专利名称：：鳐血管生成抑制因子1的分离、一级结构及其用于制备抑制血管生成和防治肿瘤药物的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种源于鳐的强抗肿瘤生长、转移的鳐血管生成抑制因子1的分离纯化、一级结构即氨基酸组成和序列，及其在制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物中的应用。发明背彔血管生成是从原已存在的血管，如毛细血管和毛细血管后微静脉生成新血管的过程。控制正常组织血管生成的机制并不能控制肿瘤的血管生成，肿瘤血管生成是由肿瘤血管生成因子与肿瘤血管生成抑制因子共同调控的。95%的癌症最后均形成肿块，称为实体瘤。实体恶性肿瘤细胞早期在无血管生长的情况下可通过周围组织的弥散作用来获得营养，肿瘤的体积一般不超过23mm3。当体积增至23mm3时，肿瘤已不能单纯依靠弥散获取氧气及营养物貭，如果没有新生毛细血管生成，肿痼组织将保持休眠状态或发生退化。新血管的形成是肿瘤转移的必要条件，肿瘤的浸润和转移依赖肿瘤血管的生成。随着肿癯微血管密度的增加，肿瘤侵袭转移等恶性潜能也明显增加。微血管密度被认为是预测肿瘤转移、复发和预后的一项指标。肿瘤血管生成因子，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板源生长因子(PDGF)等，能促进肿瘤新生微血管的生长。抗血管生成疗法旨在抑制肿瘤血管生长，使肿瘤得不到足够的营养和氧气而萎縮。当肿瘤半径萎縮到小于2mm，肿瘤细胞距离毛细血管0.2111111以上时，氧气将无法通过弥散作用抵达肿瘤细胞，肿瘤细胞既不能从肿瘤血管处得到营养和氧气，也无法从周围血管通过弥散作用得到营养和氧气，肿瘤组织于是发生退化或处于长期休眠期。与传统的治疗方法相比，血管生成抑制剂具有遗传稳定、特异性高和容易达到靶细胞等诸多优点，肿瘤血管生成的各个环节及其调节因子均可作为血管生成抑制剂的作用靶点。按照作用机制不同，肿瘤血管生成抑制剂大体可分为抑制基底膜降解、抑制内皮细胞增殖功能、阻断血管生成因子、阻断内皮细胞特异性整合素和非特异性作用机制等。近年来，我国的科技工作者也开始进行肿瘤血管生成抑制剂的寻找和研究工作，取得了可喜的进展。中科院上海药物研究所发现来源于天然产物的新化合物PAA、DYB、ZH-1等具有抑制新生血管生成作用，中山大学正在研发的内皮抑素已进入临床试验。期刊上也出现了多篇有学术价值的报道。美国基因技术研究所的科学家在1989年成功克隆VEGF，1993年又制造出VEGF的抗体Avastln，2004年美国FDA批准Avastln上市，用于一线治疗转移性结、直肠癌。Avastln是一种抗血管生成的新型抗癌药，是一种人源性的单克隆抗体，其作用机制是抑制新生血管生成，从而阻断肿瘤生长的血液供应，抑制肿瘤生长与转移。与传统化疗药物结合使用，可延长结肠癌患者的生存期，这种"饿死肿瘤"的疗法被美国《科学》杂志评为2003年十大科学突破。王宁等通过VEGF单克隆抗体Avastln联合或不联合氟尿嘧啶对人类胃癌裸鼠原位种植模型的肿瘤生长和转移进行干预治疗，探讨Avastln对胃癌生长、转移和血管生成的影响。结果发现，和对照组相比，氟尿嘧啶单用组、Avastln单用组和联合用药组原位移植肿瘤重量明显降低.抑瘤率分别为37.52%、58.76%和98.51%。Avastln单用组和联合用药组微血管密度均比对照组明显减少(8.40±1.26和7.20±1.23vs15.30±1.06)。Avastln和氟尿嘧啶联合应用不仅对原位肿瘤的生长抑制最为明显，而且对肝脏转移有显著的抑制作用。因此，Avastln和传统细胞毒化疗药物联合应用对胃癌的治疗效果更显著。抗血管生成疗法治疗实体瘤目前已取得了巨大的进展，并且相对于传统的肿瘤治疗方法有许多优点，如不易产生耐药性，可抑制肿瘤转移，以血管为耙，对多种肿瘤有效等等。但是在临床应用中仍然有很多问题亟待解决(l)使用周期长，用药剂量大；(2)大剂量长期用药使药物毒性加大；(3)费用相对较高，患者难以承受；(4)药物在体内的半衰期短，药物的使用剂量大和次数频。