专利名称：核糖核酸及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及核糖核酸及其制备方法与应用。
背景技术：
核糖核酸是动物体内一种生物大分子，是一种重要的免疫触发剂或免疫调节剂。1967年通过肉瘤免疫绵羊制取的淋巴细胞核糖核酸对大鼠进行试验，发现核糖核酸能抑制荷瘤鼠肿瘤的生长，甚至消除，首次证实了免疫核糖核酸能传递免疫信息。1982年林单坤等人把从免疫羊肝中提取得到的核糖核酸做成制剂注入体内，发现对肿瘤与癌症有明显的疗效并能提高机体的免疫功能，而且未出现不良的副作用。从脾脏中提取得到的免疫核糖核直接制成针注入体内，可激活人体的T细胞及B细胞的活性；同时有提高人体免疫功能的作用，对一些与人体免疫功能下降有关的疾病，如慢性支气管炎、哮喘病、慢性乙型肝等，以及胃癌、乳腺癌、大肠癌等恶性肿瘤有显著的疗效。虽然免疫核糖核酸在国内已经用于临床治疗，但在生产工艺方面仍然存在一定的问题，给推广带来一定的难度。中国专利CN1116879C曾描述了从牛脾脏制备核糖核酸的方法，受当时条件限制，有些不足1)由于工艺中使用SDS可能造成残留，并可能使DNA从组蛋白上解离下来，造成DNA含量超标，RNA含量为95-96％左右；2)生产周期过长，生产效率低，整个提取步骤大约需要一周时间；3)收率低，约为1g核糖核酸/公斤胰脏。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产周期短、污染小、成本低、高活性的核糖核酸制备方法。
本发明所提供的核糖核酸的制备方法，包括如下步骤1)提取原液的制备将动物胰腺小块绞碎后移入胶体磨，加入提取缓冲液进行研磨，得到提取原液；所述提取缓冲液为0.01～0.10mol/L Tris-乙酸缓冲液，pH4～8；2)核糖核酸的提取提取原液加入0.2～10倍体积饱和酚液体的上层水相，和0.2～10倍体积的饱和酚液体的下层酚相，加热到40～80℃，恒温30～180分钟；然后，在4～10℃下离心，收集上清液；所述饱和酚液体是将苯酚融化后，加入等体积的步骤1)所述提取缓冲液，搅拌均匀后得到的；上清液加入0.5～2倍体积的氯仿-异戊醇溶液，摇匀5～30分钟，在4～10℃下离心，收集上清液；上清液加入0.2～2倍体积氯仿-异戊醇，摇匀后在4～10℃离心，收集含核糖核酸的上层上清液，所述氯仿-异戊醇溶液中氯仿与异戊醇的体积比为10～50∶1；上清液加入0.1～1体积助沉淀缓冲液，再加入2～6倍体积95％乙醇，摇匀，4℃放置过夜，在4～10℃下离心，收集得到核糖核酸沉淀；助沉淀缓冲液为1-5mol/L乙酸钠溶液，pH为3-6。
为了能进一步提高核糖核酸的纯度，减少杂质含量，动物胰腺小块在绞碎前，还要去除非胰腺组织。核糖核酸沉淀还以溶解缓冲液溶解，加乙醇至乙醇终浓度为50～85％，在4～10℃离心；然后，以70-80％乙醇洗涤，并在4～10℃下离心；所述溶解缓冲液为0.5-1M NaCl溶于0.025-0.075M Tris-HCl缓冲液中，pH9.5。在制备过程中，离心的加速度为2000～10000g，优选为4000g。
应用本发明所制备的核糖核酸，还可以制备出一种注射用核糖核酸冻干制剂。
该注射用核糖核酸冻干制剂，是按如下过程制备的a)制备注射用核糖核酸中间体将核糖核酸和右旋糖酐混合，搅拌均匀，控制溶液调节pH值为6.5～7.5，其中，核糖核酸和右旋糖酐的重量比为1∶1～3；然后，加入溶液重量0.1～0.8％的活性炭，混匀、脱色，加注射用水至所需量，使得溶液中核糖核酸浓度为20～30g/L，右旋糖酐浓度为30～60g/L；再依次经孔径为0.3-0.5μm的第一微孔滤膜及孔径为0.1-0.3μm的第二微孔滤膜过滤除菌，得到注射用核糖核酸中间体；b)病毒灭活将所得注射用核糖核酸中间体在50～80℃恒温6～12小时，灭活病毒；c)冻干将经病毒灭活后的注射用核糖核酸中间体放置冻干箱中，-50至-30℃预冻2～3小时，-30至-20开始升华，真空度≤20Pa；然后，在20-40℃干燥，得到所述注射用核糖核酸冻干制剂。
