专利名称：化合物6－糠基氨基嘌呤用于制备抗肝损伤药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及6-糠基氨基嘌呤(俗称激动素，Kinetin)的一种新用途，具体指已知的化合物6-糠基氨基嘌呤用于制备抗肝损伤药物的用途。
背景技术：
肝脏是人体内最大的、功能最多的实质性腺体器官，被喻为“人体最大的化工厂”，它参与体内消化、代谢、排泄、解毒和免疫等过程，是具有重要而复杂的代谢功能的器官。它具有肝动脉和门静脉双重的血液供应，且有肝静脉及胆道系统出肝，加上丰富的血窦及精巧的肝小叶结构，以及肝细胞中富含线粒体、内质网、核蛋白体和大量酶类，因而能完成复杂多样的代谢功能。但是由于天然或人工合成化学物质主要通过胃肠道门静脉或体循环进入肝脏进行转化，因此肝脏更容易受到化学物中的毒性物质损害，在欧美国家约25％急性肝衰竭(ALF)由化学物质引起。
肝内过量形成活性氧产物是肝细胞损伤的重要原因。百草枯(除莠剂)等化合物经P-450处理时可刺激氧自由基形成，后者亦可由激活的枯否细胞和多形核白细胞(PMNs)产生。氧自由基主要来源于黄嘌呤氧化酶系统和线粒体，黄嘌呤氧化酶通常以黄嘌呤脱氢酶形式存在于体内，其催化反应不形成自由基.但在ATP耗竭或氧化应激时，黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶.催化ATP代谢产生的黄嘌呤氧化成尿酸并生成O2-和1O2，O2-在水介质中反应性差.弥散快，很快由酶的岐化作用转化为O2，经还原反应生成OH-。线粒体呼吸链在正常情况下即可产生少量氧自由基，线粒体功能受损时致大量氧自由基生成。
氧自由基是引起动物体衰老及疾病的主要原因。氧是地球上最丰富的元素，原子密度为53.8％。地球大气层中的氧本身就是自由基，又是活细胞中自由基反应的主要促进者，当氧略高出正常浓度就使需氧生物中毒。氧的毒性不是由于氧分子本身的反应能力，而是由于氧分子还原成水过程中产生的许多中间产物，包括超氧阴离子、过氧化氢分子、羟自由基、氢过氧基、氢过氧化物、烷氧基、烷过氧基和单线态氧等。这些中间产物包括自由基和分子，统称为活性氧，但习惯把它们称为自由基。自由基是指那些具有不配对电子的原子、分子或离子，它们有得到或失去电子的倾向。因此，自由基的性质特别活泼，具有很高的反应活性，极易与其它物质发生反应生成新的自由基或氧化物。在有机体的生命活动过程中，自由基的产生、淬灭、利用和损伤作用是几乎同时进行的对立统一过程。在正常情况下，机体内氧自由基的产生和清除是处于动态平衡的，动物体内有一套完整的防御系统来保护机体不受自由基的伤害。因此在生理条件下，氧自由基浓度处于正常状态，不仅不会损伤组织，而且还显示出其独特的生理作用，例如吞噬细胞杀灭有害的微生物、合成前列腺素和凝血酶原、药物与毒物的解毒、消灭突变的细胞以及免疫调节等作用。但在病态和衰老的情况下，机体不能有效清除产生的氧自由基，可引起体内氧自由基浓度升高致组织损伤而发生疾病。从分子生物学角度来看，氧自由基主要是通过脂质过氧化作用、损伤蛋白质与核酸等生物分子而逞毒性作用的。
因此，肝脏氧化损伤是动物和人体所面临的一个非常常见和严重的损伤，可引起动物和人体的衰老和其他疾病的发生，加重机体的衰老和病变。目前，市场上有许多抗肝脏氧化损伤的物质，但是大多数都有不易提取获得，纯度不高，有效成分不明确，价格高等缺点，给应用带来了很大的麻烦。开发一种来源广，纯度高，成分明确，效果好，安全无毒无害的抗肝脏氧化损伤的物质非常的迫切且具有重大的意义。
6-糠基氨基嘌呤是1956年，MLiller在加热灭菌过的鲱鱼精子DNA提取物中发现了一种具有促进细胞分裂活性的小分子化合物。它是一种非天然的细胞分裂素，俗称激动素(kinetin，KT)，分子式C10H9N5O。纯品为白色固体，熔点是265～266℃，系两性化合物。易溶于稀盐酸或稀碱溶液；难溶于水、乙醇、乙醚和丙酮。其结构式为 6-糠基氨基嘌呤是第一个被发现在植物上具有细胞分裂素作用的物质。它除具有促进细胞分裂、分化、和生长的作用外，还具有延缓器官衰老，诱导芽分化，增加气孔开度，诱导愈伤组织长芽，解除顶端优势，打破侧芽休眠和促进种子发芽，延缓蛋白质和叶绿素的降解的作用。主要用于植物组织培养，促进细胞分裂和调节细胞分化，延缓衰老，果蔬保鲜，调节营养物质的运输，促进结实等方面。
