专利名称：：治疗肿瘤疾病的方法治疗胂瘤疾病的方法本发明涉及医学领域，特别是使用含有遗传材料的制剂来治疗患者的方法，可用于治疗由癌基因、抑癌基因(oncosuppressor)中的突变以及经历恶性转化的细胞中全基因纯合化(totalgenehomozygotization)所导致的肺瘤疾病。基于对细胞中的点突变进行修复的治疗方法是已知的US,No.5,795,972，1998年8月18日.1。这种方法显示相对较低的疗效以及有限的施用范围，因为此方法需要在开始治疗之前精确测定突变。由于还缺乏特定突变在癌症病因中的可靠证据，因此开发上述方法需要进行长期的细致研究，以检测出需要校正的具体突变，从而使得有必要开发出基于对癌症病因的已有知识能够适用的方法，而不注重基因组中诱导恶性化的具体变化。涉及局部施用DNA片段以治疗患者皮肤的癌前状态或者晒黑刺激的方法也是已知的[US，No.5,955,059,1999年9月21日，US,No.5,470,577，1995年11月28日。这些方法的应用有限，因为在这些专利中并未指明具体DNA序列和DNA来源。他们提出使用来自"任何合适来源"的天然及合成DNA，例如长度为200bp并可少至单核苷酸及核苷的鲑鱼DNA，包括二聚体，根据作者的测试，它们是最为有效的。然而，在人体中施用外源DNA的效果和后果尚未详细研究，这就预先决定了应用这些方法的某些危险。与所提出方法本质上最接近的方法是基于激活细胞中的DNA修复，根据这一方法，将修复酶递送至皮肤细胞中US，No.5,302,389，12.04.1994年4月12日(原型)。这一最接近的技术方案的缺点是应用领域有限，因为它仅意图用于治疗皮肤肿瘤疾病，并且不牵涉已有突变的回复。所有这些均证明，校正遗传突变方法的需求仍然非常受到关注。在相当程度上，这指的是治疗患有由癌基因和抑癌基因的突变以及全基因纯合化所导致的肺瘤疾病的个体。意图解决的问题是扩展应用领域，以及治疗患有由癌基因和抑癌基因的突变所导致的以及全基因纯合化所导致的肿瘤疾病的患者。在一个广义的方面中，本发明的技术问题是开发影响癌细胞和整体肿瘤的方法，其已经在人腺癌细胞培养物和人工诱导小鼠肿瘤的模型中通过实验证实，该方法以下述方式作用即细胞在进行逆向遗传转化时改变基因的内稳态，导致丧失癌细胞的主要特征一_其无限增殖活性。所需结果通过基于将片段化DNA引入所述生物体来治疗肺瘤疾病的方法而得以实现，其中使用同源DNA片段，其包含生理及遗传上健康供体的完整基因组。在这种方法中，所引入DNA的量等于或大于患者血浆及组织液中的自身DNA，但不超过最大可容许量——30ng/ml。与本文提出的方法相比，目前的文献没有提到使用片段化的遗传健康DNA对患有肿瘤疾病的患者进行治疗、其在染色体间空间递送和累积的天然机制，以及所递送片段与相应染色体区域之间的同源交换，所述区域中带有导致该特定细胞发生癌转化的突变。因此，本文提出的内容满足新颖性和创造性的标准。证实本发明还满足(工业)实用性的理论及实验数据在下文给出。图1.图1显示对片段化人胞外DNA取决于细胞接触培养基中DNA的时间而在MCF-7细胞培养物细胞区室中的分布所进行的分析(天然电泳条件，培养物生长对数期)。用溴化乙锭染色的琼脂糖胶块示于右侧；左侧为同一胶块干燥后的X射线图。胶块上方的数字表示培养物与标记的溴化乙锭和a-dATP+—起孵育的时间。胶块右侧和左侧的数字是分子量标记(kbp),a是最初的a-dATP女前体。图2.图2显示健康序列以及含有已修复外显子4及外显子5和6的半胱天冬酶3mRNA特定区域的序列。图中所示为引物组以及RT过程中431bp大小的预计半胱天冬酶3基因PCR片段；证实431bp片段的引物组以及236和304bp大小的预计PCR片段。431bp片段的扩增证明存在从已修复半胱天冬酶3基因合成的mRNA。236和304bp片段的扩增表明，431bp片段的内部结构与含有已修复外显子4以及外显子5和6的半胱天冬酶3mRNA相应区域匹配。将含有外显子4、5和6的半胱天冬酶3mRNA序列与得自431bp片段模板的已测序236和304bp片段(作为内部区段)进行比较。图3.图3显示DNA制备物对Ehrlich腹水瘤生长的影响。表1.表1列出了本实验中所使用材料量的一^^征。表2.表2显示加入培养基中的a-dATP^示记材料的绝对计数(AC，cpm)和百分比。在该实验中取一个点——180分钟。表3.表3列出了多种细胞区室中标记材料(DNA"的含量取决于与细胞孵育的时间而变化的定量特征。表4.表4列出了对照组及接受DNA的组中带有GA-1瘤的小鼠的寿命数据。表5.表5显示片段化DNA对Lewis癌的生长和转移形成的影响数据。表6.表6列出了不同浓vtJ&外DNA对hTERT-BJl人细胞培养物分Sil率的影响数据。表7.表7分析了以300ng/ml剂量的胞外DNA处理2天的hTERT-BJl人二倍体细胞培养物中所诱导的结构染色体重排率。按下文实现本文提出的用于治疗肺瘤疾病的方法。根据此方法，将片段化DNA引入该患者的机体中(通过静脉内、肌内或皮内注射；皮下；腹膜内；通过清洗或贴敷到粘膜和/或皮肤上；通过经口给药，预先中和或不中和酸性胃介质或者使用在胃中不溶的特殊胶囊；直肠内；阴道内；眼内；鼻内；通过引入肿瘤内；大脑内；通过眼内注射；通过吸入或者注射进脑脊髄管中)。为了这一目的，使用同源DNA片段，其包含在生理及遗传上健康的供体的完整基因组。所引入的片段化DNA的量等于或大于该健康供体血浆及组织液中自身DNA的量，但是，这个量不超过最大容许量——20ng/ml。在此方法中，大小在生物学上有活性的DNA片段在进入患者机体时通过天然递送机制(血流以及位于分裂细胞表面并对目的DNA片段显示高亲和力的特定受体)递送至身体中活跃分裂的细胞，包括已经历恶性化的细胞。递送至胞内空间的DNA片段在核的染色体间区室累积，以进行核内加工。