专利名称：：新型线虫蛋白质及其在生产抗蠕虫药和疫苗中的应用的制作方法新型线虫类蛋白质及其在生产抗蠕虫药和疫苗中的应用发明领域本发明涉及用于鉴定新型抗蠕虫药的筛选，特别涉及抗血矛线虫属蠕虫的药剂，以及用作针对蠕虫如血矛线虫属(haemonchus)蠕虫的疫苗或免疫原性药剂的蛋白服的制备。
背景技术：
：蠕虫寄生虫引起宽范围的家畜动物的疾病和感染，当它们导致疾病和感染时，其导致生产力丧失并且甚至导致动物死亡，因此有相当大的经济重要性。食血(bloodfeeding)线虫类血矛线虫属感染反刍动物的胃肠道内层。它在世界范围内具有非常值得考虑的经济重要性，具有从家畜动物的体重增加的减少、生产力丧失和缺乳到死亡范围内的影响。贫血是感染的基本特征。当大量幼虫感染绵羊时，在绵羊仍然看起来是健康的时候可能突然发生死亡。这称为"急性潜伏期病"，此时用粪便检查看不到卵。包括较少量蠕虫的慢性感染可能引起水肿(下颌水肿)，缺铁性贫血症，进展性虚弱，毛发断裂(woolbreaks),和死亡。四阶段幼虫和成虫都刺穿胃壁中的血管，并且以所释放的血液为生。因此，宿主利用营养来替换失去的血液成分，而不是用于生长和毛发生产。一种相关的线虫胃线虫属(Ostertagia)具有相似的作用。疾病血矛线虫病(haemonchosis)和奥斯特塔格线虫病(ostertagiasis)特征在于浪费，所述浪费部分是由于与严重感染相关的食欲缺乏引起。相关的摄取血液的线虫，钩虫感染反刍动物、狗、猫、其它食肉动物、和人。超过7亿人感染了钩虫，特别是美洲钩虫(Necatoramericanus)，每年有700-900,000新病例，和50-60,000例由这些寄生虫的灾害引起的死亡。蠕虫寄生虫的控制目前主要依赖与牧场管理结合的抗蠕虫药的使用。然而，这样的技术具有许多缺点…-频繁的药物施用和牧场管理通常不切实际，并且耐药性蠕虫品系变得愈加普遍。从血矛线虫属获得的包含蛋白双联体H110D的提取物在注射给绵羊时提供抗血矛线虫病的保护。该双联体H110D在血矛线虫属蠕虫的肠内腔表面上发现。H110D的制备和应用已经在WO-A-88/00835中进行了描述。在WO-A-89/00163中，在寄生虫线虫蛇形毛圆线虫(Trichostrongyluscolubriformis)幼虫中描述了这样一种蛋白，该蛋白在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上具有41Kd的分子量。该蛋白从匀桨的蛇形毛圆线虫(T.colubriformis)三阶段幼虫中提取。己经克隆了关于该蛋白的基因。在捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus)中发现了一种非常相似的DNA序列，尽管尚未报道血矛线虫属蠕虫基因的体内表达。该文献还报道了使用由重组生物体表达的抗原在绵羊中针对捻转血矛线虫的接种试验的结果。在这些试验中，报告了在粪便中减少的卵数量，总体上平均减少40%的卵数量。在接种后63天宰杀时，发现接种组绵羊含有比对照组平均少52%的蠕虫。EP0434909公开了具有抗凝活性的蛋白，其可以有效用作疫苗。在WO9402169和WO9526402中公开了其它潜在有效用作疫苗候选物的蛋白。然而，对鉴定新的抗蠕虫药和/或开发针对这样的寄生虫的新型疫苗存在紧急需求。本发明的目的之一是提供用于开发新抗蠕虫药的肽或蛋白。提供用于在反刍动物中提高免疫反应的肽或蛋白也是本发明的目的之一。发明概述本发明部分是基于本发明人鉴定和表征了一种在捻转血矛线虫中表达的新型蛋白。本发明人己经鉴定了多种与所述蛋白相关的生理和酶活性，开创了将所述蛋白用作治疗蠕虫且特别是血矛线虫属蠕虫感染的药物靶标和疫苗候选物的可能性。如在下文更详细地描述地，本发明人已经在变性条件下鉴定了蛋白的表观分子量，约55KDa。基因组和蛋白质组研究表明，它包含来自捻转血矛线虫(Hco"toWw)的2种高度同源的蛋白。所述蛋白表现出与秀丽隐杆线虫(C.中的脯氨酰羧肽酶样蛋白的同源性，并且包括2个丝氨酸羧肽酶S28型结构域。对该蛋白的生理学和酶学研究表明所述蛋白具有显著的二肽基肽酶IV(DPPIV)活性和弱DPPII活性，并且能够延迟血纤蛋白凝块形成。因此，在本发明第一方面，提供用于鉴定抗蠕虫药的筛选测定方法，所述测定方法包括使某种药剂与蠕虫蛋白接触的步骤，所述蠕虫蛋白特征为表现出二肽基肽酶IV活性，并且导致血液凝固时间的增加，从而检测所述药剂是否能够调节所述蛋白的所述活性或血液凝固作用。便利地，所述蛋白包括图2a所示的序列，或如图2c和2d所示的编码所述蛋白的核苷酸序列，或基本与其同源或功能等价。也可以使用所述蛋白的片段，只要所述片段表现出所述DPPIV活性和任选地所述增加的血液凝固时间作用。应该理解，术语"调节活性"涉及药剂提高或降低由所述酶表现出的DPPIV和任选地所述血液凝固活性的能力。理想地，所述药剂将能够抑制或降低所述酶的DPPIV活性，并且任选地抑制或降低所述酶增加血液凝固时间的能力。根据第一方面，所述酶可以通过重组方法提供，如在下文更详细所述，或简单地从寄生虫本身纯化。所述酶可以从寄生虫的食血L4或成虫阶段分离。