已有文献证明，6-糠基氨基嘌呤在植物方面的抗氧化、抗衰老的作用是非常明显的，也有文献报道6-糠基氨基嘌呤能够改善包括逆转衰老对哺乳动物细胞的不良效应，但在动物和人体的内脏器官上的应用还没有人作过尝试。
发明内容
本发明的目的在于，提供化合物6-糠基氨基嘌呤用于制备抗肝损伤药物的应用。
上述肝损伤是指酒精性肝损伤和化学性肝损伤。
酒精性肝损伤包括由酒精引起的脂肪肝、肝纤维化和肝硬化或肝脏系统的疾病。
化学性肝损伤包括由阿斯匹林、保泰松、布洛芬、四环素、红霉素、异菸肼、呋喃妥因，氯丙嗪、甲基多巴、他马唑、雌性激素或某些抗肿瘤药引起的肝内胆汁郁积和肝细胞坏死；或者由三硝基甲苯、四氯化碳、氯奈、丙烯醛、砷、汞、锑、苯胺、氯仿、二甲基甲酰胺、硝基酚、乙醛、有机磷、丙烯晴、铅等化学物质引起的肝脏不同程度的细胞坏死、脂肪变性、肝硬化和肝癌。
化合物6-糠基氨基嘌呤的给药方式为口服给药、注射给药或透皮给药。
化合物6-糠基氨基嘌呤用于制备抗肝损伤药物，可以用于粉剂、片剂、针剂、纳米乳或目前所有剂型的开发应用，用量限定在450mg/kg.b.w以内。
图1是透射电镜观察各组小鼠肝细胞超微结构图(TEM×25000)，其中，A空白对照组小鼠肝细胞结构清晰，线粒体、内质网结构完整；B模型组肝细胞出现空泡变性，核仁消失，染色质增多边集；C化合物6-糠基氨基嘌呤低剂量组肝细胞结构完整，线粒体轻度水肿，嵴模糊；D化合物6-糠基氨基嘌呤高剂量肝细胞损伤轻微，与空白对照组无明显差异。
下面结合附图和发明人给出的具体试验例来进一步说明。
具体实施例方式
申请人经过大量的试验证明，化合物6-糠基氨基嘌呤对动物和人体肝脏具有抗氧化损伤的作用，首次发现了化合物6-糠基氨基嘌呤的抗氧化损伤作用在动物和人体上同样也具有，并证明了化合物6-糠基氨基嘌呤能够用于制备抗肝损伤的药物。
1材料1.1试验药品和试剂化合物6-糠基氨基嘌呤，购于厦门星隆达化学试剂有限公司，由美国Sanland公司生产。用0.06mol/L的盐酸配制成1000mg/L、2000mg/L的储备液，备用。联苯双酯滴丸，浙江万邦药业有限公司，批号050907，临用前用蒸馏水配成10g·L-1的药液；丙二醛(MDA)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20060320。过氧化氢酶(Catalasa CAT)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20060325，超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20060322，考马斯亮兰试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20060323。清蛋白(Alb)检测试剂盒，批号050251，中生北控生物科技股份有限公司；丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(批号D051262)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒(批号D060122)，购自上海复星长征医学科学有限公司。
1.2主要仪器OPECORD50型紫外可见光分光光度计，德国analytikjena公司制造；BS224S万分子一电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HS10268型10～100μL移液器，DRAGONMED公司生产；TD24-WS低速自动平衡离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；H-600透射电子显微镜，日本日立公司；CL8000全自动生化分析仪，日本岛津公司；1.3试验动物及损伤模型复制清洁级ICR小鼠(Mus muscculus)，雌性，体重(20.0±2.0)g，购自西安交通大学医学院实验动物中心，合格证号陕动证字08-004号。
