专利名称：：经修饰的具有改良生物活性的可溶性FGF受体Fc融合物的制作方法经修饰的具有改良生物活性的可溶性FGF受体Fc融合物发明领域和引言本发明涉及经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物、含有其的组合物以及生产所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合分子的方法，该融合物包含FGF受体的可溶性片段或区域以及免疫球蛋白的Fc区，具有改良的生物活性。特别的，所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物具有改良的抗血管发生活性和抗肺瘤抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，称为ADCC(抗体依赖性细胞毒性)和/或CDC(补体依赖细胞毒性)，并且因此可用于治疗癌症、转移性肺瘤以及在受试者中降低肺瘤生长。本发明还涉及抑制肺瘤生长的方法和治疗或预防下述病理状态的方法，所述病理状态包括但不限于乳腺癌、黑素瘤、白血病、脑转移、肾癌、原发性黑素瘤、原发性结肠癌、原发性膀胱癌、婴儿性血管瘤、卵巢癌、前列A，癌和肺癌。
背景技术：
：和关联血管发生(即从已有的血管形成新的血管)包括内皮细胞增殖、迁移、基底膜降解和新血管组织的复杂协调(Ji等，1998,FASEBJ.12:1731-1738)。血管发生生长因子的局部、自由释放和/或天然血管发生抑制剂生产的改变导致血管发生平衡的改变(Hanahan等，1996,Cell.86:353-64),从而导致肿瘤新血管形成和血管发生依赖的疾病中内皮细胞的自由增殖(Folkman,1995,Nat.Med.1:27-31)。已鉴定了大量的血管发生天然诱导物，包括血管内皮生长因子(VEGF)家族成员、血管形成素(angi叩oietins)、转化生长因子-a和-卩(TGF-a和-P)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、白细胞介素、趋化因子以及成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员。这些有效的血管发生西子通常由胂瘤组织过表达(Presta,2005,Cytokine&GrowthFactorsReviews.16:159-178;Grose，2005,Cytokine&GrowthFactorsReviews.16:179-186)。实际上，FGF,尤其是FGF2在许多人类癌症中过表达，所述癌症包括黑素瘤(Halaban,1996,SeminOncol.23:673-81;Hanada,2001,CancerRes.61:5511-5516)、白血病(Krejci等,2001Leukemia.15:228-37,Bieker等，2003,CancerRes.63:7241-7246)、肾癌(Hanada,2001,CancerRes.61:5511-5516)、结肠癌(Tassi，2006,CancerRes.66:1191-1198)、卵巢癌(Whitworth等，2005,ClinCancerRes.11:4282-4288，Gan等，2006，PharmRes.23:1324-31)、前列腺癌(Aigner等,2002Oncogene,21:5733-42;Kwabi-Addo等，2004,EndocrRelatCancer.11:709-24)以及肺癌(Takanami等，1996,PatholResPract192:1113-20;Volm等，1997,AnticancerRes.17:99-103;Brattstrom等，1998,AnticancerRes.18:1123-1127)。此外，FGF2过表达与包括膀胱癌、乳腺癌，头颈癌在内的某些癌症中的化学抗性相关(Gan等，2006,PharmRes.23:1324-31)。就FGF家族成员而论，由于由胂瘤细胞分泌的FGFs具有对细胞表面的氨基葡聚糖侧链以及基质蛋白聚糖的亲和性，这些分泌的FGFs最有可能隔绝(sequestered)于肺瘤细胞附近，形成FGF库。这尤其使得FGF提供了定向需要稳定表达和易于接近的靶分子的活性分子的良好策略。当前采用基于不同抗体的产品作为治疗药物，一些单克隆抗体(mAbs)现已在多个治疗领域例如肺瘤、炎症、传染病和心血管疾病中被批准。这些mAbs通过多种机制诱导肿瘤细胞杀伤，包括免疫系统的募集(Harris,2004,LancetOncol,5:292-302)。mAbs的Fc部分负责这些免疫介导效应子功能，包括两种主要机制抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖细胞毒性(CDC)。当mAb首先通过其抗原结合部位与其胂瘤细胞上的耙标结合时产生ADCC，随后该Fc部分纟皮攻击耙细胞的效应细胞(即，NK,嗜中性白细胞、巨噬细胞......)上特异的Fc受体(FcR)识别。CDC是如下过程当mAb结合Clq后，在补体活化部位附近的抗体覆盖肺瘤细胞表面上形成C3b,不同补体蛋白的级联成为活化的。C3b的存在控制C5-C9膜攻击复合物的形成，其可以插入膜溶解肺瘤细胞(Sharkey，2007,CACancerJClin,56:226-243)。mAbs刺激ADCC的能力依赖于其同种型。IgGl和lgG3抗体与FcRs高度结合，而lgG4和lgG2抗体结合较弱。mAb的CDC能力也依赖于mAb同种型。lgG3和IgGl(在较低的程度上)是刺激经典补体级联的最有效同种型。lgG2mAbs在活化补体级联中较弱，而lgG4无此能力(Strome,2007,TheOncologist,12:1084-1095)。融合蛋白的使用是这些治疗策略的一个方面，所述融合蛋白可如抗体一样具有显示出特异性靶向的结合部分以及能够通过募集免疫系统诱导粑细胞裂解的效应子部分的双重功能性。此外，为了有效治疗，所述分子需要具有有利的药代动力学性质PK。Fc部分可以可检测地增加所述经修饰可溶性FGF受体Fc融合物的血清半衰期，但仍有进一步增加血清半衰期的需要。最后，如果该融合蛋白用作药物，其必须可靠、有效地生产，并且具有合适的生产率。因此，需要具有粑向FGF的具有ADCC和/或CDC活性的融合蛋白，其用于治疗癌症、转移性胂瘤和在受试者体内降低肿瘤生长，具有改良的PK性质，并且可以有效地生产。本申请人现发现，经修饰具有特别的聚糖性质的可溶性FGF受体部分(结合或靶向部分)和Fc部分(效应子功能部分)之间的可溶性融合蛋白具有实质上改良的生物活性，包括ADCC和/或CDC活性，并且因此可用作治疗自由的细胞生长或癌症的有效抗血管发生和抗肿瘤药物。由于其唾液酸化率，这些经修饰的可溶性融合蛋白具有有利的PK性质，并且由于其糖基化才莫式，可以适当的产率和最小的聚集生产。发明概述本发明因此涉及经修饰的可溶性FGF受体Fc,其包含FGF受体的可溶性片段或区域与免疫球蛋白Fc区域的融合物，其中至少所述FGF受体部分的第5号N-糖基化位点被占据，并且其中至多45%的FGF受体部分的N-聚糖不具有唾液酰基。此外，根据本发明进一步优选的实施方案，所述FGF受体部分的笫3、4、6和7号N-糖基化位点^皮占据。优选的，所有的N-糖基化位点均被占据。在进一步优选的实施方案中，本发明融合物中FGF受体部分中每个N-聚糖的唾液酸平均数为至少0.9;甚至更优选的，为至少1.2。根据本发明，经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物的每个N-聚糖分子含有3个甘露糖残基、平均1.5-3.0个半乳糖残基、3.5-5个N-乙酰葡糖胺以及0.6-1个岩藻糖残基。本发明还涉及经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其包括FGF受体可溶性片段或区域与免疫球蛋白Fc区域的融合物，其中所有的N-糖基化位点均被占据，并且其中至多45%的FGF受体部分的N-聚糖不具有唾液酰基，以及其中Fc区域的N-聚糖为60-100%岩藻糖基化。在一个实施方案中，所述FGF受体可溶性片段或区域为FGF受体l(sFGFRl)或FGF受体2(sFGFR2)的可溶性或胞外区域。在另一个实施方案中，所8述FGF受体可溶性片段或区域为FGF受体1同种型或变种IIIc(sFGFRl(IIIc))或FGF受体2同种型IIIc(sFGFR2(IIIc))的可溶性或胞外区域。根据一个优选的实施方案，所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物由具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的多核香酸编码，或由具有与SEQIDNO:1的核苷酸序列至少80°/。同一性的多核苷酸编码。在进一步的实施方案中，本发明所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物具有如SEQIDNO:2中所示氨基酸序列或具有与SEQIDNO:2中所示序列至少95%、97%、98%或99%同一性的序列。本发明所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物具有ADCC和/或CDC活性，因此可用于治疗诸如癌症的疾病。本发明还涉及包含所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物的药物组合物。本发明还涉及经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物与具有抗肿瘤和/或抗血管发生性质的化学治疗剂或生物治疗剂的组合。本发明的另一方面是治疗癌症的方法，或预防或降低肿瘤生长和体积和转移性肺瘤的方法，包括向受试者给予治疗有效量的本发明经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物。附图简述图1A和B分别显示了SIAT6(ST3GAL3)和B4GT1(B4GALT1)的表达载体图谱。图2A和B显示了用于从pXL4551中表达的B4GT1(B4GALT1)的核酸(SEQIDNo.9)和氨基酸(SEQIDNo.IO)序列。图3A和B显示了用于从pXL4544中表达的SIAT6(ST3GAL3)的核酸(SEQIDNo.ll)和氨基酸(SEQIDNo.12)序列。图4A相应于用于从pXL4410、pXL4429或pXL4636表达的sFGFR2-Fc核酸序列(SEQIDNo.1),图4B相应于由pXL4410、pXL4429或pXL4636编码的sFGFR2-Fc氨基酸序列(N-糖基化位点以粗体显示)(SEQIDNo.2)，图4C相应于sFGFR2的氨基酸序列(SEQIDNo.4),图4D相应于Fc的氨基酸序列(SEQIDNo.6)，图4E相应于连接子的氨基酸序列，以及图4F相应于信号肽的氨基酸序列(SEQIDNo.8)。其为用于白细胞介素-2的信号肽。观察到这种肽在SEQIDNo.2表示的序列的上游融合产生具有同种N末端氨基酸序列的分泌蛋白。图5为用于构建编码sFGFR2-Fc和谷氨酰胺合成酶的pXL4636策略的图示。