优选的，第一微孔滤膜的孔径为0.45μm；第二微孔滤膜的孔径为0.22μm。
本发明采用氯仿-异丙醇为提取溶剂，能有效提取出动物胰腺中的核糖核酸，该提取过程的生产周期短，基本上在16～18时间内即可以完成提取过程；提取率高，能达到3.0～4.8g核糖核酸/kg胰脏的收率，相比现有技术所提取的核糖核酸，提高了1～2倍，成本降低70％左右；产品的纯度高，其中RNA含量在98-99.7％左右；应用所制备的核糖核酸来生产注射用核糖核酸冻干制剂，产品经过病毒灭活步骤，安全性更易于保证。
具体实施例方式
实施例1、制备核糖核酸一、配制溶液(1)提取缓冲液(0.02M Tris-乙酸缓冲液)900ml纯化水，加2.42克Tris，用乙酸调pH5.0，定容至1000ml。
(2)饱和酚液体将苯酚在50℃融化，加入等体积提取缓冲液，搅拌均匀制成饱和酚溶液，避光保存。
(3)助沉淀缓冲液3M乙酸钠溶液，pH5.0(4)溶解缓冲液1M NaCl溶于0.05M Tris-HCl缓冲液中，pH9.5。
二、提取过程1、原材料选择和预处理取小牛(1岁半以下)胰腺50公斤在25℃左右去筋膜、脂肪及结缔组织等非胰腺组织，用纯化水清洗干净，切成3～5cm小块。
2、组织及细胞的破碎用干净绞肉机将胰腺小块绞碎，将绞碎的小牛胰腺移入胶体磨中，加入等量提取缓冲液，第一次以200μm破碎研磨，第二次以50μ研磨，真空下，研磨液应较易通过200目不锈钢网，得到100kg左右的匀浆液。
3、有效成份提取匀浆液加入1倍体积饱和酚液体的上层水相，加入0.5倍体积饱和酚液体的下层酚相，加热到60℃，恒温120分钟，迅速冷却，在4～10℃离心(4000g，30分钟)，收集上清液，弃去沉淀(回收苯酚)。
上清液加入0.6倍体积氯仿-异戊醇(体积比24∶1)，摇匀15分钟，在4～10℃离心(4000g，30分钟)，收集上层的上清液，弃去中间层沉淀，回收底层氯仿层。
上清液加入0.3倍体积氯仿-异戊醇(体积比24∶1)，摇匀15分钟，在4～10℃离心4000g，30分钟)，收集含核糖核酸的上层上清液，弃去中间层沉淀，回收底层氯仿层。
上清液加入1倍体积助沉淀缓冲液，再加入2倍体积乙醇(95％)，摇匀，4℃放置过夜，在4～10℃离心(4000g，30分钟)，收集核糖核酸沉淀，上层的上清液为乙醇，回收乙醇。
为了能进一步提高核糖核酸的纯度，减少杂质含量，核糖核酸沉淀以溶解缓冲液溶解，加入乙醇至终浓度75％(质量)，在4～10℃下离心(4000g，30分钟)。
用75％乙醇反复洗涤沉淀2次，在4～10℃离心(4000g，30分钟)，收集核糖核酸沉淀，置50℃水中放置到无醇味(约1小时)。
以上过程提取过程可在16～18时间内完成，核糖核酸的提取率为3.8g/kg胰脏，较已有的核糖核酸提取工艺大大缩短了提取时间，产量提高1～2倍。在核糖核酸提取过程中，总会带有少量DNA杂质，由于DNA分子一般均比较大，注射时会间接引起过敏反应。本发明由于核糖核酸提取效率的提高，核糖核酸产品中RNA含量在99.7％左右，纯度OD260/OD280＞1.9，相比现有技术所提取得到的产品(RNA含量为95-96％)，产品纯度有了很大的提高，脱氧核糖核酸“污染”含量降低，能提高产品安全性；并且，提取过程批成品率提高30％左右，批报废率由30％降低到零，成本降低70％左右。
实施例2、制备核糖核酸一、配制溶液(1)提取缓冲液(0.06M Tris-乙酸缓冲液)900ml纯化水，加7.26克Tris，用乙酸调pH7.0，定容至1000ml。
(2)饱和酚液体将苯酚在50℃融化，加入等体积提取缓冲液，搅拌均匀制成饱和酚溶液，避光保存。