6-糠基氨基嘌呤灌胃给药，给药量按照mg/Kg.b.w计算，每天一次，连续一周。末次给药两小时腹腔注射CCl4溶液，复制小鼠急性肝损伤模型。
2方法2.1分组将小鼠随即分为5组，具体分组如下错误！未找到引用源。组空白对照组，灌胃0.06mol/L盐酸0.4mL，每天一次，连续一周，末次灌胃两小时腹腔注射溶剂油溶液0.2mL，随后动物禁食。
错误！未找到引用源。组CCl4模型组，灌胃0.06mol/L盐酸0.4mL，每天一次，连续一周，末次灌胃两小时腹腔注射3.2％CCl4油溶液0.2mL，复制小鼠急性肝损伤模型，随后动物禁食。
错误！未找到引用源。组联苯双酯组灌胃10g/L联苯双酯药液0.4mL，给药剂量为200mg/Kg.b.w，每天一次，连续一周，末次灌胃两小时腹腔注射3.2％CCl4油溶液0.2mL，复制小鼠急性肝损伤模型，随后动物禁食。
错误！未找到引用源。组化合物6-糠基氨基嘌呤低剂量保护组灌胃1000mg/L 6-糠基氨基嘌呤药液0.4mL，给药剂量为20mg/Kg.b.w，每天一次，连续一周，末次灌胃两小时腹腔注射3.2％CCl4油溶液0.2mL，复制小鼠急性肝损伤模型，随后动物禁食。
错误！未找到引用源。组化合物6-糠基氨基嘌呤高剂量保护组灌胃2000mg/L 6-糠基氨基嘌呤药液0.4mL，给药剂量为40mg/Kg.b.w，每天一次，连续一周，末次灌胃两小时腹腔注射3.2％CCl4油溶液0.2mL，复制小鼠急性肝损伤模型，随后动物禁食。
2.2待测样本采集禁食24小时后快速处死小鼠，并分离血清。取部分肝组织，用冷生理盐水漂洗后制成1％和10％的肝匀浆，离心，取上清液，准备检测各项指标。另取部分肝组织，于冰上快速切成约1mm3的小块，4％戊二醛4℃下固定乙醇逐级脱水，环氧树脂包埋，制作电镜切片，H-600透射电镜下观察肝细胞超微结构。
2.3血清检测指标采用全自动生化分析仪测定ALT、AST活性和Alb含量。
2.4总蛋白的测定按说明书的要求，在测定抗氧化酶和MDA之前，先测定10％肝匀浆的总蛋白含量，以考马斯亮兰法，用紫外可见分光光度计在540nm测定各管A值，按下列公式计算各管的蛋白含量。
蛋白含量(g/L)＝(测定管A值/标准管A值)×标准管浓度(g/L)2.5肝匀浆中T-SOD测定取1％肝匀浆，按照试剂盒要求操作，用紫外可见光分光光度计在550nm处比色(蒸馏水调零，1cm比色杯)。按照如下公式计算T-SOD活力单位 2.6肝匀浆MDA含量的测定取10％肝匀浆，按照试剂盒要求操作，用紫外可见光分光光度计在532nm处比色(蒸馏水调零，1cm比色杯)。按照以下公式计算MDA含量 2.7肝匀浆CAT活性的测定取1％肝匀浆，按照试剂盒要求操作，用紫外可见光分光光度计在240nm处比色(蒸馏水调零，1cm比色杯)。按照以下公式计算CAT酶活力 式中，2.303表示从自然对数换算成常用对数log时必须乘以2.303A***表示血红蛋白或组织蛋白的稀释倍数。
B****表示样品中每毫升血红蛋白克数或每毫升组织蛋白克数。
3结果3.1化合物6-糠基氨基嘌呤对小鼠血清生化指标的影响模型组血清ALT和AST明显增高，血清Alb明显降低，与空白对照组比较均有非常显著差异(P＜0.01)，说明本次实验的小鼠急性肝损伤造模成功。6-糠基氨基嘌呤低剂量组血清ALT活力较模型组明显降低(P＜0.01)，AST活力较模型组明显降低(P＜0.05)、Alb含量较模型组明显升高(P＜0.05)，化合物6-糠基氨基嘌呤高剂量组血清ALT、AST和Alb与模型组比较均有非常显著差异(P＜0.01)，其效果与阳性对照联苯双酯组相似(P＞0.05)。见表1。
表1 化合物6-糠基氨基嘌呤对小鼠血清ALT、AST和Alb的影响 n＝6，X±S
ALT丙氨酸氨基转移酶；AST天冬氨酸氨基转移酶；Alb清蛋白。与阳性对照联苯双酯组比较，经方差分析，两两比较aP＞0.05，与模型组比较，经方差分析，两两比较bP＜0.05，cP＜0.013.2化合物6-糠基氨基嘌呤对小鼠肝组织生化指标的影响6-糠基氨基嘌呤低剂量组肝组织CAT活力较模型组明显升高(P＜0.01)，SOD活力较模型组明显升高(P＜0.05)、MDA含量明显低于模型组(P＜0.05)，6-糠基氨基嘌呤高剂量组肝组织CAT、SOD和MDA与模型组比较均有非常显著差异(P＜0.01)，其效果与阳性对照联苯双酯组相似(P＞0.05)。见表2。
