专利名称：一种软骨组织工程支架及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于软骨组织工程的双层胶原支架，尤其是一种用于人体内软骨修复及体外软骨组织工程构建的支架。
背景技术：
随着人们对健康要求的提高，崇尚运动的人越来越多，软骨、骨、肌腱等的损伤比较常见，也越来越多。人的关节软骨每天都承受着各种活动引起的机械力，并且人到中年后肌肉功能逐渐减退，容易导致关节损伤，软骨破坏，而软骨自身修复能力很弱，持续发展会导致软骨变性，从而发生骨软骨炎。在中国年龄50岁以上的人群中，骨关节炎患病率为50％，而75岁以上的人群中患病率达80％，其中53％的严重病例会导致关节功能丧失，甚至丧失劳动和生活自理的能力。因此软骨修复问题刻不容缓，但软骨的再生是面临的一大难题。目前临床上主要用骨膜或不可降解或可降解的生物材料来修复。但是这些治疗方法都有其固有的缺陷。如降解产物对机体的不良反应，不可降解的材料引起机体的排异反应和远期效果不好等。
当今应用的多是高分子材料或是胶原海绵等支架传递软骨细胞修复软骨缺损，但医用高分子材料昂贵且其降解产物对组织有破化性，而单层胶原海绵修复的软骨缺损有较多的骨生成，没有阻挡作用，寻找一种生物学性能良好、又能提供足够相通的细胞组织容纳空间、同时又具备阻挡作用的支架，成为本发明的出发点。
发明内容本发明是为了提供一种具有良好生物学性能和足够相通的细胞组织容纳空间、同时又具备阻挡作用的软骨组织工程支架。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是一种软骨组织工程支架，主要由致密层胶原和疏松层胶原复合而成，致密层胶原孔径为10～50μm，疏松层胶原孔径为50～300μm，所述的致密层胶原和疏松层胶原相连通。
所述软骨组织工程支架可复合生长因子(1ng～1mg/cm3)，生长因子可为FGF-b，BMP2，PDGF，IGF，VEGF中的一种或多种的混合物。
本发明还涉及制备所述的软骨组织工程支架的方法，所述方法按如下步骤进行首先将质量浓度1～15％的胶原溶液制成胶原海绵，压扁后再加入质量浓度1～15％的胶原溶液，冻干，即得所述软骨组织工程双层胶原支架。
复合生长因子时，可采用将所得的双层支架用物理冻干或化学交联的方法进行。
所述的双层组织工程支架可应用于生物体内组织修补。如体内植入进行软骨、骨、肌腱、韧带、神经，皮肤等各种组织修补。所述的双层组织工程支架也可应用于生物体外组织构建。如体外接种各种间质干细胞、纤维细胞或纤维母细胞等。
本发明是在以前研究的基础上进一步提高，构想出双层胶原支架。从而实现一个支架同时具备有良好生物学性能和足够相通的细胞组织容纳空间，又具备阻挡作用，但又能让营养物质自由出入。此发明将促进软骨组织工程技术走向临床化和产业化。
本发明的有益效果主要体现在本发明支架的双层结构既具有良好生物学性能、足够相通的细胞组织容纳空间，又具有阻挡作用；疏松层可以让细胞自由生长和黏附，致密层可以阻挡其他细胞的进入，同时不妨碍营养物质的自由进出；本发明支架所用材料容易获得、生物学性能优良，抗原性很小或没有；本发明的支架的同时具有两种大小不同的孔隙和良好生物学性能；本发明还可与PLA、PGA等其他力学性能优异但生物学性能较差的生物材料复合，组成力学性能和生物学性能都很优异的支架系统；本发明支架适合于软骨、骨、肌腱、皮肤等组织的修复和组织工程。
图1为胶原支架疏松层电镜照片；图2为胶原支架致密层电镜照片；图3为胶原支架疏松层与致密层交界处电镜照片。
