醇化BPFI变体与游离mPEG(5000)-O-CH2-C三CH和当活化未封闭PEG的分子两端从而使BPFI变体分子交联时可形成的聚乙二醇化BPFI的任何高分子量复合物分离。疏水相互作用色谱期间的条件应使得游离mPEG(5000)-O-CH2-CECH流过柱，同时在所需形式后洗提出任何交联聚乙二醇化BPFI变体复合物，其含有与一个或一个以上PEG基团接合的一个BPFI变体分子。适合条件视交联复合物相对于所需接合物的相对尺寸而变化且易于由所属领域技术人员确定。将含有所需接合物的洗出液通过超滤浓缩且通过透滤脱盐。必要时，可通过一种或一种以上所属领域技术人员已知的程序进一步纯化从疏水性色谱获得的聚乙二醇化BPFI，这些程序包括但不限于亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括但不限于)DEAESEPHAROSE);硅胶色谱；反相HPLC;凝胶过滤(使用(包括但不限于)SEPHADEXG-75);疏水相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合物色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序(包括但不限于，制备型等电聚焦)；差示溶解度(包括但不限于，硫酸铵沉淀)；或萃取。可通过与球状蛋白质标准物(Preneta,AZ,Proteinpurificationmethods,Apracticalapproach(Harris和Angal编)IRLPress1989,293-306)比较而由GPC来估算表观分子量。可通过蛋白水解降解(包括但不限于，胰蛋白酶裂解)，接着质谱分析来评估BPFI-PEG接合物的纯度。PepinskyRB.等人，/P/wmco/.&77^297(3):1059-66(2001)。可不受限制地进一步衍生化或取代与本发明的BPFI的氨基酸连接的水溶性聚合物。含叠氮基的PEG衍生物在本发明的另一个实施例中，用含有可与非天然编码的氨基酸的侧链上所存在的炔部分反应的叠氮基部分的PEG衍生物修饰BPFI。一般来说，PEG衍生物将具有在1-100kDa且在一些实施例中10-40kDa的范围内的平均分子量。在一些实施例中，叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-N3111其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。在另一实施例中，叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-CKCH2)ro-NH-C(0)-(CH2)p-N3其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10,p为2-10，且n为IOO-I，OOO(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。在本发明的另一个实施例中，将包含含炔氨基酸的BPFI用含有末端叠氮基部分的分枝PEG衍生物修饰，其中分枝PEG的各链具有在10-40kDa且优选在5-20kDa的范围内的MW。举例来说，在一些实施例中，叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3其中R为简单垸基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000，且X视情况为在各情况下可存在或不存在的O、N、S或羰基(C=0)。含炔PEG衍生物在本发明的另一个实施例中，用含有可与非天然编码的氨基酸的侧链上所存在的叠氮基部分反应的炔部分的PEG衍生物修饰BPFI。在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH线0)n-0-(CH2)nrCsCH，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。在本发明的另一个实施例中，用含有借助于酰胺键与PEG主链连接的末端叠氮基或末端炔部分的PEG衍生物修饰包含含炔非天然编码的氨基酸的BPFI。在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH2。)n"0-(CH2)m-NH-C(OHCH2)p-OCH，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000。在本发明的另一个实施例中，将包含含叠氮基氨基酸的BPFI用含有末端炔部分的分枝PEG衍生物修饰，其中分枝PEG的各链具有在10-40kDa且更优选5-20kDa的范围内的MW。举例来说，在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构环加成反应来修饰包含含叠氮基或炔基非天然115编码的氨基酸的BPFI。这种方法允许以极高选择性修饰蛋白质。XT.含5i^J的二聚体和多衆体本发明也提供BPFI组合，诸如同二聚体、异二聚体、同多聚体或异多聚体(即，三聚体、四聚体等)，其中含有一个或一个以上非天然编码的氨基酸的特定BPFI与另一BPFI、其类似物或变体或者非BPFI肽的任何其它多肽或其变体的多肽主链直接结合或经由连接基结合。由于与单体相比分子量增加，故BPFI二聚体或多聚体接合物相对于单体BPFI可显示新颖或所需特性，包括但不限于不同药理学、药物动力学、药效性质；经调节的治疗半衰期；或经调节的血浆半衰期。在一些实施例中，本发明的接合物或融合体将调节BPFI与其受体或结合搭配物的相互作用。在其它实施例中，本发明的BPFI接合物、融合体、二聚体或多聚体将充当受体拮抗剂、激动剂、超激动剂或调节剂。在一些实施例中，在含有BPFI的二聚体或多聚体中所存在的一个或一个以上BPFI包含与受体结合区或与结合搭配物结合的区域内所存在的水溶性聚合物连接的非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，经由(包括但不限于)Asn-Lys酰胺键或Cys-Cys二硫键直接连接BPFI。在一些实施例中，经连接BPFI将包含不同的非天然编码的氨基酸以促进接合、融合、二聚合或多聚合，包括但不限于第一BPFI的一个非天然编码的氨基酸中的炔与第二BPFI的第二非天然编码的氨基酸中的叠氮基将经由Huisgen[3+2]环加成而接合。或者，可将包含含酮非天然编码的氨基酸的第一BPFI和/或经连接BPFI与包含含羟胺非天然编码的氨基酸的第二BPFI接合且多肽是经由形成相应肟进行反应。或者，两个BPFI是经由连接基连接。可使用异双官能连接基或同双官能连接基来连接可具有相同或不同一级序列的两个BPFI。在一些情况下，用于将BPFI拴在一起的连接基可为双官能PEG试剂。连接基可具有多种分子量或分子长度。可使用较大或较小分子量连接基以在BPFI与连接实体之间，或BPFI与其结合搭配物之间，或连接实体与其结合搭配物之间(如果存在)提供所需空间关系或构象。还可使用具有较长或较短分子长度的连接基以在BPFI与连接实体之间，或BPFI与其结合搭配物之间，或连接实体与其结合搭配物之间(如果存在)提供所需空间或灵活性。类似地，在BPFI到达其标靶之前或之后，可利用具有特定形状或构象的连接基赋予BPFI或连接实体以特定形状或构象。这种BPFI与连接实体和结合搭配物之间的空间关系的最优化可向分子提供新颖、经调节或所需的特性。在一些实施例中，本发明提供具有哑铃结构的水溶性双官能连接基，其包括a)聚合物主链的至少第一末端上的含叠氮基、炔、肼、酰肼、羟胺或羰基的部分；和b)聚合物主链的第二末端上的至少第二官能团。第二官能团可与第一官能团相同或不同。116在一些实施例中，第二官能团不与第一官能团反应。在一些实施例中，本发明提供包含分枝分子结构的至少一个臂的水溶性化合物。举例来说，分枝分子结构可为树枝状。在一些实施例中，本发明提供通过与水溶性活性聚合物反应而形成的包含一个或一个以上GH超基因家族成员(诸如BPFI)的多聚体，其中所述聚合物具有以下结构R-(CH2CH2O)n-0-(CH2)m^X，其中n为约5到3,000，m为2-10，X可为含有叠氮基、炔、肼、酰肼、氨基氧基、羟胺、乙酰基或羰基的部分，且R为可与X相同或不同的封端基团、官能团或离去基。R可为例如选自由以下各基团组成的群组的官能团羟基、经保护羟基、烷氧基、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、1-苯并三唑基酯、N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯、1-苯并三唑基碳酸酯、縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烃以及酮。鄉量5i>FJ活性和5PP7对受体或结合搭配物的亲和性可使用标准活体外或活体内检定来测定BPFI活性。可使用多种检定来监测本发明BPFI的活性。可如Budge等人J.orVirology2004年5月；78(10);5015-5022中所述进行抗病毒活性检定，包括但不限于抗原减少检定、病毒附着抑制检定和附着后病毒感染性抑制检定。可使用如Pastey等人NatureMedicine2000;6(1):35-40中所述的活体外检定，其测试BPFI抑制合胞体形成的能力。其它检定包括细胞与细胞融合检定、竞争性ELISA检定，并且RSV的动物模型也可用于测量BPFI活性，如Pastey等人NatureMedicine2000年1月；6(1):35-40中所述。其它检定包括但不限于基于细胞的检定，其测量细胞病变效应(CPE)对感染RSV的细胞的诱导；利用RSV报告病毒的感染检定；和测试肽对A和B型RSV菌株的作用的检定。或者，可使用所属领域技术人员已知的多种其它检定来监测本发明BPFI的活性，所述检定包括但不限于测量抗病毒活性的其它检定，包括但不限于测量病毒进入或病毒融合的检定。修改这些检定以测试与另一抗病毒剂的组合疗法也已为所属领域技术人员所知。又，可利用所属领域技术人员众所周知的标准方法来检定非逆转录病毒活性。有关呼吸道合胞病毒和副流感病毒活性检定技术的讨论，例如参看Pringle等人(Pringle,C.R.等人，1985,J.MedicalVirology17:377-386)。此外，有关所述技术的一般综述，例如参看117"ZinsserMicrobiology",1988,Joklik，W.K.等人编，Appleton&Lange,Norwalk，Conn.