专利名称：：一种大豆皂苷的医药用途及其纯化方法
技术领域：
：本发明涉及一种农副产品的新用途及其纯化方法，确切地说是一种大豆皂苷的医药用途及其纯化方法。二
背景技术：
：目前，国内外公知的大豆皂苷的提取分离方法大致有三类L用甲醇或者乙醇提取大豆原料，经过一系列有机溶剂萃取后，提取物进行硅胶柱色谱分离；2.树脂法提取大豆原料粗皂苷；3.直接以脱脂大豆或大豆饼粕为原料用有机溶剂浸提提取大豆皂苷。但是，提取纯化大豆皂苷的工艺过程中存在提取率低、产品纯度低、成本高等问题。此外，近几年来，越来越多的研究表明大豆皂苷具有较多有益的生理功能。l.降低血中胆固醇和甘油三酯含量Kitagawa等发大豆皂苷可抑制血清中脂类的氧化，抑制过氧化脂质的生成，并降低血中胆固醇和甘油三酯的含量。2.抗氧化、抗自由基、降低过氧化脂质含量Ohminami等已证实大豆皂苷具有抗脂质氧化和降低过氧化脂质含量的作用，且抑制过氧化脂质对肝细胞的损伤。LP0是自由基的代谢产物，大豆皂苷可降低老龄大鼠LP0在肝脏及血浆中的含量，并可防护四氯化碳对肝脏的损伤作用。这些都证明大豆皂苷有淬灭自由基的作用，从而促进DNA损伤的修复。高学敏等研究表明大豆皂苷在一定程度上促进细胞超氧化歧化酶(superoxidedismurse，SOD)的合成，从而使细胞增加抗自由基能力，延缓衰老过程。3.抑制肿瘤细胞生长郁利平发现大豆皂苷对S180细胞和YAC-1细胞的DNA合成有明显抑制作用，并且对K562细胞和YAC-1细胞亦有明显的细胞毒作用。国外也有学者报道大豆皂苷的抑瘤作用，认为大豆皂苷的抑癌机制可能为直接的细胞毒作用、免疫调节作用、胆汁酸结合作用和促使致癌物引起的细胞扩增转为正常。4.抗病毒、抗血栓大豆皂苷的抗病毒作用是最近几年来关于大豆皂苷研究的一个新领域。Nakajima报道大豆皂苷对人类艾滋病(AIDS)病毒的感染和细胞生物学活性都具有一定的抑制作用，并且认为大豆皂苷无论对AIDS的治疗还是预防都是非常有用的。国内学者的研究表明大豆皂苷对单纯疱疹病毒I型(HSV-I)，柯萨奇B3(CoxB3)病毒的复制有明显的抑制作用，同时大豆皂苷还表现出对病毒感染细胞具有很强的保护作用。Kubo以Wistar大鼠为对象进行研究发现，大豆皂苷可抑制血小板和血纤维蛋白原的减少，可抑制内毒素引起的纤维蛋白的聚集，也可抑制凝血酶引起的血栓纤维蛋白形成，表明大豆皂苷具有抗血栓作用。王银萍等研究发现经胃给糖尿病大鼠灌注大豆皂苷，可降低大鼠的血糖、血小板凝聚率及血栓素A2(TXA2)、前列腺素I2(PGI2)值，提高胰岛素水平。5.免疫调节作用大豆皂苷的抑瘤机制之一可能与其免疫调节作用有关。此外还有大豆皂苷防止动脉粥样硬化，抗石棉尘毒性等的报道。己经证实大豆皂苷具有降血脂、抗氧化、抑制肿瘤、抗血栓、抗病毒、免疫调节、减肥、调节糖代谢等多种生物活性。大豆中皂苷理论含量0.5%，豆渣中皂苷理论含量1%。田晶等以脱脂大豆为原料利用AB-8树脂法进行提取，结果表明最佳条件下皂苷提取量为0.45%，提取率为90%(洗脱液中皂苷含量采用205nm波长下紫外光谱法测定)。徐龙权等以脱脂大豆为原料，用乙醇浸提、正丁醇萃取、丙酮沉淀法提取大豆中皂苷的提取量为0.47%，提取率为94%(洗脱液中皂苷含量采用205nm波长下紫外光谱法测定)。胡学烟等研究表明正丁醇萃取法所得大豆皂苷含量只有30%左右；李华等研究表明索氏提取法所得豆渣大豆皂苷提取率为36.2%;有机溶剂回流提取率94%，微波方法提取率59.4%，超声方法提取率60.7%;田晶等将大豆皂苷的醇提液经正丁醇萃取，减压浓縮得浓縮液加入甲醇溶解后，再加入10倍体积的丙酮，搅拌，静置沉淀，抽滤后得沉淀，干燥得80%含量的大豆皂苷。