表2 化合物6-糠基氨基嘌呤对小鼠肝组织CAT、SOD和MDA的影响 n＝6，X±S
SOD超氧化物歧化酶；CAT过氧化氢酶；MDA丙二醛。与阳性对照联苯双酯组比较，经方差分析，两两比较aP＞0.05，与模型组比较，经方差分析，两两比较bP＜0.05，cP＜0.013.3透射电镜对急性肝损伤小鼠肝细胞超微结构观察空白对照组小鼠肝细胞细胞器丰富，粗面内质网分布规律，线粒体结构正常，嵴发达且清晰可见，核大而圆，居中，异核膜清晰，核周边圆滑，染色质少而分散，常染色质多而集中，血窦内皮系统未见异常变化(图1A)。CCl4模型组小鼠多数肝细胞肿大，细胞质中出现大量脂滴，以中小脂滴为主；细胞内有大小不等的多数空泡形成，多呈灶状分布；线粒体高度肿胀，嵴排列紊乱，发生局部降解或全部降解，内部结构消失，双层膜结构不清；粗面内质网(RER)轻度肿胀，但处于功能不活跃状态，有部分脱颗粒现象；滑面内质网(SER)增生呈泡状；糖元颗粒明显减少；细胞核边缘不规则，核仁消失，染色质增多边集，核周隙模糊。血窦普遍变窄，多有成堆红细胞瘀积，枯否氏细胞吞噬功能活跃，窦内皮细胞无明显肿胀，狄氏间隙变窄，肝细胞窦面微绒毛减少(图1B)。6-糠基氨基嘌呤低剂量组细胞核边缘不整齐，较模型组轻，核周隙模糊，线粒体轻度水肿，嵴模糊(图1C)。6-糠基氨基嘌呤高剂量组肝细胞核基本正常，核周隙清晰，线粒体清晰可见，嵴减少较模型组明显改善接近空白对照组，血窦宽度与空白对照组无显著差异，灶性红细胞瘀积现象消失，狄氏间隙变宽(图1D)。
4结论实验结果表明，化合物6-糠基氨基嘌呤对CCl4急性损伤造成的肝组织CAT降低、SOD降低、MDA升高具有抑制作用，6-糠基氨基嘌呤组各项指标同模型组相比均具有显著差异(P＜0.01)；同时由电镜观察化合物6-糠基氨基嘌呤能维持肝细胞正常超微结构，同时保护细胞粗面内质网，细胞膜，核膜，线粒体等亚细胞结构。通过该实验可以证明6-糠基氨基嘌呤具有保护小鼠急性肝损伤作用。
权利要求
1.化合物6-糠基氨基嘌呤用于制备抗肝损伤药物的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肝损伤是酒精性肝损伤和化学性肝损伤。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的酒精性肝损伤包括由酒精引起的脂肪肝、肝纤维化和肝硬化或肝脏系统的疾病。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的化学性肝损伤包括由阿斯匹林、保泰松、布洛芬、四环素、红霉素、异菸肼、呋喃妥因，氯丙嗪、甲基多巴、他马唑、雌性激素或某些抗肿瘤药引起的肝内胆汁郁积和肝细胞坏死；或者由三硝基甲苯、四氯化碳、氯奈、丙烯醛、砷、汞、锑、苯胺、氯仿、二甲基甲酰胺、硝基酚、乙醛、有机磷、丙烯晴、铅等化学物质引起的肝脏不同程度的细胞坏死、脂肪变性、肝硬化和肝癌。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的化合物6-糠基氨基嘌呤的给药方式为口服给药、注射给药或透皮给药。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的化合物6-糠基氨基嘌呤的药物剂型为粉剂、片剂、针剂、纳米乳或现有的所有剂型。
全文摘要
本发明公开了化合物6－糠基氨基嘌呤用于制备抗肝损伤药物的应用，经实验证明，化合物6－糠基氨基嘌呤能局部提高机体肝脏抗氧化损伤能力，对肝坏死、肝硬化等肝脏疾病以及机体衰老都有一定保护作用。化合物6－糠基氨基嘌呤作为外源性嘌呤类物质，可以发挥动、植物激素样作用，有助于小鼠抵抗外来的氧化损伤，促进抗氧化酶合成，能直接捕捉、清除自由基，从而阻止或抑制氧自由基反应和脂质过氧化反应，并维持细胞膜完整性。
文档编号A61P1/16GK101036653SQ20071001761
公开日2007年9月19日 申请日期2007年4月3日 优先权日2007年4月3日
发明者欧阳五庆, 茹琴 申请人:西北农林科技大学