在能够测定药剂对所述酶的DPPIV活性的作用方面，在本领域中许多DPPIV活性测定方法是已知的。一种这样的测定是由普洛麦格(普洛麦格集团(PromegaGroup),美国)提供的DPPIV-GbTM蛋白酶测定方法，其使用促发光的(proluminescent)DPPIV底物，即Gly-Pro-氨基萤光素，其在由DPPIV酶裂解该底物且随后由萤光素酶作用后产生"辉光(glow)-型"发光信号。另一种DPPIV测定方法使用罗丹明llO-缀合的甘氨酸-脯氨酸，其在裂解时(通过罗丹明110)以异硫氰酸荧光素(FITC)波长发光。另一种DPPIV测定方法使用生色底物，如对-硝基苯胺(pNA)，其在从其二肽上裂解时导致在405nm吸光度的增加。一种这样的试剂盒由美国PA的BIOMOL国际(BIOMOLInternational,PA,USA)提供。因此，应该理解，在本领域中存在多种已知的DPPIV测定方法，并且应该理解本发明不限于任何具体的DPPIV测定方法。典型地，待检测的药剂可以是，例如，小的化学个体，对所述蛋白特异性的抗体，设计靶向所述蛋白肽的表达的RNAi分子，肽模拟物等，可以与分离的酶接触，并且然后测量所述酶的DPPIV活性。通过与在不加入所述药剂的条件下所述酶的DPPIV活性水平进行比较，可能检测所述药剂是否具有对所述酶的DPPIV活性的任何调节作用。自然地，一旦已经鉴定某种药剂对所述酶具有作用，则所述药剂可以施用给活的蠕虫，如捻转血矛线虫，以检测其对该生物体的作用。然后，可以将所述药剂施用给感染了所述蠕虫的宿主动物，以检测所述药剂对所述寄生虫在其存在于宿主生物体内时的作用，并且确保所述药剂对所述被感染的宿主动物无害。因此，理想地，按照本发明鉴定的抗蠕虫药是对寄生虫特异的，并且基本不影响可能存在于宿主动物中的DPPIV蛋白的DPPIV活性。在本领域中，已经存在多种已知的DPPIV抑制剂，诸如DiprotinA和B,vildagliptin,Sitagliptin,二甲双胍,Saxagliptin和MK-0431缬氨酸pyrrolidide,异亮氨酸thiazolidide,FE99901(Ferring制药(FerringPharmaceuticals)),NVP-DPP728(Novartis)，LAF237(Norvartis),SYR322(Syrrx，公司)，SYR619(Syrrx，公司)，并且这些中的任一种或全部可以表现出本发明所述的抑制酶的活性。事实上，本发明人已经表明，例如，DiprotinA部分抑制本发明所述的所述酶的DPPIV型活性。因此，在另一个方面中，提供了DPPIV抑制剂在制备治疗蠕虫感染特别是捻转血矛线虫感染的药物中的应用。还提供了治疗被蠕虫感染的动物如反刍动物的方法，所述方法包括对所述动物施用DPPIV抑制剂的步骤。不希望受到理论限制，考虑了任何这样的DPPIV抑制剂，通过调节本发明所述的所述酶的活性，可以消除蠕虫的生育力、破坏、抑制或杀死蠕虫，由此治疗被感染的动物宿主。除了DPPIV活性之外，本发明人还观察到本发明所述的酶具有增加血液凝固时间的活性。因此，在本发明的另一个实施方案中，筛选步骤可以用来鉴定抑制所述酶增加凝固时间的能力的药剂。同样不希望受到理论限制，考虑了任何这样的药剂可以引起由蠕虫摄取的血液食物在该蠕虫内凝固，如以前一样导致蠕虫生物体的破坏或死亡。许多用于检测血液凝固时间的测定方法是已知的，包括，例如，"凝血因子II时间"和"激活的部分促凝血酶原激酶时间"检测。这些检测测量在将特定的激活性化学剂添加到血液样品中后血液凝固所花费的时间。因此，通过进行在存在和不存在药物候选物的条件下包括本发明所述的蛋白的检测，可以告知所述药物候选物是否能够调节受所述蛋白影响的血液凝固时间。使用血液成分而不是全血的相似检测是可能的。实例包括血纤蛋白凝固时间或血纤蛋白凝块重聚集检测。通常地，凝块形成通过使用光度测定方法检测，因为凝块表现出与包括检测介质的非凝块不同的光学特性。在本发明的另一个方面中，还提供这样的核酸分子，其包括一种或多种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码蠕虫丝氨酸羧肽酶或其酶促反应性部分或抗原性部分，其基本上对应于图2a所示的预测的氨基酸序列的全部或部分；或如图2c或2d所示能够编码所述酶或其部分的核苷酸序列；或编码蠕虫丝氨酸羧肽酶的序列，其与所述序列的任一个基本同源或可以与所述序列的任一个杂交。因此，本发明的核酸可以是单链或双链DNA，cDNA或RNA。在一种物种内不同蠕虫品系之间，在蠕虫生命周期的不同阶段之间(例如，在幼虫和成虫阶段之间)，在不同地理起源的相似品系之间，并且还在同一种蠕虫内部，可能发生在羧肽酶-编码核苷酸序列中的改变。所述变化包含在本发明的范围内。当用于本文时，"基本上同源"包括具有约60%或更多，例如75%,80%,90%或95%或更多的序列同一性的那些序列，以及还包括功能-等价等位基因变体和通过一个或多个碱基取代、添加、倒位和/或删除进行修饰的相关序列。"功能等价"意指编码具有羧肽酶活性的多肽的核酸序列，所述多肽是相似酶促活性的，即，其能够催化相同的生化或生理反应(例如，表现出DPPIV活性和/或增加血液凝固时间的能力)，或是相似免疫反应性的，即，其产生针对蠕虫的宿主保护性抗体。