在这种情况下，根据同源重组的天然机制，在核的染色体间区室中累积的DNA片段将导致该细胞恶性化的基因突变中的突变区替换成健康区域，并替换纯合化(homozygotized)的等位基因(这是经历恶性转化的细胞的特有特征)，恢复其杂合状态(这是健康状态的特征)。作为这些事件的结果，先前的癌细胞发生逆向的完全或部分转化，由此导致该细胞丧失不受控增殖的状态。因此，将来自生理及遗传上健康的供体的同源片段化DNA引入机体时，它通过活跃分裂细胞的特征性天然递送机制(受体介导的胞饮作用)被活跃分裂的恶性细胞摄取。递送至核区室(染色体间空间)的片段化DNA在此处累积，并参与与相应染色体基因座同源交换的过程。由于同源重组的天然机制，在染色体间空间累积的DNA片段将基因的突变区(其中的突变导致细胞恶性化)替换成相应的健康片段，并且目的DNA片段替换纯合化的等位基因(这是经历恶性转化的细胞的特有特征)，恢复其杂合状态(这是健康状态的特征)。作为这些事件的结果，先前的癌细胞发生逆向的完全或部分转化，由此将细胞转换至分化细胞的发育途径。在使用此处公开的发明时所达到的效果通过以下理论数据来证实。生物体的每个细胞均含有基因组DNA，其编码关于该生物体中所有细胞的所有蛋白质的信息，以及关于所有这些蛋白质正确的时空表达所需的基因在核中空间组织的信息。因此，基因组DNA是该生物体生活的模板，其含有关于整个生物体及其发育的信息。最初，生物体的所有细胞中基因组DNA均相同。然而，随着生物体的发育，每个细胞中的基因组DNA由于环境因素的影响以及细胞复制和修复中出现的错误而发生突变。已知在突变发生后，修复机制立即替换错误或受损的DNA碱基，并在单链或双链断裂(double-strandbreak,DSB)后再次连接DNA分子的末端。为了这一目的，它们可使用第二条DNA链作为模板。当受影响的区域非常长并且两条链均有所涉及时，修复是有问题的，并且可能由于该损伤而出现突变。因此，诱变性环境因素和细胞修复及复制的错误是细胞中体细胞突变的来源。致癌作用的现代科学概念指出，细胞中突变的逐渐累积导致其多步骤癌转化。细胞恶性化以及癌症本身的遗传多突变(multimutational)性质提示，治疗癌症的方法应该着眼于消除疾病成因，首先并且最重要的是治疗(校正)突变。治疗与遗传受损相关的疾病(肺瘤疾病即属于此类)的惟一原理性途径是通过一种或多种方法改变患者机体中恶性细胞的基因组，并恢复健康细胞特征性的初始遗传稳态。在这一途径的范围内已经开发了多种基因治疗方法，然而，这些方法均具有严重的缺点，并且在复杂的真核生物中无效。基因治疗的经典方法(基因打靶)着眼于使用病毒构建体来校正染色体突变，该方法能够将基因的有效拷贝有效引入细胞基因组中。尽管如此，由于基因及其调节区的随机插入，这些方法存在大量问题，这些问题涉及基因表达对其整合位点的依赖、所引入病毒基因组的沉默以及与致癌作用相关的插入谦变[Khon，D.B.，SadelainM.，GIoriosoJ.C.OccurrenceofleukaemiafollowinggenetherapyofX-linkedSCID.NatureRev.Cancer.477-488(2003);Persons,D.A.,Menhuis,A.W.Genetherapyofhemoglobindisorders.Hematol.Rep.2，348-355(2003)。通过其天然同源重组，使用递送至细胞的无目的突变的DNA模板来校正或替换染色体中的突变基因，这代表了这些方法的一种^f艮有吸引力的替代方案，但在其早期应用尝试中证实此方法的效率极低[Yanez,R丄和Porter,A.C.G.Therapeuticgenetargeting.GeneTherapy.5,149-159,(1998).,Rothstein，R.J.One-stepgenedisruptioninyeast.MethodsEnzymol.101:202-211(1983)。;历史上，以l服酵母(后来是哺乳动物细胞)中插入诱变的问题为目标开发的基因置换策略包括使用末端与待替换靶基因的侧翼区同源的线性重组DNA，并且该基因本身被选择标记替换[Thomas,K.R.，Capecchi，M.R.Site-directedmutagenesisbygenetargetinginmouseembryo-derivedstemcells.Cell.51(3):503-512(1987)。这种类型的基因打乾称为"末端移除(ends-out)"，因为该构建体的末端对应于来自靶基因的两段染色体DNA序列。在这种方法中，末端移除基因打靶构建体的末端具有重组性质，并有利于替换位于末端同源区之间的基因序列。最近证实，在酵母中通过此方法使用异源序列替换完整基因或者替换单个突变碱基对时，该过程由两个独立的链侵入(strandinvasion)起始，这意味着对同源性的搜索以及其中涉及治疗性构建体两个末端区段的重组事件[Langston，L.D.，Symingtom，L.S.Genetargetinginyeastisinitiatedbytwoindependentstrandinvasions.ProcNMAcadSciUSA.101(43):15392-15397(2004)。更早些时候，这Read,L.R.，Baker,M.D.ThemechanismofmammaliangenereplacementisconsistentwiththeformationoflongregionsofheteroduplexDNAassociatedwithtwocrossing-overevents.Mol.CellBiol.21(2):501-510(2001)1。体细胞同源重组显然一定执行了对所有生物界均适用的绝对必要的功能，并且是高效地实现，因为它在进化上已经保留了数十亿年。由于单细胞酵母中体细胞同源重组是精确DSB修复的主要机制，其效率一定非常高才能提供对个体的挽救。