酸碱水解-乙酸乙酯萃取法所得产品纯度较高，一般在90%以上,但收率低，产品外观差，分离过程耗用大量的酸碱,不适合工业化生产。铅盐沉淀法所得大豆皂苷产品纯度可达95%以上，但产率极低,且铅离子有毒，因此限制了其应用。朱翠萍等比较了ZTOl、AB-8、XAB-8、X-5、D312等5种大孔吸附树脂对大豆皂苷的影响，结果发现选择ZTC-1树脂纯化大豆皂苷粗提液得到大豆皂苷产品纯度为78.2%,回收率为93.1%。李晓霞等，考察HPD-IOO、HPD-300、HPD-600、AB-8、H103等5种树脂的吸附性能，选用H103树脂从大豆皂苷的醇提液中吸附异黄酮和皂苷，同时在柱后串联对皂苷有良好吸附性能的HPD-600树脂回收流失的皂苷,经树脂纯化所得的皂苷纯度为53.4%。许浮萍等发明采用食用级醇溶液，例如乙醇溶液萃取大豆脱脂豆粕,得到的提取液经浓縮后进行醇沉，醇沉处理得到的上层液经蒸发除去溶剂后加水离心分离，得到上清液和沉淀物，所述的沉淀物经处理后得到高纯度大豆异黄酮；离心所得的上清液用中极性或极性大孔树脂进行吸附分离，得到75%以上含量大豆皂苷。Satoshi等利用大孔吸附树脂处理皂苷提取液，通过醇梯度洗脱制得60%含量的大豆皂苷。王哲等用微滤膜和超滤膜分离系统将均质后的提取液分离，得到含有大豆皂苷的透过液；透过液用吸附树脂进行吸附分离，被树脂吸附的物质用60%~90%乙醇梯度解吸，然后将解吸液蒸发处理，所得大豆皂苷含量在50%以上。Shuichi等将料液先通过弱碱性阴离子交换树脂(如MP-64树脂)吸附后,分别通过水洗、70%乙醇洗去除水溶性糖、大豆异黄酮等杂质。然后用醇溶液将皂苷洗脱后，再通过非极性大孔吸附树脂(如HP-20树脂)纯化皂苷，所得产品纯度高达91.4%。备注大豆皂苷制备的原料和方法以及所采用的标准品和大豆皂苷含量的测定方法不同，所以在比较时应加以注意。以上所述方法基本上可以得到较高纯度的大豆皂苷，但是其产率低、成本高、工艺复杂。
发明内容本发明旨在开发大豆皂苷的医药用途以及针对现有大豆皂苷提取率低、产品纯度低等缺陷，同时提供一种纯化方法，所要解决的技术问题是提高大豆总皂苷的含量和通过动物模型试验确证其医药用途。本发明所称的大豆皂苷的医药用途是指大豆总皂苷含量>19%的大豆皂苷在制备治疗镇咳祛痰药物中的应用。作为药物原料，其有效成分的含量高比低好。大豆皂苷作为医药用途，使用大豆总皂苷含量为60%~65%的大豆皂苷在制备治疗镇咳祛痰药物中的应用。本大豆皂苷纯化方法，可以以现有方法提取的大豆总皂苷含量为30%或50%的大豆皂苷产品为原料进行纯化，也可以以脱除大豆蛋白后的豆渣为原料，先提取、后纯化，该方法包括大豆皂苷的提取、分离、脱脂和纯化，所述的提取使用60%~70%(质量百分比，下同)乙醇浸提豆渣，分离得到浸提液，向浸提液中加入石油醚萃取脱脂，与现有技术的区别是脱脂后的浸提液经前处理得到大豆总皂苷含量为19%~20%(质量百分比，下同)的粗品，粗品经纯化得到大豆总皂苷含量为60%~65%的精品。所述的前处理是脱脂后的浸提液浓縮脱去部分乙醇后加入等体积饱和正丁醇水溶液，搅拌均匀后浓縮脱溶至褐色粘稠膏状，冷却后加入70%~90°/。的甲醇搅拌溶解，再加入乙酸乙酯至沉淀完全，分离沉淀并干燥并得到大豆总皂苷含量19%~20%的大豆皂苷粗品。所述的纯化是将粗品溶解于去离子水中用经预处理的D101大孔吸附树脂进行吸附纯化，第一次上柱预吸附后其流出液再上柱重吸附至少一次，最后用60%~70%的乙醇洗脱，收集洗脱液，经真空脱溶干燥后得到大豆总皂苷含量60%~65%的皂苷精品。