在本发明范围内还包括与图2c或2d中所示的序列杂交的核酸分子，或如上述定义的任何基本同源或功能等价序列。当用于本文时，"杂交"定义在中等或高度严格性例如2xSSC,65°C(其中SSC=0.15MNaCl,0.015M柠檬酸钠，pH7.2)下结合的那些序列。产生这样的衍生物相关序列的方法，例如，通过位点定向诱变，随机诱变，或酶裂解和/或连接核酸，在本领域内是公知的，确定这样修饰的核酸是否与所述序列具有显著同源性的方法，例如通过杂交或核酸测序，在本领域内也是公知的。因此，提供本发明所述的核酸分子能够大量获得重组羧肽酶、或其酶性或免疫原性片段，由此允许进行上述筛选测定方法和/或开发抗-蠕虫疫苗和/或用作抗凝血剂。因此，在本发明另一方面中，提供包括一种或多种核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码用于药物筛选测定方法的一种或多种多肽和/或用于产生抗蠕虫寄生虫的保护性抗体的一种或多种多肽，其序列结合来自图2a所示的羧肽酶-编码序列的一个或多个酶性或抗原性区域。'本发明还扩展至合成的多肽，所述合成的多肽包括组成羧肽酶或其酶性或抗原性部分的一个或多个氨基酸序列，其基本上对应于图2a所述的氨基酸序列的全部或部分，或其功能等价变体。所述酶的酶性部分应该理解为比全长蛋白序列短，但是能够表现出至少一种蛋白生化或抗原性特性，诸如其DPPIV或血液凝固时间活性中的提高。当在本文中引用时，术语"抗体"包括完整的抗体，其包括IgG,IgM和IgA同种型的那些，以及其任何抗原结合片段(g卩，"抗原-结合部分")或单链。"抗体"是指一种糖蛋白，其包括中间通过二硫键连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条重链包括重链可变区(在本文简写为VH)和重链恒定区。IgG重链恒定区包括4个结构域即CH1,铰链，Ch2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(在本文简写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括1个结构域即C^。Vh和Vt区可以进一步细分为高可变性区域，其称为互补性决定区(CDR)，散布更保守的称为构架区(FR)的区域。每个Vh和VL由3个CDRs和4个FRs组成，其以下列顺序从氨基端到羧基端排列FR1,CDR1，FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以调节免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应器细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。当用于本文时，术语抗体的"抗原-结合部分"(或简称为"抗体部分")是指抗体的保留特异性结合本发明的蛋白或蛋白片段能力的一个或多个片段。已经表明，抗体的抗原-结合功能可以由全长抗体的片段执行。包含在术语抗体的"抗原-结合部分"的结合片段的实例包括(i)Fab片段，其为由VL,VH,Cl和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab，)2片段，其为包括通过铰链区二硫键连接的2个Fab片段的二价片段;(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成;(iv)Fv片段，其由抗体一条臂的Vl和Vh结构域组成；(v)dAb片段(Ward等，(1989)自然(Nature)^1:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域Vl和Vh由独立的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成的连接体结合，所述连接体能使它们形成单条蛋白链，其中Vl和Vh区配対形成单价分子(称为单链Fv(scFv);参见，例如，Bird等.(1988)科学(Science)242:423-426;和Huston等.(1988)美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)^1:5879-5883)，或它们可以通过其它方法如使用二硫键或通过二聚化基序结合。这样的单链抗体也意欲包含在术语抗体的"抗原-结合部分"内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且所述片段以与完整抗体相同的方式筛选用途。其它已知的抗体片段包括纳米抗体，与其相关的技术授权给比利时的Ablynx。本发明还包括与本文描述的抗体和抗体片段基本同源的变体和等价物。这些可以包含，例如，保守取代，即，由相似氨基酸取代一个或多个氨基酸。例如，保守取代是指用在同一大组内的另一种氨基酸取代一种氨基酸，例如，用另一种酸性氨基酸取代一个酸性氨基酸，用另一个碱性氨基酸取代一个碱性氨基酸，或用另一个中性氨基酸取代一个中性氨基酸。