依博素及其质量控制方法

专利名称：：依博素及其质量控制方法
技术领域：
：本发明涉及依博素及其质量控制方法，属药物领域。
背景技术：
：类风湿性关节炎属于自身免疫性疾病，为常见病、多发病，目前仍缺乏有效治疗手段，在美国被列为危害人类健康的五大疾病之一，严重患者丧失工作能力。具冊o统计全世界患者达1.65亿，据了解我国患者多达2000万。依博素是经研究发现的一种具有抗白细胞介素l受体活性的微生物多糖，为链霉菌的代谢产物，在国内外属首次报导，已申请并获得国家专利(专利申请号99110826.4)，该产生菌由中国医学科学院医药生物技术研究所分离自我国四川省峨嵋山土壤，经中国科学院微生物研究所对菌种进行分类鉴定，根据菌种形态，培养特征及分子生物学分类等研究确定其为唐得链霉菌。据研究结果显示，依博素是一种新型结构微生物胞外多糖，由8种单糖组成，其种类为鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖和半乳糖醛酸。具有较强的抗炎作用，亦具有明显的镇痛作用，对于急性、亚急性及慢性炎症，特别对于类风湿性关节炎有显著的抑制作用。随着科学技术的不断发展，药物也必须在保证产品质量稳定可控的基础上，才能不断的更新发展，由于依博素在国内外无生产和使用报导，产品的质量控制方法没有确定的标准，也没有统一有效的控制方法。因此，如何制定合理有效的质量控制方法，控制这种微生物多糖的质量，保证用药的安全性，使工艺控制更加严格合理，使广大消费者更加了解产品质量，是我们需要去研究解决的问题。在专利申请号:99110826.4实施例3中提到"多糖的鉴定方法为l.采用了凝胶色谱法测定了139A多糖的分子量，2.毛细管电泳分析确定多糖的组成"。通过该方法只能鉴定多糖的分子量和组成摩尔，仅凭这两点对于依博素的鉴定和质量控制是远远不够的。对于一种药物的质量控制我们必须要进行定性和定量的分析，从性状、鉴别、检査到含量测定。只有通过全面详细的质量控制方法的检测才能获得安全、合格的药物，从而制备出高效，优质的药物更好的为广大患者服务，也才能获得良好的经济效益。针对这些缺陷，本发明人通过全面的、科学的研究建立了一套质量控制方法。它包括l.性状:'外观、色、臭、味以及溶解性的测定；鉴别:采用紫外、红外吸收、颜色反应以及气，质联用色谱法中任一项或全部鉴别;检査:干燥失重、灼灼残渣、重金属、蛋白质检査以及对分子量检测中的部分或全部；含量:药物中多糖的含量测定。这一质量控制方法操作简单，专属性强，稳定性好，精确度高的用于依博素质量控制的方法。
发明内容本发明的技术方案是提供了依博素及其质量控制方法。本发明提供了依博素，它含有多糖，其中，多糖中含有单糖的重量百分比为鼠李糖3.0%-4.0%、木糖4.0%_6.0%、葡萄糖0.0%-4.0%、甘露糖3.0%-7.0%、阿拉伯糖12%-30%、岩藻糖3.0%-7.0%、半乳糖12%-40%和半乳糖醛酸3.0%-5.5%等8种单糖。采用分子排阻色谱法测定其峰位分子量为40.0xl04-90.0x104。进一步优选地，多糖中含有单糖的重量百分比为鼠李糖3.2%、木糖4.9%、葡萄糖3.9%、甘露糖6.8%、阿拉伯糖29.7%、岩藻糖6.8%、半乳糖39.4%和半乳糖醛酸5.3%。其中，依博素中含多糖以八种单糖总量计，重量百分含量不得少于85.0%本发明还提供了一种控制所述的依博素的质量的方法，其中包括定性控制和定量控制；其中定性控制为包括外观、溶解性、颜色反应、紫外吸收光谱、红外吸收光谱、高压液相色谱、纯度检査；含量测定，采用苯酚-硫酸比色法测定检测波长为400-600nm。