图6A和B显示了用于sFGFR2-Fc和DHFR的表达载体pXL4429以及编码新霉素抗性基因的pXL4417的图谱。图7为显示每个sFGFR2N-聚糖的唾液酸平均数和sFGFR2-Fc在血中清除率的相关性的图表-最佳比例>1.2,优选比例>0.9。图8显示了存在(+)或不存在(-)PNGaseF情况下孵育1pgsFGFR2-Fc的SDS-PAGE(非还原条件下)。M:分子量标记。图9显示了N-聚糖的位置以及在sFGFR2-Fc二聚体中的编号。编号从FGFR2(FGFR2_HUMAN)的N末端氨基酸序列开始，这样位置Nl相应于Asn83,N2相应于Asnl23,N3相应于Asn228,N4相应于Asn241,N5相应于Asn265，N6相应于Asn297,N7相应于Asn318，N8相应于Asn331。位置N297相应于人Fc(IgGl)上的Asn位置。图IO为蛋白sFGFR2-Fc在血中长达72小时的清除动力学(正方形)图表。图11显示了蛋白sFGFR2-Fc在血浆和肝脏中的回收量，以注射剂量的％表示。图12为治疗至第40天后的A549肺瘤体积分析图表(100^ig/小鼠/给药三角；300pg/小鼠/给药正方形；500ng/小鼠/给药封闭圆圈；PBS对照开口圆圏)。图13为治疗之后笫40天的A549肺瘤重量分析图表。图14为治疗至第22天的H460肺瘤体积分析的图表(治疗组封闭圆圏；PBS对照组开口圆圏)。图15为治疗后第22天后的H460肿瘤重量分析图表。图16为sFGFR2-Fc对H460和A549肺瘤细胞体外ADCC活性的评价图表。图17显示了当植入三种小鼠系(即SCID(图17A)、NOD/SCID(图17B)和SCID/bg(图17C))时直到第41天的A549肺瘤体积分析图表(sFGFR2-Fc100吗/小鼠/给药菱形；PBS对照:开口圆圈)。图18显示了当植入三种小鼠系(即SCID(图18A)、NOD/SCID(图18B)和SCID/bg(图18C))时直到第22天的H460肺瘤体积分析图表(sFGFR2-Fc100pg/小鼠/给药菱形；PBS对照开口圆圏)。图19A显示了编码sFGFR2-Fc(Fc中A265)的质粒图谱，图19B显示了sFGFR2-Fc(Fc中A265)的蛋白序列(SEQIDNo.14)。位置392为Fc区中的突变位置(Asp2MAla)，以粗体表示。图20为显示当移植至棵鼠系中时直到第23天的H460肿瘤体积分析的图表(开口圆圈PBS对照;菱形sFGFR2-Fc500吗/小鼠/给药;开口正方形sFGFR2-Fc(A265Fc)500吗/小鼠/给药。"p<0.01vs对照，Anova&Newman画Keuls后检验)。发明详述在整个该公开文本中，申请人参考了期刊文章、专利文件、出版的参考文献、网页、数据库中可获得的序列信息，以及其他信息来源。本领域技术人员可利用任何所引用的信息源的全文来制备和使用本发明的方面。每一个引用的信息源特别地整体通过援引引入本文。如果允许或需要的话，这些来源的部分可被包括入该文件中。然而，本文中特别恪；以下的说明和实施例仅用于解释本发明的范围和本公开的内容。本领域技术人员可在不偏离本发明范围的情况下设计和实施下列实施例的大量修饰。本发明涉及包含FGF受体区域的可溶性蛋白融合物。本发明通常包括FGF受体片段、区域以及尤其是可溶的或胞外的区域。FGF受体的胞外区域与适当的融合伙伴，例如免疫球蛋白的Fc单元，连接。因此，从最广义的范围来说，本发明所述修饰的可溶性FGF受体融合物可以是与融合伙伴，尤其是Fc区域融合伙伴连接的FGF受体(FGFR)蛋白、片段、域、胞外域，可溶性区域，和任何的这些。申请人发现，包含FGF受体可溶性区域与免疫球蛋白Fc区融合物的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中至多45。/。的N-聚糖不含唾液酰基，具有有利的性质。本发明所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物唾液酸化作用的优点包括更好的药代动力学性质和对体内切割改良的抗性。典型的N-聚糖为通过特定天冬酰胺(Asn)残基共翻译地附着。共有序列Asn-X-Ser/Thr(其中X为除Pro外的任何氨基酸)是必要但不充分的，因为局部的二级结构会决定添加(Jefferis等，2006,NatureBiotechnology24:1241)。某些因素被认为是造成未占据的N-糖基化位点的原因(Jones等，2005,BiochimicaetBiophysicaActa1726:121)。一些N-糖基化位点在本发明的可溶性FGF受体范围内。例如，在FGFR2IIIc的胞外域有8个N-糖基化位点(见图9)。所述N-聚糖含有与Asn连接的保守寡糖核心。该核心由3个甘露糖(Man)和2个N-乙酰葡糖胺(GlcNAcs)单糖残基组成。附加的GlcNAcs通常连接于与a6Man或a3Man连接的卩1,2,而N-乙酰神经氨酸(NeuAca2,6)、半乳糖(Gd卩1,4)、岩藻糖(Fucal,6)和二等分GlcNAc(131,4)可以存在或不存在(Jefferis等,2006,NatureBiotechnology24:1241)。申请人证明了FGFR部分N末端第5号N-糖基化位点上N-聚糖的存在提供了生产率和低聚集方面的有利性质，如实施例中所示。特别的，当该特定位点无糖基化时，生产率显著下降，而聚集增加。此外，该N-聚糖的存在对于FGF结合来说是必需的。本发明因此涉及经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其包含FGF受体的可溶性区域和免疫球蛋白的Fc区的融合物，其中至少所述FGF受体部分的第5号N-糖基化位点被占据，并且至多45。/。的所述FGF受体部分的N-聚糖不含唾液酰基。根据本发明的另一个实施方案，所述FGF受体部分的第3、4、6和7号N-糖基化位点被占据。当所迷FGF受体部分至少7个N-糖基化位点被糖基化时，本发明的融合物具有关于生产率和低聚集的更好的性质。这样，在另一方面，本发明涉及FGF受体的可溶性片段或区域与免疫球蛋白的Fc区的融合物，其中至少7个N-糖基化位点被占据，并且至多45%的所述FGF受体Fc融合物的N-聚糖不含唾液酰基。在本发明一个特定的实施方案中，所有的N-糖基化位点均被占据。另一方面，本发明所述修饰的可溶性FGF受体Fc融合物中，FGF受体部分每个N-聚糖的唾液酸平均数为至少0.9，即该数值可以是0.9或任何高于0.9的值。在一个优选的实施方案中，本发明所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物具有至少1.2的每N-聚糖唾液酸平均数。该比例由申请人发现，用于保证本发明可溶性FGF受体融合物在血中的最大浓度，其比得上对Fc分子在血中发现的最佳浓度。本发明还涉及经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其包含FGF受体的可溶性片段或区域和免疫球蛋白Fc区的融合物，其中所有的N-糖基化位点均被占据，并且其中至多45。/。的所述FGF受体部分的N-聚糖不含唾液酰基，所述Fc区域的N-聚糖不被岩藻糖基化。在另一个实施方案中，本发明所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物纟支部分岩藻糖基化，例如，0-60%岩藻糖基化。在另一个实施方案中，本发明所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物被完全岩藻糖基化。在一个优选的实施方案中，本发明所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物被60%-100%岩藻糖基化。在另一个优选的实施方案中，本发明所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物的每个N-聚糖分子还包括3个甘露糖残基以及平均1.5-3.0个半乳糖残基，每分子聚糖3.5-5个N-乙酰葡糖胺，以及0.6-l个岩藻糖残基。根据本发明，所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物以高亲和性结合FGF配体。例如，所迷融合物结合FGF2的KD值为l-5nM(由BiacoreTM测定)。在本发明一个优选的实施方案中，所述融合物对FGF2的Ko值为1.5nM左右(由BiacoreTM测定)。上述这类修饰的融合物可用作有效和治疗有效的肿瘤生长抑制剂。实际上申请人证明了本发明所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物能在体内抑制肺瘤的生长。此外，本发明所述经修饰的FGF受体Fc融合物能够在体内和体外触发ADCC和/或CDC反应。作为有效的ADCC和/或CDC介导分子，这些化合物尤其可用于治疗FGF过表达的癌性肿瘤。用于FGFR化合物的FGFR序列、FGFR的全长或片段、合成FGFR序列、胞外域、可溶性区域或这些的融合物可选自任何可获得的或已知的序列。FGFR属于酪氨酸激酶家族受体以及免疫球蛋白(Ig)超基因家族。在受体的跨膜形式中，所述酪氨酸激酶区域是胞内的，而Ig-样区域是胞外的。跨膜和分泌形式均结合FGF。至少有4个基因编码FGFRs，其具有2或3个胞外免疫球蛋白(Ig)-样环(Igl-IgIII)以及1个胞内酪氨酸激酶区域的共同结构。来自编码胞外区域的外显子的可选的剪接产品也是已知的，产生多种受体形式。第三Ig样环导致至少3种受体变体，已通过对编码环III第二半的两个外显子(IIIb和nic)的可选的剪接产生了两种跨膜形式。例如，外显子IIIb和IIIc之前的选择性多腺苷酸化位点;陂用于产生FGFR1(IIIa)的可溶形式。在人类和小鼠中，FGFR1的IgIIIa剪接变体编码明显不具有疏水跨膜区域的蛋白，因此可以是所述受体的分泌或可溶形式。所述FGFR化合物也可利用来自FGFR1(NCBI中的蛋白座，NP_075598)、FGFR2(NCBI中的蛋白座，NP—000132)、FGFR3(NCBI中的蛋白座，P22607)和FGFR4(NCBI中的蛋白座，NP—002002)的序列(Kiefer等.，1991,GrowthFactors5:115-127)。包含胞外域的FGF受体的可溶形式也在美国专利号5,288,855、6,656,728、WO91/00916、WO92/00999、WO00/46380、WO2005/016966、WO2005/113295、WO2006/113277、WO2007/014123和欧洲专利529076中进行了讨论。本发明中使用的FGFR片段、区域或可溶性或胞外区域可包括其天然形式为胞外的，或由天然分泌形式的部分或全部组成的的FGFR片段。此外，本发明中使用的FGFR序列可以是那些特别描述或列出的，以及具有与所述全长多肽序列约98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%氨基酸序列同一性的序列，或具有与编码本发明FGFR序列的核酸的多肽编码区域约95%、90%、85%、80%或75%核酸序列同一性的序列。所述片段或区域还可包括其他氨基酸或FGFR的其他区域，只要这些附加的氨基酸和区域不阻止或显著降低如本文所述待使用的FGFR化合物的能力。