保守氨基酸取代所指的内容在本领域中是公知的。当用于本文时，"特异性结合"是指抗体与预先确定的抗原结合。典型地，抗体以1(^M或更小的解离常数(Kd)结合，并且以这样的KD结合预先确定的抗原，所述KD比与除所述预先确定的抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA，酪蛋白)结合的Ko小至少两倍。本发明还扩展至在人或非人动物中刺激针对蠕虫寄生虫的免疫反应的疫苗组合物，所述组合物包括至少一种上述合成的多肽，以及药用载体。当用于本文时，术语"多肽"包括全长蛋白、和较短的肽序列二者。本发明还涉及对本文鉴定的蛋白特异的抗体。所述抗体可以以治疗意义用于结合所述蛋白并且干扰其活性。所述抗体可以是单克隆的或多克隆的，并且可以依据本领域技术人员公知的技术制备。与多肽氨基酸序列相关的"功能等价物"，如上文所用，定义与上述多肽序列相关的或由上述多肽序列衍生而来的多肽，其中所述氨基酸序列已经通过单个或多个氨基酸取代、添加、倒位或删除而进行修饰，并且定义其中氨基酸己被化学修饰的序列，所述化学修饰包括糖基化或去糖基化，但是其仍然保留保护性抗原性(免疫原性)活性。所述功能等价物变体可以作为天然生物学变化存在，或可以使用已知技术制备，例如，功能等价的重组多肽可以使用下列己知技术制备位点定向诱变、随机诱变、或酶促裂解和/或氨基酸的连接。本发明所述的合成多肽可以代表保护性抗原性序列。当用于本文时，术语"保护性抗原"定义能够产生宿主-保护性(免疫原性)免疫反应的那些抗原，所述宿主-保护性(免疫原性)免疫反应即是这样的宿主反应，其引起产生消除寄生虫的生育力、破坏、抑制或杀死寄生虫的免疫效应器分子、抗体或细胞，并且由此"保护"宿主免受临床或亚临床疾病以及生产力丧失。这样的保护性免疫反应可以通常由产生这样的抗体而证明，所述抗体能够抑制寄生虫的代谢功能，导致发育障碍、卵生产缺乏和/或死亡。本发明该方面所述的合成多肽可以通过在宿主细胞中表达而制备，所述宿主细胞包含重组DNA分子或包含含有所述重组DNA分子的重组DNA克隆媒介物或载体，所述重组DNA分子包括上文广泛描述的核苷酸序列，该核苷酸序列与表达控制序列可操作性的连接。备选地，可以通过直接注射本发明所述的裸DNA分子到宿主细胞中而表达所述多肽。这样表达的合成多肽可以是一种融合多肽，其包括表现出本发明所述的羧肽酶的全长或部分的生化/生理学免疫原活性的部分，和由与其融合的重组分子的DNA编码的另一种多肽。例如，可以理想地产生这样的融合蛋白，其包括与蛋白如(3-半乳糖苷酶、磷酸酶、谷胱甘肽-S-转移酶、脲酶、乙型肝炎核心抗原(Francis等，1989)等偶联的本发明所述的合成的羧肽酶或其它多肽。大部分融合蛋白通过重组基因表达形成，在所述重组基因中，两个编码序列协调地符合阅读框连接在一起。备选地，多肽可以通过化学方法在体外连接。本发明包括羧肽酶-编码核酸分子的所有这样的融合或杂交衍生物以及它们各自的氨基酸序列。这样适当重组的DNA和多肽表达技术，例如，记述在Sambrook等，1989中。备选地，所述合成多肽可以通过化学方法产生，诸如公知的Merrifield固相合成法。本发明的其它方面包括上述核酸分子或合成的肽或多肽用于制备在哺乳动物中特别是反刍哺乳动物中刺激免疫反应的疫苗组合物的应用。备选地认为，本发明还提供在哺乳动物中特别是反刍动物中刺激针对蠕虫寄生虫感染的免疫反应的方法，所述方法包括给所述动物施用疫苗组合物，所述疫苗组合物包括一种或多种由上文定义的核苷酸序列编码的多肽。疫苗组合物可以依据本发明通过疫苗制备领域公知的方法制备。传统的疫苗制剂可以在存在一种或多种药用载体或稀释剂的条件下包括一种或多种本发明所述的合成多肽，以及，在适当情形中，一种或多种合适的佐剂，例如，氢氧化铝、皂苷、QuilA、或其更纯化的形式，胞壁酰二肽、矿物油、或Novasomes。适当的载体包括液体介质，如适合用作赋形剂将所述肽或多肽引入到哺乳动物中的盐溶液。可以包括其它成分如防腐剂。备选的疫苗制剂可以包括病毒或宿主细胞，例如，微生物(例如，痘苗病毒、腺病毒、噬菌体沙门氏菌(Salmonella))，其在其中插入了本发明所述的核酸分子(例如，DNA分子)，以刺激针对由所插入的核酸分子编码的多肽的免疫反应。疫苗组合物的施用可以通过任何常规途径实施，例如，口服或肠胃外，诸如通过肌内注射，任选地以这样的时间间隔，但不限于其进行，例如，以7-28天的时间间隔注射两次。如上文所述，本发明所述的羧肽酶-编码序列的表达可以使用一些己知技术和表达系统实现，包括在原核细胞中如在大肠杆菌(E.COli)中表达，和在真核细胞中如酵母或(of)杆状病毒-昆虫细胞系统中表达，或在转化的哺乳动物细胞以及在转基因动物和植物中表达。特别有利地，所述核苷酸序列可以使用转基因线虫系统进行表达，诸如用于线虫隐杆线虫(Caenorhabditis)的系统，例如，在Fire，(1986);Fire等，(1989);Spieth等,(1988);Han等，(1990)中所述。本发明的另一个方面提供制备上述合成多肽的方法，所述方法包括在表达所述多肽的条件下，培养上述含有核酸分子的真核细胞或原核细胞，并且回收这样产生的所述多肽。