所述的D101大孔吸附树脂的预处理包括溶胀和淋洗。先用95%乙醇浸泡使其充分溶胀，再用95%乙醇淋洗至淋洗液加3倍水不出现白色沉淀为止，用去离子水洗至无醇味，然后依次用3~5倍体积的5%HC1和5%NaOH淋洗，酸碱淋洗后分别用去离子水洗去酸、碱，最后流出的水的pH值7.07.5。本方法制备的大豆皂苷经小鼠氨水引咳法和气管酚红排泌法动物实验，以氢溴酸右美沙芬口服液为对照，结果表明具有止咳、祛痰作用，也就是说本方法制备的大豆皂苷的用途就是在制备治疗止咳祛痰药物中的应用。本发明原料来源丰富，工艺简便，既可制备大豆皂苷的粗品，又可制备大豆皂苷的精品，而且收率高。经动物模型实验表明，所制备的大豆皂苷具有明显的祛痰止咳作用，不仅可望直接用于制备止咳祛痰的药物，而且可以为研制新的疗效更好的治疗各种常见多发咳嗽、祛痰药物提供作为先导化合物而深度开发。具体实施例方式(一)大豆皂苷的制备1、以去除蛋白的干豆渣为原料、用65%乙醇室温浸提10~11小时，料液为1:4~5，分离得到浸提液，向浸提液中加入1/3体积的石油醚萃取脱脂，分离除去石油醚层。2、大豆皂苷粗品的制备真空浓縮脱脂后的浸提液，除去部分乙醇，然后加等体积的饱和正丁醇水溶液，搅拌均匀后真空浓縮脱溶，得褐色粘稠膏状物，冷却后加入85%甲醇溶液溶解，过滤分离除去部分沉淀物，向滤液中加入乙酸乙酯至有沉淀析出，待沉淀完全后分离、干燥沉淀物，得到淡黄色大豆皂苷粗品，经香草醛一高氯酸比色法、齐墩果酸标准品对照，大豆总皂苷含量19%~20%。3、大豆皂苷精品的制备(1)D101大孔吸附树脂的预处理将D101大孔吸附树脂置于95y。乙醇中浸泡24小时，使其充分溶胀，分离后用95%乙醇淋洗至淋洗液加3倍水不出现白色沉淀为止；用去离子水淋洗至无醇味；然后用3~5倍体积的5%HC1溶液、以0.3~0.5ral/min速度淋洗，酸液淋洗后用去离子水淋洗至淋出液pH57;最后用3~5倍体积的5%NaOH溶液淋洗，速度同上，碱液淋洗后用去离子水淋洗至淋出液pH7.0~7.5，将树脂置于去离子水中备用。(2)大豆皂苷粗品纯化将大豆皂苷粗品溶于去离子水中，上柱D101树脂吸附，控制流速0.6ml/min，流出液再返回树脂重吸附至少一次，最后用65%乙醇溶液洗脱，洗脱速度0.4ml/min，收集洗脱液，真空脱溶干燥，得到白色大豆皂苷精品，用香草醛一高氯酸比色法、齐墩果酸标准品对照定量检测，大豆总皂苷含量60~65%。(二)大豆皂苷镇咳祛痰动物模型实验用上述粗品和精品大豆皂苷进行小鼠氨水引咳法及气管酚红排泌法动物实验。1实验原料与试剂准备1.10.9%的生理盐水的配制精确称取9.0gNaCl，置于1000ml容量瓶中，用去离子水溶解并定容至刻度；1.25%粗制大豆皂苷(cSS)生理盐水溶液的配制精确称取50.Omg粗制大豆皂苷，置于10ml容量瓶中，用0.9%生理盐水溶解并定容至刻度;1.310%粗制大豆皂苷(cSS)生理盐水溶液的配制精确称取100.Omg粗制大豆皂苷，置于lOml容量瓶中，用0.9%生理盐水溶解并定容至刻度；1.45%精制大豆皂苷(rSS)生理盐水溶液的配制精确称取50.Omg精制大豆皂苷，置于10ml容量瓶中，用0.9%生理盐水溶解并定容至刻度；1.510%精制大豆皂苷(rSS)生理盐水溶液的配制精确称取lOO.Omg粗制大豆皂苷，置于10ml容量瓶中，用0.9%生理盐水溶解并定容至刻度；1.6粗制大豆皂苷和氢溴酸右美沙芬口服液混合溶液的配制精确量取6ral的10%粗制大豆皂苷生理盐水溶液和4ml氢溴酸右美沙芬口服液置于10ml容量瓶中混匀；1.7精制大豆皂苷和氢溴酸右美沙芬口服液混合溶液的配制精确量取5ml的10