，第19版。这些参考文献都是以全文引用的方式并入本文中。可用本发明的BPFI进行动物研究。所述研究包括但不限于毒性研究。不管使用何种方法产生BPFI类似物，都使所述类似物经历生物活性检定。一般来说，针对生物活性的测试应提供对所需结果的分析，诸如生物活性增加或降低(如与未改变BPFI相比)、不同生物活性(如与未改变BPFI相比)、受体或结合搭配物亲和力分析、BPFI本身或结合搭配物的构象或结构改变(如与未改变BPFI相比)或血清半衰期分析。有关检定方法的参考文献的上述汇编并不详尽，且所属领域技术人员将了解可用于测试所需最终结果的其它检定。A///.鄉量效力、功能性活体内半衰欺和药物动力学参数本发明的一个重要方面是通过在存在或不存在多肽与水溶性聚合物部分接合的情况下构建BPFI而获得的延长的生物半衰期。BPFI血清浓度的迅速降低已使得评估对经接合和未接合BPFI和其变体治疗的生物反应相当重要。在经静脉内投与后，本发明的接合和未接合BPFI和其变体优选也具有延长的血清半衰期，使得有可能通过例如ELISA方法或初步筛检检定来进行测量。可如本文所述进行活体内生物半衰期的测量。可在正常Sprague-Dawley雄性大鼠(N二每治疗组5只动物)中评估包含非天然编码的氨基酸的BPFI的药物动力学参数。动物将经静脉内接收每只大鼠25微克的单一剂量或经皮下接收每只大鼠50微克的单一剂量，且将根据预定时程取约5-7个血样，对于未与水溶性聚合物接合的包含非天然编码的氨基酸的BPFI来说，通常历时约6小时；且对于包含非天然编码的氨基酸且与水溶性聚合物接合的BPFI来说，通常历时约4天。可在活体外(例如，在合胞体检定、感染性检定中)或活体内(例如，在适当动物模型或人体内)评估BPFI抑制RSV进入细胞或病毒融合的能力。可通过所属领域已知的各种检定来测定根据本发明的BPFI的比活性。可通过本文所述或所参考或者所属领域技术人员已知的方法来测试根据本发明获得并纯化的BPFI突变蛋白或其片段的生物活性。ATK投药和医药组合物视情况将本发明的多肽或蛋白质(包括但不限于，包含一个或一个以上非天然氨基酸的BPFI、合成酶、蛋白质等)用于治疗用途，包括但不限于与适当医药载剂组合使用。所述组合物例如包含治疗有效量的化合物和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括但不限于生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。使调配物适应于投药模式。一般来说，投与蛋白质的方法已为所属领域中众所周知并且可用于投与本发明的多肽。根据所属领域中众所周知的方法，视情况在一个或一个以上适当的活体外和/或活体内疾病动物模型中测试包含一种或一种以上本发明多肽的治疗组合物以确认功效、组织代谢且评估剂量。具体来说，最初可通过本文中的非天然氨基酸与天然氨基酸同源物相比(包括但不限于，经修饰以包括一个或一个以上非天然氨基酸的bpfi与天然氨基酸bpfi的比较)(即，在相关检定中)的活性、稳定性或其它适合量度来确定剂量。通过通常用于引入分子以使其最终与血液或组织细胞接触的任何途径进行投药。本发明的非天然氨基酸多肽是以任何适合方式视情况与一种或一种以上医药学上可接受的载剂一起投与。可使用对患者投与本发明上下文中的这些多肽的适合方法，且尽管可使用一种以上途径投与特定组合物，但特定途径通常可提供比另一途径更即时且更有效的作用或反应。医药学上可接受的载剂由所投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法部分决定。因此，存在多种本发明的医药组合物的适合调配物。可通过多种途径投与多肽组合物，所述途径包括但不限于经口、静脉内、腹膜内、肌肉内、透皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。也可经由脂质体投与包含经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物。所属领域技人员一般已知所述投药途径和适当调配物。也可将单独或与其它合适组分组合的包含非天然氨基酸的bpfi制成欲经由吸入投与的气溶胶调配物(g卩，其可"雾化")。可将气溶胶调配物放入加压的可接受推进剂(诸如，二氯二氟甲烷、丙垸、氮气等)中。适于不经肠投药(诸如，通过关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径)的调配物包括水性和非水性等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预期受体的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。可于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中提供bpfi的调配物。不经肠投药和静脉内投药为优选的投药方法。具体来说，已用于天然氨基酸同源物治疗剂的投药途径(包括但不限于，通常用于glp-1、dp-178、pyy、epo、gh、g-csf、gm-csf、ifn、白细胞介素、抗体和/或任何其它医药传递多肽或蛋白质的那些投药途径)以及目前使用的调配物一起提供本发明多肽的优选投药途径和调配物。在本发明的上下文中，视应用而定，投与患者的剂量足以随时间在患者体内产生有119益治疗反应，或(包括但不限于)足以抑制病原体感染，或其它适当活性。剂量是由以下因素确定特定载体或调配物的功效和所用非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者的状况，以及待治疗的患者的体重或表面积。剂量大小也由特定患者中伴随特定载体、调配物等的投药的任何有害副作用的存在、性质和程度决定。在确定在治疗或预防疾病(包括但不限于，癌症、遗传性疾病、糖尿病、AIDS等)中将投与的载体或调配物的有效量时，医师评估循环血浆含量、调配物毒性、疾病发展和/或(相关时)抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。举例来说，对70千克患者投与的剂量通常在相当于目前使用的治疗性蛋白质的剂量的范围内，其是根据相关组合物活性或血清半衰期的改变加以调整。本发明的载体可通过任何已知的常规疗法来补充治疗条件，这些常规疗法包括投与抗体；投与疫苗；投与细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应调节剂等。对于投药来说，本发明的调配物是以由相关调配物的LD-50或ED-50和/或观察各种浓度的非天然氨基酸的任何副作用(包括但不限于，当关系到患者的体重和整体健康状况时)所测定的速率投与。可经由单剂量或分剂量实现投药。如果经历调配物输注的患者出现发热、发冷或肌痛，那么他/她接收适当剂量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、醋氨酚(acetaminophen)或其它疼痛/发热控制药物。在即将输注前30分钟，用阿司匹林、醋氨酚或(包括但不限于)苯海拉明(diphenhydramine)对经历输注反应(诸如发热、肌痛和发冷)的患者前驱用药。度冷丁(meperidine)用于不能对退热剂和抗组胺剂迅速反应的较为严重的发冷和肌痛。视反应的严重性而减缓或中断细胞输注。本发明的人类BPFI可直接投与哺乳动物个体。通过通常用于将BPFI引入个体的任何途径进行投药。根据本发明的实施例的BPFI组合物包括适于经口、经直肠、局部、吸入(包括但不限于，经由气溶胶)、经口腔(包括但不限于，舌下)、阴道、不经肠(包括但不限于，皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内)、局部(即，皮肤与粘膜表面，包括气管表面)和透皮投与的那些BPFI组合物，但在任何给定情况下最适合的途径将视所治疗的病状的性质和严重性而定。投药可为局部或全身性投药。可于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中提供化合物的调配物。可将本发明的BPFI制备为单位剂量可注射形式(包括但不限于溶液、悬浮液或乳液)与医药学上可接受的载剂的混合物。也可通过连续输注(使用(包括但不限于)微型泵，诸如渗透泵)、单次团注或缓释储槽调配物来投与本发明的BPFI。适于投药的调配物包括水性和非水性溶液(等张无菌溶液)，其可含有抗氧化剂、120缓冲剂、抑菌剂和使调配物等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。可由先前所述类型的无菌粉末、颗粒和片剂来制备溶液和悬浮液。本发明的医药组合物可包含医药学上可接受的载剂。医药学上可接受的载剂由所投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法部分决定。因此，存在多种本发明的医药组合物的适当调配物(包括可选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)(例如参看，iew/"gfow'51尸/wfrmaceMrica/Sc/e"ces,第17版1985)。适合载剂包括缓冲剂，其含有磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约IO个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA;二价金属离子，诸如锌、钴或铜；糖醇，诸如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子型表面活性剂，诸如TweenTM、PluronicsTM或PEG。还可通过持续释放系统或作为持续释放系统的部分来投与本发明的BPFI，包括与水溶性聚合物(诸如PEG)连接的那些BPFI。持续释放组合物包括(包括但不限于)成形物品形式(包括但不限于，薄膜或微胶囊)的半透性聚合物基质。