因此，本发明的其它方面包括包含本发明所述的核苷酸序列的克隆和表达载体。所述表达载体包括与本发明的核酸分子阅读框匹配连接的适当的控制序列，诸如例如翻译(例如起始和终止密码子)和转录控制元件(例如，启动子-操纵子区、核糖体结合位点、终止序列)。本发明所述的载体可以包括本领域公知和记录的技术所述的质粒和病毒(包括噬菌体和真核病毒)，并且可以在多种不同表达系统中表达，所述表达系统也是本领域公知和记录的。适当的病毒载体包括，如上文所述，杆状病毒以及腺病毒和痘苗病毒。本领域记述了多种其它病毒载体。许多技术是已知的，并且可以用来将所述载体引入到原核细胞或真核细胞中进行表达，或引入到生殖细胞系或体细胞中以形成转基因动物。在文献中充分描述了适当的转化或转染技术。上文定义的包含本发明所述的核酸分子的转化的或转染的真核或原核宿主细胞或转基因生物体形成本发明的另一个方面。一般地真核表达系统，特别是线虫表达系统，具有这样的优点，可以发生翻译后加工，且特别是发生糖基化…-在转基因线虫系统的情形中，可以预测与在天然蛋白中发现的相对应的糖基化。哺乳动物细胞表达系统也具有许多优点。哺乳动物宿主细胞提供天然形式的良好重现和抗原的保护性表位，原因在于真核表达系统将产生大肠杆菌缺少的更相似的糖基化模式，二硫键和其它翻译后修饰，大肠杆菌可以产生需要重折叠的不溶蛋白并且具有极差的天然形式重现。另外，哺乳动物糖基化不可能诱导分散(distractfrom)抗蛋白保护反应的免疫反应。对于人和家畜动物的保护，因此，优选使用人或动物成纤维细胞或骨髓瘤细胞系，如HeLa，——一种人细胞系;BHK-幼仓鼠肾细胞；VERO，即一种猴子肾细胞系；FR3T3，即费希尔速率成纤维细胞(Fisherratefibroblast);NIH3T3，即一种小鼠成纤维细胞系；C1271,即一种小鼠乳腺瘤细胞系；CV-1，即非洲绿猴肾成纤维细胞；3T6，即小鼠胚胎成纤维细胞；L细胞，即一种小鼠细胞系；CHO，即中国仓鼠卵巢细胞系；NSONSI,Sp2和其它小鼠骨髓瘤细胞系和大鼠骨髓瘤细胞系如YB2/0和Y3。适用于不同种类的哺乳动物细胞系的载体在本领域内是公知的。通常，这些包括与编码所述抗原或其片段的核苷酸序列可操作性连接的启动子和/或增强子。适当的启动子包括SV40早期或晚期启动子，例如，PSVL载体，巨细胞病毒(CMV)启动子，小鼠金属硫蛋白I启动子和小鼠乳腺瘤病毒长的末端重复序列。所述载体优选地包括适合的标记，如关于二氢叶酸还原酶或谷氨酰胺合酶的基因。这些类型的载体记述在WO86/05807,WO87/04462,WO89/01036和WO89/10404中。对宿主细胞的转染可以使用标准技术实施，例如，使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物、原生质体融合、脂质体、直接的显微注射、基因轰击(genecannon)或电穿孔。优选后一种技术，并且使用电穿孔转染哺乳动物细胞系的方法由Andreason等，1980描述。一般地，线性DNA比环形DNA更容易引入。发明详述现在，将通过实施例和参考附图的形式进一步描述本发明，所述附图显示.-图1丝氨酸羧肽酶富集的蛋白级分在还原条件下的SDS-PAGE图谱。挑取约55kDa的明显条带(条带A和B)，并且通过胰蛋白酶消化、肽质量指纹分析和LC-MS/MS分析进行分析；图2(A)捻转血矛线虫丝氨酸羧肽酶样蛋白Hc-PCPl和Hc-PCP2的预测氨基酸序列。两种蛋白中的N端信号序列的裂解位点用箭头标记。推定的糖基化位点用*标记。两种蛋白均包含用[]标记的两个丝氨酸羧肽酶S28型结构域。(B)捻转血矛线虫PCP，S的图示，所述捻转血矛线虫PCP，s包含信号肽(SP)和两个羧肽酶S28型结构域。(C)预测的He-PCP1核苷酸序列。(D)预测的Hc-PCPS核苷酸序列。图3通过RT-PCR显示的//c-;7c/7/和//c-pcj^的转录。泳道是使用来自出鞘的L3、L4、11日龄和22日龄成虫寄生虫的靶RNA的独立的RT-PCR反应。将关于细胞质超氧化物歧化酶(5^D^的RT-PCR用作对照，检验RNA纯化的均匀性。图4二肽基肽酶活性测定。(A)在pH7.5丝氨酸羧肽酶对DPPIV和DPPII特异性底物的剂量依赖性降解。(B)在不同pH温育的丝氨酸羧肽酶对DPPIV特异性底物的活性。(C)检测两种DPPIV特异性抑制剂对丝氨酸羧肽酶DPPIV型活性的作用。图5添加丝氨酸羧肽酶(PCP，s)对血纤蛋白重聚集的抑制。(A)对照血纤蛋白单体的重聚集与用不同浓度丝氨酸羧肽酶温育的血纤蛋白单体重聚集的比较。(B)分析DiprotinA对血纤蛋白重聚集抑制的影响。所有结果表示为在350nm测量的散射光的变化，其是对重聚集的血纤蛋白单体量的测量。图6丝氨酸羧肽酶对血纤蛋白(x-链的蛋白水解性降解和DiprotinA对该活性的部分抑制。(A)血纤蛋白溶液在用丝氨酸羧肽酶温育之前(泳道1)和温育15秒之后(泳道2)的10。/。还原SDS-PAGE。(B)对照血纤蛋白溶液(泳道l)、用丝氨酸羧肽酶温育15秒的血纤蛋白(泳道2)和用丝氨酸羧肽酶和DiprotinA温育15秒的血纤蛋白(泳道3)的10%还原SDS-PAGE凝胶。