基本上由FGFR区域或片段组成的多肽或融合蛋白可含有其他氨基酸，只要保留其在哺乳动物细胞中表达并结合FGF的能力，并且任选的，另外，只要保留降低细胞生长或降低血管化作用的能力。在一个实施方案中，所述FGF受体的可溶性片段或区域为FGF受体l(sFGFRl)或FGF受体2(sFGFR2)的可溶性或胞外区域。所选择的FGFR1和FGFR2片段可以具有一个或更多个下述突变1-7个氨基酸的N末端缺失；或N末端取代；loopl序列的缺失；酸性盒序列的缺失。编码氨基酸序列突变体的多核苷酸可以本领域已知的多变体形式的经寡核苷酸介导的D定位的)诱变、'PCR诱变和盒i诱变(例如参见Kunkel,1985,ProcNatlAcadSciUSA82:488)。在另一个实施方案中，FGF受体的可溶性片段或区域为FGF受体1同种型IIIc(sFGFRl(IIIc))和FGF受体2同种型nic(sFGFR2(IIIc))的可溶性或胞外区域。优选的实施方案包括由具有SEQIDNO:3序列的多核苷酸编码和/或具有SEQIDNO:4的氨基酸序列或与SEQIDNO:4具有至少95%、97%、98%或99%同一性的序列的FGF受体2同种型或变体IIIc的可溶性片段或区域。根据该最近的实施方案，本发明经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物(sFGFR2-Fc)有利地具有对其天然配体FGF2的高亲和性或纳摩尔级的高Kd但，包括在l到5nM之间，更精确的为约1.5nM。免疫球蛋白区域的特异性例子包括但不限于免疫球蛋白分子的Fc区；免疫球蛋白分子的铰链区；免疫球蛋白分子的CHi区；免疫球蛋白分子的CH2区；免疫球蛋白分子的CH3区；免疫球蛋白分子的CH4区；以及免疫球蛋白分子的轻链和任何上述的人源化变体。这些区域的序列对于本领域技术人员来说是可获得的(参见例如Huck等.，1986,NucleicAcidsRes.14:1779)。在本说明书和权利要求书中，"免疫球蛋白Fc区域或Fc"表示免疫球蛋白重链恒定区的羧基末端部分。Fc区域在确定免疫球蛋白的生物功能方面尤其重要，这些生物功能被称为效应子功能。正如本领域中已知的那样，免疫球蛋白亚类的重链包含4或5个区域IgM和IgE具有5个重链区域，IgA、IgD和IgG具有4个重链区域。IgA、IgD和IgG的Fc区为铰链-CH2-CH3区域的二聚体，在IgM和IgE中其为铰链-CH2-CH3-CH4区域的二聚体。此外，IgM和IgE的CH3区域在结构上等价于IgG的CH2区域，并且IgM和IgE的CH4区域是IgG的CH3区域的同系物(参见W.E.Paul,ed.,1993,FundamentalImmunology,RavenPress,NewYork,NewYork)。任何已知的Fc区可用作本发明经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物中的Fc区。在一个实施方案中，编码人IgG(FCy)的Fc区的基因通过利用由人白细胞制备的RNA和适当的5，和3，引物进行反转录和PCR获得。所得的DNA片段含有IgG的铰链区、CH2和CH3区域的全序列，如本领域已知的，可用作模板产生特定氨基酸被替换的变体。在PCR过程中可加入编码多肽连接子(包括任选的限制性酶位点)的引物，所得的DNA片段插入到保持载体(holdingvector)中，通过DNA测序确认。优选的，使用免疫球蛋白Y-l的Fc区，其至少包含铰链区、CH!区、CH2区和CH3区的部分。此外，免疫球蛋白，1的Fc区可以是CH!缺失的Fc或CH2缺失的Fc，并且包括铰链区和CH3区的部分，其中CHi和/或CH2区被缺失。CH2缺失的Fc描述于Gillies等，(19卯，Hum.Antibod.Hybridomas,1:47)。最优选的，IgGl的Fc区域包含由具有序列SEQIDNO:5的多核苷酸编码的序列，和/或SEQIDNO:6的氨基酸序列或与SEQIDNO:6具有至少95%同一性的序列。然而，其他免疫球蛋白类，IgA、IgD、IgE和IgM的Fc区也可用作所述Fc区域。此外可以制备这些其中一个或更多个恒定区缺失的Fc区域的缺失构建物。本领域普通技术人员可采用公知的分子生物学技术制备这些缺失构建物。此外，所用的Fc区可以是与SEQIDNO:6中所示的具有约99%、或约98%、或约95%、或约卯％、或约85%、或约80%、或约75%氨基酸同一性的序列。与SEQIDNO:6相比，特定的突变可选自并采用下列的单个或任何组合N末端最初20个氨基酸以内一个Cys的替换或缺失；SEQIDNO:6中位置5的Cys的缺失；或位置5上Cys的替换。所选定的Fc区序列可检测的增加了所述经修饰可溶性FGF受体Fc融合物的血清半衰期。本发明经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物可包含用于可溶性受体部分和Fc区之间的铰链或间隔区。(Ashkenazi等.，1997,CurrentOpinioninImmunology,9:195-200)。例子包括约20或更少氨基酸长度的柔性肽连接子。更优选的，所述肽连接子可以是至少3个氨基酸长度，和/或包含2个或更多个下列氨基酸的肽连接子甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。在一个优选的实施方案中，所述肽连接子不包括蛋白酶切割位点。最优选的连接子为SAL(Ser-Ala-Leu)。本发明同样提供了编码本发明经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物的多核苷酸构建物以及当引入合适的宿主细胞时能够表达所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物的载体。根据优选的实施方案，所述编码经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物的多核苷酸具有序列SEQIDNO:1,或与SEQIDNO:1共有至少80%同一性的序列。本文中，"载体"应当理解为表示任何包含感兴趣核苷酸序列并能导入宿主细胞中，以及任选的表达编码的蛋白或多肽的核酸。载体包括线性核酸、质粒、噬菌体、粘粒等，均在本领域技术人员理解范围之内。编码本发明FGFR或融合化合物的多核苷酸、含有这些核酸的载体以及引入这些载体的宿主细胞均特别的并入本发明的范围。最优选的，本发明的融合分子由包含在C末端与人免疫球蛋白基因的Fcyl区融合的FGFR的胞外区域的DNA编码。所述免疫球蛋白yl基因的Fcyl区包含至少铰链区和CH3区的部分或至少铰链区、CH2区和CH3区的部分。编码本发明嵌合多肽分子的DNA可以是其基因组构型或其cDNA构型。信号肽可用于有效起始蛋白穿过内质网膜的转运。信号序列在本领域是容易表征的，已知通常含有16-30个氨基酸残基，尽管其他大小也是可能的。关于信号肽序列的详细讨论由vonHeijne提供(1986,NucleicAcidsRes.,14:4683)。根据一个优选的实施方案，所述信号肽取自本领域已知的白介素-2信号肽(SEQIDNo.8)。申请人发现将该肽融合到FGFR的胞外区域时能产生具有同种的N末端氨基酸序列的分泌性蛋白，而当使用内源性FGFR信号肽时并非如此。含有位于适当转录和翻译调控序列控制下的本发明经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物编码序列的表达载体可通过本领域已知的重组DNA技术构建。该表达载体通过本领域技术人员已知的任何技术引入宿主细胞。随后采用任何本领域技术人员已知的技术生长所得的含载体的细胞产生经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物或其片段。根据本发明，可釆用多种表达系统表达所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合分子。一方面，所述表达系统表示载体，通过所述载体感兴趣编码序列可被产生并随后纯化，还表示当用适当的核苷酸编码序列瞬时转染后原位表达本发明经修饰的可溶性FGF受体Fc融合分子的细胞。通常采用哺乳动物细胞表达重组的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合分子，尤其是表达整个重组的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合分子。例如，哺乳动物细胞如HEK293或CHO细胞与载体连接，其含有表达信号(例如携带来自人巨细胞病毒的主要中早期基因启动子元件)，是表达本发明经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物的有效系统(Foecking等.,1986，Gene45:101;Cockett等，1990,Bio/Technology8:2)。此外，选定调节插入序列表达，或以所需的特定模式修饰和加工基因产品的宿主细胞。蛋白产品的此类修饰(例如糖基化)和加工对于所述蛋白的功能是重要的。不同的宿主细胞具有蛋白和基因产品翻译后加工和修饰的特点和特定机制。选择适当的细胞系或宿主系统以保证已表达的感兴趣的经-修饰的可溶性FGF受体Fc融合物的正确纟务饰和加工。因此，可使用具有正确加工原始转录物、糖基化基因产品的细胞机制的真核宿主细胞。这些哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、COS、HEK293、3T3或骨髓瘤细胞。所述宿主细胞可用两个或更多表达载体，包括表达本发明蛋白的载体，共转染。例如，宿主细胞可用编码前述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合多肽的第一载体以及编码糖基转移酶多肽的第二载体转染。或者，所述笫二载体可表达针对糖基转移酶的小干扰RNA。为了长期、高产量的生产重组蛋白，优选稳定的表达。在本发明的一个实施方案中，稳定表达所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合分子的细胞系可^皮加工。宿主细胞可用在适当表达调控元件(包括启动子、增强子、转录终止子、多腺苷酸化位点以及其他本领域技术人员已知的适当序列)控制下的DNA与可检测标记转化，而非采用含有病毒复制起点的表达载体。引入外源性DNA后，加工的细胞可在富集培养基中生长l-2天，随后转移至选择性培养基。重组质粒的可选标记赋予选择抗性，允许细胞将质粒稳定整合入染色体中，并扩展至细胞系。根据本发明，可釆用大量的选择系统，包括但不限于分别位于tK、hgprt或aprt细胞中的单纯疱渗病毒胸苷激酶(Wigler等.，1977,Cell11:223)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska等，1992,ProcNatlAcadSciUSA48:202)、甲硫氨酸砜酰亚胺存在下的谷氨酸合酶选择(AdvDrugDelRev,2006,58:671,以及LonzaGroupLtd的网页或文献)和腺噤呤磷酸核糖转移酶(Lowy等.，1980,Cell22:817)基因。同样，可采用抗代谢药抗性作为选择下列基因的基础dhfr,其赋予曱氨喋呤抗性(Wigler等，1980,ProcNatlAcadSciUSA77:357);gpt，其赋予霉酚酸抗性(Mulligan等，1981,ProcNatlAcadSciUSA78:2072);neo，其赋予氨基葡糖苷G-418抗性(Wu等，1991,Biotherapy3:87)以及hygro,其赋予潮霉素抗性(Santerre等，1984,Gene30:147)。重组DNA