持续释放基质包括生物可相容材料，诸如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(Langer等人，JMato:i化，15:267-277(1981);Langer,C/ze附.rec/z.,12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上文)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)、聚乳酸(polylactide;polylacticacid)(美国专利第3,773,919号；EP58,481)、聚乙醇酸(乙醇酸的聚合物)、聚乳酸-共-乙醇酸(乳酸与乙醇酸的共聚物)、聚酑、L-谷氨酸与，乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人，5/opo/y附ers，22，547-556(1983))、聚(原酸)酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、聚核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯垸酮和硅酮。持续释放组合物也包括脂质体捕获的化合物。含有化合物的脂质体是由本身已知的方法来制备DE3,218,121;Eppstein等人，户亂淑/.^cadC/.""82:3688-3692(1985);Hwang等人，Prac.淑/.Jca^HS.A,77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;EP88,046;EP143,949;EP142,641;日本专利申请案83-118008;美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；和EP102,324。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。脂质体捕获的BPFI可由描述于例如以下文献中的方法来制备DE3,218,121;Eppstein等人，M/",Sc/.C/.S.A,82:3688-3692(1985);Hwang等人，iVoc.爿c^/.C/.S.A,77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;EP88,046;EP143,949;EP142,641;日本专利申请案83-118008;美国专利第4，485，045号和第4,544,545号；和EP102,324中。脂质体的组成和尺寸为众所周知的或能够由所属领域技术人员根据经验容易地确定。脂质体的一些实例描述于例如ParkJW等人，iVoc.A^f/.Xcy^.92:1327-1331(1995);LasicD和PapahadjopoulosD(编)MEDICALAPPLICATIONSOFLIPOSOMES(1998);DrummondDC等人，Liposomaldrugdeliverysystemsforcancertherapy,TeicherB(编)CANCERDRUGDiscoveryandDevelopment(2002);ParkJW等人，C//".Ca"cer8:1172-1181(2002);NielsenUB等人，5/op/z>^.爿"a1591(1-3):109-118(2002);MamotC等人，Ca"c"ie;y.63:3154-3161(2003)。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。在本发明的上下文中，对患者投与的剂量应足以随时间在个体体内引起有益反应。通常，每剂不经肠投与的本发明的BPFI的总医药有效量在每天每千克患者体重约0.01微克到约100微克或约0.05毫克到约l毫克的范围内，但此是由治疗判断决定。给药频率也由治疗判断决定，且可比批准用于人类的市售BPFI产品的频率高或低。通常，可通过上述任何投药途径投与本发明的聚乙二醇化BPFI。本发剪的5P/7的治疗滞途本发明的BPFI可用于治疗多种病症。投与本发明的BPFI产品会在人体内产生由其它BPFI制剂所表现的任何活性。含有BPFI产品的医药组合物可以有效浓度调配以通过各种方式投与人类患者，其经历可受BPFI激动剂或拮抗剂影响的单独存在或作为病状或疾病的部分存在的病症。BPFI产品的平均量可变化且尤其应根据执业医师的推荐和处方。BPFI的确切量优选受以下因素影响诸如所治疗的病状的确切类型、所治疗的患者的情况以及组合物中的其它成分。本发明也提供投与治疗有效量的另一种活性剂。所属领域技术人员可根据利用BPFI的疗法容易地确定欲提供的量。BPFI的治疗用途包括但不限于治疗RSV感染、抑制RSV进入、抑制其它包膜病毒(包括但不限于，HIV)的进入。本发明的BPFI优选展现抗病毒活性。BPFI可用于预防RSV。因此，可将肽用作人类和非人类病毒和逆转录病毒(尤其HIV)传播到未感染细胞的抑制剂。传播受本发明的肽抑制的人类逆转录病毒包括但不限于HIV-1和HIV-2的所有品系以及人类T淋巴细胞病毒(HTLV-I和II)。传播受本发明的肽抑制的非人类逆转录病毒包括但不限于牛白血病病毒；猫肉瘤病毒和白血病病毒；猴免疫缺陷病毒、肉瘤病毒和白血病病毒；以及羊进行性肺炎病毒。传播受本发明的肽抑制的非逆转录病毒包括但不限于人类呼吸道合胞病毒。本发明另外涵盖使用肽与至少一种其它治疗剂(包括但不限于，抗病毒剂)的组合疗法来治疗上述非逆转录病毒。肽的另一实例为T-20(DP-178),其为与HIV-1la!跨膜蛋白(TNI)gp41的氨基酸638到673(即，gp41的细胞外部分的羧基末端螺旋区段)相对应的肽。gp41的细胞外部分具有另一a螺旋区，其为所提出的拉链区域的氨基末端，即DP-107。DP-107通过抑制病毒融合来展现有效的抗病毒活性。其为与HIV-1l^跨膜gp41蛋白的残基558到595对应的具有38个氨基酸的肽。用DP-107进行的研究已证实二者在活体外研究和动物体内都无毒。美国专利第5,656,480号(以引用的方式并入本文中)描述DP-107和其抗病毒活性。T-20通过充当病毒融合抑制剂来抑制HIV进入细胞中。fflV的融合过程已经良好表征。HIV经由gpl20与CD4受体结合，并且在与其受体结合后，gpl20经历一系列构象改变从而使其与其辅受体CCR5或CXCR4结合。在与其受体和辅受体结合后，gpl20使gp41暴露以起始融合过程。gp41具有两个区，称为七肽重复1和2(HR1和2)。标识为HR1的细胞外域为a螺旋区，其为所提出的拉链区域的氨基末端。gp41的HRl与HR2—起形成发夹。所形成的结构为6螺旋束，其将HIV包膜放在细胞膜邻近处，引起两个膜之间的融合。T-20通过结合gp41跨膜糖蛋白的第一个七肽重复(HR1)来防止病毒融合所需的构象改变。因此，6螺旋束的形成因T-20与gp41的HR1区结合而被阻断。HlVgp41蛋白的DP107和DP178区域(即，HR1和HR2区域)彼此非共价复合并且其相互作用为病毒正常感染性所需。破坏DP107与DP178之间相互作用和/或类DP107肽与类DP178肽之间相互作用的化合物具有抗融合作用，包括抗病毒作用。DP-178充当HIV-1介导的CD-4+细胞-细胞融合(即，合胞体形成)和无细胞病毒感染CD-4+细胞的有效抑制剂。所述抗逆转录病毒活性包括但不限于抑制HIV传播到未感染的CD-4+细胞中。DP-178在低浓度下起作用并且经证实其在活体外研究中和动物体内无毒。已描述DP-178—HIV-1和HIV-2的相应区内的氨基酸保守性。于美国专利第5,464,933号和第6,133,418号以及美国专利第6,750,008号和第6,824,783号中(所有专利都是以引用的方式并入本文中)描述DP-178肽的潜在用途，其是用于抑制与HIV传播有关的融合事件。已对DP178和DP-107的部分、同源物和类似物以及DP178/DP-107、类DP178/类DP107或HR1/HR2相互作用调节剂进行研究，其展现抗病毒活性和/或展现抗膜融合能力或调节涉及除HIV-1之外的逆转录病毒和非逆转录病毒中巻曲螺旋肽结构的细胞内过123程的能力。所述研究中的病毒包括猴免疫缺陷病毒(美国专利第6,017,536号)、呼吸道合胞病毒(美国专利第6,228,983号、第6,440,656号、第6,479,055号、第6,623,741号)、艾伯斯坦-巴尔病毒(美国专利第6,093,794号、第6,518,013号)、副流感病毒(美国专利第6,333,395号)、流感病毒(美国专利第6,068,973号、第6,060,065号)和麻疹病毒(美国专利第6,013,263号)。所有专利都是以引用的方式并入本文中。市售形式的DP-178为Fuzeon⑧(恩夫韦地，RocheLaboratoriesInc.和Trimeris,Inc.)。Fuzeor^具有乙酰化N末端和作为C末端的甲酰胺，并且以以下一级氨基酸序列描述CH3CO-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2。将其与其它抗病毒剂组合用于尽管正在进行抗逆转录病毒疗法但仍展现HIV-1复制的HIV-1患者。美国专利第5,464,933号和第6,824,783号(以引用的方式并入本文中)描述DP-178、DP-178片段、类似物和同源物，包括但不限于具有氨基和羧基末端截断、取代、插入、缺失、添加或大分子载体基团的分子；以及在氨基和/或羧基末端处存在化学基团(诸如疏水基团)的DP-178分子。其它变体包括但不限于美国专利第6,830,893号中所述的那些变体和美国专利第6,861,059号中所揭示的DP-178的衍生物。一组T-20杂交多肽描述于美国专利第6,656,906号、第6,562,787号、第6,348,568号和第6,258,782号中，并且DP-178-毒素融合物描述于美国专利第6,627,197号中。HAART(高活性抗逆转录病毒疗法)为HIV的标准疗法，其组合来自数类抗逆转录病毒剂的药物以降低病毒负荷。美国专利第6,861,059号(其是以引用的方式并入本文中)揭示使用DP-178或DP-107或其衍生物与至少一种其它抗病毒治疗剂治疗HIV-1感染或抑制HIV-1复制的方法，所述抗病毒治疗剂诸如逆转录酶抑制剂(例如，AZT、ddl、ddC、ddA、d4T、3TC或者其它双脱氧核苷酸或双脱氧氟核苷)或HIV-1蛋白酶抑制剂(例如，茚地那韦、利托那韦)。其它抗病毒剂包括细胞因子(例如，rIFNa、rIFN卩、rIFNY)、病毒mRNA帽抑制剂(例如，利巴韦林)、HIV蛋白酶抑制剂(例如，ABT-538和MK-639)、具有抗HIV活性的作为脂质结合分子的两性霉素B和作为糖蛋白加工抑制剂的栗精胺。