专利名称：核酸分子cxsi12及其在制备抗癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及一种核苷酸分子及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
肿瘤疾病现已上升为世界第2号〃杀手〃，其死亡人数仅次于心血管病。几年来， 国外医学界对于肿瘤疾病的发病机理在细胞基础上又有了新的认识。基于对肿瘤发 病机制的进一步理解，人们利用各种途径来研制和开发能够特异，有效地杀伤肿瘤细 胞而对正常细胞无毒性的药物。目前，对于癌症的治疗仍以化疗及放疗为首选，两 者虽对肿瘤的治疗取得了相当的疗效，但由于缺乏对肿瘤细胞的特异性因而具有较大 的毒副作用以及某些肿瘤细胞对化疗和放疗处理的不敏感，因此在很大程度上限制了 它们在临床中的应用。近年来，为了开发出能特异性地杀伤癌细胞而对正常细胞无 毒负作用的药物，人们对癌症的发病机制从细胞，分子水平上的研究予以高度重视和 巨额投资。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备抗肿瘤药物的核苷酸分子。 本发明的另一个目的是提供上述核苷酸分子的应用。
本发明提供了一种用于制备抗肿瘤药物的核苷酸分子，它具有抑制肿瘤生长的 活性并且其序列包括5， -AUUCAAGAAACUGUCGCUC-3'或者5， - ATTCAAGAAACTGTCGCTC -3'。在本发明中被称为CXSI12。
其中，A、 T、 U、 G和C分别是腺嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、 鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸。
3在本发明中，术语"核苷酸分子CXSI12 "该术语还包括 5' -AUUCAAGAAACUGUCGCUC-3，或者5' - ATTCAAGAAACTGTCGCTC -3'的核苷酸序列 变异形式。这些变异形式包括若干个(通常为1-15个，较佳地1-10个，更佳地l-5 个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'禾B/或3'端添加数个(通常为IO个以 内，较佳地为5个以内)核苷酸。例如，在5' -AUUCAAGAAACUGUCGCUC-3'后(3 '端) 加入若干dT (脱氧胸苷)后形成的序列。
本发明中，CXSI12可以是具有抑制肿瘤生长的活性并且包括 5， -AUUCAAGAAACUGUCGCUC-3' dTdT的序列。
本发明中，CXSI12可以是具有抑制肿瘤生长的活性并且是 5' -AUUCAAGAAACUGUCGCUC-3， dTdT的序列。
本发明中，CXSI12可以是具有抑制肿瘤生长的活性并且是5'-ATTCAAGAAACTGTCGCTC -3' 的序列。
在本发明中，可选用本领域己知的各种载体，如市售的载体，与CXSI12连接成 为重组载体。例如，可以采用慢病毒、腺病毒或者森林脑炎病毒表达系统(Semliki Forest Virus)。慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒亚属，以人类免疫缺陷病毒 (human immunod efficiency virus, HIV)为代表.慢病毒不仅具有感染分裂革巴 细胞并整合其基因组中，尤其是具有感染包括神经元细胞、巨噬细胞、肝细胞、心肌 细胞和干细胞等在内的多种非分裂细胞能力，因而，慢病毒载体已作为基因转移的有 效工具，被广泛应用于基因功能尤其是基因治疗的研究。
另一方面，本发明还提供了上述的核苷酸分子CXSI12的制备方法，即按CXSI12 的序列，将各核糖核酸分子依次脱水縮合。
本发明的核苷酸分子CXSI12可以采用各种常规的制备方法制备。本发明的核苷 酸分子CXSI12序列通常可以用酶解法或人工合成的方法获得。
本发明还提供了上述的核苷酸分子CXSI12在制备抗肿瘤药物中的应用。 实验表明，将本发明的CXSI12转入H1299细胞，结果表明，H1299细胞呈现出 明显的G1期阻滞。本发明的CXSI12还可抑制肿瘤细胞增殖。将CXSI12或者含有CXSI12的细胞施 用于裸鼠，与相同培养条件下未施用CXSI12的裸鼠相比，前者瘤体的增长明显受到 抑制，而且这种现象随着时间的推移日益明显。
本发明的核苷酸分子CXSI12及其类似物，当在治疗上进行施用(给药)时，可提 供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载 体介质中，其中PH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质 的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给 药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
以本发明的核苷酸分子CXSI12为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联 用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类 载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物
制剂应与给药方式相匹配。本发明的核苷酸分子CXSI12可以被制成针剂形式，例如 用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶 囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和 胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千 克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的CXSI12还可与其他治疗剂一起使用。 当本发明的核苷酸分子CXSI12被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用 于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况 下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约l毫克/千克体 重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技 能范围之内的。
本发明中，所述的抗肿瘤药物是由含有效治疗量的核苷酸分子CXSI12和药学上 的载体或者赋形剂组成的药物组合物。所述药物组合物可以是针剂或者片剂。其有效 治疗量可以为每天1微克/千克至10毫克/千克体重。所述药物可以是针剂、粉剂或 者片剂。
本发明的核苷酸分子CXSI12加入H1299，结果细胞呈现出明显的Gl期阻滞； 施用于裸鼠时，与相同培养条件下的对照裸鼠相比，瘤体的增长明显受到抑制，而且 这种现象随着时间的推移日益明显。本发明为肿瘤的治疗和缓解提供了一种新的途径和手段。
具体实施例方式
实施例一 CXSI12对细胞周期的影响
采用上海吉凯基因技术有限公司的GeneChem Easy-siRNA合成的CXSI12。 用Lipofectami.ne 2000转染siRNA的实验操作步骤
(1) 细胞于转染前一天接种于24孔板，所加培养基体积为500ul。转染时细胞 融合率应为40%-50%.