(3)助沉淀缓冲液3M乙酸钠溶液，pH5.0(4)溶解缓冲液1M NaCl溶于0.05M Tris-HCl缓冲液中，pH9.5。
二、提取过程1、原材料选择和预处理取仔猪(6-10月)胰腺50公斤在25℃左右去筋膜、脂肪及结缔组织等非胰腺组织，用纯化水清洗干净，切成3～5cm小块。
2、组织及细胞的破碎用干净绞肉机将胰腺小块绞碎，将绞碎的仔猪胰腺移入胶体磨中，加入等量提取缓冲液，第一次以200μm破碎研磨，第二次以50μ研磨，真空下，研磨液应较易通过200目不锈钢网，得到125kg左右的匀浆液。
3、有效成份提取匀浆液加入8倍体积饱和酚液体的上层水相，加入0.4倍体积饱和酚液体的下层酚相，加热到60℃，恒温120分钟，迅速冷却，在4～10℃离心(4000g，30分钟)，收集上清液，弃去沉淀(回收苯酚)。
上清液加入1.5倍体积氯仿-异戊醇(体积比30∶1)，摇匀15分钟，在4～10℃离心(4000g，30分钟)，收集上层的上清液，弃去中间层沉淀，回收底层氯仿层。
上清液加入1倍体积助沉淀缓冲液，再加入4倍体积乙醇(95％)，摇匀，4℃放置过夜，在4～10℃离心(4000g，30分钟)，收集核糖核酸沉淀，上层的上清液为乙醇，回收乙醇。
为了能进一步提高核糖核酸的纯度，减少杂质含量，核糖核酸沉淀以溶解缓冲液溶解，加入乙醇至终浓度75％(质量)，在4～10℃下离心(4000g，30分钟)。
用75％乙醇反复洗涤沉淀2次，在4～10℃离心(4000g，30分钟)，收集核糖核酸沉淀，置50℃水中放置到无醇味(约1小时)。
以上过程提取过程可在16～18时间内完成，核糖核酸的提取率为4.8g/kg胰脏，较已有的核糖核酸提取工艺大大缩短了提取时间，产量提高1～2倍；核糖核酸产品中RNA含量在99％左右。
实施例3、制备注射用核糖核酸1、制备注射用核糖核酸中间体取核糖核酸(实施例1提取得到)50g，加入右旋糖酐90g，加入1800ml的水，搅拌均匀，用1mol/L Tris溶液调节pH值为6.5～7.5(20℃～22℃)。加入溶液重量0.1％的针用活性炭，混匀，40℃脱色15分钟。添加注射用水至2000ml，经0.45μm微孔滤膜精滤及0.22μm微孔滤膜过滤除菌至澄明，得到注射用核糖核酸中间体。测定其pH值为7.2，含量为25mg/ml，细菌内毒素＜10EU。
2、病毒灭活(巴氏灭活)取注射用核糖核酸中间体，60℃10小时恒温，灭活病毒。
3、制备注射用核糖核酸按含量要求，将药液灌装于西林瓶中，放置冻干箱中，-40℃预冻2～3小时，-30℃开始升华，约15h，真空度≤20Pa。干燥温度约30℃，经约5h后，干燥(残留水分≤3.0％)，得到注射用核糖核酸制剂。
二、产品检测1、光谱学特征在190～360nm波长范围，对所得注射用核糖核酸中间体进行紫外吸收扫描，结果显示在258nm有最大吸收，在230nm吸收峰最小，A260/A230、A260/A280的比值分别达到2.1和1.9以上，巴氏灭活后光谱学特征没有改变。
2、RNA特性RNA中的核糖与酸作用生成糠醛，后者再与3，5二羟基甲苯作用产生绿色物质。根据这一特性，取3，5二羟基甲苯盐酸溶液，在80℃水浴中加热，进行RNA特性检测。结果表明，所得注射用核糖核酸中间体有绿色反应，说明病毒灭活后RNA特性没有改变。
3、增色效应RNA在强碱溶液中可使核酸链断裂、吸光度增加的原理，做了增色效应检测，注射用核糖核酸中间体增色效应达到35％以上，进行病毒灭活后增色效应有1～2％减小，仍符合国药标准大于20％的质量要求。
4、病毒灭活效果取出液氮内冻存的BHK21细胞，置37℃水浴，全融后开封，移入含MEM营养液的细胞培养瓶内，置37℃培养，使细胞长成单层，传代培养。病毒滴度采用细胞病变培养法，在96孔板上进行滴定，样品用MEM营养液10倍系列稀释，每一稀释度接种6孔，滴定结果按karber法计算TCID50。