目前极需寻找能克服上述缺点的强效的血管生成抑制因子。肿瘤血管生成是一个受众多生长因子调节的复杂的生理、病理过程，在这些生长因子中，VEGF是目前已知作用最强、专属性最高的促血管生长因子，它能够增加血管通透性，促进肿瘤血管形成，对肿瘤血管内皮细胞的增殖和迁移等发挥重要作用。以VEGF及其受体作用途径中的任一环节为靶点，阻断VEGF对肿瘤血管的作用，都可以达到遏制肿瘤生长和转移的目的。VEGF又称为血管通透因子，是由两个相同肽链通过二硫键交连构成的同源二聚体糖蛋白。它的生物学效应是通过存在于内皮细胞表面的特异性受体(VEGFR)来介导的。Avastln是一种人工合成的抗VEGF的抗体。Avastln的原理是通过抗VEGF来抑制肿瘤酌生长。鳐血管生成抑制因子1则是从海洋生物中分离出来的一种天然产物，它不仅作用于VEGF，还作用于其他多个涉及血管生成和肿瘤生长、转移的耙点。
发明内容本发明的目的在于提供一种鳐血管生成抑制因子1的一级结构即氨基酸组成和序列，具有这种氨基酸组成和序列的鳐血管生成抑制因子1显示强抑制血管生成、强抗肿瘤生长和转移的生物活性。本发明的目的尚在于提供分离、纯化鳐血管生成抑制因子1的方法。本发明的目的还在于提供鳐血管生成抑制因子1的理化及药理性质，以利用于制备药物。一种强抑制血管生成，强抗肿瘤生长和转移的鳐血管生成抑制因子1的一级结构由381个氨基酸残基按下列顺序组成MPFGNTHNKWKLNYSAEQEFPDLKHHNNHMAKAL:SYEVFKALFDPV乖RHGGYKPTDKHKTD-LNHENLKGGDDLDPNYVLSSRVRTGRS1KG1ALPPHCSRGERRLVEKLCLEGLATLTGEFQGKYYPLTTMSDAEQ=QQL腦HICFDKPVSPLLLASGMARDWPDARG1WHNNDKTFLVWVNEEDHL謂SMQKGGNMKEVFRRFCVGLKK:1EEFFVKAGRGFMWNEHLGYVUTCPSNLGTGLRGGVHVK1PHLCKHEKFEEV1XRTRLQKRGTGGVDTAAVGSVY=D1SNADRL鹏EVEQVQMWDGVKLM1EMEKVLEKGKS1DNLMPAQK最适pH为7.0-9.0，稳定pH为4.0-9.0。鳐，一类软骨鱼，体扁平，呈圆形或菱形，光滑无鳞。臀鳍消失，无鳔，种类很多，如孔鳐、锯鳐、犁头鳐、斑鳐、电鳐等。魟，海底生活的鳐类。体扁平，略呈圆形或方形，尾呈鞭状，有毒刺。种类颇多，有黄魟、黑魟,赤魟等。我国沿海均产。鯆鱼，生活于淡水的鳐，与魟同种。我国近年发现的龙州鯆鱼即属此类，与海产的赤魟同种而为淡水鳐。鳐类,均可作为制备鳐血管生成抑制因子1的原料，海底生活的鳐(魟)尤佳。鳐血管生成抑制因子1的分离纯化为依次进行如下柱层析1)AnionQSepharoseFastFlow柱层析；2)H1CB啤lSepharoseFastFlow柱层析；3)SOURCERPC柱层析。上述抑制血管生成，抗肿瘤生长和转移的鳐血管生成抑制因子1分离纯化方法的特点在于鳐组织加0.15mol/LNaCl，0.01~0.02mol/LTrls*HC1，pH7.09.0缓冲液匀浆，匀浆液离心(4°C，16000g)1小时，收集上清液并加饱和度2080M的(NH4)2SO4分级分离。分级收集沉淀，脱盐后用0.01~0.02mol/L,pH8.0~8.8的Trls'HC1缓冲液溶解，经AnionQ层析纯化，层析条件为流动相A为0.01~0.02mol/L,pH7.0~9.0的Trls-HCl缓冲液，B液为A液加lmoi/LNaCl，流速为15ml/mln,二元梯度洗脱，B%(0—120mlA90ml,0mlc180ml^60ml，^A120mlirvrk、——(J-3~~~5-!)-iUU-经AnionQ柱层析纯化所得组分再经H1CButylSepharoseFastFlow柱层析，层析条件为流动相A液为0.010.02mol/L，pH7.09.0的Trls-HCl缓冲液，B液为含3mol/LNaCl的A液，流速为10ml/mln，二元梯度洗脱，110ml270ml150mJ、B0/o(100——100——0——0)。