图7oc-链的消化产物和Y-链协同泳动和质谱分析，表明消化从C端起始。下划线字体表示a-链区域，其中阳性击中(hits)用胰蛋白酶消化的片段获得。注意在C端没有获得击中，这表明该区域己被羧肽酶活性去除。材料和方法縱遂鎌麥膽節通过打开和清洗来自感染的绵羊的皱胃而收集成虫捻转血矛线虫。将蠕虫在PBS中匀浆，然后以3000rpm离心5分钟。收集上清，并且将沉淀物再在PBS中匀浆，然后以3000rpm离心。合并上清，并且以10000g离心10分钟。沉淀物用PBS洗涤1次，并将合并的上清以35000rpm离心90分钟。将含有丝氨酸羧肽酶的沉淀物重悬在lmlPBS中，并且在分析前保存在-80。C。微敏欲微谱分叛在还原条件下在10%SDS-PAGE凝胶上分析丝氨酸羧肽酶富集的蛋白提取物。蛋白成分通过考马斯亮蓝染色显现。从凝胶上切下蛋白条带，并用于质谱分析。简言之，使用胰蛋白酶在凝胶中消化蛋白条带，然后纯化，并且通过MALDI-TOF质谱分析。必要时，剩余物质用于LC-MS/MS分析。Mascot搜索引擎用来分析质谱和LC-MS/MS数据，并且鉴定所述蛋白。cD顺游分蓐舰虔从11日龄捻转血矛线虫cDNA文库分离丝氨酸羧肽酶的全长cDNA序列(从此处开始命名为//c-pq/和Z/c-;cp2)。基于EST簇HCC00232(7/c少c;^j和HCC00298(Hc-pc;9"的共有序列，设计特异性引物，以分离每种cDNA的5'和3'末端。引物序列显示在表1中。基因特异性引物与T3cDNA文库载体引物组合使用。将PCR产物克隆在pGEM-T(普洛麦格(Promega))中并测序。使用DNAstar软件(DNAstar公司)进行序列分析和比对。生激/,息学使用可在Nembase网址(www.nematodes.org/nematodeESTs/nembase.html)获得的Partigene生物信息学途径(Parkinson筝2004)分析捻转血矛线虫和其他线虫的EST数据(在www.nema.cap.ed.ac.uk/nematodeESTs/nembase.html上获得)。使用DNAstar软件(DNAstar公司)进行进一步的序列和推定氨基酸序列分析。数据库搜索在NCBI月艮务器(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)上进行。使用信号P-(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)禾口NetNGlyc-程序(www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlvc)分析氨基酸序列的信号肽和糖基化位点。及綠麟凝游潛使用反转录酶偶联的PCR(RT-PCR)来确定//c-pc^7和//c-;x^的阶段-特异性转录。使用总RNA分离试剂(高级生物技术有限公司(AdvancedBiotechnologiesLtd.)),按照Hashmi等(2002)所述，从出鞘的L3、L4和成虫寄生虫提取总RNA。RT-PCRs使用Superscript—步RT-PCR系统(Invitrogen)进行。用于检测//c-pc;7或(of)说-;x^转录物的特异性引物显示在表1中。在35个扩增周期后，在P/。琼脂糖凝胶上分离RT-PCR产物。关于细胞质超氧化物歧化酶基因(SODc)的RT-PCR用来控制RNA纯化的均匀性，所述细胞质超氧化物歧化酶基因是一种在所有生命周期阶段表达的基因。二嚴基農線/孺定使用一组分别具有对DPPI,II，III和IV的特异性的底物的初始筛选表明存在强DPPIV活性和非常轻微的DPPII活性。然后，分别使用生色底物H-Ala-Pro-对硝基苯胺(pNitroanilide)和H-Lys-Ala-对硝基苯胺(Bachem)测量DPPIV和DPPII活性。两种底物的储液it甲醇中制备(浓度为1M)。将不同体积的丝氨酸羧肽酶制备物(2-6nl)与底物(终浓度lmM)混合在100(ilpH3-8范围内的缓冲液中(pH3-5:0.1M醋酸钠缓冲液，pH6-7:0.1M磷酸缓冲液，pH8:0.1MTris缓冲液)。将样品在37°C温育45分钟，然后转移到微量滴定板。在405nm处测量光密度。每次实验一式两份地进行。DPPIV抑制剂DiprotinA和DiprotinB对酶活性的作用通过向上述反应混合物中加入不同浓度的抑制剂(10piM，100(iM,500和lmM)而确定。厨節/鄉/羞覆雄定通过加入lW凝血酶储液(IOmg/ml)并且在37。C温育15分钟，来凝固牛血纤蛋白溶液(浓度15mg/ml)。收集血纤蛋白凝块，并且重悬在8ml1MNaBr/0.05醋酸钠缓冲液pH5.3中。随后将这种血纤蛋白单体溶液浓縮至750pl，并且在使用前保存在4。C。通过将5^il血纤蛋白单体溶液与95plPBS混合而实施血纤蛋白溶液的重聚集/凝固。通过在分光光度计中测量在350nm处的90。角散射光来监测重聚集。结果表示为在10分钟期间散射光的变化。在进行分光光度计测量分析前，通过将5pl血纤蛋白单体溶液与不同浓度的丝氨酸羧肽酶在37。