取注射用核糖核酸中间体900ml，分别加入指示病毒100ml，混匀，取出30ml作病毒灭活前阳性病毒滴度检测。然后在60℃10小时恒温灭活病毒，分别在30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时取样，用0.22μm膜除菌后密封，-65℃保存，同时设药液阴性对照组，测定病毒滴度。
结果表明，经病毒灭活后，灭活液中均未检测出病毒，经盲传三代，亦均未见特异性细胞病变(CPE)，这表明所采用的灭活方法的灭活效率高，能够保障产品的安全性。
5、产品活性测定目前，如何对核糖核酸生物活性进行检测，尚未得到满意的解决方案。正常白细胞都具有粘附于玻璃、塑料表面的特性，但在特异因子作用下，正常白细胞的这种粘附能力可显著降低，这种反应称为白细胞粘附抑制反应，一般以抑制率＞20％为有意义。本发明采用正常白细胞给予一定浓度核糖核酸来诱发白细胞的粘附抑制反应，通过小鼠白细胞粘附的抑制率来表征核糖核酸的生物活性，抑制率越高，说明核糖核酸的生物活性越高。
1)溶液配制培养液 含10％小牛血清的RPMI-1640培养液，用Hepes和碳酸氢钠调节PH值至7.2～7.4，过滤除菌后-20℃保存。
红细胞分离液(0.83％NH4Cl-Tris缓冲溶液)0.17mol/L Tris(20.60g/1000ml)10.0ml与0.16mol/L NH4Cl(8.30g/1000ml)90.0ml混匀，用1mol/L HCl调pH至7.2，4℃保存备用。
供试品溶液取注射用核糖核酸冻干制剂(实施例3制备)，用培养液制成每1ml中含核糖核酸5mg的溶液，作为供试品溶液；对照组溶液培养液。
2)小鼠脾细胞悬液的制备取小鼠拉脱颈椎或放血而死，用碘酒、酒精处理皮毛。剪开皮肤，打开腹腔。在胃底部找到红色的脾，用镊子分离后摘除。
脾经培养液洗涤后，置50～300(200)目不锈钢网上，用剪刀剪成数块，用注射器柄挤压研磨，低速离心(1000r/min)，悬起沉淀部分即得脾细胞悬液。若其中有较多红细胞，可将脾细胞悬液放在5ml预冷的0.83％NH4Cl-Tris缓冲溶液中，置37℃水浴中10min，低速离心(1000r/min)收集沉淀白细胞。
3)测定方法在96孔培养板中进行，供试品孔及对照组孔各做三孔。
每孔各加溶液50μl，然后每孔加小鼠脾细胞悬液50μl；将培养板于二氧化碳培养箱中，37℃孵化2小时，使细胞在培养板底部粘附，取出细胞培养板，用震荡器在低强度下摇30～60秒，将未粘附细胞摇起，吸出上清液(组间再震荡一次保证均匀)，移至另一孔，每孔再加入培养液液50μl按上法洗一次，将洗液与上清液合并(注意勿起气泡)，在酶标仪上，在405nm波长下测定每孔的吸收值，作为粘附后细胞的吸收值。
另取溶液50μl，加小鼠脾细胞悬液50μl混匀，再加50μl培养液，在405nm波长下测定吸收度值，做为粘附前细胞的吸收值。
按下式计算粘附率和粘附抑制率粘附率＝(粘附前细胞的吸收度值-粘附后细胞的吸收度值)/粘附前细胞吸收度值×100％
粘附抑制率＝(对照品粘附率-供试品粘附率)/对照粘附率×100％4)测定结果对照组粘附率＝(对照组粘附前细胞的吸收度值-对照组粘附后细胞的吸收度值)/对照组粘附前细胞吸收度值×100％＝1.405-0.912/1.405＝35％供试品粘附率＝(供试品粘附前细胞的吸收度值-供试品粘附后细胞的吸收度值)/供试品粘附前细胞吸收度值×100％＝0.701-0.528/0.701＝24.6％粘附抑制率＝(对照组粘附率-供试品粘附率)/对照组粘附率×100％＝35％-24.6％/35％＝29.7％以上结果说明，本发明所提取的核糖核酸具有良好的活性。
现有技术提取(中国专利CN1116879C)的核糖核酸的粘附抑制率为17-23％。
权利要求