早先将质粒显微注射进细胞核的实验[Capecchi，M.Generatingmicewithtargetedmutations.NatureMedicine7，1086-1090.(2001)导致了这一发现，即在所有情况下，质粒均以单个多联体的形式整合进细胞基因组，其结果为同源重组机制以惊人的效率工作，其中所述多联体由所有(常多于一百个)注射的质粒组成，这些质粒以首尾相接的方式连接成一个分子。然而，经典基因打靶(意味着使用同源重组)低效背后的原因可能是同源重组的目标与其由进化选择的实现其自身(尽管仍然未知)功能的能力之间的偏差。已公开的相关数据允许鉴定对于同源重组机制的工作而言至关重要的某些因素。递送至重组复合体所处位置处的DNA片段的线性大小对于同源重组机制的高效运行而言是很重要的。例如，当将校正构建体中同源区的长度由2kbp提高到14.5kbp时，记录到了基因打靶效率的100倍指数式提高，然而，所达到的效率(10—5个基因校正事件/细胞)仍然不足以无需选择地应用此方法[Deng,C.和Capecchi,M.K.Reexaininationofgenetargetingfrequencyasafunctionoftheextentofhomologybetweenthetargetedvectorandthetargetlocus.Mol.CellBiol.12，3365-3371(1992)。使用小片段同源置换(smallfragmentshomologousreplacement,SFHR)校正突变基因的结果则显示与上述数据截然相反——校正率为l-20。/o/细胞[US，No.5,470,577，28.11.1995,Gruenert，D.，Bruscia，E.，Novelli，G"Colosimo，A"Dallapiccola，B.，Sangiuolo，F"Goncz,K.Sequence-specificmodi打cationofgenomicDNAbysmallDNAfragments.Clin.Invest.112，637-641(2003)。在这些实验中获得的基因打靶效率可能意味着，同源重组偏好于以短片段运行，或者通过连接酶IV按首尾相连方式连接DNA片段而由短片段形成多聚片段，其在重组事件中最为有效。在哺乳动物细胞中获得重组产物的必要条件是末端同源性部分的长度，约为200bpLin，Y"Lukacsovich，T"Waldman，A.S.MultiplepathwaysforrepairofDNAdouble-strandbreaksinmammalianchromosomes.Mol.CellBiol.19，8353-60(1999)，Nassif,N.,Engels,W.DNAhomologyrequirementsformitoticgaprepairinDmsrp/ri7fl.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90(4):1262-6(1993)。进行同源重组的主要条件是作为来源双链末端的所递送治疗性DNA的线性形式。环形形式的治疗性质粒基本上不参与同源交换。DSB的产生和DNA分子双链末端的形成局部激活并增强染色体及染色体外的重组和基因打乾[Kucherlapati，R.S.,Eves,E.M.，Song,K.Y.,Morse,B.S.，Smithies,O.HomologousrecombinationbetweenplasmidsinmammaliancellscanbeenhancedbytreatmentofinputDNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.81,3153-3157(1984)。最近iV^""中的出版物[Urnov，F.D.，Miller,J.C"Lee,Y.L.,Bea雄jour，C.M.，Rock,J.M.，Augustus,S.,Jamieson,A.C.，Proteus,M.H.,Gregory,P.D.，Holmes,M.C.Highlyefficientendogenoushumangenecorrectionusingdesignedzinc-fingernucleases.Nature.435,646-651(2005)报道了使用这一原理诱导对IL2R基因的校正，其中外显子5中的点突变导致与X染色体连锁的致死性遗传病一一重度联合免疫缺陷(SCID)。其作者证实了通过用表达合成锌指核酸酶的遗传构建体以及带有覆盖SCID突变区的同一基因非突变片段的质粒转染细胞时高达20%的高基因校正水平，所述合成锌指核酸酶能够特异性切割基因组DNA中IL2R基因内突变附近的序列。据推测，同源重组有效进行每个基因校正的能力原则上与核空间中游离双链DNA末端的出现来起始该过程有关，而与这些末端的来源无关一一它们可以是由于DSB而形成的断裂染色体的末端，或者是递送至核中并表现出典型末端移除结构的DNA片段的双链末端。任何下述这样的未修饰基因组DNA片段都是典型的末端移除构建体其两个末端与染色体DNA的两段序列同源，并且中央部分能够替换相应的基因組片段并校正突变。这意味着该片段的末端将起始对同源性部分的搜索以及与基因组DNA的同源重组，所述同源重组将导致用从外部空间递送至细胞的片段的中央部分替换该基因组DNA片段。在使用遗传上正确的外源DNA的条件下，这些事件将导致对遗传缺陷的校正Yakubov，L.，Popova，N.，Nikolin,V"Semenov，D.，Bogachev，S.,Oskina,I.ExtracellulargenomicDNAprotectsmiceagainstradiationandchemicalmutagens.GenomeBiology.5:P3(2003)。哺乳动物和人的血浆和间隙液总是含有由于自然细胞死亡期间基因组DNA片段化而形成的基因纟且DNA片段[Anke，rP.