其中，所述的定量测定方法具体为照苯酚-硫酸比色法测定检测波长为400-600nm;称取苯酚于烧瓶中，加入铝片，碳酸氢钠，加热蒸馏，收集180-185'C馏分，置棕色容量瓶中，加蒸馏水至刻度溶解，即得苯酚溶液；按组成该微生物多糖的八种单糖的比例，精密称取干燥至恒重的鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖、半乳糖醛酸八种单糖，置容量瓶中溶解并定容；量取10-20ml于量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得对照品溶液；取本发明所述微生物多糖，精密称取，置容量瓶中，溶解定溶即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，置试管中分别加入苯酚溶液，混匀，迅速加入浓硫酸，摇匀后放置至室温，在400-600nm处测定吸光度值。更具体的含量测定方法为照苯酚-硫酸比色法测定检测波长为400-600nm;称取苯酚90-110g于烧瓶中，加入0.05-0.2g铝片，0.02-O.lg碳酸氢钠，加热蒸馏，收集180-185'C馏分2-10g，置于100ml棕色容量瓶中，加蒸馏水至刻度溶解，即得苯酚溶液；按组成该微生物多糖的八种单糖的比例，精密称取干燥至恒重的鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖、半乳糖醛酸八种单糖共504.8mg,置于500ml容量瓶中溶解并定容。量取10-20ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即成浓度为101.0-201.9mg/ml的对照品溶液；取本发明所述微生物多糖，精密称取，置500ml容量瓶中，溶解定溶即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液1.0-3.0ml，置试管中分别加入5%苯酚溶液1.0-3.0ml，混匀，迅速加入浓硫酸5-8ml，摇匀后放置至室温，在400-600nm处测定吸光度值；本发明中，该微生物多糖所含多糖以八种单糖总量计，不得少于80.0%。其中，所述的定性控制方法中，颜色反应采用ct-萘酚为检测试剂。所述的定性控制方法中，紫外吸收光谱在190"00nm波长范围内记录紫外光谱。所述的定性控制方法中，红外吸收光谱具有六个吸收带35003300cm";3000-2900cnT1;17501600cnT、14501200cm";1100~1000cnf1;890cnT1，在890cm"左右为弱吸收。所述的定性控制方法中，高压液相色谱法中，色谱条件为仪器高效液相色谱仪，示差折光检测器；色谱柱G6000PWXL(7.8mm-300mm);流动相0.7%硫酸钠溶液；流速0.5ml/min;检测器WatersR401型示差折光检测器；检测器参数RI=1;柱温35'C，进样量样品为25lU，标样为100U1。本发明所提供的质量控制方法灵敏度高、专属性强，操作简便，易于检测，是该微生物多糖理想的质量控制方法。图l依博素的ABEE衍生物与标准单糖ABEE衍生物的毛细管电泳谱图(A:标准单糖ABEE衍生物，B:依博素的ABEE衍生物。1:ABEE,2:氨基半乳糖，3:鼠李糖，4:木糖，5:葡萄糖，6:甘露糖，7:阿拉伯糖，8:岩藻糖，9:半乳糖，10:葡萄糖醛酸，11:吲哚乙酸(内标物)，12:半乳糖醛酸。)图2依博素糖链的部分甲基部分乙酰基糖醇乙酸酯衍生物的GCMS总离子流图(无编号的为污染物峰)。图3依博素红外吸收光谱图4依博素高压液相色谱具体实施例方式实施例1单糖的组成分析1.1实验仪器和条件实验仪器自装毛细管电泳系统，石英毛细管(45cmX50jim);LKB2238紫外检测器电解液75mM硼砂，pH为10.35电泳电压15KV电泳电流30jiA检测波长214nm1.2单糖的对氨基苯甲酸乙酯(ABEE)衍生物的制备称取依博素lmg，样品溶解在2mL的三氟乙酸水溶液(4moI/L)中，充氮气后，在IOO'C保温4小时，氮气吹干后，加入ABEE16,5mg，NaBH3CN3.5mg，加入甲醇50fiL，含10%冰醋酸的水溶液10pL，置于80'C反应1小时，氮气吹干，加入三氯甲烷和水各0.5mL到反应瓶中，充分振荡后收集水相进行毛细管电泳分析。