图4为双层胶原支架修复兔软骨缺损图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1用酸提法提取的肌腱胶原蛋白(可采用Schor方法取新鲜大白鼠尾腱10g，置于1∶1000新洁尔灭液内浸泡10分钟～15分钟，取出后以生理盐水反复冲洗5次以上，倒掉生理盐水，用剪刀修成1mm3左右的组织块、放入锥形烧瓶内，加入含1MNaCl的0.05MTris/HCl(PH7.5)溶液100ml进行前提取，以除去非胶原性杂质。在4℃冰箱内放置4天，每天定时振摇4次～6次。4天后弃去上清液，加入0.5M乙酸400ml，4℃下提取4天，并定时振摇。然后高速低温离心3小时(2000g)，去除不溶解的碎片，其上清液即为液态粗制胶原。在粗制胶原液中加入等量的20％NaCl液，胶原即以白色絮状沉淀析出，2000g高速离心3小时，以生理盐水清洗沉淀物数遍后，将胶原沉淀物再次溶入400ml0.5M乙酸内，放入透析带内用10倍体积的三蒸水透析2天，排除Na离子和CL离子，每天换蒸馏水2次，最后将胶原液2000g离心过夜，吸取上清液即精制胶原液，贮存于4℃冰箱内。)，经-70度冷冻后，冰冻抽干机抽干后，可得到胶原海绵(电镜照片见图1)，压扁后(电镜照片见图2)，在上面加入胶原溶液后，再次冻干可得到双层胶原支架，两者的交界处电镜照片见图3。其中疏松层胶原孔径为100～300μm，致密层胶原孔径为10～50μm。
实施例2将实施例1所得的双层支架用物理冻干或化学交联的方法复合生长因子，可单独或分别复合FGF，BMP2，IGF，VEGF，PDGF等。
实施例3将实施例1所得的双层支架修复兔软骨缺损，软骨修复良好(见图4)。
实施例4将实施例1所得的双层支架种上间充质干细胞，体外静态培养，细胞粘附和生长良好。
权利要求
1.一种软骨组织工程支架，主要由致密层胶原和疏松层胶原复合而成，致密层胶原孔径为15～50μm，疏松层胶原孔径为100～300μm，所述的致密层胶原和疏松层胶原相连通。
2.如权利要求1所述的软骨组织工程支架，其特征在于所述组织工程胶原支架内复合1ng～1mg/cm3的生长因子。
3.如权利要求2所述的软骨组织工程支架，其特征在于所述生长因子为下列之一或其中两种或两种以上的混合物FGF-b，BMP2，PDGF，IGF，VEGF。
4.制备如权利要求1所述的软骨组织工程支架的方法，所述方法按如下步骤进行首先将质量浓度1～15％的胶原溶液制成胶原海绵，压扁后再加入质量浓度1～15％的胶原溶液，冻干，即得所述软骨组织工程支架。
5.如权利要求1所述的软骨组织工程支架在生物体内组织修补或加强中的应用。
6.所述权利要求1所述的软骨组织工程支架在生物体外组织构建中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种新型双层软骨组织工程支架，由致密层和疏松层构成，致密层和疏松层相连通，它具有良好的生物学性能并提供足够相通的细胞组织容纳空间，同时又具备阻挡作用但营养物质可以自由出入。它能更好的用于人体内软骨修复及体外软骨组织的构建。这种新型支架还可以容易的与其它各种生物材料组成复合支架，综合各种材料的优点从而更好的应用于软骨组织工程。具体制作时，将用酸提法获得的胶原蛋白做成不同浓度的溶液，经冰冻抽干机抽干后得到胶原海绵，压扁后，再注入不同浓度的胶原蛋白溶液，再次抽干，就得到双层支架。支架的孔径与浓度有关，我们可以用不同的浓度控制支架的孔径。
文档编号A61L31/14GK101066475SQ20071006876
公开日2007年11月7日 申请日期2007年5月25日 优先权日2007年5月25日
发明者欧阳宏伟, 齐义营 申请人:浙江大学