技术领域：
已知的方法可常规应用于选择需要的重组克隆，这些方法描述于，例如Ausubel等，eds.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(1993)中。经修饰的FGF受体Fc融合分子的表达水平可通过载体扩增增加。当表达经修饰的FGF受体Fc融合物的载体系统中的标记是可扩增的时，培养物中抑制剂水平的增加会增加标记基因的拷贝数。由于该扩增区域与编码本发明经修饰的FGF受体Fc融合物的基因有关，所述经修饰的FGF受体Fc融合物的产量也同样增加(Crouse等，1983,MolCellBiol3:257)。本领域技术人员已知有大量的因素能影响糖蛋白的糖基化水平。例如，可釆用经修饰的哺乳动物宿主细胞通过提高或减少糖基转移酶的表达来改变所修饰的可溶性FGF受体Fc融合物的糖基化性质。此类经修饰的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、COS、HEK293、PER.C6、3T3、YB2/0和骨髓瘤细胞(Stanley等.，1986,ArchivesofBiochemistryandBiophysics,249:533;Mori等，2006,BiotechnologyandBioengineering94:68;Chitlaru等，1998,Biochem.J.336:647;Umana等.，1999NatureBiotechnology17:176)。本领域技术人员同样已知影响糖蛋白寡糖生物合成的生物加工因素(Goochee等，1994,CurrOpinBiotechnol.5:546)。细胞培养条件，例如葡萄糖或铵离子浓度、pH、血清的作用和其他生物加工因素例如细胞生长率、培养时间的作用也影响N國连接的糖基化(Biotechnol.Bioeng.39:327(1993);Biotechnol.Bioeng.68:370(2000);Bio/technology11:720(1993);Cytotechnology17:13(1995);BiochemJ.272:333(1990))。同样已知，除了宿主细胞和生物加工因素夕卜，寡糖加工还受到局部糖蛋白环境中各个N糖基化位点局部环境的影响。如通过t-PA观察到的那样，位点-位点差异可以是多方面的，或如从EPO的3个N-糖基化位点观察到的那样，其可在分支和末端加工方面包括更多的细微差异(Goochee等，1991，Bio/Technology9:1347)。本发明经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物在制备后可通过免疫球蛋白分子纯化领域已知的任何方法纯化，例如，通过色谱(例如离子交换、亲和尤其是蛋白A对Fc的亲和力等)、离心、不同的溶解性或任何其他用于纯化蛋白质的标准技术。所纯化的修饰的可溶性FGF受体Fc融合蛋白中N-聚糖的定量唾液酸鉴定(N-乙酰神经氨酸残基)、碳水化合物组成分析和定量的寡糖作图可基本上按照之前描述的方法进行(Saddic等.MethodsMol.Biol.194:23-36(2002)和Anumula等.Glycobiology8:685-694(1998》。整合可溶性FGF受体区域的融合蛋白可通过加以必要修正的本领域技术人员熟悉的用于任何其他哺乳动物，可表达的或生物活性的融合物的方法制备。例如，可对已报道的结合IgG的Fc区域与细胞因子和可溶性受体的区域的方法进行设计，并制备本发明的FGFR化合物(参见如Capon等.，Nature,337:525-531(1989);Chamow等.，TrendsBiotechnol.,14:52-60(1996);U.S.5,116,964,5,349,053和5,541,087)。其他可采纳的受体-Ig融合蛋白的例子包括U.S.5,726,044、5，707，632和5,750,375中的那些。由于FGF受体胞外域与免疫球蛋白基因家族的共有同源性程度;f艮高，并且FGFR胞外域含有Ig样片段，尤其优选使用Fc区域。在一个实施方案中，所述融合物为通过IgGFc铰链区的半胱氨酸残基连接的同型二聚体蛋白，所得的分子与IgG分子具有类似的性质。采用Fc区的一个优点是延长了循环半衰期。此外，本发明经修饰的可溶性FGF受体Fc融合蛋白的糖基化修饰导致了改良的药代动力学性质，因为本发明的融合物在体内表现出比得上类似同种型的人IgG的药代动力学性质。本发明的另一个实施方案提供了制备修饰的可溶性FGF受体Fc融合蛋白的方法，该融合蛋白包括FGFR片段或区域、柔性肽连接子以及人IgGFc变体，所述方法包括(a)产生CHO衍生的细胞系；(b)在重组融合蛋白表达的条件下生长该细胞系；以及(c)纯化步骤(b)中表达的蛋白。在该例中，优选的，所述在可溶性FGF受体和人IgGFc变体之间包含至少约3个氨基酸的柔性肽连接子包含2个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。在其他和相关的实施方案中，所述连接肽不存在或仅为l个氨基酸长度。在一个优选的实施方案中，所述肽连接子不包括蛋白酶切割位点。最优选的连接子是SAL(Ser-Ala-Leu)。优选的，经修饰的可溶性FGF受体融合蛋白在CHO细胞中以悬液的方式制备，如本文的实施例中所述。如本文实施例中所示，本发明修饰的可溶性FGF受体Fc融合物具有抗肺瘤活性(至少通过诱导ADCC和/或CDC反应)，并且因此可用于治疗转移性胂瘤和疾病例如癌症。因此本发明的一个方面涉及上述具有ADCC和/或CDC活性的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物。特别感兴趣的是具有增强的介导细胞毒效应子功能例如ADCC的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物。此类蛋白可通过在所述分子的Fc区单或多取代获得，由此改变其与Fc受体的相互作用。设计该突变体的方法可在例如Lazar等(2006，Proc.Natl.Acad.Sd.U.S.A.103(11):4005-4010)和Okazaki等(2004，J.Mol.Biol.336(5):1239-49)中找到，同样参见WO03/074679、WO2004/029207、WO2004/099249、WO2006/047350、WO2006/019447、WO2006/105338、WO2007/041635。也可以采用特别加工的细胞系制备改良的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物。特别的，这些系具有改变的糖基化途径调控，导致了岩藻糖基化很少或甚至完全无岩藻糖基化的修饰的可溶性FGF受体Fc融合物。这些细;9包系和加工它们的方法乂^开于例如Shinkawa等(2003,J.Biol.Chem.278(5):3466-3473)、F函ra等(2006,J.Biol.Chem.281(8):5032-5036;2006,Biotechnol.Bioeng.93(5):851-61)、EP1331266、EP14984卯、EP1498491、EP1676910、EP1792987和WO99/54342中。本发明的一个方面是在受试者中抑制肿瘤生长的方法以及在受试者中治疗或预防转移的方法，包括给予有效量的上述修饰的可溶性FGF受体Fc融合物。本发明同样涉及作为药物的上述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物。本发明还涉及上述修饰的可溶性FGF受体Fc融合物在制备治疗或抑制受试者胂瘤生长的药物中的用途。本发明的另一个方面涉及本发明修饰的可溶性FGF受体Fc融合物的药物组合物。本发明的药物组合物通常包含本发明的修饰的可溶性FGF受体Fc融合物和可药用的载体。本文中，"可药用的载体"包括任何以及所有生理上适合的溶剂、緩冲剂、盐溶液、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和延迟吸收试剂等。载体的类型可基于计划的给药途径选择。在不同的实施方案中，载体适于静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部、经皮或口服给药。可药用的载体包括无菌水溶液或分散剂和用于临时制备无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。药用活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。如下文中详细4又述的，其他活性化合物也可加入到所述组合物中，例如抗癌和/或抗血管发生试剂；特别的，所述其他活性化合物可以是抗血管发生试剂、化疗试剂或低分子量试剂。典型的用于静脉内输注的药物组合物可含有250ml无菌林才各氏溶液以及100mg所述组合。制备可而易见的，更详细的叙述于，例如Remington'sPharmaceuticalScience,17版，MackPublishingCompany,Easton,Pa.(1985),以及其第18和19版，其通过援引引入本文。本发明经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物也可用载体和控释制剂制备，包括埋植剂和微嚢化递送系统。可使用生物可降解或生物相容性的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚肝、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类、聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。制备所述制剂的许多方法对于本领域技术人员通常是已知的。所述组合物中经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物优选为以有效量配制。"有效量"指以剂量并且在需要的时间内有效获得所需的结果(例如调节FGF和/或FGFR活性以及诱导ADCC和/或CDC反应)的量。"治疗有效量，，表示足以影响特定疾病状态治疗过程的量。治疗有效量也是治疗有益的效果胜于该试剂任何毒性或有害效果的剂量。对于治疗应用，本发明经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物以可药用的剂型例如上述讨论的那些向哺乳动物，优选人类给予，所述剂型包括可以作为大丸剂向人静脉内给予的那些或在一段时间内通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径连续输注向人给予的那些。所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物也可以通过瘤内、瘤周围、病灶内部或病灶周围途径适当给予，以获得局部以及全身性治疗效果。