其它抗病毒剂(包括但不限于，逆转录酶抑制剂、整合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、细胞因子拮抗剂和趋化因子受体调节剂)与T-20的潜在组合疗法描述于多种参考文献中，包括但不限于美国专利第6,855,724号、第6,844,340号、第6,841,558号、第6,833,457号、第6,825,210号、第6,811,780号、第6,809,109号、第6,806,265号、第6,768,007号、第6,750,230号、第6,706,706号、第6,696,494号、第6,673,821号、第6,673,791号、第6,667,314号、第6,642,237号、第6,599,911号、第6,596,729号、第6,593,346号、第6,589,962号、第6,586,430号、第6,541,515号、第6,538,002号、124第6,531,484号、第6,511,994号、第6,506,777号、第6,500,844号、第6,498,161号、第6,472,410号、第6,432,981号、第6,410,726号、第6,399,619号、第6,395,743号、第6,358,979号、第6,265,434号、第6,248,755号、第6,245,806号和第6,172,110号。DP-178的潜在传递系统包括但不限于美国专利第6,844,324号和第6,706,892号中所述的那些传递系统。此外，在包涵体中产生T-20的方法描述于美国专利第6，858，410号中。还发现T20/DP178、T21/DP107和其片段与N-甲酰基肽受体(FPR成员)相互作用。T-20活化人类噬菌细胞中所存在的N-甲酰基肽受体(Su等人(1999)Blood93(11):3885-3892))并且为单核细胞和嗜中性粒细胞的趋化因子和活化剂(参看美国专利第6,830,893号)。FPR类受体为G蛋白偶合STM受体，其结合趋化因子fMLP(N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸)并且涉及在单核细胞趋化性和宿主对病原体的免疫反应的诱导中。原型FPR类受体FPR以高亲和力结合fMLP并且由低浓度fMLP活化。fMLP结合FPR会诱导一系列G蛋白介导的信号转导事件，从而引起噬菌细胞附着、趋化性、氧中间物释放、增强的吞噬作用和细菌杀伤作用，以及MAP激酶活化和基因转录。(Krump等人，JBiolChem272:937(1997);Prossnitz等人，PharmacolTher74:73(1997);Murphy,A匪.Rev.Immuno.12:593(199化禾口Murphy,TheN國formylp印tidechemotacticreceptors,Chemoattractantligandsandtheirreceptors.CRCPress,BocaRaton,第269页(1996))。另一FPR类受体为FPR的高度同源的变体，称为FPRLl(也称为FPRH2和LXA4R)。FPRLl最初是作为孤儿受体克隆(Murphy等人，J.Biol.Chem.,267:7637-7643(1992);Ye等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.,184:582-589(1992);Bao等人，Genomics,13:437-440(1992);Gao,J.L.和P.M.Murphy,J.Biol.Chem.,268:25395-25401(1993);和Nomura等人，Int.Immunol.,5:1239-1249(1993))，但随后发现其回应高浓度fMLP而介导Ca"活动。(Ye等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，184:582-589(1992);禾QGao,J.L.和P.M.Murphy,J.Biol.Chem.,268:25395-25401(1993))。实例提供以下实例以说明但并不限制所主张的本发明。实例1本实例描述用于选择将非天然编码的氨基酸并入BPFI的优选位点的多组潜在标准中的数种。设计出最佳的来源于HR-C的肽候选物。评估诸如肽表达、稳定性、螺旋倾向和抗病毒活性的标准，以鉴别最佳的RSV肽融合抑制剂。在基于计算机进行氨基酸125序列分析后，将就螺旋形成而言最佳的肽克隆到表达载体中。在RSVF蛋白的HR-C区(474位到523位)内以生物合成方式产生具有不同长度的肽。使用已知的有利于螺旋的策略(包括螺旋末端封端、色氨酸笼蔽和盐桥形成)对一部分肽进行工程改造以使其具有增强的螺旋倾向。商业上合成带有特定限制位点的每一单肽的DNA编码区以迅速克隆到表达载体中。检定以生物合成方式产生的肽的生物活性。通过CD(圆二色性)分析肽以测定何种肽呈现最佳螺旋倾向。利用定点放置与结构机制的组合来研发HR-C类似物肽，其在共价连接聚乙二醇侧链后仍保持RSV抑制效力。还研发出介于HR-C类似物与源自RhoA的阴离子肽之间的双官能异二聚肽。使用HR-C结构数据(Zhao等人ProcNatlAcadSciUSA.2000年12月19号；97(26):14172-7)，根据溶剂暴露和暴露的螺旋面来选择一种或一种以上肽中的PEG连接位置。也在所选肽编码序列的各位置处，利用琥珀密码子取代来构建突变体(将产生多达50种不同的突变体)，从而提供将pAcF并入肽中各位置处的可能性。通过SDS-PAGE评估琥珀密码子取代突变体的抑制效率。评估各位置的抑制效率。以生物合成方式产生经pAcF(对乙酰基苯丙氨酸)取代的肽并使用30kDa的PEG对pAcF进行聚乙二醇化。在基于细胞的检定中测试RSV肽类似物的抗病毒活性。为进一步评估抗病毒活性和合胞体形成的抑制，使用包括但不限于使用原始人类呼吸道上皮细胞的细胞-细胞融合检定的检定。进行候选肽与RSVF蛋白的结合。对经pAcF取代和聚乙二醇化的肽进行圆二色性(CD)和差示扫描量热法(DSC)以测定其螺旋倾向和稳定性。设计异二聚或多聚肽分子，其是由HR-C来源的肽和源自GTPaseRhoA序列的可多聚合或与HR-C类似物肽连接的小阴离子肽(包括但不限于15聚体到19聚体)构成。使用最佳HR-C候选物和GTPaseRhoA来源的肽产生双特异性肽。在抗病毒检定中，测试以合成方式产生的具有可变长度的5个阴离子RhoA肽。通过连接非天然氨基酸pAcF的连接基将一个或一个以上RhoA来源的肽与一个或一个以上HR-C类似物肽连接。改变两个肽之间的键以获得最具生物活性的分子。此键(可改变连接基的长度)导致形成双特异性肽，测试所述肽的抗病毒活性，包括但不限于阻断RSV与特定细胞受体连接以及抑制病毒与细胞膜融合的能力。由于利用两种单独的抑制机制，故这类双特异性肽构筑体可提供增加的抗病毒效力。制备双特异性肽并在抗病毒和细胞融合检定中进行测试。图13为BPFI对RSV的潜在作用机制的示意图。实例2本实例详细说明大肠杆菌中包括非天然编码的氨基酸的BPFI的表达。使用包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的经引入的翻译系统来表达含有非天然编码的氨基酸的BPFI。O-RS优先利用非天然编码的氨基酸使O-tRNA氨酰基化。翻译系统转而回应编码的选择密码子将非天然编码的氨基酸插入BPFI中。表2:O-RS和O-tRNA序列SEQIDNO:2詹氏甲烷球蒽mtRNAS^tRNASEQIDNO:3/fl^DOl最优化的號莉湖劍/iiN^tRNASEQIDNO:4HZJ25J;最优化的移码湖制,iA^涯ASEQIDNO:5历于并入对叠氮基-Z-苯两氨酸的氨翁基^A^合成藤RSSEQIDNO:6用于并入对苯甲敏基丄-苯两氨酸的氨雜基^A^合成藤p匿5戸及柳RSSEQIDNO:7历于并入炔两基-苯两氨酸的氨敏基^A^合成酶炔两基-尸破SRSSEQIDNO:8用于并入炔丙基-苯两氨酸的氨激基fiA^合成藤欢两基-尸/e及SRSSEQIDNO:9历于并入炔两基-苯两氨酸的氨激基/iA^合成藤炔丙基-P/ie及SRSSEQIDNO:IO用于并入对叠氮基-苯两氨餒的氨敏基/iA^合成藤RSSEQIDNO:11用于并入对叠氮基-苯两氨酸的氨敏基^A^合成藤RSSEQIDNO:12鮮并入对叠氮基-苯臓酸的氨激基麵合成藤RSSEQIDNO:13用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的氨敏基fiM4合成藤RSSEQIDNO:14用于并入对乙激基-苯两氨酸的氨離基,ii^合成藤CL『7)RSSEQIDNO:15厉于并入对乙離基-苯丙氨酸的氨敏基fiA^合成酶CL『5)RSSEQIDNO:16用于并入对乙敏基-苯丙氨酸的氮麼基^A^合成藤o:附》RSSEQIDNO:17历于并入对叠氮基-苯两氮麼的氨衝基,iA^合成藤64^^i^-J)RSSEQIDNO:18历于并入对叠氮基-苯丙氨麼的氨敏基/iA^合成藤C4zP^iS-6)RS用含有经修饰BPFI基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(对所需非天然编码的氨基酸具特异性)的质粒转化大肠杆菌允许将非天然编码的氨基酸位点特异性地并入BPFI中。在37"下在含有介于0.01-100mM之间的特定非天然编码的氨基酸的培养基中生长的经转化大肠杆菌以高保真度和高效率表达经修饰BPFI。实例3本实例详细说明含羰基氨基酸的引入和与含氨基氧基PEG的后续反应。127本实例证实一种产生并有含酮非天然编码的氨基酸的BPFI的方法，所述氨基酸随后与约5000MW的含氨基氧基PEG反应。举例来说，单独用具有以下结构的非天然编码的氨基酸取代BPFI中的各个残基用于将对乙酰基苯丙氨酸位点特异性地并入BPFI中的序列为描述于上文实例2中的SEQIDN0:2(muttRNA，詹氏甲烷球菌mtRNA^A)和14、15或16(TyrRSLWl、5或6)。修饰后，使包含含羰基氨基酸的BPFI变体与以下形式的含氨基氧基PEG衍生物反应R-PEG(N)-0-(CH2)n-0-NH2其中R为甲基，n为3且N为约5,000MW。使以10mg/mL溶解于25mMMES(SigmaChemical,St.Louis,MO)(pH6.0)、25mMHepes(SigmaChemical,St.Louis,MO)(pH7.0)或lOmM乙酸钠(SigmaChemical,St.Louis，MO)(pH4.5)中的含对乙酰基苯丙氨酸的经纯化BPFI与10到100倍过量的含氨基氧基PEG反应，且随后在室温下搅拌10-16小时(Jencks,W.爿m,CAe附.Soc.1959,81,第475页)。接着将PEG-BPFI稀释于适当缓冲液中以供立即纯化和分析。实例4经由酰胺键与由连接到PEG的羟胺基组成的PEG接合。