经H1CButylSepharoseFastFlow柱层析所得组分再经SOURCERPC柱纯化，层析条件为流动相A液为含0.1%TFA的水溶液，B为含0.1%TFA的乙腈溶液，iEil为0.5ml/mln，二元梯度洗脱，B%(0，20，90，IOO!IOO)。纯化所得鳐血管生成抑制因子1的高压液相层析结果呈单一峰(图1)，SDS-PAGE电泳结果呈单一条带(图2)。鳐血管生成抑制因子1的生物活性检测结果显示它对肿瘤细胞无直接杀伤作用，显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜和肿瘤细胞诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，显著抑制肿瘤生长和肿瘤转移。一、药效试验1.鳐血管生成抑制因子1对血管生成的影响1.1鳐血管生成抑制因子1对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响选择清洁、蛋壳均质、气室均匀的种鸡蛋，在19200型智能孵化箱中孵化1周，无菌条件下在胚头端开一直径lcm小孔，形成假气室。将100nl鳐血管生成抑制因子1药液浸过之滤纸置于气室内的尿囊膜上，用透明胶带封口。置38'C恒温培养箱中培养，24h、48h后分别再加药液10(^1于滤纸上，对照组则加等量溶剂。72h后用丙酮和无水乙醇分别固定12分钟。剪下放有滤纸的膜置载玻片上，弃取滤纸，显微镜下随机选取5个视野计数可见血管的分支点数并照相。。结果表明，鳐血管生成抑制因子1显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，并呈剂量依赖关系(表l，图3)。对照组血管分支点数一给药组血管分支点数血管生成抑制率-对照组血管分支点数表1鳐血管生成抑制因子1对鸡胚绒毛尿囊腆血管生成的抑制作用组别鸡胚数(只)用药量(Hg/只)血管分支点数(I±S)抑制率(％)对照组5—80.1±3.3一鳐血管生成抑制因子l组5054.4±3.232.0鳐血管生成抑制因子l组10044.7±3.044,2鳐血管生成抑制因子l组515034.5±2..657.01.2鳐血管生成抑制因子1对人低分化彝咽癌细胞(CNE-2Z)诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响选择清洁、蛋壳均质、气室均匀的种鸡蛋，在19200型智能孵化箱中孵化1周，无菌条件下在胚头端开一直径lcm小孔，形成假气室。接种CNE-2Z细胞U.9X10"只)，用透明胶带封口。置培养箱中培养4天后，将中央打一小孔的滤纸置于气室内的尿囊膜上，加鳐血管生成抑制因子1药液100^1于滤纸上，对照组则加等量溶剂，每天1次，共给药4次。然后去掉透明胶带，用丙酮和无水乙醇分别固定12分钟。剪下放有滤纸的尿囊膜置载玻片上，弃取滤纸，显微镜下随机选取5个视野计数可见血管的分支点数并照相。结果表明，鳐血管生成抑制因子1显著抑制CNE-2Z细胞诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，且与剂量相关。(表2，图4)。血管生成诱导率=肿瘤细胞对照组血管分支点数一空白对照组血管分支点数空白对照组血管分支点数xiooo/0血管生成抑制率-肿瘤细胞对照组血管分支点数一给药组血管分支点数肿瘤细胞对照组血管分支点数xioo%表2鳐血管^R抑^IS子1对CNE~2Z细胞诱导的鸡胚^尿囊旗血管^g的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1.3鳐血管生成抑制因子1对促血管生成因子表达的影响用药途径为鳐血管生成抑制因子1(20.0x14mg/kg力腹腔注射，实体瘤标本为BALB/c裸小鼠Lewis肺癌组织。细胞桨及胞膜中出现淡黄至褐黄色细颗粒状着色为阳性细胞，免疫组化法检测结果显示，鳐血管生成抑制因子1对VEGF、bFGF和PDGF等三种促血管生成因子的表达有明显的抑制作用(表3，图5-7)。