腹膜内途径，例如在卵巢肺瘤的治疗中预期是特别有效的。可以调节给药方案以提供最佳的反应。例如，可以给予单个大丸剂，随时间给予几个分开的份剂量或按比例减少或增加剂量。本发明的组合物可向受试者给予以影响受试者体内的细胞生长活性。本文中，"受试者"意图包括存在FGF依赖的细胞生长的存活有机体，尤其包括哺乳动物，例如兔、狗、猫、小鼠、大鼠、猴、其转基因物种以及人类。本发明经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物和药物组合物可用于治疗或预防包括(但不限于)以下的多种癌症癌，包括膀胱、乳腺、结肠、头颈、肾(包括肾细胞癌)、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、子宫颈、曱状腺和皮肤癌；包括鳞状细胞癌；淋巴语系的生血肺瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt，slymphoma);骨髓谱系的生血肿瘤，包括急性和慢性髓细胞性白血病和前髓细胞性白血病；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横紋肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、tetratocarcinoma、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和外周神经系统胂瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横紋肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、keratoactanthoma、精原细月包瘤、曱状腺小嚢癌和畸胎癌，以及其他由FGF过表达引起的有待确认的癌症。在一个优选的实施方案中，本发明经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物被用于治疗黑素瘤、白血病、肾癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌或头颈癌。本发明因此涉及上述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物在制备治疗或抑制受试者中癌相关的疾病的药物中的用途。本发明的一个方面或目的是提供治疗由癌细胞增殖导致的疾病和进程的方法，以及用于治疗或抑制癌生长的组合物。本发明的另一个方面是提供用于调节癌症的基因治疗的组合物和方法。本发明的方法可尤其用于治疗黑素瘤、白血病、肾癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌，肺癌、膀胱癌、乳腺癌或头颈癌。经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物在预防或治疗疾病中的效果可通过连续给予所述融合物或与有效用于这些目的的其他试剂组合得到改善。所述其他试剂例如肺瘤坏死因子(TNF),能够抑制或中和酸性或碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、或肝细胞生长因子(HGF)的血管发生活性的拮抗剂，能够抑制或中和组织因子、蛋白C或蛋白S促凝活性的拮抗剂(参见WO91/01753)，能结合HER2受体的拮抗剂例如抗体(参见US5,772,997),或一种或更多种常规治疗剂，例如，烷化剂、叶酸拮抗剂、核酸代谢的抗代谢药、抗生素、嘧啶类似物、5-氟尿嘧，定、顺铂、嘌呤核苷、胺类、氨基酸、三唑核苷或皮质激素。在本发明的另一方面，所述给药与治疗有效量的化学治疗剂，例如紫杉酚(紫杉醇)或泰索帝(紫杉辟)的给药联合进行。化学治疗剂包括但不限于，抗微管试剂例如二辟类化合物和长春花生物石咸类；柏配位络合物；烷化剂例如氮芥、oxazaphosphorines、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯；抗生素试剂例如蒽环类抗生素、放射菌素和博莱霉素；拓朴异构酶II抑制剂，例如表鬼臼脂素；抗代谢物例如噪呤和嘧咬类似物以及抗叶酸化合物；拓朴异构酶I抑制剂例如喜树石咸；激素和激素类似物；信号转导途径抑制剂；非受体酪氨酸激酶血管发生抑制剂；免疫治疗剂；促凋亡试剂；以及细胞周期信号抑制剂。此外，本发明的方法可与其他抗癌治疗、抗血管发生剂或化学治疗剂或放疗组合。优选的实施例是紫杉萜或泰索帝。其他例子包括2,2-二氟脱氧胞嘧啶核香、顺铂二碎和长春花生物碱、紫杉醇、长春碱、长春新碱和长春瑞滨、卡铂、环磷酰胺、美法兰和苯丁酸氮芥、白消安、卡氮芥、达卡巴嗪、环磷酰胺、美法兰、苯丁酸氮芥、白消安、卡氮芥、达卡巴嗪，抗肿瘤试剂，包括《旦不限于放射菌素例如更生霉素、anthrocyclins例如柔红霉素和阿霉素、博莱霉素、表鬼臼脂素、依托泊苷和鬼臼噻吩苷；抗代谢肺瘤试剂，5-氟尿嘧啶、曱氨喋呤、阿糖胞苷、巯基噤呤(mecaptopurine)、硫代鸟噪呤、喜树碱、盐酸依立替康和盐酸托泊替康。也可选择多种不同的化学治疗剂或抗癌多肽。信息来源例如www.clinicaltrials.gov、www.ncbi.nlm.nih和www.druqs.com，包括了可供选择的多肽和试剂的参考文献。所述其他试剂，例如抗血管发生试剂或化学治疗试剂可以组合物的形式给予或分开给予。在本发明的一个方面，给药与其他有效成分同时、分开或随时间序贯进行。当同时给药时，两种有效成分可以组合成包含这两种成分的单个药物组合物，例如片剂或凝胶胶嚢。在另一方面，不管是否同时给药，所述两种有效成分可以存在于分开的药物组合物中。为此，所述组合可以是试剂盒的形式，其一方面包含前述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，以及另一方面包含第二有效成分，前述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物和第二有效成分位于分开的室中，并且意图同时、分开或随时间序贯给予。根据本发明的组合可尤其与化疗、蛋白治疗(即采用如抗体或重组蛋白的治疗剂)、基因治疗、放疗、免疫治疗、外科手术或其组合联合用于肿瘤治疗。在其他治疗策略的背景下，如前所述，长期治疗如辅助治疗一样是同样可能的。以下实施例仅用于解释本发明的范围和本公开的内容。本领域技术人员可以设计和构建下列实施例的多种修饰，而不偏离本发明的范围。实施例实施例1:在HEK293中制备具有高唾液酸成分和低血液清除率的sFGFR2國Fc从克隆收集物(Invitrogen)中回收编码人a-l,4-半乳糖转移酶(B4GTl)(SEQIDNo.9)或人卩-2,3-唾液酸转移酶(SIAT6)(SEQIDNo.11)的cDNA，将其克隆至表达由CMV启动子启动的哺乳动物表达载体pXL4214中。同一表达载体也用于克隆sFGFR2-Fc的蛋白融合物，产生pXL4410。图1和5显示了编码B4GT1的pXL4551、编码SIAT6的pXL4544以及编码经修饰的可溶性FGFR2IIIc-Fc融合物(本文中称为sFGFR2-Fc)的pXL4410的质粒图谱，也显示了B4GT1(图2)、SIAT6(图3)和sFGFR2-Fc(图4A、B)的核酸和相应的氨基酸序列。通过1-3个编码sFGFR2-Fc、B4GTl或SIAT6的表达质粒与JETPEI(Q-Biogen)复合物的瞬时转染从附着的HEK293EBNA细胞(Invitrogen)中生产sFGFR2-Fc。pXL4410/pXL4544/pXL4551的质粒比为90/5/5。优化质粒比例以保证sFGFR2-Fc多肽的最佳生产率和质量。转染后8天收集分泌蛋白并离心。用100mMpH2.7的甘氨酸/HCl从柱上洗脱之后，蛋白在ProteinGSepharose(AmershamBiosciences)上通过亲和色谱纯化。所述sFGFR2-Fc蛋白配制于PBS中，0.22pm过滤。通过microBC分析(Interchim)测定蛋白浓度。所述sFGFR2-Fc纯化蛋白中N-聚糖的定量唾液酸鉴定、碳水化合物组成分析和定量寡糖作图基本上按照之前描述的进行(Saddic等.2002.MethodsMol.Biol.194:23-36andAmimula等.1998.Glycobiology8:685-694)。首先，sFGFR2-Fc轻微水解后释放唾液酸残基，用邻苯二胺荧光标记，反相HPLC分离。荧光检测单个的峰(激发230nm;发射425nm),通过与N-乙酰神经氨酸和N-羟基乙酰神经氨酸标准物比较进行鉴定和定量。其次，酸水解sFGFR2-Fc样品释放单糖个体后确定碳水化合物组成。水解后，单糖(中性和氨基糖)用邻氨基苯甲酸衍生化，随后用反相HPLC分离，并用荧光片企测检测(激发360nm;发射425nm)。通过与单糖标准物比4交筌定和定量单个的峰。第三，寡糖用PNGaseF酶解释放，用邻氨基苯甲酸荧光标记，随后根据其唾液酸残基的数目通过正相阴离子交换HPLC在Asahipak-NH2P(Phenomenex)柱上分离。通过荧光才企测(激发360nm;发射425nm)检测和定量标记的聚糖。基于每摩尔FGFR2-Fc的N聚糖总摩尔数和用番木瓜蛋白酶释放后获得的每Fc摩尔的N-聚糖摩尔数计算FGFR2区域的每个N-聚糖的平均唾液酸数目。将纯化的sFGFR2-Fc蛋白注射入瑞士棵小鼠(CharlesRiver)尾中。每个蛋白批使用3只小鼠。注射500pg的sFGFR2-Fc后6小时收集血液，获得血浆，采用抗人FGFR2单克隆抗体(R&Dsystem)和抗人IgG-HRP结合多克隆抗体(Pierce)利用三明治法通过ELISA法测定FGFR2-Fc浓度(在2个稀释度分析2次，一式三份)。在对照试验中，小鼠用胎球蛋白和无唾液酸胎球蛋白在注射sFGFR2-Fc1小时前预处理。表1概述了不同sFGFR2-Fc批次的生产条件，每个批次的N-聚糖性质和单糖组成以及小鼠静脉内注射6小时后sFGFR2-Fc的血浆浓度。表1-HEK293中生产的FGFR2-Fc的N-聚糖含量和药代动力学<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>所述融合蛋白与人a-l,4-半乳糖转移酶或人卩-2,3-唾液酸转移酶的瞬时共表达显示在HEK293EBNA中生产的sFGFR2-Fc融合蛋白具有改善的唾液酸化模式。非唾液酸化聚糖百分比减少到1/2,每mol蛋白中总唾液酸含量增加到2倍，并且每个N-聚糖的唾液酸平均数目增加到2.5倍，这证明所述唾液酸化状态得到大幅改善。注意单糖含量并未受到影响(参见表l)。唾液酸化N聚糖的增加到2.5倍与sFGFR2-Fc显著改善的药代动力学参数直接相关。特别的，在小鼠i.v.注射6小时后，血浆中测定的sFGFR2-Fc增加到100倍。与用胎球蛋白预处理相比，用无唾液酸胎球蛋白预处理小鼠时，药代动力学同样改善到100倍。已知无唾液酸胎球蛋白而非胎球蛋白结合肝无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)(Webster等，MO3，Xenobiotica33:945)。