%精制大豆皂苷生理盐水溶液和5ml氢溴酸右美沙芬口服液置于10ml容量瓶中混匀；1.80.5%苯酚红注射液的配制将0.5克酚红置研钵中，缓漫滴加15ml0.IN(0.4%)NaOH溶液边加边磨，并不断吸出已溶解的酚红液，直至全部溶解，然后加入85ml双蒸水，颜色为深红，经滤纸过滤后使用，室温保存；1.95%氢氧化钠溶液的配制精确称取5.26g氢氧化钠置于100ml容量瓶中，用去离子水溶解并定容至刻度；1.104%碳酸氢钠溶液的配制精确称取4.17g碳酸氢钠置于100ml容量瓶中，用去离子水溶解并定容至刻度；2实验方法与步骤2.1实验动物分组将小鼠随机分成1、生理盐水(NS)组；2、氢溴酸右美沙芬(DextromethorphanHydrobromide，DH)口服液阳性对照药物组；3、5%粗制大豆皂苷(cSS)生理盐水溶液组；4、10%粗制大豆皂苷生理盐水溶液组；5、5%精制大豆皂苷(rSS)组生理盐水溶液组；6、10%精制大豆皂苷组生理盐水溶液组；7、粗制大豆皂苷生理盐水溶液和氢溴酸右美沙芬口服液合用组；8、精制大豆皂苷生理盐水溶液和氢溴酸右美沙芬口服液合用组。共8组，每组8只小鼠，标记，观察正常活动及呼吸情况。2.2实验设计(1)生理盐水组每天灌胃给药2次，每次0.4ml/只，连续3d;(2)氢溴酸右美沙芬口服液组每天灌胃给药2次，每次0.4ml/只，连续3d;(3)5%粗制大豆皂苷生理盐水溶液组每天灌胃给药2次，给药0.6ml/只，连续3d;(4)10%粗制大豆皂苷生理盐水溶液组每天灌胃给药2次，给药0.6ml/只，连续3d;(5)5%精制大豆皂苷组生理盐水溶液组每天灌胃给药2次，给药0.4ml/只，连续3d;(6)10%精制大豆皂苷组生理盐水溶液组每天灌胃给药2次，给药0.4ml/只，连续3d;(7)粗制大豆皂苷生理盐水溶液和氢溴酸右美沙芬口服液合用组每天灌胃给药2次，每次O.5ml/只，连续3d;(8)精制大豆皂苷生理盐水溶液和氢溴酸右美沙芬口服液合用组每天灌胃给药2次，每次0.4ml/只，连续3d;2.3末次给药后40min，将30ml氨水放入50ml锥形瓶中，将氨气通过导管连到大漏斗，并倒盖，制造氨气环境。然后将小鼠置于氨气环境中15s后(30ml/次，一熏一换氨水，每次熏1只小鼠)，立即记录放入时间，观察并记录咳嗽潜伏期及3min内咳嗽次数；2.4观察结束后立即腹腔注射0.5%酚红注射液0.5ml/只，30min后拉颈臼死小白鼠，手术取出自甲状软骨下端至气管分支处的一段气管。将所取气管用4%碳酸氢钠溶液冲洗3次，合并冲洗液于试管中，加5%氢氧化钠溶液1滴使成碱性，加4%碳酸氢钠溶液至5ml，在可见分光光度计546ran波长处测定其吸光度。3实验结果与分析3.1实验结果3.2各组实验动物的咳嗽潜伏期表l8组动物的咳嗽潜伏期TablThecoughi对照ubationperiodforthe8groupsofanimals组别实验动物咳嗽潜伏期/s下；e<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><replacetable>complexreplacetableseeoriginaldocumentpage9</replacetable>注、DH-氢溴酸右美沙芬组，cSS-粗制大豆皂苷组,rSS-精制大豆皂苷组，与生理盐水组比较，bP<0.053.3各组实验动物3min咳嗽次数表28组动物3rain中内的咳嗽次数Tab2Thecoughfreque对照ywithin3minsforthe8groupsofanimals<replacetable>complexreplacetableseeoriginaldocumentpage9</replacetable>注、DH-氢溴酸右美沙芬组，cSS-粗制大豆皂苷组,rSS-精制大豆皂苷组，与生理盐水组比较，"P<0.013.4各组动物所取气管的冲洗液在546nm波长处吸光值表38组动物所取气管的冲洗液的吸光值Tab3Theabsorbe对照yoftracheafluidforthe8groupsofanimals组别实验动物所取气管的冲洗液在546nm波长处的吸光值下^e<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注a:DH-氢溴酸右美沙芬组，cSS-粗制大豆皂苷组,rSS-精制大豆皂苷组，与生理盐水组比较，°:P<0.01。根据光吸收基本原理，如果保持入射光的波长与溶液厚度不变，光吸收度与溶液的浓度成正比关系。故吸收度越大，则证明溶液中酚红的浓度越大，因此可以作为衡量祛痰作用的一个常用指标。大豆皂苷制备粗提和纯化物经动物实验，以氢溴酸右美沙芬口服液对照，结果充分显示大豆皂苷具有剂量依赖性的镇咳祛痰作用。本制备品可以推广为工业化生产用于止咳和祛痰的药用原料。(三)药物制剂的制备以大豆总皂苷含量60%~65%的得大豆皂苷为主药，非限定实施例叙述如下1、普通片剂以玉米淀粉为稀释吸收剂，添加少量糊精或糖粉以增加其粘性，以淀粉浆为润湿粘合剂，以硬脂酸镁或微粉硅胶为润滑剂，用公知湿法制粒压片法加工普通片剂，即先制软材，再制湿粒，经干燥整粒后压片。2、胶囊剂以微晶纤维素为填充料，微粉硅胶为助流剂，与粉碎后的主药混合均匀后装3#空心胶囊，得到硬胶囊剂。权利要求1、一种大豆皂苷的医药用途，其特征在于大豆总皂苷含量为≥19wt％的大豆皂苷在制备治疗镇咳祛痰药物中的应用。2、根据权利要求1所述的大豆皂苷的医药用途，其特征在于大豆总皂苷含量为60wt《65wtM大豆皂苷在制备治疗镇咳祛痰药物中的应用。3、由权利要求1所述的大豆皂苷的纯化方法，以脱除大豆蛋白后的豆渣为原料，包括大豆皂苷的提取、分离、脱脂和纯化，其特征在于所述的纯化是脱脂后的浸提液经前处理得到大豆总皂苷含量为19wtM20wty。的大豆皂苷粗品，粗品经纯化得到大豆总皂苷含量为60w线65wty。的大豆皂苷精品，具体方法如下(1)所述的前处理是脱脂后的浸提液经浓縮后搅拌下加入等体积的饱和正丁醇溶液，浓缩脱溶至褐色粘稠膏状，冷却，加入70wty。90wty。甲醇溶液，搅拌溶解，分离，向滤液中加入乙酸乙酯至沉淀析出完全，分离、干燥沉淀得到大豆皂苷粗品；(2)所述的纯化是大豆皂苷产品溶于去离子水中用经预处理的D101大孔吸附树脂吸附纯化，第一次上柱预吸附后其流出液再上柱重吸附至少一次，然后60wty。70wty。乙醇洗脱，收集洗脱液经脱溶干燥后得到大豆皂苷精品。全文摘要一种大豆皂苷的医药用途是大豆总皂苷含量≥19wt％的大豆皂苷在制备治疗镇咳祛痰药物中的应用。为提高大豆总皂苷的含量，其纯化方法是将粗品溶于去离子水中用经过预处理的D101大孔吸附树脂进行吸附纯化，第一次上柱预吸附后其流出液再上柱重吸附至少一次，最后用60％～70％的乙醇洗脱，收集洗脱液，经真空脱溶干燥后得到大豆总皂苷含量为60％～70％的皂苷精品。本发明不仅可望直接用于制备止咳祛痰的药物，而且为研制开发疗效更好的止咳祛痰药物提供了先导化合物。文档编号A61P11/00GK101342227SQ20081002179公开日2009年1月14日申请日期2008年8月13日优先权日2008年8月13日发明者锋孙,伟庞,张必芳,徐晓伟,潘丙南,王俊伟,范远景,黄南山申请人:合肥工业大学