，Zajac，V,Lyautey，J.,Lederrey，C.,Dunand，C.，Lefort,F"Mulcahy，H.，Heinema叫J.，Stroun,M,TranscessionofDNAfrombacteriatohumancellsinculture:apossibleroleinoncogenesis.Aim.NYAcadSci.1022，195-201(2004);Anker,P"Mulcahy,H.,Chen,X.Q.，Stro叫M.DetectionofcirculatingtumourDNAintheblood(plasma/serum)ofcancerpatients.CancerMetastasisRev.18，65-73(1999)。这些DNA片段通过被活跃分裂细胞吞入并递送至细胞区室来参与持续发生的DNA交换。胞外DNA的递送通过活性受体介导的胞饮作用来进行，其中涉及特定的膜受体[Yakubov，L.A"Deeva，E.A"Zarytova，V.F.,Ivanova,E.M.，Ryte,A.S.，Yurchenko，LY"Vlassov，V.V.Mechanismsofoligonucleotideuptakebycells:InvolvementofspecificreceptorsProc.Nail.Acad.Sci.USA86，6454-6458(1989);Doerfler，W"Remus,R.，Muller,K.，Heller,H.，Hohlweg，U.，Schubbert,R.ThefateofforeignDNAinmammaliancellsandorganisms.Dev.Biol.(Basel),106，89-97,(2001)。存在许多基因转染法，然而，这些方法仅提供通过所考虑的受体介导机制进行转运所需的对治疗性DNA的紧密包装Budker，V.,Budker,T.，Zhang，G"Subbotin,V"Loomis,A.，Wolff,J.A.Hypothesis:nakedplasmidDNAistakenupbyv/wbyareceptor-mediatedprocess.GeneMed.2(2)，6-88，(2000);Satkauskas，S.，Bureau,M.F"Mahfoudi，A.，Mir，L.M.Slowaccumulationofplasmidinmusclecells:supportingevidenceforamechanismofDNAuptakebyreceptor-mediatedendocytosis.Mol.Ther.4，317-323(2001)。在血浆和间隙液中高浓度片段化的遗传上正确的DNA产生将导致出现基于竟争的病理DNA片段置换，所述病理DNA片段在血中循环并由于癌细胞死亡而出现，所述置换来自染色体相应区域同源交换的持续过程。这种效应的长期持续将导致细胞健康基因型的恢复并且向正常细胞逆向转化[Yakubov，L.，Popova，N.，Nikolin，V"Semenov，D.，Bogachev，S.,Oskina，I.ExtracellulargenomicDNAprotectsmiceagainstradiationandchemicalmutagens.GenomeBiology.5:P3(2003),Yakubov,L.A.，Petrova，N.A.，Popova，K.A.，Semenov，D.V"Nikolin，V.P"Oskina，I.N.RoleofextracellularDNAinmaintainingofstabilityandvariabilityofcellulargenomes,Dokl.Biokhim.Biofiz.382,31-34(2002)1。所述技术问题基于生物体中胞外DNA周转(turnover)的先进理念而得以解决，该理论已有大量的表现证据。真核生物中胞外DNA周转这一概念的主要主题如下。胞外片段化基因组DNA由于程序性细胞死亡(或称为细胞凋亡)而形成，并在胞间空间和血浆中持续存在，所述胞外片段化基因组DNA含有突变序列，其频率对应于细胞中相应突变的频率Anker,P.,Mulcahy,H.，Chen,X.Q.,Stroun，M.DetectionofcirculatingtumourDNAintheblood(plasma/serum)ofcancerpatients.CancerMetastasisRev.18，65-73(1999);Giacona，M.B"Ruben，G.C.，Iczkowski，K.，Roots,T.,Porter,D.，Sorenson，G.Cell-freeDNAinhumanbloodplasma:lengthmeasurementsinpatientswithpancreaticcancerandhealthycontrols.Pancreas.17,89-97(1998)。细胞能够通过受体介导的机制吞入所形成的DNA或染色质片段，并将这些片段转运至细胞核[Yakubov,L.A.，Deeva,E.A.，Zarytova，V.F"Ivanova，E.M.，Ryte，A.S.，Yurchenko，L.Y"Vlassov,V.V.Mechanismsofoligonucleotideuptakebycells:InvolvementofspecificreceptorsProc.Nail.Acad.Sci.USA86，6454-6458(1989);Shestova,O.E.,Andreeva，A.Yu,Vlassov,V.V"Yakubov,L.A.Transportationofthecomplexesofoligonucleotideswithcellsurfaceproteinsintothecellnucleus.Dokl.Ross.Akad.Nauk368，264-267，(1999)。