综上，这些结果表明，通过来自N-聚糖的暴露的末端半乳糖残基与无唾液酸糖蛋白受体的特异性结合是sFGFR2-Fc的清除的原因，而sFGFR2-Fc上每个N-聚糖一个唾液酸的存在显著的降低了该清除。实施例2:筛选表达为获得最佳的药代动力学每个FGFR2N-聚糖的唾液酸平均数大于1.2的sFGFR2-Fc蛋白的CHO稳定克隆用于在CHO细胞中稳定表达sFGFR2-Fc的哺乳动物表达质粒pXL4636由编码谷胺酰胺合成酶选择性标记物(Lonza)的质粒pEE14.4以及含有编码sFGFR2-Fc的cDNA序列的质粒pXL4410产生，图5。利用AMAXA细胞系核因子试剂盒如供应商推荐地通过将质粒pXL4636通过核转染引入CH0K1细胞。将转染的细胞转移至选择性培养基中，细胞增殖后筛选7个生产纯化的sFGFR2-Fc分子唾液酸含量最佳的CHO/GS半克隆(SC弁9,11,26,58,112,118,170)。选择两个唾液酸含量最高的半克隆(SC弁11和118)进行克隆和扩大生产；特别的，来自SC#118的克隆进一步描述为GClll。尽管由所有半克隆生产的sFGFR2-Fc分子均具有高唾液酸含量，其并不能产生相同的药代动力学。有趣的是，在两个半克隆(SC弁11和118)中观察到唾液酸含量最高的sFGFR2-Fc产生最高的在小鼠iv注射后6小时时血液sFGFR2-Fc浓度，如表2所示。并且在两个克隆中(SC弁9和170)中观察到唾液酸含量最低的sFGFR2-Fc产生最低的小鼠iv注射后6小时时血液sFGFR2-Fc浓度。表2-表达为获得最佳的药代动力学每个sFGFR2N-聚糖的唾液酸残基比例大于1.2的sFGFR2-Fc蛋白的CHO稳定克隆<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>基于高唾液酸化的sFGFR2-FcN-聚糖的克隆筛选可预测最佳的sFGFR2-Fc药代动力学参数。实施例3:每个sFGFR2-FcN-聚糖的唾液酸平均数和sFGFR2-Fc在血中清除率的关系在与实施例2中所述试验类似的其他试验中，釆用DHFR选择和具产生l达sFGFR2-Fc的稳定CHO/DHFR克隆。这些CHO-DHFR克隆同样用于筛选每分子sFGFR2-Fc的唾液酸含量，同时测定了由这些克隆产生的sFGFR2-Fc的清除率。基于每摩尔FGFR2-Fc的N-聚糖总摩尔数和用番木瓜蛋白酶释放后每个Fc摩尔的N-聚糖摩尔数计算FGFR2区域的每个N-聚糖的平均唾液酸数目。图7中所示的结果显示，与Fc分子的血液最佳浓度相比时，超过1.2的每个FGFR2N-聚糖的唾液酸残基的比例保证了血液中最佳的sFGFR2-Fc浓度。仅仅选择的克隆到达了该最佳比例。因此，通过每FGFR2N-聚糖的唾液酸残基比例筛选克隆使得本领域技术人员能预测sFGFR2-Fc在血中的低清除率。实施例4:sFGFR2-Fc融合蛋白的氨基酸序列由质粒pXL4410或pXL4636或pXL4429(图5和6)编码的蛋白sFGFR2-Fc是可溶性人FGFR2人序列与衍生自人IgGl序列的Fc片段的融合蛋白。编码sFGFR2-Fc的多核香酸序列见SEQIDNO:1和图4A。同样，sFGFR2-Fc蛋白的全长氨基酸序列见图4B中的SEQIDNO:2。位置1-350的氨基酸相应于FGFR2IIIc同种型(参见图4CSEQIDNO:4),即SwissProt(FGFR2JIUMAN)中所述第27-376位的氨基酸。位置354-584的氨基酸为SwissProt(IGHGljIUMAN)中所述的第99-329位的IgGl氨基酸；参见图4D和SEQIDNO:6。位置351-353的氨基酸为合成连接子的氨基酸SAL(SerAlaLeu),见图4E。实施例5:CHO稳定克隆GC111中产生的sFGFR2-Fc中的定义的N-聚糖含量对条件进行了优化，以制备每个sFGFR2N-聚糖的唾液酸残基比例超过1.2的sFGFR2-Fc。该实施例提供了达到该状态的条件。在5-L装有4.4LCD-CHO无蛋白培养基、100MSX和1XGS补充物的Celligen生物反应器(NewBrunswick)中以3.5x105细胞/mL的起始细胞密度接种克隆GC111,在37。C培养。釆用氧气、氮气、空气和二氧化碳的混合物或纯氧进行喷气装置通气，溶解的氧维持在30%的空气饱和度。在培养基中添加二氧化碳，输入1M的碳酸氢钠，使pH维持在7.2。所用细胞提升式搅拌器的搅拌速率为110rpm。持续输入供应液(450g/L葡萄糖)，以维持葡萄糖2-3g/L的目标浓度。在第5天残留的葡萄糖浓度到达2.5g/L时开始供应。持续的营养供应基于预测的细胞生长和葡萄糖消耗，营养供应速率与葡萄糖消耗速率相等。按照每日离线控制脉沖添加使谷氨酸浓度维持在l-3mmol/L。监测细胞培养物的细胞数、存活情况和代谢产物(葡萄糖、乳糖、谷胺酰胺、氨和谷氨酸)和表达期的产物浓度。当细胞存活度下降至55%时，停止培养，收集培养收获物。澄清细胞培养收获物，用亲和色谱(ProsepvA,Millipore)和2步离子交换色谱纯化sFGFR2-Fc,随后无菌过滤，储存于磷酸盐緩沖盐中以供进一步分析和体内试验。非还原条件下的SDS-PAGE分析显示，sFGFR2-Fc的表观分子量为180kDa。这与根据sFGFR2-Fc同型二聚体的氨基酸序列计算的理论分子量130kDa大不相同。表观和计算分子量的巨大差异归因于另外存在约30Q/。N-聚糖，见表3。实际上在用肽-N-糖普酶F(PNGaseF,Roche)消化后再进行非还原条件下的SDS-PAGE分析显示，去糖基化的sFGFR2-Fc的分子量约为160kDa(图7)。sFGFR2-Fc的碳水化合物组成和N-聚糖性质按照实施例1中所述分析，如表3所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>与表2中获得的结果相比，最佳条件下从克隆GC111产生的sFGFR2-Fc的唾液酸化的N-聚糖比在标准条件下从GC111的亲本半克隆SCW18产生的sFGFR2-Fc更多。例如，非唾液酸化种类％从43%下降至30%。基于每摩尔FGFR2-Fc的N-聚糖摩尔总数和用番木瓜蛋白酶释放后每个Fc摩尔的N-聚糖摩尔数，测定了每个FGFR2具有7个N-聚糖。因此FGFR2区域大多数位点几乎被完全占据。实施例6:对FGF亲和力和生产率重要的N-糖基化位点sFGFR2-Fc融合蛋白在FGFR2区域和Fc区域分别具有8个和1个N-糖基化位点，见图8和表5关于N-聚糖位点Nl-N8的定义。制备了不再含有Ig样区域1的两个sFGFR2-Fc变体，蛋白4493和4565。在生产率和与FGF-2或肝素结合方面，4493显示了与衍生自pXL4636的野生型FGFR2-Fc类似的性质。而相反，sFGFR2区域所有糖基化位点均被突变(N-至Q的取代)的4565由于突变体生产率下降到低于1/50而不再具有该特征。参见表4。表4.sFGFR2-Fc变体的物理化学性质<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>**与FGF-2的结合在BIAcore仪上采用Gamsjaeger等描述的"构象变化的二态反应"才莫型测定，Gamsjaeger等，Biochem.J.7Apr.2005/BJ20050156。简而言之，对除"批效应"区域外整个感应图部分积分。浓度范围设定为l-8nM之间。同时的ka/kd动力学方法测定两个Ka和两个Kd,方程如下用于A+BAB的kal和kdl用于ABAB*的ka2和kd2,可表示(FGF國FGFR2画Fc)复合物的二聚化。解离常数KD按照下式计算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>根据报道的两个竟争性^t型(Mohammadi的对称性双终点才莫型和Pellegrini的不对称才莫型)，位点N3至N7可潜在地与FGF1或FGFR2c的氨基酸残基和/或肝素相互作用，然而在所有的晶体结构中，位点N8不太可能涉及相互作用(Pellegrini等.2000.Nature407:1029;lbrahimi等.2005Mol.Cell.Biol.25:671)。基于上述的信息，通过将相应的Asn置换成Gln，并保留N8不变研究位置N3至N7的N-糖基化位点以获得显著的生产率是相关的。N-聚糖对于sFGFR2-Fc物理化学性质的位置影响采用二级部分析因试验进行了统计学评价。选择了5个变量(位置N3至N7的糖基化位点占据)和16个独立的构建物进行了研究。按所述进行试验2"部分设计和数据分析(StatisticsforExperimenters,G,BoxEd.,Willey,1978)。部分析因设计基于4493和具有5个变量(N3至N7)的二级析因设计设计位点特异的N-糖基化变体，其可以是增加水平(N)或减少水平(Q)。所述设计用16个构建物分部(25",即解析V设计)，允许鉴定主要效果和2-因子相互作用，但将2-因子和3-因子的相互作用混淆。16个质粒构建物通过连续PCR和克隆获得，产生位置N3、N4、N5、N6或N7的N到Q的替换，但保留N8位以及Fc区域的N糖基化位点不变。这些蛋白变体与4493仅有如表5所列的2或4个点突变的区别。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表6.生产率构建物来自1L的生产的滴度(mg/L)45720457013457794571344587545854045864245733245740457530458837457627457930456954457837449367反应(mg/L)变量28平均17N314N420N513N613N7-8N3-N43N3國N51N3-N6-2N3-N7-2N4-N5-1N4-N66N4-N74N5-N60N5-N7誦1N6-N7聚集纯化的蛋白用凝胶过滤(Superdex2000)分析来量化纯化的制备物中高分子量种类的百分比(HMW;。/。)。对于4587获得的最高值(最坏的情况)为80.2%HMW,其用于不能制备的两种构建物(4572和4574)的DOE分析(从14个构建物中获得的平均HMW百分比值用作比较，获得类似的结论)。位置N5和N6(较低程度)的N-糖基化不利于HMW种类的出现，N5-N6相互作用表现出对聚集类似的影响。34表7.聚集形成构建物HMW(%)反应(％)变量45728057平均457073.0-12N3457771.6-5N4457172.1-33N5458780.2-18N6458547.57N7458647.76N3-N4457357.5-8N3-N5457480-5N3-N6457569.62N3-N7458871.8陽2N4-N5457672.93N4-N6457935.2■4N4-N7456912.0-18N5-N6457839.4-6N5-N744933.61N6-N7与FGF-2的结合采用BIAcoreTM测定每个构建物对FGF-2的结合亲和度。显示出可测量亲和度的构建物的解离常数(KD)为0.49-2.31nM,对于不与FGF-2结合或不能生产的构建物来说，使用10nM的数值进行DOE分析。N5位和N6、N3位(较低程度)的N-糖基化对与FGF-2的结合具有积极的效果。N3-N5&N5-N6的相互作用对结合具有显著的积极效果，N3-N6和N4-N7则对结合具有消极的效果。