1.3单糖的定性分析将标准的单糖制备成ABEE衍生物，与样品在同样条件下进行电泳分析，将样品与标准单糖电泳峰的保留时间相比较定性。1.4单糖的定量采用峰面积归一化方法1.5测定结果图1是依博素的ABEE衍生物与标准单糖ABEE衍生物的毛细管电泳比较。定性结果是依博素糖链含有鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖和半乳糖醛酸。各种单糖的面积百分含量见表l。表1各种单糖的峰面积百分含量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.单糖的连接点分析2.1实验仪器和条件实验仪器ShimadzuQP5050型气相色谱(GC)/质谱(MS)联用仪。2.1.1GC条件色谱柱DB-5MS石英毛细管柱(0.32mmX30m，膜厚0.25pm)柱温初始温度为120'C，以每分钟5'C升到250'C进样器温度260'C载气氦气流速41cm/s。2.1.2MS条件EI源温度250'C离子化电势70eVCI源温度250'C反应气异丁烷。2.2依博素多糖的部分甲基部分乙酰基糖醇乙酸酯的制备2.2.1甲基化反应称取5mg的依博素多糖，经真空干燥过夜。加入IOmL二甲基亚砜(DMSO),^^:密封后超卢溶解lTImin，加AfFM^aOH^末(Img),充氮^WffS浴中超声振荡10min。置于冰箱4'C下5min，取出后加入与DMSO相等体积的碘甲烷，充入氮气后避光在室温下静置4hr。加入10mL水终止反应，加入10mL三氯甲垸萃取后离心，并移去水相，有机相用氮气吹干。真空干燥后再进行一次甲基化反应。2.2.2水解反应将甲基化后的依博素样品溶解在3mL的三氟乙酸水溶液(2mol/L)中，在12(TC保温2小时，氮气吹干后，加入1mLNaOH水溶液(0.05mol/L)中，加入40-50mg的硼氢化钠，室温放置过夜，滴入乙酸至无气泡为止。氮气吹干，加入甲醇再用氮气吹干的步骤重复5次。真空干燥过夜。2.2.3乙酰化反应加入吡啶O.SmL至反应管中，乙酸酐0,5mL，在90'C下保温30min后，用氮气除去反应试剂。加入1mL的二氯甲垸溶解，过滤后收集二氯甲烷相，用氮气吹干后再用二氯甲垸定容，待GC/MS分析。2.3部分甲基部分乙酰基糖醇乙酸酯的定性分析应用GC/CIMS和GC/EIMS测定依博素多糖的部分甲基部分乙酰基糖醇乙酸酯衍生物的结构。2.4部分甲基部分乙酰基糖醇乙酸酯的定量分析依博素糖链的部分甲基部分乙酰基糖醇乙酸酯的定量分析是依据E.c.r.'理论。即色谱峰面积除以响应因子得到相对摩尔数。2.5测定结果与结论通过对依博素多糖的部分甲基部分乙酰基糖醇乙酸酯衍生物的GC/CIMS测定，衍生物都得到准分子离子峰(M+l)+和(M+l)+-60(乙酸)的基峰。GC/MS的总离子流图见图2。表2给出了CIMS测定得到的每个峰的分子量。从表中看出测定值与理论值完全相符。表2依博素糖链单糖部分甲基部分乙酰基糖醇乙酸酯衍生物的分子量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>经EIMS测定，将EIMS谱图与标准EIMS谱图对比确定每个峰的分子结构，从而得到各种单糖的连接位置。表3给出了每个衍生物的离子碎片峰。各种单糖的连接位置和相对摩尔数给在表4。图15~26是EIMS谱图。表3依博素糖链生成的离子碎片峰<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表4依博素糖链单糖的连接点和相对摩尔数<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*2，3，4-Me3-Ara/的摩尔数作为1。