(2) 配制工作母液2. 5nmo1 (1.0OD)的双链siRNA中加入125ul 1 XUniversal Buffer,得到浓度为20uM的si謂A母液。
(3) 以下稀释步骤(4和5)中可以用不含血清的Opti-MEM(Invitrogen)，也可
以用其他不含血清的培养基。
(4) 对于24孔板的每个孔，用0.84ug siRNA双链。把3ul20uM的siRNA双链 与50ulOpti-MEM混合。
(5) 将Lipofectamine 2000试剂盒轻柔摇匀，取lul Lipofectamine 2000试 剂在另一管中与50ul Opti-MEM混合，室温下孵育5分钟。
(6) 把稀释后的siRNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻混匀。 室温下温育20分钟。
(7) 把siRNA与Lipofectamine 2000的混合液加入培养细胞，轻轻混匀然后将 细胞放入培养箱。
(8) 在检测RNAi效果之前一般无需换液。但如果转染试剂有明显细胞毒性，可 在转染满3小时时换液。
结果，细胞呈现出明显的G1期阻滞。
实施例二抑制裸鼠肿瘤生长
2.1裸鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)成瘤大量培养检测SK-H印l细胞， 胰酶消化，离心收获所培养的细胞，用PBS洗涤后计数，重悬于PBS，并将细胞用一 次性注射器对裸鼠进行皮下注射，每组注射》5只，(雌性，30-40天)，每只裸鼠的 细胞注射量为200 ri，细胞数约为106， 一周后肿瘤长出。2.2病毒注射当肿瘤体积长至10-30 mm3体积时，将20 W含有3 X 107 TU 滴度病毒的PBS用注射器直接注射进入肿瘤内。实验组注射LV-CXSI12病毒，对照 组注射LV-non-silencing病毒。两天后，再用同样的方法和剂量注射一次病毒。
2. 3肿瘤监测和瘤块切取每天检测小鼠的状态，每三天测量一次肿瘤的体积。 实验组和对照组小鼠各五只进行测量，从感染第29天起，实验组肿瘤和对照组肿瘤 体积出现显著差异。32天后，处死小鼠，并从皮下取出瘤块进行称量。
结果显示，与对照组相比，注射了含有CXSI12的裸鼠瘤体生长明显减慢。这说 明，本发明的CXS工12可以明显抑制肿瘤生长。
权利要求
1. 一种核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制肿瘤生长的活性并且其序列包括5’-AUUCAAGAAACUGUCGCUC-3’或者5’-ATTCAAGAAACTGTCGCTC-3’。
2. 如权利要求l所述的一种核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制肿瘤生长 的活性并且其序列包括5' -AUUCAAGAAACUGUCGCUC-3' dTdT。
3. 如权利要求1所述的一种核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制肿瘤生长 的活性并且其序列是5' -AUUCAAGAAACUGUCGCUC-3， dTdT。
4. 如权利要求1所述的一种核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制肿瘤生长 的活性并且其序列是5' - ATTCAAGAAACTGTCGCTC -3，。
5. —种如权利要求1-4中任一种核苷酸分子的制备方法，其特征在于，按权 利要求1-4中任一种核苷酸分子的序列，将各核糖核酸基团或者脱氧核糖核酸基团 依次脱水縮合。
6. 如权利要求1-4中任一种核苷酸分子在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及一种核苷酸分子及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供了一种用于制备抗肿瘤药物的核苷酸分子，它具有抑制肿瘤生长的活性并且其序列包括5’-AUUCAAGAAACUGUCGCUC-3’或者5’-ATTCAAGAAACTGTCGCTC-3’。在本发明中被称为CXSI12。本发明的核苷酸分子CXSI12可以细胞停止于G1期；施用于裸鼠时，与相同培养条件下的对照裸鼠相比，瘤体的增长明显受到抑制。
文档编号A61K31/7088GK101503447SQ20081003357
公开日2009年8月12日 申请日期2008年2月5日 优先权日2008年2月5日
发明者龙 余, 翔 王 申请人:复旦大学