35表8.与FGF-2的结合<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>解析-V2"D.0.E.显示N3、N4、N5、N6、N7位置的N-糖基化对于生产率来i兌具有积4及贡献，而在N5〉>N6和N3位的N-糖基化对与FGF-2的结合具有积极影响；所有位置的N-糖基化不利于高分子量分子的出现，尤其是N5〉N6。因此N-聚糖在N5位的占据是必须的，并建议分别在N3、N4、N6和N7位占据(分别为FGFR2—HUMAN(Swissprot)的265、228、241、297和318位)。实施例7:sFGFR2-Fc融合蛋白的药代动力学在实施例7中，sFGFR2-Fc是相应于SEQIDNO2的氨基酸序列，每个sFGFR2N-聚糖的唾液酸平均数为1.3。每个时间点向3只小鼠由尾静脉注射入500pg融合蛋白。在注射该产品后的不同时间点收集血液，图IO显示了血浆和肝中的蛋白浓度。图11显示了每个时间点血浆和肝中的蛋白回收量，以注射剂量的百分比表示。采用非区划分析计算药代动力学参数。用提供对数线性末端时期最佳拟合的最后6个数据点计算清除半衰期。表9参数单位sFGFR2-Fct%hr70.1Tlasthr72.0Clastjjg/ml_27.6AUCIasthrg线3138ClobsmL/hr/kg4.2VssmL/kg406AUCIast:给药到最后可测量浓度时间内曲线下面积。CIobs血管外给药的机体总清除率。Clast相应于Tlast的浓度tl/2最终半衰期Tlast最终可测量浓度(非零)的时间Vss稳定态分布容积的估算静脉内给药后，sFGFR2-Fc显示了有利的药代动力学性质，其具有长的清除半衰期(约3天)和减少的总体内清除率。分布容积被限定为低于总的身体水体积，表明限制的组织分布。在72小时，sFGFR2-Fc的血浆浓度停留在很高的浓度，清除率也很好。sFGFR2-Fc的药代动力学参数非常适合该融合蛋白作为治疗剂的使用。如实施例中所显示的效果，小鼠静脉内注射后的血浆浓度相当高，清除率在注射后72小时维持在很低的水平。重要的是，sFGFR2-Fc体内切割的动力学也很低，由于sFGFR2-Fc仅部分切割(18小时后40%),全长分子浓度直到72小时仍未变化。因此，所述融合分子(如SEQIDNO:2所列，其每个sFGFR2N-聚糖的唾液酸分子平均数为1.3)显示了有利的药代动力学性质，其具有长的清除半衰期(约3天)和满意的总体内清除率。实施例8:sFGFR2-Fc融合蛋白在A549皮下肿瘤才莫型中的效果。在本实施例中，sFGFR2-Fc是相应于SEQIDNO2的氨基酸序列，每个sFGFR2N-聚糖的唾液酸平均数为1.3。A549皮下肺瘤才莫型A549细胞系作为肿瘤细胞系被鉴定，用于评价sFGFR2-Fc的效果。申请人:在体外证实，该细胞系表达FGF2，并且sFGFR2-Fc可取消这些细胞的自分泌增殖。申请人在Balb/c棵鼠中建立皮下A549肿瘤才莫型。此外，该肺瘤在体内也表达FGF2。在本实验中，用A549胂瘤生长模型评价sFGFR2-Fc分子的效果。皮下注射产品，一周两次。对不同剂量，即25、15和5mg/kg的sFGFR2-Fc进行了评价。对肿瘤体积演化进行总体分析后表明，用sFGFR2-Fc的三个治疗组与用PBS治疗的组的胂瘤演化具有统计学差异。在剂量为5mg/kg,—周两次时，sFGFR2-Fc对这种模型中的肺瘤生长有效。试验设计在第0天向Balb/c棵鼠皮下注射200pl中的5.106A549细胞。当天注射细胞后，小鼠根据体重随机分成4组，每组4只。治疗在注射细胞后当天随机化后开始。每组接受皮下500、300或100pg/小鼠/给药，分别相应于25、15和5mg/kg,—周两次周一和周五，39天。结果肿瘤体积分析如图12所示，肿瘤体积分析直至第40天。组IOO吗(三角)、300pg(正方形)和500ing/小鼠/给药(封闭圆圈)与PBS组(开口圆圈)具有统计学差异。我们推断sFGFR2-Fc在25、15和5mg/kg剂量上降低了肿瘤生长。第40天的肿瘤重量如图13所示，在试^r结束时收集并称取肿瘤。组100pg、300pg和500吗/小鼠/给药与PBS组具有统计学差异。我们推断根据本发明的sFGFR2-Fc在25、15和5mg/kg剂量上降低了肿瘤重量。sFGFR2-Fc—100、sFGFR2-Fc—300和sFGFR2-Fc—500组的肿瘤生长的演化与用PBS组处理的组的演化具有统计学差异。根据本发明的sFGFR2-Fc融合蛋白(氨基酸序列SEQIDNO2,每个sFGFR2N-聚糖的唾液酸平均数为1.3)能在5mg/kg的剂量上实质性的抑制肿瘤生长。实施例9:sFGFR2-Fc融合蛋白在H460皮下肿瘤才莫型中的效果在实施例9中，sFGFR2-Fc是相应于SEQIDNO2的氨基酸序列，每个sFGFR2N-聚糖的唾液酸平均数为1.6。H460皮下肺瘤模型H460细胞系鉴定为肿瘤细胞系，用于评价sFGFR2-Fc的效果。体外证实，该细胞系表达FGF2。在本试验中对sFGFR2-Fc对肿瘤生长的效果进行了评价。产品以25mg/kg的剂量皮下注射，一周两次。对肺瘤体积演化总体分析表明，sFGFR2-Fc降低了肿瘤生长。试验设计在第0天向Balb/c棵鼠右侧腹皮下注射200pl中的5.106H460细胞。注射细胞后，细胞接种当天(第0天)小鼠根据测定的体重随机化，分配到治疗组。治疗为皮下注射(200pl)—周两次，连续3周(周一和周五)。首次给药在第一天细胞接种后进行，以最大化细胞对治疗的暴露。结果胂瘤体积分析图14显示了直到第22天的肿瘤体积分析。我们推断SFGFR2-Fc从实质上降低了肿瘤生长。肺瘤重量分析图15显示了第22天的肿瘤重量分析。我们推断sFGFR2-Fc从实质上降低了肿瘤的重量。SFGFR2-Fc组肿瘤生长的演化与用PBS处理的组的演化存在统计学差异。我们明确的推断，根据本发明的sFGFR2-Fc融合蛋白(氨基酸序列SEQIDNO2,每个sFGFR2N-聚糖的唾液酸平均数为1.6)能在25mg/kg的剂量上实质性的降低H460肿瘤生长。实施例10:sFGFR2-Fc融合蛋白对A549和H460细胞系的体外ADCC活39性评价在本实施例中，sFGFR2-Fc是相应于SEQIDNO2的氨基酸序列，每个sFGFR2N-聚糖的唾液酸平均数大于1.6。sFGFR2-Fc介导体外ADCC活性的能力在两个选定的模型H460和A549肿瘤细胞中进行了评价(参见实施例8和9)。试验设计将PBS2%BSA(106/mL)中的胂瘤细胞(A549和H460)与500ng/mLFGF2(R&DSystems)以及2pg/mLsFGFR2-Fc或对照人IgGl(Sigma)在4。C下孵育30分钟。胂瘤细胞在RPMI1%FBS中稀释，以每孔5000细胞在96孔板中孵育。以NK/肿瘤细胞20/1'和6/1的比例加入纯化的NK。培养板在37°C下孵育4小时，随后离心，在上清中滴定乳酸脱氪酶(ROCHE试剂盒)。用tritonX1000.2Q/。获得100%裂解。根据制备者需要计算特异性sFGFR2-Fc诱导的ADCC。结果结果如图16所示，在sFGFR2-Fc存在下，在20/1(NK/肿瘤细胞)条件下由天然杀伤细胞(NK)介导的A549和H460肿瘤细胞的肿瘤细胞裂解均接近25%，这表明sFGFR2-Fc能介导这些胂瘤细胞的ADCC效应。实施例11:sFGFR2-Fc融合蛋白在A549皮下肺瘤模型中的体内ADCC和CDC活性评价。在本实施例中，sFGFR2-Fc是相应于SEQIDNO2的氨基酸序列，每个sFGFR2N-聚糖的唾液酸平均数大于1.6。A549皮下胂瘤f莫型A549细胞系鉴定为胂瘤细胞系，用于评价sFGFR2-Fc的效果，因为这些细胞在体内表达高水平的FGF2,并且对体外sFGFR2-Fc介导的ADCC敏感。小鼠系选择三种不同的小鼠系(SCID、NOD/SCID和SCID/bg小鼠)评价sFGFR2-Fc介导体内ADCC和/或CDC活性的能力。SCID小鼠保留了NK和补体功能，能产生ADCC和CDC反应，净皮选为阳性对照。NOD/SCID小鼠既没有NK功能，也不能刺激补体活性，不能产生ADCC或CDC活性。SCID/bg小鼠不具有NK功能，不能产生ADCC活性。在本试验中，在三种不同的小鼠系中皮下植入的A549胂瘤上评价了sFGFR2-Fc分子系的效果。在整个研究过程中，sFGFR2-Fc以5mg/kg的剂量皮下注射，一周两次。试验设计如前文所述(参见实施例8),将A549皮下移植到SCID、NOD/SCID和SCID/bg小鼠中。皮下注射治疗，一周两次，连续6周。在研究期间，体重和肺瘤体积一周测量2次。结果如图17中所示，在3组试^^中对肿瘤体积进行分析(直至第41天)。在SCID小鼠中，5mg/kgsFGFR2-Fc治疗组(菱形)与对照组(开口圆圈)之间具有统计学差异，显示了39%的肿瘤抑制(按IOO-(治疗组体积/对照组体积xl00)计算)。在NOD/SCID小鼠中，5mg/kg的sFGFR2-Fc没有显示活性。在SCID/bg小鼠中，5mg/kg的sFGFR2-Fc部分恢复了其活性(肺瘤抑制=18%)。根据这些结果，sFGFR2-Fc效果包括了CDC和ADCC机制。实施例12:sFGFR2-Fc融合蛋白在H460皮下胂瘤模型中的体内ADCC和CDC活性评价。在本实施例中，sFGFR2-Fc是相应于SEQIDNO2的氨基酸序列，每个sFGFR2N-聚糖的唾液酸平均数大于1.6。H460皮下肿瘤才莫型H460细胞系鉴定为胂瘤细胞系，用于评价sFGFR2-Fc的效果。这些细胞在体内表达高水平的FGF2,并且对体外sFGFR2-Fc介导的ADCC敏感。小鼠系如之前在实施例11中所描述的，三种具有不同免疫功能的小鼠系(SCID、NOD/SCID和SCID/bg小鼠)被选择用于评价在H460中sFGFR2-Fc介导体内ADCC和/或CDC活性的能力。在本试验中，评价了sFGFR2-Fc分子对三种不同的小鼠系中皮下植入的H460肿瘤的效果。在整个研究过程中，sFGFR2-Fc以25mg/kg的剂量皮下注射，一周两次。试验设计41如前文所述(参见实施例9),将H460皮下移植到SCID、NOD/SCID和SCID/bg小鼠中。皮下注射治疗，一周两次，连续3周。在研究期间，体重和肿瘤体积一周测量2次。结果如图18中所示，在3组试验中对肿瘤体积进行分析(至第22天)。在SCID小鼠中，25mg/kgsFGFR2-Fc治疗组(菱形)与对照组(开口圓圏)之间具有统计学差异，显示了29%的胂瘤抑制。在NOD/SCID小鼠中，5mg/kg的sFGFR2-Fc显示了活性损失，胂瘤抑制为14%。在SCID/bg小鼠中，5mg/kg的sFGFR2-Fc恢复了所有的活性(肺瘤抑制=32%)。在这些研究中，如在A549肺瘤模型中所观察到的(见实施例11),CDC和ADCC机制涉及到sFGFR2-Fc效果。实施例13:与sFGFR2-Fc(A265Fc)相比的sFGFR2-Fc在H460皮下肺瘤模型中体内效果的评价Shields等描述了在人IgGlFc区的一个点突变，称为(A265Fc),其赋予了减少的与所有FcyR受体结合，以及很低的抗体依赖的细胞毒性(2001J.Biol.Chem276:6591)。该点突变^皮引入编码sFGFR2-FcFc区的质粒pXL4547的DNA序列中(图19),得到SEQIDNo.13表示的多核苦酸序列。