3.小结将依博素经三氣乙酸水解，然后将单糖衍生为对氨基苯甲酸乙酯衍生物，应用毛细管电泳技术分析，采用与标准单糖保留时间对比方法定性，峰面积归一化方法定量，其结果是依博素糖链含有鼠李糖3.2%、木糖4.9%、葡萄糖3.9%、甘露糖6.8%、阿拉伯糖29.7%、岩藻糖6.8%、半乳糖39.4%和半乳糖醛酸5.3%。将依博素糖链进行甲基化反应，然后进行酸水解，再将水解的部分甲基化单糖进行还原和乙酰化反应。最后将生成的单糖部分甲基部分乙酰基糖醇乙酸酯衍生物进行GC/CIMS和GC/EIMS测定。经过对GC/CIMS和GC/EIMS测定的结果进行分析。确定每个色谱峰的结构。每个糖残基的定量是色谱峰面积除以响应因子得到相对摩尔数。其结果是依博素多糖链是以一4)Ara(1—和一4)Gal(1—为主链，有少量的一4)Xyl(1—和一6)Gal(1—糖苷键，Rhm、Ara和Man分别在2、3、6位有分枝，还有少量的Ara、Fuc、Man和Glc处于分子边缘。实施例2定性控制方法1.性状1.1本品为类白色粉末，无臭无味。1.2溶解性本品溶解于水，不溶于氯仿等有机溶剂。2.鉴别2.1颜色反应取本品少许，用l.Oml蒸馏水溶解于试管中，加入a-萘酚2滴混匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸lml，然后小心竖起试管，硫酸与样品溶液分为二层，两液间有紫色环出现。a-萘酚试剂称取2克萘酚溶于95%乙醇，稀释至100ml，临用前新配。2.2紫外吸收光谱仪器岛津UV2201PC分光光度计照分光光度法(中国药典2005年版二部附录IVA)测定，在l卯400nm波长范围内记录紫外光谱。取本品，分别用水、O.lNHCl、O.lNNaOH配制成每毫升含250吗样品的溶液，按照分光光度法(中国药典2000版二部附录IVA)测定，在190400nm波长范围内记录紫外光谱，水溶液为末端吸收，O.lNHCl溶液最大吸收波长为206nm,O.lNNaOH溶液的最大吸收波长为216nm。样品测定前，根据药典要求做了仪器的校正和鉴定工作，仪器符合药典要求。2.3红外吸收光谱:'仪器美国尼高力公司傅立叶变换红外光谱仪(IMPACT400)取本品，经KBr压片，照红外分光光度法(中国药典2000年版二部附录IVC)，应具有六个吸收带35003300cm、3000~2卯0cm1;17501600cm、1450~1200cm1;lKHKlOOOcm1;890cm1,在8卯cm"左右为弱吸收。35003300cm_1(强宽峰)是由分子内和分子间羟基(糖羟基和羧基)形成多种方式的氢建所致，17501600cm"间的峰是C-O伸展振动吸收峰；14501200cm、中等强度)是与O相连的亚甲基的弯曲振动和醚键C-O-C伸缩振动吸收峰；11001000cm'、强峰)是C-OH的伸缩振动峰。见图3。2.4高压液相色谱法2.4.1方法的选择经测试，本品分子量为80万左右，按照高压液相色谱法(中国药典2000版附录VH),采用多糖专用凝胶柱(G6000PWXL),经多批测定，本品峰位分子量为75.0x10、83.6x104。2.4.2色谱条件仪器高效液相色谱仪，示差折光检测器。色谱柱G6000PWXL(7.8mm-300mm)流动相0.7%硫酸钠溶液流速0.5ml/min检测器WatersR401型示差折光检测器检测器参数RI-1柱温35"C进样量样品为25iU，标样为100iU。标样为已知分子量(重均分子量为50001400000)的系列右旋糖酐。其分子量分别为5.72万、14.4万、38.5万、56.3万、98.1万、140万。2.4.3测定方法取本品10mg，加流动相至lml，振摇，室温放置过夜，取25lU注入液相色谱仪，记录色谱图。