表3鳙血管生成抑制因子1对促血管生成因子表达的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>1.4鳐血管生成抑制因子1对小鼠Lewis肺癌组织微血管密度(MVD)的影响用药途径为鳐血管生成抑制因子1(20.0x14mgZkg.d)腹腔注射，实体瘤标本为BALB/c裸小鼠Lewis肺癌组织。经CD31免疫组化染色的血管内皮细胞呈棕色。免役组化法检测结果显示，对照组Lewis肺癌组织内毛细血管大量增生，富集在肿瘤边缘处，微血管分布不均，形态不规则，数量相差悬殊，呈异质性，.微血管数为18.2±3.2。鳐血管生成抑制因子1组仅在癌巢间质有极少量新生毛细血管，微血管数为6.5土1.5。鳐血管生成抑制因子1组的微血管数明显低于对照组(图8)。2.鳐血管生成抑制因子1的抗肿瘤生长和抗肿瘤转移效果2.1鳐血管生成抑制因子1对小鼠Lewis肺癌生长及转移的影响BALB/c裸鼠随机分为对照组、阳性(环磷酰胺)对照组和实验组，每组8只，雌雄各半。每鼠背部皮下接种0.2ml(4X106)Lewis肺癌细胞。肿瘤接种后第7天，实验组腹腔注射或灌胃不同剂量鳐血管生成抑制因子1溶液，每天1次，共14次；对照组腹腔注射或灌胃等量溶剂；阳性对照组腹腔注射环磷酰胺，每周l次，共2次。第21天牺牲小鼠，剥离肿瘤称重(用10%中性福尔马林固定用于免疫组化实验)，解剖、观察并记录肝转移节结数。结果显示，不论是腹腔注射还是灌胃鳐血管生成抑制因子1组的肿瘤明显较对照组体积小，基底窄，身剥离。肝转移灶数量少，体积小。鳐血管生成抑制因子1明显抑制小鼠Lewis肺癌的生长及肝转移,这一作用与剂量相关。(表4-7，图9)。肿瘤生长抑制率=对照组平均瘤重—给药组平均瘤重对照组平均瘤组X100%肿瘤转移抑制率=对照组平均肝或肺转移结节数实验组平均肝或肺转移结数对照组肝或肺转移结节数X100%表4鳐血管生成抑制因子1腹腔注射对裸小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用剂量组别mg/kg.d小鼠体重(g)实验前实验后瘤重(g)抑瘤率(%)对照组一20.3±2.421.3±2.91息0.54—鳐血管生成抑制因子l10.0x1420.8士2.021.0±1.30.55±0.3053.7鳐血管生成抑制因子l20.0x1421.6±1.922.7±2.00.46±0.1161.4环磷酰胺*50.0x220.7±1.721.0±2.00.俠0.2259.1*环磷酰胺分别于肿瘤接种后第7天、第14天腹腔注射。表5鳐血管生成抑制因子1腹腔注射对小鼠Lewis肺癌肝转移的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*环磷酰胺分^于舯瘤接种后第7天、第14天腹腔注射表6鳐血管鬼自制因子l濂胃对裸小鼠Lewis肺癯生长的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*环磷酰胺分别于肿瘤接种后第7天、第14天腹腔注射c<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.2鳐血管生成抑制因子1对小鼠黑色素瘤细胞(B16)转移的影响BALB/c裸鼠随机分为对照组、阳性(环磷酰胺)对照组和实验组，每组8只，各半。每鼠尾静脉接种0.2ml(3X106)B16细胞，肿瘤接种当天，实验组腹腔注射或灌雷不同剂量鳐血管生成抑制因子1溶液，每天1次，共14次；对照组腹腔注射或灌胃等量溶剂；阳性对照组腹腔注射环磷酰胺，每周1次，共2次。第15天牺牲小鼠，取肺组织计转移节结数。结果显^M血管生成抑制因子1鹏糊或灌冑都显著懒赚小鼠黑色素瘤细llim移，并与剂量相关，其作用优于临床上f自Wil^。鳐血管生成抑制因子l和环礴SIKW协同作用(表8,9，图IO)。