使用实例3中所述的程序将具有以下结构的PEG试剂与含酮非天然编码的氨基酸偶R-PEG(N)-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)n-0-NH2128其中R-甲基，n=4且N为约20,000MW。反应、纯化和分析条件如实例3中所述。实例5本实例详细说明将两个截然不同的非天然编码的氨基酸引入BPFI中。本实例证实一种产生并有非天然编码的氨基酸的BPFI的方法，所述氨基酸在两个位置处包含酮官能团，其中乂*表示非天然编码的氨基酸。如实例1和2所述制备BPFI，但将选择密码子引入核酸内的两个不同位点处。实例6本实例详细说明使BPFI与含酰肼PEG接合且随后在原位还原。根据实例2和3中所述的程序制备并有含羰基氨基酸的BPFI。修饰后，将具有以下结构的含酰肼PEG与BPFI接合R-PEG(N)-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)n-X-NH-NH2其中11=甲基，n=2iN=10，000MW，并且X为羰基(C=0)。使以0.1-10mg/mL溶解于25mMMES(SigmaChemical,St.Louis，MO)(pH6.0)、25mMHepes(SigmaChemical,St.Louis,MO)(pH7.0)或10mM乙酸钠(SigmaChemical,St.Louis,MO)(pH4.5)中的含对乙酰基苯丙氨酸的经纯化BPFI与1到100倍过量的含酰肼PEG反应，且通过加入溶解于H20中的1MNaCNBH3储液(SigmaChemical,St.Louis,MO)直到10-50mM的最终浓度来将相应腙原位还原。反应是在黑暗中于4'C到室温下进行18-24小时。通过加入约pH7.6的1MTris(SigmaChemical,St.Louis,MO)直到最终Tris浓度为50mM来终止反应或将反应稀释于适当缓冲液中以立即纯化实例7本实例详细说明将含炔氨基酸引入BPFI中和用mPEG-叠氮化物进行衍生化。用以下非天然编码的氨基酸各自取代BPFI的任一残基<formula>formulaseeoriginaldocumentpage129</formula>用于将对炔丙基-酪氨酸位点特异性地并入BPFI中的序列为描述于上文实例2中的SEQIDNO:2(muttRNA,詹氏甲烷球菌miKi、AcUA)和7、8或9。在大肠杆菌中表达含有炔丙基酪氨酸的BPFI并使用实例3中所述的条件加以纯化。将含有炔丙基-酪氨酸的经纯化BPFI以介于0.1-10mg/mL之间的浓度溶解于PB缓冲液UOOmM磷酸钠，0.15MNaCl，pH=8)中且将10到1000倍过量的含叠氮基PEG加到反应混合物中。随后将催化量的CuS04和铜丝加到反应混合物中。培育混合物(包括但不限于，在室温或37'C下约4小时或者在4'C下整夜)后，加入H20并使混合物滤过透析膜。可通过(包括但不限于)实例3中所述的类似程序分析样本的加成。在本实例中，PEG将具有以下结构R-PEG(N)-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)n-N3其中R为甲基，n为4且N为10,000MW。实例8本实例详细说明用炔丙基酪氨酸取代BPFI中的大疏水氨基酸。如实例7中所述，用以下非天然编码的氨基酸取代BPFI内所存在的Phe、Trp或Tyr残基修饰后，将PEG与包含含炔氨基酸的BPFI变体连接。PEG将具有以下结构Me-PBG(N)-0-(CH2)2-N3且偶合程序将遵循实例7中的那些程序。这会产生BPFI变体，其包含大致与一个天然存在的大疏水氨基酸等排的非天然编码的氨基酸且在多肽内的不同位点处经PEG衍生物修饰。实例9本实例详细说明由一个或一个以上PEG连接基分隔的BPFI同二聚体、异二聚体、同多聚体或异多聚体的产生。使实例7中所产生的含炔BPFI变体与以下形式的双官能PEG衍生物反应N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-0-PEG(N)-0-(CH2)2-NH-C(0)-(CH2)n-N3其中n为4且EPG具有约5,000的平均MW，以产生两个BPFI分子由PEG物理分隔的相应BPFI同二聚体。可以类似方式将BPFI与一个或一个以上其它多肽偶合以形成异二聚体、同多聚体或异多聚体。将如实例7和3中所述进行偶合、纯化和分析。实例10本实例详细说明糖部分与BPFI的偶合。如实例3中所述，用以下非天然编码的氨基酸取代BPFI的一个残基。修饰后，使包含含拨基氨基酸的BPFI变体与N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的P-连接氨基氧基类似物反应。将BPFI变体(10mg/mL)与氨基氧基糖(21mM)混合于100mM乙酸钠缓冲液水溶液(pH5.5)中并在37。C下培育7到26小时。通过在周围温度下将接合糖的BPFI(5mg/mL)与UDP-半乳糖(16mM)和(3-l,4-半乳糖基转移酶(0.4单位/毫升)在150mMHEPES缓冲液(pH7.4)中培育48小时，来将第二种糖与第一种糖酶促偶合(Schanbacher等人，J所o/.C/亂1970，245,5057-5061)。实例11本实例详细说明聚乙二醇化BPFI拮抗剂的产生。如实例3中所述，用以下非天然编码的氨基酸取代BPFI的残基。131修饰后，使包含含羰基氨基酸的BPFI变体与以下形式的含氨基氧基PEG衍生物反应R-PEG(N)-0-(CH2)n-0-NH2其中R为甲基，n为4且N为20,000MW，以产生包含非天然编码的氨基酸且在多肽内的单一位点处经PEG衍生物修饰的BPFI拮抗剂。将如实例3中所述进行偶合、纯化和分析。实例12直接连接BPFI分子的BPFI同二聚体、异二聚体、同多聚体或异多聚体的产生可将包含含炔氨基酸的BPFI变体与包含含叠氮基氨基酸的另一种BPFI变体直接偶合，其各自包含非天然编码的氨基酸。可以类似方式将BPFI与一个或一个以上其它多肽偶合以形成异二聚体、同多聚体或异多聚体。将如实例3、6和7中所述进行偶合、纯化和分析。实例13PEG-OH+Br-(CH2)n-OCR，PEG"0-(CH2)n-OCR，AB使聚烷撑二醇(P-OH)与垸基卤化物(A)反应以形成醚(B)。在这些化合物中，n为1到9的整数且R'可为直链或支链、饱和或不饱和CI到C20烷基或杂烷基。R'也可为C3到C7饱和或不饱和环状垸基或环状杂垸基、经取代或未经取代的芳基或杂芳基或经取代或未经取代的垸芳基(所述垸基为CI到C20饱和或不饱和烷基)或杂烷芳基。通常，PEG-OH为具有800到40,000道尔顿(Da)的分子量的聚乙二醇(PEG)或单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。实例14132mPEG-OH+Br-CH2-C^CHmPEG-0-CH2-OCH用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理具有20，000Da的分子量的mPEG-OH(mPEG-OH20kDa;2.0g，0.1mmol，S皿bio)。随后将溶解于二甲苯(0.56mL，5mmol，50equiv，Aldrich)中的80重量％溶液形式的炔丙基溴溶液和催化量的KI加到溶液中，且将所得混合物加热到回流达2小时。随后加入水(1mL)且在真空下去除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)且将有机层分离，用无水Na2S04干燥，且将体积缩减到约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴加到乙醚(150mL)中。将所得沉淀物收集，用数份冷乙醚洗涤且干燥，得到炔丙基-O-PEG。实例15mPEG-OH+Br<CH2)3-C=CH^mPEG-0-(CH2)3-OCH用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理具有20,000Da的分子量的mPEG-OH(mPEG-OH20kDa;2.0g，0.1mmol，Sunbio)。随后将50当量的5-溴-l-戊炔(0.53mL，5mmol，Aldrich)和催化量的KI加到混合物中。将所得混合物加热到回流达16小时。随后加入水(1mL)且在真空下去除溶剂。向残余物中加入CH2C12(25mL)且将有机层分离，用无水Na2S04干燥，且将体积縮减到约2mL。将此CH2Cb溶液逐滴加到乙醚(150mL)中。将所得沉淀物收集，用数份冷乙醚洗涤且干燥，得到相应炔。可将5-氯-l-戊炔用于类似反应中。实例16(j)w-HOCH2C6H40H+NaOH+Br-CH2-C=CH^w-HOCH2C6H40-CH2-feCH(2)w-HOCH2C6H40-CH2-H+MsCl+,)3+ot-MsOCH2C6H40-CH2-CsCH(3)tw-MsOCH2C6H40"CH2-CsCH+LiBr+w-Br-CH2C6H40-CH2-CsCH(4)mPEG-OH+OT-Br-CHaCeHUO-CHb-OCH^mPEG-0-CH2-C6H40-CH2-CsCH首先向3-羟基苯甲醇(2.4g，20mmol)于THF(50mL)和水(2.5mL)中的溶液中加入粉末状氢氧化钠(1.5g，37.5mmol)且随后加入溶解于二甲苯(3.36mL，30mmol)中的80重量％溶液形式的炔丙基溴溶液。将反应混合物在回流下加热6小时。向混合物133中加入10%柠檬酸(2.5mL)且在真空下去除溶剂。将残余物用乙酸乙酯(3x15mL)萃取且将合并的有机层用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤，用MgS04干燥且浓縮，得到3-炔丙基氧基苯甲醇。在0。C下将甲烷磺酰氯(2.5g，15.7mmo1)和三乙胺(2.8mL,20mmol)加到化合物3(2.0g，ll.Ommol)于CH2C12中的溶液中，且将反应放在冰箱中达16小时。常用处理得到呈浅黄色油状物的甲磺酸酯。将所述油状物(2.4g，9.2mmo1)溶解于THF(20mL)中且加入LiBr(2.0g，23.0mmo1)。将反应混合物加热到回流达1小时且随后冷却到室温。向混合物中加入水(2.5mL)且在真空下去除溶剂。将残余物用乙酸乙酯(3x15mL)萃取且将合并的有机层用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤，用无水Na2S04干燥且浓縮，得到所需溴化物。