所递送的片段按照同源重组机制与核内的基因组DNA重组，并且其本身就能起始这一过程。据推测，这三个过程的结合组成了能够在生物整体水平控制体细胞遗传学情况的机制，这是通过使用组织液和血浆的胞外DNA作为外部基因组标准品在细胞中校正突变或谦导遗传改变来实现的。这种机制的工作可形成该生物体细胞基因组整体的背景。此机制可借助于胞外DNA标准品的突变序列来消除所出现的和固定的突变，以及将突变插入细胞中.如果此机制可使用基本不含有害突变的DNA标准品，则其惟一功能将是从身体细胞中消除突变。由于等位基因通常高度同源，并且经常在相对小的有改变序列区域中存在不同，因此所推测机制的另一方面功能可能是使用替代序列替换染色体中等位基因的序列，与使用非突变序列替换突变序列相似。所述技术问题还通过以下得到解决将个体的完整基因组以作为基因组DNA片段的一组多核苷酸分子的形式引入生物体中，其中它们发生循环，被细胞吞入并到达核，它们在这里累积并参与与细胞基因组DNA的同源重组。因此，有可能通过将完整基因组以作为无遗传缺陷之基因组DNA片段的一组多核苷酸分子的形式引入生物体中，从而校正遗传缺陷，并且也有可能基于本发明所述方法，为患有与遗传突变相关的疾病和病症的个体提供有效的治疗。所提出的治疗方法利用基因组DNA的片段，其包含在生理和遗传上健康的个体中与核基质蛋白质相关联的完整基因组。外源片段的大小与由于凋亡性核溶解而出现的受治疗生物体血浆中循环的片段大小相匹配(1-30个核小体单位)。原型使用多种不代表个体完整基因组的人工DNA构建体。该DNA不与核基质蛋白质相关联，并且不与该生物体中天然凋亡DNA的大小(l-30个核小体单位)匹配。使用人乳腺癌细胞系(体外)研究了本文提出的用于治疗肿瘤疾病的方法的独特特征，所述肿瘤疾病是由于细胞中多突变事件的结果而被诱发。在小鼠中诱发肿瘤的实验(体内)中研究了本文提出的用于治疗肿瘤疾病的方法。提出用于给药并在本文要求保护的治疗方法中指明的治疗性DNA最大容许量在使用人细胞培养物(体外)进行的细胞毒性测试中测定。在人乳腺癌细胞培养物模型中研究在本文提出的治疗方法中确定的外源来源的片段化基因组DNA向内部细胞区室的递送。材料和方法细胞培养在5%胎牛血清(FBS;Biolot，Russia)存在下，在37"C和5%C02气氛下，在补充了10mML-谷氨酰胺和50ng/ml链霉素(Sigma,USA)的RPMI1640培养基中将人乳腺癌(MCF-7)细胞培养至密度为24孔板的每4个孔中为0.7xl0"个细胞。DNA和前体的制备在KIenow片段、三种非放射性dNTP(colddNTP)和一种放射性dNTP(hotdNTP)存在下，通过缺口翻译来标记片段化为500bp的人胎盘DNA(10ng)。根据GloverGlover,D.，1988.DNACloning:APracticalApproach,IRLPress,Oxford,1985.TranslatedunderthetitleKlonirovanieDNK.Metody.Mir,Moscow所述方案，通过4吏用异丙醇进行双沉淀来除去未掺入的前体。纯化后获得的标记DNA的量为7-15jig。将DNA溶于适当体积的蒸馏水中，并加入平板的孔中(每个孔不超过20jil)。每个孔含有250-350nl培养基。从工作体积中取出1nl的等分试样以测定放射性。将a-dNTpw的等分试样稀释到适当体积的水中，并取样1nl稀释的三磷酸酯计数放射性。在每个点加入相对于DNA大致相似量(在放射性计数和体积方面)的a。表1中列出了三个实验的DNA(jig和cpm)和a-dNTP*(cpm)的量。表l实验中所使用材料量的一般表征<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>结果长度500bp的胞外DNA(表现为包含完整人基因组的片段库)在细胞区室中的分布。定量评估实验结果所需的数字每个实验点的人乳腺癌细胞MCF-7的计数为0.7xio6。根据用于MCF-7的方案，107个细胞含有60jigDNA。每个细胞含有6pgDNA。实验点的总DNA量为4.2g。加入实验点的被标记DNA的量在表1列出。所加入DNA的放射性计数(cpm)示于表1。每个实验点的a-dNTPA放射性计数(cpm)为表1列出的值。单倍体人基因组含有3.3x109bp。加入培养基中的被标记DNA片段的原始大小为500bp。选捧两个培养物生长阶段(指数期和接触抑制期)和两类电泳测定(在天然和变性条件下)用于分析胞外DNA的行为。分析细胞中胞外DNA行为的定性特征和定量参数。被标记材料的定性行为特征(天然条件)。在细胞生长指数期时将DNA和前体加入培养基中(图1)。该图含有电泳图镨(右侧)以及通过暴露于干燥后的同一琼脂糖胶块获得的相应的X射线图镨(左侧)。胞质级分(胶块的上方組)DNA基本上立即进入胞质。在0点，观察到迁移率与原始被标记材料相对应的低分子量级分。在O点，起点处标记不可见。在起点处所有其余样品均显示可观的标记材料量。这可能提示DNA与胞质的成分形成高分子量的复合体。检测不到明显的沉淀DNA糊状物。所有样品均含有相同迁移率的DNA级分，该迁移率与加入培养基中的原始标记DNA的迁移率一致。这意味着递送至胞质级分的DNA的自由迁移部分未经历任何可见的代谢转化。起点处可见的其他DNA部分以某种方式进行了转化，或者掺入到高分子量复合体中。染色体间级分(胶块的中间组)DNA也基本上立即进入核的染色体间级分。在0点，观察到迁移率与原始标记材料相对应的低分子量级分。在0点和所有其余样品中，起点处标记均不可见。整个高分子量DNA级分在离心过程中形成透镜状沉积物，这在核液中检测不到。在除0点以外的所有样品中均观察到DNA迁移率的改变。DNA形成"模糊云"状的高分子量库，其从下部上升至琼脂糖胶块的高分子量区。