C温育30分钟，而测定丝氨酸羧肽酶对血纤蛋白重聚集的作用。DPPIV抑制剂DiprotinA的作用通过向上述反应混合物中加入0.4pl的0.5M抑制剂储液而确定。i,歪雄颜定将25吗按上述制备的血纤蛋白单体与不同浓度的丝氨酸羧肽酶混合，并且在37。C温育15秒-30分钟范围内的不同长度的时间。随后，在还原条件下在10%SDS-PAGE凝胶上分析样品，并且通过考马斯亮蓝染色显现。DiprotinA抑制剂的作用通过向上述反应混合物中加入终浓度为O.lM的抑制剂而进行研究。结果錄麽微麟赦丝氨酸羧肽酶富集的级分的蛋白图谱显示在图l中。它包括约55kDa的明显的条带(图l中的箭头)。从考马斯亮蓝染色的凝胶上挑取该条带，并且通过胰蛋白酶消化、肽质量指纹分析和LC-MS/MS分析进行分析。然后，针对捻转血矛线虫EST数据筛选该结果。55kDa条带的LC-MS/MS分析导致3种肽序歹i」，其显示与簇HCC00232和HCC00298的100。/。匹配(表2)。簇HCC00232和HCC00298分别包含421和37个单个EST序列。簇HCC00232的共有序列为2579bp长。使用与T3载体引物组合的基因特异性引物通过PCR方法从cDNA文库分离在5'端的另一个884bp。这形成编码122kDa蛋白的全长克隆序列。簇HCC00298具有3037bp的共有序列。与在3'端的另一个562bp—起，它编码129kDa的蛋白，所述3，端的另一个562bp以与上述相同的方法分离。两种蛋白均表现出与秀丽隐杆线虫中的脯氨酰羧肽酶样蛋白(PCP-2acc.NP—501599和PCP-3acc.NP501598.1)的同源性。在捻转血矛线虫和秀丽隐杆线虫蛋白之间共有的同一性在约38%变化。这两种捻转血矛线虫蛋白从此处开始命名为Hc-PCPl(簇HCC00232)和Hc-PCP2(簇HCC00298)。Hc-PCPl和Hc-PCP2的序列比对显示在图3版A中。这两种蛋白在氨基酸序列上彼此表现出64%的同一性，并且都包含信号肽和多个推定的糖基化位点(在图3版A中标记)。Hc-PCPl和Hc-PCP2都包括两个丝氨酸羧肽酶S28型结构域(pfam05577)，其以串联重复排列(图3版B)。这种特征似乎是线虫特有的，只有秀丽隐杆线虫PCP's表现出相似的结构。每个S28结构域编码51kDa丝氨酸羧肽酶，其近似匹配SDS-PAGE凝胶上条带B的尺寸。因此，可能是两个串联结构的PCP's被翻译后加工到4种独立的丝氨酸羧肽酶中。i/dA》银录漠式在关于出鞘的L3、L4、11日龄和22日龄寄生虫的总RNA样品的RT-PCR中，使用/fc-/cp/和/7c-pcp2特异性引物。RT-PCRs的结果显示在图3中。这两种基因的转录物从L4阶段开始存在。使用关于细胞质超氧化物歧化酶基因(SODc)(acc，Z69621)的反转录酶偶联的PCR来控制RNA纯化的均匀性。二屋基厕緒丝二肽基肽酶活性测定的结果显示在图4中。在pH7.5，丝氨酸羧肽酶以剂量依赖性方式水解DPPIV特异性底物。发现非常轻微的针对DPPII特异性底物的活性(版A)。在pH6检测到针对DPPIV的最大活性(图4版B)。特异性抑制剂对DPPIV活性的作用显示在图4版C中。DiprotinA以剂量依赖性方式部分抑制DPPIV型活性。使用DiprotinB抑制剂没有观察到任何作用。踏節蘇窗/定血纤蛋白重聚集测定的结果显示在图5版A中。向血纤蛋白单体溶液中加入丝氨酸羧肽酶以剂量依赖性方式显著抑制重聚集，其通过在10分钟期间内散射光的变化而测量。通过加入DPPIV抑制剂DiprotinA，部分逆转这种作用(图5版B)。血纤蛋白单体溶液在还原条件下在10%SDS-PAGE凝胶上的级分显示在图6版A中。其形成约63kDa,56kDa和47kDa的3条蛋白条带，这些分别是a-链、p-链和Y-链。加入丝氨酸羧肽酶在37°C温育15秒后导致cx-链非常快速的蛋白水解降解(图6版A)。加入DiprotinA抑制剂部分逆转这种作用(图6版B)。a-链的消化产物与？链协同泳动和质谱分析，(图7)表明消化从C末端开始。红色字体表示其中使用胰蛋白酶消化片段获得阳性击中的a-链区域。注意，针对C端没有获得击中，这表明该区域已被羧肽酶活性去除。表l:用于RT-PCR和RACE实验的PCR引物序列捻转血矛线虫EST簇(基因名称)引物序列HCC00232(〃c隱拜"FRT-PCR5，aagcaggttcagccttttcaRRT-PCR5，cttgcccattgttcgttttt5'RACE5'cataatgacgcacgatogacHCC00298(〃c-pcp2JF-RT-PCR5'cgctgacctgtgteaagtgtRRT-PCR5'aagtagccggettcgtattg3'RACE5'ageategccgetttcaat表2:55kDa条带LC-MS/MS分析的肽序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>权利要求1.一种用于鉴定抗蠕虫药的筛选测定方法，所述测定方法包括使药剂与蠕虫蛋白或其片段接触的步骤，所述蛋白或其片段特征在于表现出二肽基肽酶IV活性并且导致血液凝固时间的增加，从而检测所述药剂是否能够调节所述蛋白的所述活性或血液凝固作用。