标样配制取右旋糖酐分子量对照品10mg，加流动相溶解并稀释至10mg/ml，系列对照分子量5.72万、14.4万、38.5万、56.3万、98.1万、140万，进样100ul。本品在色谱图中峰位分子量为75.0xl04~83.6xl04。见图4。实施例3定量控制方法1方法的选择-本方法参照苯酚-硫酸比色法测定多糖的原理，即多糖被浓硫酸水合产生的高温迅速水解成单糖，该单糖在强酸性条件下，与苯酚反应生成棕色衍生物。它在490nrn处有最大吸收，其吸光度与浓度呈线性关系。2操作方法2.1苯酚液的配制称取苯酚100g于烧瓶中，加入O.lg铝片，0.05g碳酸氢钠，加热蒸馏，收集182'C馏分5g，置于10Q迈1棕色容量瓶中，加蒸馏水至刻度溶解备用。2.2标准液的制备按组成依博素的八种单糖的比例，依下表精密称取干燥至恒重的鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖、半乳糖醛酸八种单糖共504.8mg,置于500ml容量瓶中溶解并定容。量取15ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即成浓度为151.4mg/ml的对照品溶液。_单糖鼠李糖木糖葡萄糖甘露糖阿拉伯糖岩藻糖半乳糖半乳糖醛酸称重(mg)7.3920.2813.7869.22166.6822.50174.8030.132.3标准曲线的制备:取8支试管，1支精密吸取1.5ml蒸馏水作空白对照;其余7支分别加入0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.5毫升八种单糖对照品(151.4ug/ml)，用水补足到1.5毫升，然后每支试管加入5%苯酚溶液2.0ml，混匀，迅速加入浓硫酸6.5ml，摇匀后放置至室温，在490nm处测定吸光度值。得回归方程A-0.006C+0.0549,r=0.9993。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.4精密度试验精密吸取稀释成101.0ug/ml的八种单糖对照品溶液1.5ml,8份，按标准曲线项下方法操作，结果RSD-1.44X。2.5反应液的稳定性试验精密吸取稀释成50.48pg/ml的八种单糖对照品溶液1.5ml，按标准曲线项下方法操作，测反应完成后样品在不同时间内的吸光度值，结果0.5h内吸收度稳定。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>反应完成后半小时内立即测定吸收度。2.6样品含量测定精密称取干燥至恒重的三批供试品各50mg，置于500ml容量瓶中溶解并定容,其浓度为Cr。分别精密吸取1.5ml按标准曲线项下方法操作，测定吸光度，根据标准曲线计算多糖含量Cs，并按下式计算多糖含量多糖含量(％)=Cs/CtX100%<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>样品多糖含量不得低于85.0%。2.7加样回收实验精密吸取1.0ml样品液，5份，分别加入不同量的对照品液，使其总体积为1.5ml,以下按标准曲线项下方法操作。结果见下表加样回收率实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>测得平均回收率为98.2%,RSD=1.96%(n=9)。权利要求1、依博素，其特征在于它含有多糖，其中，多糖中含有单糖的重量百分比为鼠李糖3.0％-4.0％、木糖4.0％-6.0％、葡萄糖0.0％-4.0％、甘露糖3.0％-7.0％、阿拉伯糖12％-30％、岩藻糖3.0％-7.0％、半乳糖12％-40％和半乳糖醛酸3.0％-5.5％8种单糖；采用分子排阻色谱法测定其峰位分子量为40.0×104-90.0×104。