采用具有合适的哺乳动物表达质粒pXL4547和质粒pXL4417(如实施例3中所描述)的DHFR选择和扩增系统产生表达sFGFR2-Fc(A265Fc)(SEQIDNO.14)的稳定CHO/DHFR克隆。蛋白sFGFR2-Fc(A265Fc)然后被生产和纯化，用于体内研究。已证实其聚糖含量与实施例3或5中制备的sFGFR2-Fc聚糖含量类似。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>460皮下肿瘤模型H460细胞系鉴定为胂瘤细胞系，用于评价sFGFR2-Fc的效果；这些细胞在体内表达高水平的FGF2,并且对体外sFGFR2-Fc介导的ADCC敏感。在本实鸟全中，sFGFR2-Fc分子和经修饰的sFGFR2-Fc(A265Fc)分子的效果在皮下植入棵鼠中的H460肿瘤上进行评价。试验设计如前文所述(参见实施例9),将H460皮下移植到Balb/C小鼠中。在整个研究过程中，按一周两次进行治疗。在研究期间，体重和肿瘤体积一周测量2次。结果如图20中所示，对肿瘤体积进行分析(直至第23天)。用25mg/kgsFGFR2-Fc治疗的组(菱形)与对照组(开口圆圈)之间具有统计学差异，显示了50%的肿瘤抑制。25mg/kg经修饰的sFGFR2-Fc(A265Fc)显示活性损失，肿瘤抑制^(叉为25%(NS)。sFGFR2-Fc的Fc中的突变(A265Fc)诱导了活性的下降。由于该修饰降低了抗体依赖性的细胞毒性，实施例13提供了sFGFR2-Fc通过涉及ADCC的机制在体内起作用的间接证据。权利要求1.经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其包含FGF受体的可溶性片段或区域与免疫球蛋白的Fc区的融合物，其中所述FGF受体部分至少第5号N-糖基化位点被占据，并且所述FGF受体部分的至多45％的N-聚糖不含唾液酰基。2.权利要求1所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中，另外，所述FGF受体部分的第3、4、6和7号N-糖基化位点被占据。3.权利要求2所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中所述FGF受体部分至少7个N-糖基化位点被占据。4.权利要求3所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中所述FGF受体部分所有的N-糖基化位点均;故占据。5.前述任一权利要求所述的经〗f饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中所述FGF受体部分每个N-聚糖的唾液酸平均数为0.9或更高。6.权利要求5所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中所述FGF受体部分每个N-聚糖的唾液酸平均数为1.2或更高。7.前述任一权利要求所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中用BiacoreTM测定的所述融合物对FGF2的Kd但包含在1到5nM之间。8.权利要求7所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中用BiacoreTM测定的所述融合物对FGF2的Ko值为约1.5nM。9.前述任一权利要求所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中所述融合物具有ADCC和/或CDC活性。10.前述任一权利要求所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中所述融合物的N-聚糖为60-100%岩藻糖基化的。11.前述任一权利要求所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物每个聚糖分子包含3个甘露糖残基，平均1.5到3.0个半乳糖残基，平均3.5到5个N-乙酰葡糖胺残基和平均0.6到1个岩藻糖残基。12.权利要求1-9任一所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中所述融合物的N-聚糖为0-60%岩藻糖基化的。13.前述任一权利要求所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中所述FGF受体选自FGF受体l(FGFR1)或FGF受体2(FGFR2)。14.前述任一权利要求所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中所述FGF受体选自FGF受体1同种型11Ic和FGF受体2同种型IIIc。15.前述任一权利要求所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中所述FGF受体可溶性区域具有SEQIDNO:4的序列，或与SEQIDNO:4具有至少95%同一性的序列。16.前述任一权利要求所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中所述Fc部分具有SEQIDNO:6的序列，或与SEQIDNO:6具有至少95%同一性的序列。17.前述任一权利要求所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物还包括至少3个氨基酸残基的连接子序列。18.权利要求17所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中所述连接子序列为SAL(Ser-Ala-Leu)。19.前述任一权利要求所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中经4多饰的可溶性FGF受体Fc融合物具有SEQIDNO:2的多肽序列，或与SEQIDNO:2具有至少95%同一性的序列。20.前述任一权利要求所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物，其中所述的经-修饰的可溶性FGF受体Fc融合物还包括SEQIDNO:8的信号肽。21.编码前述任一权利要求所述的经修饰的融合FGF受体的多核苷酸。22.权利要求21所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQIDNO:1的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列。23.包含权利要求21和22任一所述多核苷酸的载体。24.包含权利要求23所述载体的细胞。25.作为药物的权利要求1到20任一所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物。26.药物组合物，其包含权利要求1-20任一所述的经修饰的融合FGF受体。27.权利要求26所述的药物组合物，其中所述组合物含有其他治疗剂。28.权利要求27所述的药物组合物，其中所述其他治疗剂为抗血管发生试剂或化学治疗试剂。29.权利要求28所述的药物组合物，其中所述抗血管发生试剂为肺瘤坏死因子，或酸性或碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白C、蛋白S、血小板衍生生长因子(PDGF),或HER2受体的拮抗剂。30.权利要求28所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂选自抗微管试剂、铂配位络合物、烷化剂、抗生素试剂、拓朴异构酶II抑制剂、抗代谢物、拓朴异构酶I抑制剂、激素和激素类似物、信号转导途径抑制剂、非受体酪氨酸激酶血管发生抑制剂、免疫治疗剂、促凋亡试剂以及细胞周期信号抑制剂。31.权利要求28所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂选自紫杉酚和泰索帝。32.权利要求l-20任一所述的经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物在制备治疗癌症的药物中的用途。33.权利要求32的用途，包括其他治疗剂在制备同一或不同的组合物中的用途。34.权利要求33的用途，其中所述其他治疗剂为抗血管发生试剂或化学治疗试剂。35.权利要求34的用途，其中所述抗血管发生试剂为肿瘤坏死因子，或酸性或碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、组织因子(TF)、蛋白C、蛋白S、血小板衍生生长因子(PDGF)或HER2受体的拮抗剂。36.权利要求34的用途，其中所述化学治疗剂选自抗微管试剂、辆配位络合物、烷化剂、抗生素试剂、拓朴异构酶II抑制剂、抗代谢物、拓朴异构酶I抑制剂、激素和激素类似物、信号转导途径抑制剂、非受体酪氨酸激酶血管发生抑制剂、免疫治疗剂、促凋亡试剂以及细胞周期信号抑制剂。37.权利要求34的用途，其中所述化学治疗剂选自紫杉酚和泰索帝。38.权利要求32的用途，其中所述癌症选自癌，包括膀胱、乳腺、结肠、头颈、肾、包括肾细胞癌、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、子宫颈、曱状腺和皮肤癌；包括鳞状细胞癌；淋巴谱系的生血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤；骨髓谱系的生血胂瘤，包括急性和'lt性髓细胞性白血病和前髓细胞性白血病；间充质来源的肺瘤，包括纤维肉瘤和橫紋肌肉瘤；其他胂瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、tetratocarcinoma、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和外周神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质来源的肺瘤，包括纤维肉瘤、横紋肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、keratoactanthoma、精原细胞瘤、甲状腺小嚢癌和畸胎癌。39.权利要求38的用途，其中所述癌症选自黑素瘤、白血病、肾癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌和头颈癌。全文摘要本发明涉及经修饰的可溶性FGF受体Fc融合物、含有其的组合物以及生产所述经修饰的可溶性FGF受体Fc融合分子的方法，该融合物包括FGF受体的可溶性片段或区域部分(靶向或结合部分)以及免疫球蛋白的Fc区部分(效应子功能部分)，具有包括ADCC/CDC活性在内的改良的生物活性。文档编号A61K38/17GK101589145SQ200780043699公开日2009年11月25日申请日期2007年11月28日优先权日2006年11月28日发明者B·卡梅龙,C·尼科拉兹,F·布兰奇,M·尼斯比特,M·特朗布,S·索德洛申请人:申特莱恩公司