将mPEG-OH20kDa(1.0g，0.05mmol，Sunbio)溶解于THF(20mL)中且将溶液在冰浴中冷却。在强烈搅拌下，经一段数分钟的时间加入NaH(6mg,0.25mmo1)，接着加入上文所获得的溴化物(2.55g，11.4mmo1)和催化量的KI。移除冷却浴且将所得混合物加热到回流达12小时。将水(1.0mL)加到混合物中且在真空下去除溶剂。向残余物中加入CH2C12(25mL)且将有机层分离，用无水Na2S04干燥，且将体积縮减到约2mL。逐滴加到乙醚溶液(150mL)中产生白色沉淀物，将其收集得到PEG衍生物。实例17mPEG-NH2+X-C(0)<CH2)n-CsCR，^mPEG-NH-C(0)-(CH2)n-C=CR，如上所示，也可通过将含有末端官能团的聚(乙二醇)聚合物与含有炔官能团的反应性分子偶合来获得含末端炔的聚(乙二醇)聚合物。n介于1与10之间。R'可为H或Cl到C4的小垸基。实例18(i)H02C-(CH2)2-OCH+NHS+DCC>>NHSO-C(0)-(CH2)2-C=CH(2)mPEG-NH2+NHSO-C(0)-(CH2)2-CsCH+mPEG-NH-C(0)-(CH2)rC^CH将4-戊炔酸(2.943g，3.0mmol)溶解于CH2C12(25mL)中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(3.80g，3.3mmol)和DCC(4.66g，3.0mmol)且在室温下将溶液搅拌整夜。所得粗NHS酯7不经进一步纯化即用于以下反应中。将具有5,000Da的分子量的mPEG-NH2(mPEG-NH2，1g，Sunbio)溶解于THF(50mL)中且将混合物冷却到4°C。在强烈搅拌下逐份加入NHS酯7(400mg，0.4mmol)。将混合物搅拌3小时，同时升温到室温。随后加入水(2mL)且在真空下去除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(50mL)且将有机层分离，用无水Na2S04干燥，且将体积縮减到约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴加到乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物并在真空中干燥。实例19本实例表示聚(乙二醇)的甲垸磺酰基酯(其也可称作聚(乙二醇)甲烷磺酸酯或聚(乙二醇)甲磺酸酯)的制备。可通过类似程序来制备相应的甲苯磺酸酯和卤化物。mPEG-OH+CH3S02C1+N脚3+mPEG-0-S02CH3+mPEG-N3在氮气下将150mL甲苯中的mPEG-OH(MW=3,400，25g，lOmmol)共沸蒸馏2小时且将溶液冷却到室温。将40mL无水CH2Cl2和2.1mL无水三乙胺(15mmol)加到溶液中。将溶液在冰浴中冷却且逐滴加入1.2mL经蒸馏的甲烷磺酰氯(15mmol)。在氮气下在室温下将溶液搅拌整夜，且通过加入2mL无水乙醇来中止反应。在真空下蒸发混合物以去除溶剂(主要是除甲苯之外的溶剂)，过滤，再次真空浓縮且随后沉淀于100mL乙醚中。用数份冷乙醚洗涤滤液且在真空下干燥得到甲磺酸酯。将甲磺酸酯(20g，8mmo1)溶解于75mlTHF中且将溶液冷却到4'C。向冷溶液中加入叠氮化钠(1.56g，24mmol)。在氮气下将反应加热到回流达2小时。随后蒸发溶剂且用CH2Cb(50mL)稀释残余物。将有机馏分用NaCl溶液洗涤且用无水MgS04干燥。将体积縮减到20ml且通过加入到150ml冷无水乙醚中来沉淀产物。实例20(i)NrC6H4-C02H+N3-C6H4CH2OH(2)N3-C6H4CH2OH+Br-CH2-C6H4-N3mPEG-OH+Br-CH2-C6H4-N3+mPEG-OCH2-C6H4-N3可使用美国专利第5,998,595号中所述的方法来制备4-叠氮基苯甲醇，所述文献是以引用的方式并入本文中。在0'C下将甲烷磺酰氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL,20mmol)加到4-叠氮基苯甲醇U.75g，11.0mmol)于CH2C12中的溶液中且将反应放135在冰箱中达16小时。常用处理得到呈浅黄色油状物的甲磺酸酯。将所述油状物(9.2mmol)溶解于THF(20mL)中且加入LiBr(2.0g，23.0mmol)。将反应混合物加热到回流达1小时且随后冷却到室温。向混合物中加入水(2.5mL)且在真空下去除溶剂。将残余物用乙酸乙酯(3x15mL)萃取且将合并的有机层用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤，用无水Na2S04干燥且浓縮，得到所需溴化物。用THF(35mL)中的NaH(12mg,0.5mmol)处理mPEG-OH20kDa(2.0g，0.1mmol，Sunbio)且向混合物中加入溴化物(3.32g，15mmol)和催化量的KI。将所得混合物加热到回流达12小时。将水(1.0mL)加到混合物中且在真空下去除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)且将有机层分离，用无水Na2S04干燥，且将体积縮减到约2mL。逐滴加到乙醚溶液(150mL)中产生沉淀物，将其收集得到mPEG-0-CH2-C6H4-N3。实例21NH2-PEG-0-CH2CH2C02H+N3-CH2CH2C02-NHS>N3-CH2CH2-C(0)NH-PEG-0-CH2CH2C02H将NH2-PEG-0-CH2CH2C02H(MW3,400Da，2.0g)溶解于NaHC03饱和水溶液(10mL)中且将溶液冷却到0°C。在强烈搅拌下加入3-叠氮基-l-N-羟基琥珀酰亚胺基丙酸酯(5当量)。3小时后，加入20mLH2O且在室温下将混合物再搅拌45分钟。用0.5NH2S04将pH值调节到3且加入NaCl直到浓度为约15重量％。将反应混合物用CH2C12(100mLx3)萃取，用Na2S04干燥且浓缩。在用冷乙醚沉淀后，通过过滤收集产物且在真空下干燥，得到①-羧基-叠氮化物PEG衍生物。实例22mPEG-OMs+HOCLi+mPEG-0-CH2"CH2-CsC-H在强烈搅拌下，向如所属领域中已知所制备且冷却到-78'C的乙炔锂(4当量)于THF中的溶液中逐滴加入溶解于THF中的mPEG-OMs溶液。3小时后，使反应升温到室温且通过加入1mL丁醇中止反应。随后加入20mLH20且在室温下将混合物再搅拌45分钟。用0.5NH2S04将pH值调节到3且加入NaCl直到浓度为约15重量％。将反应混合物用CH2Cl2(100mLx3)萃取，用Na2S04干燥且浓縮。在用冷乙醚沉淀后，通136过过滤收集产物且在真空下干燥，得到l-(丁-3-炔基氧基)-甲氧基聚乙二醇(mPEG)。实例23使用以下文献中描述的方法将含叠氮基氨基酸和含乙炔氨基酸位点选择性地并入蛋白质中L.Wang等人，(2001),Science292:498-500;J.W.Chin等人，Science301:964-7(2003);J.W.Chin等人，(2002),JournaloftheAmericanChemicalSociety124:9026-9027;J.W.Chin,&P.GSchultz,(2002),ChemBioChem3(11):1135-1137;J.W.Chin等人，(2002),PNASUnitedStatesofAmerica99:11020-11024;和L.Wang,&P.G.Schultz,(2002),Chem.Comm..1:1-11。并入氨基酸后，就在37。C下在存在2mMPEG衍生物、1mMCuS04和约1mg铜丝的情况下用磷酸盐缓冲液(PB)(pH8)中的0.01mM蛋白质进行环加成反应达4小时。实例24本实例描述用于选择将非天然编码的氨基酸并入T-20的优选位点的多组潜在标准中的数种。本实例证实如何选择用于引入非天然编码的氨基酸的T-20多肽内的优选位点。用于本实例中的序列编号是根据T-20(SEQIDNO:22)和TEX(SEQIDNO:24)的氨基酸序列。TEX为T-20的N末端延长的多肽。除非另作说明，否则所引用的位置编号是根据T-20肽的第638-673位和TEX肽的第630-673位。举例来说，第639位对应于SEQIDNO:22中的第二氨基酸。所属领域技术人员将理解，可易于在SEQIDNO:24或任何其它T-20分子中鉴别与SEQIDNO:22中的位置对应的氨基酸位置。根据来自W.Shu,J.Liu,H.Ji,L.Rading,S.Jiang,M.Lu，HelicalInteractionsintheHIV-lgp41CoreRevealStructuralBasisfortheInhibitoryActivityofgp41Peptides(Biochemistry39:1634(2000)的PDB1DLB进行T-20的潜在a螺旋结构的重塑。使用以下标准评定供引入非天然编码的氨基酸的T-20的各位置残基(a)不应受丙氨酸扫描突变诱发的影响；(b)应表面暴露并且基于重塑而展现与周围残基的最小范德华力(vanderWaals)或氢键结相互作用；(c)在不影响T-20变体的活性的情况下可变化或为非必需的；(d)在经非天然编码的氨基酸取代后将引起保守取代；以及(e)可见于高度挠性的区域或结构呈刚性的区域。此外，利用Cx程序(Pintar等人(2002)历oz'"/om加'",18,第980页)对T-20分子进行进一步计算以评定来自肽的各蛋白质原子的突起程度。关于非天然氨基酸并入的TEX氨基酸位置分析的结果展示于图3中。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入T-20(包括TEX)的任何位置、第一氨基酸之前、羧基末端处添加或其任何组合。在一些实施例中，将一个137或一个以上非天然编码的氨基酸并入T-20(包括TEX)中的任何位置处，包括但不限于如下残基W631、D632、1635、N636、N637、Y638、T639、S640、L641、L645、N651或其任何组合。实例25以生物合成方式产生T-20和TEX的克隆策略图9A展示设计成将非天然编码的氨基酸并入T-20多肽和在N末端处延伸的T-20多肽(TEX)中的构筑体的示意图。使用HIV前病毒DNA扩增编码T-20和TEX的序列，包括多肽产物N末端处的甲硫氨酸。用于扩增来自HIV前病毒DNA的T-20序列26)和R-T205'GCGGATCCCATTAAAACCAATTCCACAAACTTGC3'(SEQIDNO:27)。