表8鳐血管^tp制因子1,注射对裸小鼠黑色劳l癯B16细胞期一转移的影响组别剂量转移发生率节结数大转移灶数转移抑制率(mgAg.d)(个)(>3mm,个)(%)对照组—8/843.0±9.936.0±7.2一鳐血管生成10.0x144/820.9±9.715.1±9.151.3抑制因子1鳐血管生成20.0x142/715.6±6.310.6±8.363.7抑制因子1环磷酰胺*鳐血管生成抑制因子H环磷酰胺*50.0x1410-0x14+50.0x24/83/824.1±9.65.1±1.316.0±9.84.1±1.643.988.2*环磷酰胺分别于肿瘤接种当天、接种后第7天腹腔注射。表9鳐血管生自翻l因子l濂胃对裸小鼠黑色素賴组别剂量转移发生率节结数大转移灶数转移抑制率(mg/kg'd)(个)(>3mm,个)(%)对照组—6/843.0±9.936.0±7.2一雜血管生成10.0x143/820.9±9,715.1±9.133.8抑制因子1鳐血管生成20.0x142/715.6±6.310.6±8.359.1抑制因子1鳐血管生成30.0x142/79.4±16.90.3±0.787.6抑制因子l环磷酰胺*鳐血管生成抑制因子1+环磷酰胺*50.0x24/83/824.1±9.65.1±1.316.0±9.84.1±1.632.958.2*环磷酰胺分别于肿瘤接种当天、接种后第7天腹腔注射。2.3鳐血管生成神制因子1对小鼠Lewis肺癌转移因子表达的影响用药途径为鳐血管生成抑制因子1(20.0x14mg/kg.d)腹腔注射，实体瘤标本为BALB/c裸小鼠Lewis肺癌组织。促转移因子CD44v6和ErBb2表达于细胞膜与细胞浆，以胞膜着色为主，出现少量胞浆着色；抑转移因子nm23主要表达于细胞浆。细胞浆及胞膜中出现淡黄至褐黄色细颗粒状着色为阳性细胞，免疫组化的结果显示，给小鼠注射鳐血管生成抑制因子l后，可使Lewis肺癌细胞中CD44v6和ErBb2的表达降低，nm23-Hl的表达升高(表10，图11-13)。表10鳐血管M抑制因子1腹腔注射对小鼠Lewis肺痛转移因子表达的影响组别阳性细胞百分率(％)CD44v6ErBb2nm23-Hl对照组50.6±9.539.1±5.83.0±0.5鳐血管生成抑,因子13.9±1.13.1±0.653.5±0.8二、毒理学实验急性毒性试验采用健康昆明种小鼠，体重1922克，雌雄各半。给药(po)前禁食4h,采用24h内多次给药法，其间酌情供给饲料，不禁水。给药量为鳐血管生成抑制因子1有效剂量的100倍(lp,20mg/kg;po，40mg/kg),给药后观察7天。观察期间逐日记录动物的毒性反应情况和死亡动物的分布。因为未发现小鼠死亡，测不出LD5c,遂改做"最大耐受量试验"，一次性用鳐血管生成抑制因子1有效剂量的300倍(lp,60mg/kg;po，120mg/kg)0.5ml和0.8ml分别给20只小鼠腹腔注射或灌胃，观察14天，结果仍未发现小鼠毒性反应或死亡。三、稳定性采用冷冻干燥技术制成鳐血管生成抑制因子1样品，在-2(TC冰箱中保存一年，其生物活性(抑制血管生成、抑制体外培养瘤细胞和小鼠移植性肿瘤生长)无明显降低。鳐血管生成抑制因子l与可药用的载体混合或溶解，制成片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂等，或液体形式的针剂、可用于各种实体形肿瘤，如食道癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、彝咽癌、口腔癌、唇痛、皮肤癌、膀胱癌、绒毛膜上皮癌、腮腺瘤、淋巴瘤、骨瘤、黑色素瘤和各种颅内肿瘤等的治疗。