此外，在均一云状背景下观察到若干离散的由大小决定的条带。其中存在少量染的条带图镨。这种标记材料的分布图谱提示发生了以下事件。据推测，进入核中的片段化DNA作为合成DNA链的引物.它表现为出现多种大小的标记DNA片段组，在电泳图镨中可见为大小达到10kbp的标记材料的模糊云状物.另一种可能性是DNA片段在其末端连接.这种推测源于大小数倍于原始DNA的离散标记条带的图镨。核染色体间空间中胞外DNA线性大小提高的组合改变形式也是可能的。染色质(胶块的下部)DNA(本身或任何其他形式的标记)基本上立即入核，并整合进核染色质的级分中。在明显分离的区域中，观察到长度数倍于原始DNA的片段的明显阶梯图语。(由于被含有高比活性标记的少量染色体间级分所污染而显示出该材料)。a-dATP*(所有胶块中，命名为180a)a-dATPw在胞质级分中缺乏。然而，存在大小与实验所使用DNA一致的标记片段。在染色体间级分中，它形成相似(但较稀薄)的模糊云状物，在形态上完全对应于标记DNA的相似级分。该标记可在180分钟后在染色质中检测到。其他时间点未监测到a-dATP*。在180分钟这个点，培养基样品中标记的DNA与a-dATPA的标记计数大致相等(见表1和2)。然而，在这个实验点使用a-dATPw检测到的标记材料量比使用DNA的改变形式低大约6倍。表2加入培养基中的a-dATP^示记材料的绝对量(AC，cpm)和百分比。取实验中的一个点<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表3在多种细胞区室中标记材料含量取决于与细胞孵育时间的定性行为特征<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>标记材料的定性行为特征基于多种细胞区室中实验点处计数的比较得到的所有定量估计在表1和2中列出。需要注意，所有方法中材料均以绝对量存在，因此比较所述数据并将该量与最初引入培养基中的标记相关联是合适的。实验给出了意想不到的结果，首先，a-dATPw不是作为单体，而是在约500bp长的DNA片段中被运送至所有细胞区室。此外，这种DNA参与与加入培养基中的DNA相似的所有过程。在所有的方面中，a-dATPM'J用的活性比被标记胞外DNA利用的活性弱数倍。接着发现，胞外DNA基本上立即(如果细胞活跃分裂则在1分钟以内)递送至所分析的所有细胞区室(胞质和核空间)并整合进染色质中。在活跃分裂细胞的胞质中，在除O点以外的所有实验点存在大致等量的标记DNA。在核区室中累积的标记取决于与培养液中存在的标记DNA接触的时间。DNA以多种长度的片段存在于核的染色体间空间中。在活跃分裂的细胞中，0点的片段大小对应于加入培养基中的胞外DNA的大小。在所有其他改变形式中，线性DNA的大小提高至约10kbp。此外，所检测到条带的"阶梯图谱，，提示，这些片段的一部分以头尾相接的方式连接。在接触抑制阶段的培养细胞中，DNA加工(变性条件，数据未显示)显示独特的动力学情况。据推测，在这个细胞培养物生长阶段时，代谢过程减緩，我们成功检测了原始DNA片段在核中形成多聚体这一过程的动力学阶段。递送至核空间的原始DNA分子线性大小的提高可能是由于参与修复事件的特异性DNA连接酶IV活性所致(参考[Lees-Miller,S.P.，Meek,K.RepairofDNAdoublestrandbreaksbynon-homologousendjoining.Biochimie85，1161-1173(2003))。报告的数据提示，在本文提出的用于治疗肿瘤疾病的方法中，一定量的DNA被递送至癌细胞的核中，在染色体间空间持续存在，并整合进基因组。在染色体间空间中，DNA经历使其线性大小提高至约10kbp的改变。使用来自人腺癌的突变体胱天蛋白酶3基因来研究本专利申请和所提出的用于治疗癌症疾病的方法中通过胞外DNA对癌细胞的作用校正突变的可行性。所进行的研究证实，在胞外DNA的作用下，人乳腺癌MCF-7中胱天蛋白酶3基因活性以及前述癌细胞中凋亡发生途径的恢复。材料和方法细胞培养及培养条件人乳腺癌(MCF-7)细胞和小鼠肉瘤(L929)细胞得自InstituteofCellCultures,SRCVBVector。在5%胎牛血清(FBS;Biolot，St.Petersburg,Russia)存在下，在37X:和5。/。气氛下，在补充了lOmML画谷氨酰胺和50fig/ml链霉素(Sigma,USA)的RPMI1640培养基中培养细胞。就转^而言，在5%胎牛血清(FBS)和0.1-0.2mg/ml人胎盘DNA存在下，在补充了10mML-谷氨酰胺和50jig/ml链霉素(Sigma,USA)的RPMI1640培养基中培养MCF-7细胞。转染时间从5至40天不等，并在图表说明中标出。PCR分析按照标准方案，使用Medigen(Russia)和BioRad(USA)试剂盒进行PCR分析。按照BioRad(USA)的方案进行实时PCR测定。合成以下引物用于分析胱天蛋白酶3基因的mRNA:Pr.1GAATGACATCTCGGTCTGGTA(21)Pr.2TGMTAATGAAAAGT丌GGGT(21)Pr.3CTCTGGAATATCCCTGGACMCA(23)Pr.4CATCACGCATCAATTCCACMT(22)所扩增的DNA片段在2%琼脂糖凝胶中分离，并用溴化乙锭染色。从细胞培养物中分离RNA4吏用总RNA纯化试剂盒(V-geneBiotechnologyLimited)进行RNA分离。按以下方案进行操作。对长期暴露于人胞外DNA后的MCF-7细胞的mRNA进行的PCR分析在经人DNA处理的细胞的提取物中检测外显子4中突变已回复的胱天蛋白酶3或相应mRNA，这可以直接证实治疗性片段在突变体细胞染色体中的同源整合。我们选择了涉及选择和分析相应mRNA的方法，这将允许通过直接测序检测外显子剪接位点以及mRNA中已回复突变的存在情况。