用于扩增来自HIV前病毒DNA的TEX序列的引物为F-EXT205'CGAAGCTTTGGATGGAGTGGGATAGAGAAATTAACAATTACACAAGTTTAATACACTCC3'(SEQIDNO:28)和R-T20(SEQIDNO」27)。F-T20和F-EXT20含有HindIII限制位点且R-T20含有BamHI位点以用于克隆。将T-20和TEX序列同框克隆到含有TrpLE融合搭配物(FP)并且在融合搭配物N末端处具有9个组氨酸的标签的表达载体中。图10展示野生型T-20与TEX序列的比较。使用上述引物扩增gp41七肽重复2(HR2)的相应DNA区以产生延长形式的肽T-20(TEX)(参看图1)。TEX在N末端处比T-20长8个氨基酸，从而提供44个氨基酸长的多肽。TEX对应于HIVNL4-3跨膜蛋白(TM)的氨基酸630到673。T-20对应于HIVNL4.3跨膜蛋白(TM)的氨基酸638到673。图4展示已将非天然编码的氨基酸并入多肽序列中的TEX突变体的产生。以生物合成方式产生的T20和TEX肽类似物的纯化在细菌中以生物合成方式产生所得融合肽。使正交tRNA和其特异性正交氨酰基tRNA合成酶表达以进行T-20或TEX构筑体的抑制。为避免细菌细胞质中的蛋白质降解，通过将融合肽引导入包涵体(IB)中来发生表达。将含有融合肽的IB再悬浮于含有100ng/ml溶菌酶和10pg/mlDNase的包涵体再悬浮缓冲液(IBRB;50mMTris(pH7.5)、200mMNaCl、2mMEDTA)中。在超声波处理再悬浮液6次后，将样本离心以旋转沉降离心块。通过用含有1%TritonX-100的包涵体洗涤缓冲液(50mMTris(pH7.5)、30mMNaCl、1mMEDTA)超声波处理并在各次洗涤之间离心，将IB小球洗涤4次以去除残余污染物。随后，通过用包涵体洗涤缓冲液(50mMTris(pH7.5)、100mMNaCl、ImMEDTA)超声波处理并在各次洗涤之间离心，将IB小球洗涤2次。将所述小球溶解于胍盐结合缓冲液(pH7.8)(6M盐酸胍、20mMNaP04(pH7.8)、500nMNaCl)中并使其与平衡ProBond树脂结合以用于融合肽的ffis标签纯化。将树脂用胍盐结合缓冲液(pH7.8)洗涤2次；用胍盐洗涤缓冲液(pH6.0)(6M盐酸胍、20mMNaP04(pH6.0)、500nMNaCl)洗涤2次；并用胍盐洗涤缓冲液(pH5.3)(6M盐酸胍、20mMNaP04(pH5.3)、500nMNaCl)洗涤2次。将结合His标签的融合肽用胍盐洗提缓冲液(pH4.0)(6M盐酸胍、200mM乙酸、20mMNaPO4(pH4)、500nMNaCl)洗提。在样本冻干前，使用PD-10脱盐柱用含有10%甲酸的胍盐洗提缓冲液进行缓冲液交换。冻干后，接着将样本再悬浮于70%甲酸中以用于整夜溴化氰(CNBr)裂解。由于CNBr特异性地裂解甲硫氨酸C末端，故用CNBr裂解使T-20或TEX与其融合搭配物分离并进一步纯化以获得纯肽以供抗病毒活性检定中测试用。图9图B中第4泳道展示CNBr处理的裂解产物。T-20和融合搭配物(TP)以箭头指示。其它泳道装载如下第1泳道一标记；第2泳道一诱导前；第3泳道一诱导后。用CNBr裂解后，将样本冻干并再悬浮于8M尿素中，并通过制备型HPLC分离。使样本在C8制备型HPLC柱上流动以纯化去除残余CNBr。将产物冻干且随后再悬浮于胍盐结合缓冲液(pH7.8)中。使溶解产物与平衡ProBond树脂结合并收集流出液。接着使样本在C8制备型HPLC柱上流动以纯化T-20或TEX并冻干。然后将纯化肽再悬浮于以下缓冲液中22.5mg/ml甘露糖醇、2.39mg/ml碳酸钠，pH9。修饰T20和TEX的突变将选择密码子引入编码T-20和TEX类似物肽的聚核苷酸中，以在设计的保守位置并入非天然编码的氨基酸。根据已公开的在HIV融合过程中6螺旋束形成的晶体结构，选择各选择密码子的位置。根据制造商的说明书(Stratagene)，通过QuickChange突变诱发引入选择密码子，并通过对各个别突变体测序来确认。用编码非天然编码的氨基酸取代的选择密码子产生5种不同的T-20构筑体。图10展示由经琥珀密码子取代的密码子所编码的T-20的5个残基的图谱称为T20639的苏氨酸；丝氨酸T20640;亮氨酸T20641;亮氨酸T20645;和天冬酰胺T20651。用编码非天然编码的氨基酸取代的选择密码子产生11种不同的TEX构筑体。图10还展示由经琥珀密码子取代的密码子所编码的TEX的11个残基的图谱称为TEX631的色氨酸；称为TEX632的天冬氨酸；称为TEX635的异亮氨酸；称为TEX636的天冬酰胺；称为TEX637的天冬酰胺；称为TEX638的酪氨酸；称为TEX639的苏氨酸；称为TEX640的丝氨酸；称为TEX641的亮氨酸；称为TEX645的亮氨酸；和称为TEX651的天冬酰胺。图12展示T20651(图A)和TEX636(图B)中所出现的抑制。sup.139为抑制的縮写。图12图C和图D展示图12图A和图B中所执行的样本的Western印迹。图E展示T-20(T-20-Mut651)和TEX(TEX-Mut636)中以星号表示的经对乙酰基-苯丙氨酸取代的残基。图5展示经对乙酰基苯丙氨酸取代的TEX-W631、TEX-D632、TEX-N636禾nTEX-T639。实例26本实例描述测量包含非天然编码的氨基酸的T-20的生物活性的方法。测试T20和TEX抗病毒活性的活体外融合检定为评定T20或TEX的抗病毒活性，使用建立在单周期感染性基础上的融合检定。所述检定的略图展示于图11中。简单来说，将293-T细胞用以下两种质粒共转染仅表达HIV包膜基因(JRFL或JC2env)的一种质粒；和表达经修饰HIV前病毒DNA的另一质粒，所述经修饰HIV前病毒DNA带有替代HIVNef基因的荧光素酶基因且不表达其内源包膜基因(pHIV丄uc)。所述假型包膜HIV-Luc病毒能够只通过一轮感染就感染标靶细胞。转染后48小时产生HIV并将其收集于转染细胞上清液中。通过ELISA测量p24"g来进行病毒定量。测定HIV浓度后，在存在或不存在T20、TEX和其相应突变体的情况下，以不同MOI感染表达人类CD4受体和两种人类辅受体CCR5或CXCR4中的任一种的人类标靶细胞。感染后3天溶解细胞，并装载底物以测定通过照度计所测量的荧光素酶活性。本检定是定量的，并评定不同肽的HIV融合的抑制水平。图6展示T20或TEX活性检定的示意图。图7A和图7B中展示，与FUZEON相比，使用T-20、TEX以及经对乙酰基苯丙氨酸取代的TEX突变体TEX-W631、TEX-D632、TEX-N636和TEX-T639进行的本检定的结果。图8展示如实例3中所述接合的用5K和30KPEG进行的TEX-N636的聚乙二醇化。或者，可使用所属领域技术人员已知的多种其它检定来监测本发明的T-20或TEX多肽的活性，所述检定包括但不限于测量抗病毒活性的其它检定，包括但不限于测量病毒进入或病毒融合的检定。修改这些检定以测试与另一抗病毒剂的组合疗法也已为所属领域技术人员所知。此外，可利用供检定非逆转录病毒活性的所属领域技术人员众所周知的标准方法。有关呼吸道合胞病毒和副流感病毒活性检定技术的讨论，例如参看Pringle等人(Pringle,C.R.等人，1985,J.MedicalVirology17:377-386)。此外，有关所述技术的一般综述，例如参看"ZinsserMicrobiology",1988,Joklik,W.K.等人编,Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,第19版。这些参考文献都是以全文引用的方式并入本文中。可用本发明的T-20多肽进行动物研究。所述研究包括但不限于毒性研究。140应了解，本文所述的实例和实施例只是出于说明目的，并且所属领域技术人员将提出根据所述实例和实施例的各种修改或变更，并且所述修改或变更都将包括在本申请案的精神和范围内以及随附权利要求的范围内。本文所引用的所有公开案、专利和专利申请案都是以全文引用的方式并入本文中用于所有目的。表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table>SSEQID#注獰NVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGCHYRGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGWEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELKILEPIRKRL15MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSALIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKXVFEAMGLKAKYVYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGTHYRGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGWEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL厉于并入对乙雜基苯两氨骏的氮酰基合成藤a『"RS16MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAAIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFE雄GLKAKYVYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGGHYLGVDVIVGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL厉于并入对乙敏基苯两氨酸的氨解基合成藤a:.RS17MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAAIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFE雄GLKAKYVYGSRFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNVIHYDGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGWEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL历于并入对叠氮基苯两氨酸的氨維基合成酶RS18MDEFEMIKRNTSEI1SEEELREVLKKDEKSAGIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSTFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNTYYYLGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKWC顧PVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL用于并入对叠氮基苯两氨酸的氨癍基合成藤RS19GAGTGGGATAGAGAAATTAACAATTACACAAGTTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTT编码TEX的核酸20EWDRE丽YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFTEX肽21ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCG编码Trx-TEV-TEX融合体的核酸143SSEQID#注獰TGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTGAAAACCTGTACTTCCAA(AGC)GAGTGGGATAGAGAAATTAACAATTACACAAGTTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTT22MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGENLYFQS-TEV位点EWDRE蘭YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL丽WFTrx-TEV-TEX融合肽23ATGGAATGGGATCGTGAAATCAACAACTACACAAGCTTAATACACAGCTTAATTGAGGAGAGCCAGAACCAGCAGGAGAAAAATGAGCAGGAACTGTTGGAACTGGATAAATGGGCAAGCCTGTGGAATTGGTTTGGTGGTGGCTCTGGCGGTGGTAGCGGTGGCGGTAGTGAGTGGGATAGAGAAATTAACAATTACACAAGTTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTT编码2TEX肽的核酸24MEWDRE顧YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFGGSGGGSGGGS-连接基EWDREINNYTSLIHSL正ESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF2TEX肽14权利要求1.一种生物合成多肽融合抑制剂(BPFI)，其包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸。2.根据权利要求1所述的BPFI3.根据权利要求1所述的BPFI接。4.根据权利要求3所述的BPFI5.根据权利要求1所述的BPFI少一个其它BPFI连接。6.根据权利要求5所述的BPFI7.根据权利要求6所述的BPFI8.根据权利要求4所述的BPFI9.根据权利要求4所述的BPFI然编码的氨基酸连接。10.根据权利要求1所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸对连接基、聚合物或生物活性分子具反应性，所述连接基、聚合物或生物活性分子对所述多肽中的20种常见氨基酸中的任一种不具反应性。11.根据权利要求1所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸包含羰基、氨基氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。12.根据权利要求11所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸包含羰基。13.根据权利要求12所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸具有以下结构其中n为0-10;Rl为垸基、芳基、经取代垸基或经取代芳基；R2为H、垸基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。14.根据权利要求11所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸包含氨基氧基。15.根据权利要求11所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸包含酰肼基。16.根据权利要求11所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸包含肼基。17.根据权利要求11所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸残基包含氨基脲基。18.根据权利要求11所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸残基包含叠氮基。19.根据权利要求18所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸具有以下结构，其中所述BPFI包含一个或一个以上翻译后修饰。，其中所述多肽与连接基、聚合物或生物活性分子连，其中所述多肽与水溶性聚合物连接。,其中所述多肽与双官能聚合物、双官能连接基或至，其中所述双官能连接基或聚合物与第二多肽连接。，其中所述第二多肽为BPFI。，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。，其中所述水溶性聚合物与所述BPFI中存在的非天其中n为0-I0;Rl为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或者不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。20.根据权利要求11所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸包含炔基。21.根据权利要求20所述的BPFI，其中所述非天然编码的氨基酸具有以下结构其中n为0-10;Rl为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为O、N、S或不存在；m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。22.根据权利要求4所述的BPFI,其中所述水溶性聚合物具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。23.根据权利要求22所述的BPFI，其中所述水溶性聚合物具有介于约0.1kDa与约50kDa之间的分子量。24.根据权利要求4所述的BPFI，其是通过使包含含羰基氨基酸的BPFI与包含氨基氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的水溶性聚合物反应来制备。25.根据权利要求24所述的BPFI，其中所述氨基氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基通过酰胺键与所述水溶性聚合物连接。26.根据权利要求4所述的BPFI,其是通过使包含羰基的水溶性聚合物与包含非天然编码的氨基酸的多肽反应来制备，所述非天然编码的氨基酸包含氨基氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基。27.根据权利要求4所述的BPFI,其是通过使包含含炔氨基酸的BPFI与包含叠氮基部分的水溶性聚合物反应来制备。28.根据权利要求4所述的BPFI，其是通过使包含含叠氮基氨基酸的BPFI与包含炔部分的水溶性聚合物反应来制备。29.根据权利要求29所述的BPFI，其中所述叠氮基或炔基通过酰胺键与水溶性聚合物连接。30.根据权利要求4所述的BPFI，其中所述水溶性聚合物为分支或多臂聚合物。31.根据权利要求30所述的BPFI，其中所述水溶性聚合物的各分支具有介于约1kDa与约100kDa之间的分子量。32.根据权利要求1所述的BPFI，其中所述多肽为拮抗剂。33.根据权利要求32所述的BPFI，其中所述多肽包含一个或一个以上翻译后修饰、连接基、聚合物或生物活性分子。34.根据权利要求33所述的BPFI,其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成的群组的部分。35.—种经分离核酸，其包含在严格条件下与编码BPFI的核苷酸序列杂交的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包含至少一个选择密码子。36.根据权利要求35所述的经分离核酸，其中所述选择密码子选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子组成的群组。37.—种制备根据权利要求3所述的BPFI的方法，所述方法包含使包含非天然编码的氨基酸的经分离BPFI与包含与所述非天然编码的氨基酸反应的部分的连接基、聚合物或生物活性分子接触。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成的群组的部分。39.—种治疗患有RSV感染的患者或预防RSV感染的方法，其包含对所述患者投与治疗有效量的根据权利要求38所述的组合物。40.—种细胞，其包含根据权利要求35所述的核酸。全文摘要本发明提供经修饰的生物合成多肽融合抑制剂、其制造方法和用途。文档编号A61K38/00GK101489571SQ200680041233公开日2009年7月22日申请日期2006年11月1日优先权日2005年11月2日发明者布鲁斯·E.·金摩,罗伯托·马利安申请人:Ambrx公司