2、根据权利要求1所述的依博素，其中多糖中含有单糖的重量百分比为鼠李糖3.2%、木糖4.9%、葡萄糖3.9%、甘露糖6.8%、阿拉伯糖29.7%、岩藻糖6.8%、半乳糖39.4%和半乳糖醛酸5.3%。采用分子排阻色谱法测定其峰位分子量为75.0xl04-3、根据权利要求1或2所述的依博素，其特征在于依博素中含多糖以八种单糖总量计，重量百分含量不得少于85.0%4、一种控制权利要求l-3任一项所述的依博素的质量的方法，其中包括定性控制和定量控制；其中定性控制为包括外观、溶解性、颜色反应、紫外吸收光谱、红外吸收光谱、高压液相色谱、纯度检查；含量测定，采用苯酚-硫酸比色法测定检测波长为400-600nm。5、根据权利要求4所述的依博素的质量控制方法，其特征在于所述的定量测定方法具体为照苯酚-硫酸比色法测定检测波长为400-600nm;称取苯酚于烧瓶中，加入铝片，碳酸氢钠，加热蒸馏，收集180-185'C馏分，置棕色容量瓶中，加蒸馏水至刻度溶解，即得苯酚溶液；按组成该微生物多糖的八种单糖的比例，精密称取干燥至恒重的鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖、半乳糖醛酸八种单糖，置容量瓶中溶解并定容；量取10-20ml于量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得对照品溶液；取本发明所述微生物多糖，精密称取，置容量瓶中，溶解定溶即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，置试管中分别加入苯酚溶液，混匀，迅速加入浓硫酸，摇匀后放置至室温，在400-600nm处测定吸光度值。6、根据权利要求4所述的依博素的质量控制方法，其特征在于所述的定性控制方法中，颜色反应采用a-萘酚为检测试剂。7、根据权利要求4所述的依博素的质量控制方法，其特征在于所述的定性控制方法中，紫外吸收光谱在l卯一00nm波长范围内记录紫外光谱。8、根据权利要求4所述的依博素的质量控制方法，其特征在于所述的定性控制方法中，红外吸收光谱具有六个吸收带35003300cnT1;3000~2900cm";17501600cm";1450-1200cm1;1100-1000cm1;890cm1，在890cm1为弱吸收。9、根据权利要求4所述的依博素的质量控制方法，其特征在于所述的定性控制方法中，高压液相色谱法中，色谱条件为仪器高效液相色谱仪，示差折光检测器；色谱柱G6000PWXL(7.8mm-300mm);流动相0.7%硫酸钠溶液；流速0.5ml/min;检测器..WatersR401型示差折光检测器；检测器参数RI-1;柱温35'C，进样量样品为25ul，标样为100ul。全文摘要本发明提供了依博素，它含有多糖，其中，多糖中含有单糖的重量百分比主鼠李糖3.0％-4.0％、木糖4.0％-6.0％、葡萄糖0.0％-2.0％、甘露糖3.0％-5.0％、阿拉伯糖16％-12％、岩藻糖3.0％-5.0％、半乳糖12％-19％和半乳糖醛酸3.0％-5.0％等8种单糖。采用分子排阻色谱法测定其峰位分子量为40.0×10⁴-90.0×10⁴。本发明还提供了控制该依博素质量的方法。本发明所提供的质量控制方法灵敏度高、专属性强，操作简便，易于检测，是该微生物多糖理想的质量控制方法。文档编号A61K31/715GK101306006SQ20071004909公开日2008年11月19日申请日期2007年5月14日优先权日2007年5月14日发明者吴剑波,蓉姜,洋张,张宝华,彭红卫,元李,李好雨,李宝义,伟杨,石莲英,董兆勇,娟蒋,斌赵,郭连宏,陈春会申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所;四川恒星生物医药有限公司