使用RT(逆转录)-PCR操作，我们扩增了含有外显子4、5和6的mRNA区。这时，4吏用与MCF-7细胞基因组中所缺少的外显子4中47bp区同源的寡核苷酸(引物3)作为正向引物。使用与外显子6末端部分互补的寡核苷酸作为反向引物，该寡核苷酸的最后一个核苷酸对应于外显子6的最后一个核苷酸。首先，从与人DNA—起孵育15天的MCF-7细胞中分离总RNA，并合成cDNA。使用引物2和3(Pr.2和Pr.3)检测对应于胱天蛋白酶3基因并含有外显子4中已修复缺失的mRNA区。扩增产生大小为431bp的目的片段，其包括已剪接的外显子4(缺少前20个核苷酸)、5和6(图3)。在总RNA级分中检测到此片段意味着总RNA中含有带有已修复47bp缺失的胱天蛋白酶3基因的mRNA。为了与431bp片段扩增中的校正进行对照，使用两种内部引物(Prl和Pr.4)、两种末端引物(Pr.3和Pr.4)并以431bpDNA片段作为模板获得两种预计PCR产物(长度为236和304bp的片段)。对两种片段的测序使我们作出以下推论。该431bp片段是含有已剪接外显子4(缺少前20个核苷酸)、5和6的胱天蛋白酶3mRNA区域的cDNA拷贝(图3)。431bp片段的左边部分是在原始MCF-7培养物中不存在的含有缺失的47个核苷酸(胱天蛋白酶3mRNA的320-367区)的外显子4修复区，它与下两个外显子正确剪接。这证明该治疗性片段同源整合进外显子4的缺陷区。整合遵循[Langston，L.D.,Symingtom，L.S.Genetargetinginyeastisinitiatedbytwoindependentstrandinvasions.Proc醒AcadSciUSA.101(43):15392-15397(2004)，Li，J.，Read,L.R.,Baker,M.D.ThemechanismofmammaliangenereplacementisconsistentwiththeformationoflongregionsofheteroduplexDNAassociatedwithtwocrossing-overevents.Mol.CellBiol.21(2):501-510(2001)中描述的机制，这时整合片段的中间部分对于整合过程并不重要。将含有外显子4、5和6的431bp片段的剪接序列与原始序列进行比较时，我们检测到各为6个核苷酸的两种插入(胱天蛋白酶的370区和3卯区)。这两种插入均不引起移码。在实验序列中，推测350位的半胱氨酸代偿了胱天蛋白酶3基因中370位的半胱氨酸缺失。这两种插入的出现与胱天蛋白酶3基因外显子4中的变异相关，或者是染色体外片段整合进染色体的结果。该序列的其余部分含有若干不重要的替换。所测序模板的其余部分(其中外显子剪接位点对应于GenBank中的序列)中基本完全的同源性证实了剪接的正确性。对已修复mRNA的检测以及对于活跃调亡(具有特征性核小体大小的片段化)的证实表明存在具有功能活性的酶。已知胱天蛋白酶基因位于染色体4上，大小为21751bp，包含8个外显子。在细胞代谢中可能存在此基因的两种表达产物17kbp和19kbp的转录物及其蛋白质产物[Wolf，B.B.,Schuler，M.，EchWerri，F.，Green，D.R..Caspase-3istheprimaryactivatorofapoptoticDNAfragmentationviaDNAfragmentationfactor-45/inhibitorofcaspase-activatedDNaseinactivation.J.Biol.Chem.274，30651-30656(1999)。功能性胱天蛋白酶3的出现需要mRNA翻译的复杂过程，在此过程中8个外显子被剪接。外显子4中47bp的缺失导致在剪接中外显子4被忽略，并损害RNA合成以及活性酶的表达。培养基中存在的DNA通过流体动力学的方式被片段化(fragmentedhydrodynamically)成为500-1000的大小，这意味着该片段能够用于合成全长产物，得到原则上不存在的功能性酶。必要片:^正确方向相连接的概率几乎为0，所述连接引起胱天蛋白酶3基因开放读码框恢复并由此形成适于合成该酶的染色体外模板。依我们看来，并且根据我们进行的实验的结果，在这些实验中，涉及胞外DNA转运的事件最有可能的结果是使得胱天蛋白酶3基因逆转为正常的健康片段整合进基因组。因此，所进行的研究的结果证明在细胞培养物中出现了新的特征，其惟一载体是胞外的断裂同种异型DNA。我们报告的数据提示，在我们提出用于治疗肺瘤疾病的方法中，通过天然细胞机制递送的胞外DNA片段在染色体上寻找到它们的同源区段，并与其重组。此外，如果染色体区带有突变，同源的胞外DNA片段能够通过替换突变区域而校正这种突变。在使用小鼠实验性肿瘤的体内系统中研究了我们提出的用于治疗肿瘤疾病的方法。材料和方法该实验使用3-4月龄的A/Sn、CBA/Lac、C57BL/6和ICR小鼠进行，它们得自俄国科学院西伯利亚分院细胞学和遗传学研究院(InstituteofCytologyandGenetics,SiberianBranchoftheRussianAcademyofSciences)的动物育种中心。在该研究中使用三林连续性肿瘤(continuoust謹or):Ehrlich痛、GA-1肝癌和Lewis瘤。Ehrlich腹水和Lewis肺癌得自俄国医学科学院西伯利亚分院Tomsk科学中心肿瘤学研究院(InstituteofOncology,TomskScientificCenter,SiberianBranchoftheRussianAcademyofMedicalSciences),首先用邻氨基偶氮甲苯在A/He小鼠中诱导GA-1肝癌，并以腹水形式在A/Sn小鼠中维持。该肺瘤可通过皮下或肌内接种来诱导，以实体形式在接种部位生长，并大量转移至肝中。