图l:鳐血管生成抑制因子1的高压液相层析2:鳐血管生成抑制因子1的SDS-PAGE电泳3:鳐血管生成抑制因子1对鸡胚絨毛尿囊膜血管生成的抑制作用图4:鳐血管生成抑制因子1对人低分化鼻咽癌细胞(CNE-2Z)诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用图5:鳐血管生成抑制因子1对血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的抑制作用图6:鳐血管生成抑制因子1对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的抑制作用图7:鳐血管生成抑制因子1对血小板衍生生长因子(PDGF)表达的抑制作用图8:鳐血管生成抑制因子l对小鼠Lewis肺癌微血管密度(MVD)的影响图9:鳐血管生成抑制因子1对裸小鼠Lewis肺癌肝转移的抑制作用图10:鳐血管生成抑制因子1对裸小鼠黑色素瘤B16细胞肺转移的抑制作用图11:鳐血管生成抑制因子1对裸小鼠Lewis肺癌促转移因子CD44v6表达的抑制作用图12:鳐血管生成抑制因子1对裸小鼠Lewis肺癌促转移因子ErBb2表达的抑制作用图13:鳐血管生成抑制因子1对裸小鼠Lewis肺癌抑转移因子nm23-Hl表达的增强作用权利要求1.一种源于鳐的强抗肿瘤生长、转移的鳐血管生成抑制因子1，其一级结构即氨基酸组成和顺序。鳐血管生成抑制因子1由381个氨基酸残基按下列顺序组成MPFGNTHNKWKLNYSAEQEFPDLKHHNNHMAKAL＝TLD1YKQLRDKETPSGFTLDDV1QTGVDNPGHPF1MTVGCVAGDEESYEVFKALFDPV1QDRHGGYKPTDKHKTD＝LNHENLKGGDDLDPNYVLSSRVRTGRS1KG1ALPPHCSRGERRLVEKLCLEGLATLTGEFQGKYYPLTTMSDAEQ＝QQL1DDHFLFDKPVSPLLLASGMARDWPDARG1WHNNDKTFLVWVNEEDHLRV1SMQKGGNMKEVFRRFCVGLKK＝1EEFFVKAGRGFMWNEHLGYVLTCPSNLGTGLRGGVHVK1PHLCKHEKFEEVLKRTRLQKRGTGGVDTAAVGSVY＝D1SNADRLGFSEVEQVQMVVDGVKLM1EMEKVLEKGKS1DNLMPAQK2、鳐血管生成抑制因子1的分离纯化技术。鳐血管生成抑制因子1的分离纯化按如下次序迸行柱层析1)AnionQSepharoseFastFlow柱层析，层析条件为流动相A液为0.01~0.02mol/L，pH7.0~9.0的Tris-HCl缓冲液，B液为A液加Imol/LNaCl,流速为15ml/mki，二元梯度洗脱，B%(0，！0!3!5^5!100M100)。2)ButylSepharoseFastFlow柱层析，层析条件为流动相A液为0.01~0.02mol/L，pH7.0~9.0的Tris-HCl缓冲液，B液为含3moi/LNaCl的A液，流速为lOml/lrin,二元梯度洗脱，B%(100，100，吐0，0)。3)SOURCERPC柱纯化，层析条件为流动相A液为含0.1%TFA的水溶液，B为含O.P/QTFA的乙腈溶液，流速为0.5ml/min，采用二元梯度洗脱，B%(o!20!90!!100)。3、鳐血管生成押制因子1在制备抑制血管生成和防治肿瘤的药物中的应用。全文摘要本发明公开一种源于鳐的强抗肿瘤生长、转移的鳐血管生成抑制因子1的一级结构即氨基酸组成和序列。鳐血管生成抑制因子1的一级结构由381个氨基酸残基组成。鳐血管生成抑制因子1的制备按如下次序进行柱层析1)AnionQSepharoseFastFlow柱层析；2)ButylSepharoseFastFlow柱层析；3)SOURCERPC柱纯化。鳐血管生成抑制因子1有效抑制鸡胚绒毛尿囊膜的和肿瘤细胞诱导的鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成，抑制肿瘤组织的血管生成，抑制小鼠Lewis肺癌的生长，抑制小鼠Lewis肺癌和小鼠黑色素瘤B16的转移。鳐血管生成抑制因子1抑制血管内皮细胞生长因子等促血管生成因子和促转移因子CD44v6和ErBb2的表达，增强抑转移因子nm23的表达。鳐血管生成抑制因子1可用于制备抑制血管生成和防治肿瘤的药物。文档编号A61K35/60GK101260151SQ200710085958公开日2008年9月10日申请日期2007年3月5日优先权日2007年3月5日发明者于廷曦,于立坚,廖铭能,张永平,张霄瑜,苏伟明,马润娣,黄来珍申请人:广东海洋大学