2.权利要求1的筛选测定方法，其中所述蛋白或其片段包括图2a所示的序列。3.权利要求1的筛选测定方法，其中所述蛋白或其片段由图2c或2d所示的序列编码。4.前述权利要求任一项的测定方法，其中所述药剂抑制或减小所述蛋白或其片段的DPPIV活性和/或所述蛋白或其片段增加血液凝固时间的能力。5.前述权利要求任一项的筛选测定方法，其中所述蛋白或其片段通过重组方式提供或从蠕虫本身纯化而来。6.前述权利要求任一项的测定方法，其中所述蛋白或其片段从蠕虫的食血L4或成虫阶段分离。7.前述权利要求任一项的测定方法，其中所述待检测的药剂选自由下列各项组成的组(i)小化学个体；(ii)对所述蛋白特异性的抗体；(iii)设计靶向所述蛋白的表达的RNAi分子；和(iv)肽模拟物等。8.前述权利要求任一项的测定方法，其中可以将所述药剂施用给活的蠕虫，诸如捻转血矛线虫(ifoemtwc/zwco"tor/to)，或施用给感染了所述蠕虫的宿主动物。9.前述权利要求任一项的测定方法，其中鉴定的抗蠕虫药对寄生虫特异，并且基本上不影响宿主DPPIV蛋白的DPPIV活性。10.DPPIV抑制剂在制备用于治疗蠕虫感染、特别是捻转血矛线虫感染的药物中的应用。11.权利要求10的应用，其中所述抑制剂选自由下列各项组成的组(i)DiprotinA禾口B;(ii)vildagliptin;(iii)Sitagliptin;(iv)二甲双胍；(v)Saxagliptin;(vi)MK-0431缬氨酸pyrrolidide;(vii)异亮氨酸thiazolidide;(viii)FE99901;(ix)NVP陽DPP728;(x)LAF237;(xi)SYR322;和(xii)SYR619。12.治疗感染了蠕虫的动物如反刍动物的方法，所述方法包括给所述动物施用DPPIV抑制剂的步骤。13.包括一种或多种核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码蠕虫丝氨酸羧肽酶和/或其酶反应性和/或抗原性部分。14.权利要求13的核酸分子，其中所述一种或多种核苷酸序列包括图2c或2d所示的序列，或编码具有与图2a所示的氨基酸序列的全部或部分基本上相对应的序列的酶。15.包括一种或多种核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码与蠕虫丝氨酸羧肽酶基本同源的酶，或其可以与权利要求13或14的任一种序列杂交。16.包括一种或多种编码一种或多种多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述核酸分子用于药物筛选测定方法和/或用于产生抗蠕虫寄生虫的保护性抗体，所述核酸分子的序列结合图2a所示的羧肽酶-编码序列的一个或多个酶的和/或抗原性区域。17.—种合成多肽，其包括一种或多种氨基酸序列或其功能等价变体，所述氨基酸序列组成羧肽酶或其酶的和/或抗原性部分，与图2a所示的氨基酸序列的全部或部分基本相对应。18.权利要求17的合成肽，其中所述肽提供保护性抗原性序列。19.一种融合多肽，其包括表现出蠕虫丝氨酸羧肽酶的全部或部分的生化/生理免疫原性活性的部分，和另一种多肽。20.制备权利要求17-19的合成多肽或融合多肽的方法，所述方法包括下列步骤(a)培养包含权利要求13-16所述的核酸分子的细胞；(b)在所述核酸表达的条件下维持所述细胞；和(c)回收这样产生的多肽。21.在人或非人动物中刺激针对蠕虫寄生虫的免疫反应的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括至少一种权利要求17-19的合成多肽或融合多肽，以及药用载体。22.—种疫苗制剂，其包括病毒或宿主细胞，所述病毒或宿主细胞中插入了一种或多种权利要求13-16的核酸分子，用于刺激针对由所述一种或多种插入的核酸分子编码的多肽的免疫反应。23.—种抗体，其对权利要求17-19的蛋白是特异性的。24.权利要求13-19所述的核酸分子、或合成的或融合的肽/多肽的应用，其用于制备在哺乳动物中特别是反刍哺乳动物中刺激免疫反应的疫苗组合物。25.—种在哺乳动物中、特别是反刍动物中刺激针对蠕虫寄生虫感染的免疫反应的方法，所述方法包括给所述动物施用疫苗组合物，所述疫苗组合物包括由权利要求13-16的核苷酸序列编码的一种或多种多肽。26.权利要求13-16所述的核酸分子、或合成的或融合的肽/多肽的应用，其用于制备用作抗凝血剂的药物。27.—种在哺乳动物中防止和/或延迟血液凝固的方法，所述方法包括给所述动物施用权利要求13-19所述的核酸分子、或合成的或融合的肽/多肽。全文摘要本发明涉及用于鉴定新型抗蠕虫药的筛选，特别涉及抗血矛线虫属蠕虫药剂，以及用作针对蠕虫如血矛线虫属蠕虫的疫苗或免疫原性药剂的蛋白/肽的制备。文档编号A61K38/48GK101563103SQ200780041427公开日2009年10月21日申请日期2007年9月13日优先权日2006年9月13日发明者彼得·布鲁诺·吉尔德霍夫,戴维·帕特里克·诺克斯申请人:莫登研究院