人DNA的来源是分娩期健康女性的胎盘；小鼠器官(肝、肾、脾和胸腺)DNA的混合物。使用无酚法分离DNA(细胞系和遗传学研究院的实验规章)。此方法允许产生完整的基因组DNA，并保留在体内条件下与核基质蛋白稳定结合的片段。在超声粉碎机中断裂DNA，以产生大小为200-6000bp的片段的混合物。将包装为等分试样的制备物在181C的温度下保存在水箱中。使用前，将必要量的DNA解冻并用生理盐水调整其浓度。使用计算机程序Statistika对数据进行统计学处理。根据Student's检验和Whitny-wilcoxon检验估计差异的显著性。结果我们进行的实验的结果证实，片段化基因组DNA的制备物显示了减緩这些肿瘤生长的能力，并对转移的发生具有中等抑制效果(表4和5;图3)。表4对照组以及接受DNA的组中带有GA-1肺瘤的小鼠的寿命<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*第一个实验中接种剂量为1百万个癌细胞，第二个实验中为50万.表5片段化DNA对Lewis癌生长和转移形成的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*根据Whitny-Wilcoxon检验对数据进行统计学处理，与对照的差异具有统计学显著性(p<0.001).在人hTERT-BJl细胞培养物的模型中评估在我们提出的治疗方法中所确定的剂量下DNA的细胞毒效应和畸变效应。材料和方法在该实验中使用浓度为1.695mg/ml的片段化DNA溶液。使用在相同条件下分离自鲑鱼籽的DNA作为参照制备物。使用二倍体hTERT國BJl细胞系(CLONTECHLaboratories,Inc.目录号C4001-1)的培养物。将相同浓度的细胞铺到6孔板中。24小时后，向孔中补充浓度为300或30照/ml的人或鲑鱼DNA。加入DNA48和72小时后，在Goryaev室中测定细胞数。使用Origin程序对数据进行统计学处理。为了评估染色体重排，使接触人或鲑鱼DNA的细胞固定在载玻片上，并按照Giemsa进行常规染色。结果分离自不同来源并以不同剂量应用的片段化DNA的细胞毒效应数据对所获得数据进行的分析证实，以300ng/ml浓度引入的人和鲑鱼DNA均在加入后第3天抑制培养物的生长。30ng/ml的DNA制备物浓度对hTERT-BJl细胞培养物的生长没有统计学显著的影响(表6)。表6不同浓度的胞外DNA对hTERT-BJl人细胞培养物分裂速率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>差异具有统计学显著性100+\-17.55和66.46+、-18.99100+\-17.55和51.27+\-16.5583.11+\-23.16和51.27+\-16.55<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>无统计学显著差异X±sep<0.05t誦检验有关自不同来源分离的片段化DNA的畸变效应数据对所获得数据进行的分析证实，在300jig/ml人或鲑鱼DNA的剂量下观察到了提高的染色体畸变水平。然而，与同种异型人DNA相比，异种DNA具有更高的畸变效应(表7)。表7在以300ng/ml剂量的胞外DNA处理2天的hTERT-BJl人二倍体细胞培养物中诱导的结构染色体重排率<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>在实验中显示，浓度等于或高于300ng/ml的片段化DNA可抑制细胞生长并诱导染色体重排。30ng/ml的浓度无细胞毒效应。用于治疗目的的DNA制备物推荐剂量为单次给药5吗/ml。这对应于每1L血中lmgDNA，或者1jtg/ml的工作浓度，这比导致不期望效应的浓度低300倍，并且比在人细胞hTERT-BJl培养物不显示细胞毒效应的外源DNA浓度低30倍。因此，本文提出用于治疗肿瘤疾病的方法实现了所需的结果，并扩展了方法的应用领域以及对肺瘤疾病患者的治疗，因为该方法允许治疗疾病的病因，即校正癌基因和抑癌基因中的突变以及向细胞的纯合基因中引入杂合等位基因。权利要求1.一种治疗肿瘤疾病的方法，包括将片段化DNA引入患者机体，其特征在于使用生理活性大小并包含生理及遗传上健康供体的完整基因组之同源DNA的片段作为所述片段化DNA。2.权利要求l的方法，其特征在于引入患者机体内的片段化DNA的量等于或大于血浆及组织液中自身DNA的量，但不超过最大容许剂量，所述最大容许量为30ng/ml。全文摘要本发明涉及医学领域，特别是使用含有遗传材料的制剂来治疗患者的方法，所述方法可用于治疗由癌基因、抑癌基因的突变以及经历恶性转化的细胞中等位基因的全部纯合化所导致的肿瘤疾病。本发明通过以下手段使其有可能扩展应用领域以及有可能治疗肿瘤疾病患者，所述肿瘤疾病由癌基因和抑癌基因突变导致，或者由细胞等位基因的全部纯合化导致将以生理及遗传健康供体完整基因组形式存在的同源DNA片段注入患者机体，其中所注入DNA的量等于或大于患者血浆及组织液中DNA的量，但不超过最大容许剂量——30μg/ml。文档编号A61P35/00GK101400357SQ200680053813公开日2009年4月1日申请日期2006年3月27日优先权日2006年1月16日发明者亚历山大·根纳迪维奇·希洛夫,内莉·亚历山德罗芙娜·波波娃,列昂尼德·阿纳托列维奇·雅库博夫,塔玛拉·叶戈罗夫娜·塞贝莱娃,奥克萨娜·维亚切斯拉沃夫娜·夫拉茨基赫,弗拉基米尔·阿莱克谢耶维奇·罗加乔夫,柳德米拉·瓦西里耶芙娜·梅凯蒂娜,瓦列里·彼得罗维奇·尼科林,米哈伊尔·阿尔卡迪维奇·舒尔多夫,纳塔利娅·谢尔盖耶夫娜·日丹诺娃,谢尔盖·尼古拉耶维奇·谢廖金,谢尔盖·斯坦尼斯拉沃维奇·博加乔夫,阿纳斯塔西娅·谢尔盖耶夫娜·利哈乔娃申请人:米哈伊尔·阿尔卡迪维奇·舒尔多夫