1.核糖核酸的制备方法，包括如下步骤1)提取原液的制备将动物胰腺小块绞碎后移入胶体磨，加入提取缓冲液进行研磨，得到提取原液；所述提取缓冲液为0.01～0.10mol/L Tris-乙酸缓冲液，pH4～8；2)核糖核酸的提取提取原液加入0.2～10倍体积饱和酚液体的上层水相，和0.2～10倍体积的饱和酚液体的下层酚相，加热到40～80℃，恒温30～180分钟；然后，在4～10℃下离心，收集上清液；所述饱和酚液体是将苯酚融化后，加入等体积的步骤1)所述提取缓冲液，搅拌均匀后得到的；上清液加入0.5～2倍体积的氯仿-异戊醇溶液，摇匀5～30分钟，在4～10℃下离心，收集上清液；上清液加入0.2～2倍体积氯仿-异戊醇，摇匀后在4～10℃离心，收集含核糖核酸的上层上清液，所述氯仿-异戊醇溶液中氯仿与异戊醇的体积比为10～50∶1；上清液加入0.1～1体积助沉淀缓冲液，再加入2～6倍体积95％乙醇，摇匀，4℃放置过夜，在4～10℃下离心，收集得到核糖核酸沉淀；助沉淀缓冲液为1-5mol/L乙酸钠溶液，pH为3-6。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述动物胰腺小块在绞碎前，还要去除非胰腺组织。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述核糖核酸沉淀还以溶解缓冲液溶解，加乙醇至乙醇终浓度为50～85％，在4～10℃离心；然后，以70-80％乙醇洗涤，并在4～10℃下离心；所述溶解缓冲液为0.5-1M NaCl溶于0.025-0.075MTris-HCl缓冲液中，pH9.5。
4.根据权利要求1或2活3所述的制备方法，其特征在于所述离心的加速度为2000～10000g。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述离心的加速度为4000g。
6.权利要求1～5任一所述制备方法得到的核糖核酸。
7.一种注射用核糖核酸冻干制剂，是按如下过程制备的a)制备注射用核糖核酸中间体将核糖核酸和右旋糖酐混合，搅拌均匀，控制溶液调节pH值为6.5～7.5，其中，核糖核酸和右旋糖酐的重量比为1∶1～3；然后，加入溶液重量0.1～0.8％的活性炭，混匀、脱色，加注射用水至所需量，使得溶液中核糖核酸浓度为20～30g/L，右旋糖酐浓度为30～60g/L；再依次经孔径为0.3-0.5μm的第一微孔滤膜及孔径为0.1-0.3μm的第二微孔滤膜过滤除菌，得到注射用核糖核酸中间体；b)病毒灭活将所得注射用核糖核酸中间体在50～80℃恒温6～12小时，灭活病毒；c)冻干将经病毒灭活后的注射用核糖核酸中间体放置冻干箱中，-50至-30℃预冻2～3小时，-30至-20开始升华，真空度≤20Pa；然后，在20-40℃干燥，得到所述注射用核糖核酸冻干制剂。
8.根据权利要求7所述的注射用核糖核酸冻干制剂，其特征在于第一微孔滤膜的孔径为0.45μm；第二微孔滤膜的孔径为0.22μm。
全文摘要
本发明公开了核糖核酸及其制备方法与应用。本发明所提供的核糖核酸的制备方法，是将新鲜胰脏加入水匀浆，匀浆液与饱和苯酚混匀、搅拌，彻底破碎细胞，变性蛋白质，离心分离水相，水溶液加入氯仿抽提，离心分离水相，水相加入乙醇沉淀核糖核酸。本发明采用氯仿－异丙醇为提取溶剂，能有效提取出牛胰腺中的核糖核酸，该提取过程的生产周期短，提取过程可在16～18时间内完成，核糖核酸的提取率为3.0～4.8g/kg胰脏，纯度OD260/OD280＞1.9，较已有的核糖核酸提取工艺大大缩短了提取时间，产量提高1～2倍，由于核糖核酸提取效率的提高，脱氧核糖核酸“污染”含量降低，批成品率提高30％左右，批报废率由30％降低到零，成本降低70％左右；产品经过病毒灭活步骤，安全性更易于保证。
文档编号A61P37/02GK101058595SQ20071009998
公开日2007年10月24日 申请日期2007年6月1日 优先权日2007年6月1日
发明者孙德军, 霍英, 李夏, 李秉安, 禹学军 申请人:吉林敖东药业集团延吉股份有限公司